JPH07504801A - Ｄｎａの単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 感染症及び寄生虫症の診断に、ＤＮＡ診断法がますます用いられるようになって きている。これらの方法の多くは、ＤＮＡ増幅法、例えば、Ｍｕｌｌｉｓ等によ る米国特許第４．６８３．１９５号、同第４．６８３．２０２号、同第４．８０ ０．１５９号及び同第４、９６５．１８８号に記載されているポリメラーゼ連鎖 反応法（ＰＣＲ）を必要としている。しかしながら、そのＤＮＡ増幅法は、ＤＮ Ａを血液又は他の生物液体から安定な生物学的に活性な形態で単離することを必 要とする；更にその増幅法を最適に適用するために、増幅されるべきＤＮＡを長 さ約２ｋｂ未満の直鎖状断片として存在させることを必要とする。更に、血液検 体の患者からの採血と血液試料から単離したＤＮＡのＤＮＡ増幅法による検査と の間にたいていかなりの経過があることから、その間ＤＮＡを血液中で安定に保 存する方法がめられている。更に、閉環状連結構造又は他のインターリンク構造 の状態にあるこれらの生物試料中のＤＮＡを増幅に適切な直鎖状の二本鎖ＤＮＡ 断片に変換することがめられている。この方法は、迅速で、実施が簡便で且つ細 胞又は他の構造から効率よくＤＮＡを遊離させて増幅に適切な断片に切断させる ことができなければならない。

ＤＮＡの単離及び保存方法は、特にＤＮＡ増幅法による寄生虫症の診断に関連し て強くめられている。シャガス病、リーシュマニア症及びマラリアのようなこれ らの疾患の多くは、医療施設が比較的原始的であり且つ感染の疑いのある患者か らの試料の採取とその検査との間に実質的な時間が経過してしまう熱帯地方に主 として存在する。最近、ＰＣＲによるこれらの疾患の診断に対して、Ａｖｉｌａ 等（Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｍ、　Ｐａｒａｓ目吐４２：１７５（１９９０））、 　Ｓｔｕｒｍ等（Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｍ、　Ｐａｒａｓｉ狽盾戟A　３３： ２０５（１９８９））、　Ｒｏｄｇｅｒｓ等（Ｅｘｐ、　Ｐａｒａｓ　ｉ　を吐 ７１　：２６７（１９９０））及びＭｏ５ｅｒ等（Ｊ、　Ｃh　ｉｎ。

ハイブリッド形成を容易にする条件下で放射能標識した寄生虫食ｐＮＡを用いた ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成法による哺乳動物血中のクルーズトリパノソー ｖ　（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ　ｃｒｕｚｉ）の検出が記載されている。

ＤＮＡを単離するために高ＤＮＡ濃縮物を使用することがＳｉｍｐｓｏｎ　＆　 Ｂｅｒｌｉｎｅｒ。

るべき血液試料の保存方法が記載されている。この溶解物は、赤血球を溶解する ために水；寄生虫を溶解するために界面活性剤／ＥＤＴＡ混合を用いて調製さね 、次いでトリフルオロ酢酸セシウムが添加されている。この方法の欠点は、赤血 球をまず溶解する必要があること、界面活性剤の使用が必要なこと及びセシウム 塩が高価なことである。更に、この系は、ＤＮＡを切断するために溶解物に加え たエキソヌクレアーゼのような酵素を阻害することがある。

寄生虫感染の疑いのある患者からの血液試料又は保存中の他の感染因子のＤＮＡ を単離及び分解防止し且つ感染の診断が行われるように増幅及び／又はハイブリ ッド形成法のためのＤＮＡを調製する方法がめられている。

即 従って、本発明は、これらの要望を満たす迅速且つ効率のよいＤＮＡ単離、保存 及び切断方法を提供し、ＰＣＨのような配列特定法による増幅に適切なりＮＡを 提供する。一般的には、ＤＮＡ含有構造を有する生物試料から生物学的に活性な りＮＡを単離するための本発明の方法は、下記段階を含むものである：（１）Ｄ ＮＡ含有構造を含む生物試料を試料中のＤＮＡ含有構造を溶解するのに十分な非 両親媒性カオトロピック（ｎｏｎ−ａＩＩＩｐｈｉｐａｔｈｉｃ　ｃｈａｏｔｒ ｏｐｉｃ）塩及びＤＡＮを分解させずに保存するキレート剤を含む溶解保存バッ ファーと接触させて生物試料及び溶解保存バッファーの混合液を作り；（２）段 階（ａ）で作った混合液をＤＮＡを切断する金属含有化学ヌクレアーゼとインキ ュベートしてＤＮＡ断片を形成し；（３）ＤＮＡ断片を精製する。

ＤＮＡ含有構造内のＤＮＡは、連結閉環状で存在する。それを寄生虫から単離す ることができる。特に、クルーズトリパノゾーマのようなキネトブラスチド寄生 虫からＤＮＡを単離することができる。また、ＤＮＡを単純ヘルペスウィルス（ Ｈ３Ｖ）と関連させることもできる。ＲＮＡもＲＮＡ含有構造から単離すること ができ、増幅するための逆転写酵素を用いてＲＮＡからＤＮＡを作製することが できる。生物試料は、ヒト血液を含む哺乳動物血液のような液体試料とすること ができる。

非両親媒性カオトロピック塩は、グアニジニウム塩、例えば、塩化グアニジニウ ム又はチオシアン酸グアニジニウムであることが好ましい。グアニジニウム塩が 塩化グアニジニウムであることが更に好ましい。塩化グアニジニウムを生物試料 及び溶解保存バッファーの混合液中少なくとも約３モルの濃度で存在させること が最も好ましい。

キレート剤は、エチレンジアミン−四酢酸（ＥＤＴＡ）であることが好ましい。

ＥＤＴＡを生物試料及び溶解保存バッファーの混合液中少なくとも約０．１モル の濃度で存在させることが最も好ましい。

一般法は： （４）ＤＮＡ断片に対してハイブリッド形成する少なくとも２種類のプライマー を用いる配列特定法によりＤＮＡを増幅し；（５）ＤＮＡを同定することによる 病原体内のＤＮＡの存在と関連した疾患を検出する： 段階を更に含むことができる。

配列特定法で用いられるプライマーは、遺伝標識を同定するために生物試料から 単離した病原体の遺伝標識に対してハイブリッド形成する少なくとも２種類のプ ライマーを含むことができる。

金属含有化学ヌクレアーゼは、１．　ｌ　Ｏ−フェナントロリン−銅複合体（ｃ ｏｍｐｌｅｘ）、ＥＤＴＡ第一鉄の誘導体、金属ポルフィリン又は４．７−ジフ ェニル−１，１０−フェナントロリンの八面体金属複合体より選ばれる。金属含 有化学ヌクレアーゼは、！、　Ｉ　Ｏ−フェナントロリン−銅複合体であること が好ましい。

一般法の適用は、キネトブラスチド寄生虫による疾患の検出方法である。本方法 は、下記段階を含むものである： （１）キネトブラスチド寄生虫による疾患に罹っていることが疑われる患者から の生物試料を試料中の連結閉環状キネドプラストＤＮＡを含む細胞を溶解するの に十分な非両親媒性カオトロピック塩及び細胞内のＤＡＮを分解させずに保存す るキレート剤を含む溶解保存バッファーと接触させて生物試料及び溶解保存バッ ファーの混合液を作り； （２）段階（１）で得られた混合液を連結閉環状キネドブラストＤＮＡを直鎖状 にする金属含有化学ヌクレアーゼとインキュベートしてキネドブラストＤＮＡ断 片を形成し： （３）ＤＮＡ断片を精製して増幅に適切な精製キネドブラストＤＮＡ断片を形成 し： （４）直鎖状ＤＮＡに対してハイブリッド形成することができる少なくとも２種 類のプライマーを用いる配列特定法により、精製キネドプラストＤＮＡ断片を増 幅して増幅キネドブラストＤＮＡを形成し；（５）プライマーに対応するので寄 生虫のキネドブラストＤＮＡに特異的な配列を有する増幅キネドプラストＤＮＡ の存在を同定することにより、疾患を検出する。

本方法をクルーズトリパノゾーマによるシャガス病を検出するために用いると、 プライマーはクルーズトリパフソーマキネトブラストミニサークルＤＮＡ内の保 存領域に対してハイブリッド形成する。

クルーズトリパノゾーマによる疾患の検出に好ましい本発明による方法は、下記 を含むものである： （１）クルーズトリパノゾーマ由来のキネトプラスチドＤＮＡを含んでいること が疑われる哺乳動物血液試料を６Ｍ塩化グアニジニウム及び０．２Ｍ　ＥＤＴＡ 、ｐＨ８，０を含むほぼ同量の溶解保存バッファーと混合して混合液を作り、こ の混合液を室温で少なくとも２４時間保存し； （２）段階（１）で得られた混合液をキネドブラストＤＮＡを切断する金属含有 化学ヌクレアーゼ１．１０−フェナントロリン−銅複合体とインキュベートして 直鎖状キネドブラストＤＮＡを形成し； （３）（ａ）フェノール−クロロホルム混合液で除タンパクし；（ｂ）−グリコ ーゲンキャリヤとエタノール沈降させ；（Ｃ）ミクロコンセントレータでろ過す る：ことにより、直鎖状キネドプラストＤＮＡを精製して精製直鎖状キネドブラ ストＤＮＡを形成し； （４）クルーズトリパノゾーマの連結閉環状キネドブラストＤＮＡの保存領域に 対してハイブリッド形成することができる少なくとも２種類のプライマーを用い る配列特定法により、精製直鎖状キネドプラストＤＮＡを増幅し；（５）プライ マーに対応するのでプライマーに対してハイブリッド形成することによるクルー ズトリパノゾーマの連結閉環状キネドブラストＤＮＡに特異的な配列を有する増 幅ＤＮＡの存在を同定することにより、クルーズトリパノゾーマによる疾患を検 出する。典型的には、直鎖状ＤＮＡは長さ約１〜約１．５ｋｂの断片を含むもの である。

本発明の方法の単離及び保存法段階は、ＤＮＡの切断から別々に行うことができ る。本発明による細胞含有生物試料からＤＮＡを単離及び保存する方法は、下記 の段階を含むものである。

（１）ＤＮＡを細胞から遊離するために、細胞内に存在するＤＮＡを含む生物試 料を溶解保存バッファーと接触させ、溶解保存バッファーが下記のものを含み＝ （ａ）溶解バッファーが生物試料と接触する際に生物試料中の細胞を溶解するの に十分な非両親媒性カオトロピック塩の濃縮物：及び（ｂ）溶解バッファーが生 物試料と接触する際にＤＮＡを分解させずに保存するのに十分なキレート剤の濃 縮物； （２）混合液中の遊離ＤＮＡを約６５℃の温度で保存する。

ＤＮＡ試料を少なくとも約１年間保存するために、保存温度は約４℃以下である ことが好ましい。

図面の簡単な説明 図１は、下記実施例１に記載されるプラスミドＤＮＡの安定性の試験結果を示す ものである。

図２は、下記実施例２に記載される単離クルーズトリパノゾーマキネトプラスト ＤＮＡの１．１０−フェナントロリン−鋼化学ヌクレアーゼ（ＯＰ−Ｃｕ”つに よる切断結果を示すものである。

図３は、下記実施例２に記載される０Ｐ−Ｃｕ”＋直鎖状ミニサークルＤＮＡ内 の一本鎖ニツクの頻度を示すものである。

図４は、下記実施例４に記載される０Ｐ−Ｃｕ”＋切断ＤＮＡの感受性力価の結 果を示すものである。

図５は、下記実施例５に記載されるクルーズトリパノゾーマミニサークル配列の 存在を分析した慢性シャガス病患者の血液試料からの結果を示すものである。

図６は、下記実施例５に記載されるトリアドミド半翅虫から単離したクルーズト リパノゾーマＤＮＡのＰＣＲ増幅の結果を示すものである。

説明 本発明は、ＤＮＡ含有構造を有する生物試料から生物学的に活性なりＮＡを迅速 且つ効率よく保存、単離及び精製する方法である。ＤＮＡ含有構造としては、細 胞及びウィルス粒子がある。本方法は、連結閉環状で存在する寄生虫ＤＮＡを単 離するのに特に有効であるが、そのようなりＮＡに使用することに限定されない 。本方法は、ＤＮＡを引き続き増幅に適切なサイズの断片に切断するために、引 き続き化学ヌクレアーゼによる制御された分解に適切な状態でＤＮＡを保存する ことができる。次いで、ＤＮＡを迅速に精製してＰＣＲのような増幅法における 使用に適するようにすることができる。

一般的には、本方法は下記を含むものである：（１）ＤＮＡ含有構造を含む生物 試料を試料中のＤＮＡ含有構造を溶解するのに十分な非両親媒性カオトロピック 塩及びＤＡＮを分解させずに保存し且つ血液の凝固を阻止するキレート剤を含む 溶解保存バッファーと接触させて生物試料及び溶解保存バッファーの混合液を作 り； （２）段階（１）で作った混合液をＤＮＡをＤＮＡ断片に切断する金属含有化学 ヌクレアーゼとインキュベートし； （３）ＤＮＡ断片を精製する。

本方法は、クルーズトリパノゾーマ、シャガス病の原因である原虫；　（３ｔｕ ｒ＋ｎ等。

２６：５７６（１９８８））；リーク５フー１−フ種、リーシュマニア症の原因 である原虫（Ｒｏｄｇｅｒｓ等、　Ｅｘｐ、Ｐａｒａｓｉｔ吐７１　：２６７（ １９９０））及び熱帯熱マラリア、三日熱マラリア（Ｐｌａｓｗｌｏｄｉｕｍ　 ｖｉｖａｘ）及び四日熱マラリア（Ｐ、　ｍａｌａｒｉａｅ）　、ヒトマラリア の原因である原虫（Ｚｏｌｇ等、　Ａｍ、　Ｊ、　Ｔｒｏｐ、　Ｍｅｄ、　Ｈｙ ｇ、　３９：３３（１９８８））のような連結閉環状キネドブラストＤＮＡを有 する寄生虫による寄生虫症の検出に特に適応されるが、これらに限定されない。

更に、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウィルス（ＭＶ）　、Ｂ 型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、エブスタインーノく−ルウイルス及びトキ ソプラズマゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓ＋ｎａ　ｇｏｎｄｉ　ｉ）のプロウィルス のような他の感染症及び感染因子の検出にも用いることができる。

本方法は、ＤＮＡを含む任意の生物試料に使用するのに適している。本方法は、 ヒト血液のような哺乳動物血液からＤＮＡを保存及び単離するのに特に適応され るが、昆虫糞便、生検組織、尿、喀痰及びリンパ液のような他の生物試料に使用 するのにも適している。本方法は、ミクロリットルからリットルまで、必要とさ れる任意の容量の液体試料に用いることができる。

Ｂ、溶解保存バッファー 生物試料を本発明の溶解保存バッファーと混合する。溶解保存バッファーは：（ １）試料中の細胞を溶解するのに十分な非両親媒性カオトロピック塩の濃縮物及 び（２）ＤＮＡを分解させずに保存するのに十分なキレート剤の濃縮物を含むも のである。非両親媒性カオトロピック塩は、主としてタンパク質及び核酸の二次 、三次及び四次構造の維持に関与する水素結合、塩結合、疎水性相互作用及びフ ァンデルワールス相互作用のような非共有結合を破壊する異なった極性及び非極 性部分を有する界面活性剤以外の塩である。

非両親媒性カオトロピック塩は、塩化グアニジニウム又は化学的に関連した塩、 例えば、チオシアン酸グアニジニウムが好ましく；他のカオトロピック塩、例え ば、臭化リチウム、チオシアン酸カリウム又はヨウ化カリウムも使用できる。塩 化グアニジニウムは、生物試料及び溶解保存バッファー中央なくとも３モルの濃 度で存在させることが最も好ましい。

キレート剤は、ＥＤＴＡが好ましいが、他のキレート剤、例えば、クエン酸ナト リウムも用いることができる。ＥＤＴＡは、生物試料及び溶解保存バッファーの 混合液中央なくとも０．１モルの濃度で存在させることが最も好ましい。

典型的には、生物試料を約６モルの塩化グアニジニウム及び約０．２モルのＥＤ ＴＡ、ｐＨ８，０を含むほぼ同量の溶解保存バッファーと混合する。

溶解保存バッファーを生物試料と混合すると、生物試料中に存在する細胞又はウ ィルス粒子のようなりＮＡ含有構造は実質的に瞬時に溶解し、ＤＮＡはＤＮＡ含 有構造から遊離する。ＤＮＡは生物試料及び溶解保存バッファーの混合液中で安 定であり、約６５℃以下の保存温度で保存することができる。３７℃の保存温度 において、溶解保存バッファー及び試料の混合液中に保存されたＤＮＡは、少な くとも１力月間無傷のままである。４℃又は−２０℃において、ＤＮＡは少なく とも１年間安定である。ＤＮＡは、本発明の方法の残りに従って、引き続き化学 ヌクレアーゼで切断及び精製するためにこの段階で保存されるか又はハイブリッ ド形成プローブを作製するためにニックトランスレーションのような他の手法に 用いられる。

生物試料が血液である場合、血液及び溶解保存バッファーの混合液をまず室温（ 即ち、約２０−２５℃）で約２４時間保存し、次いで４℃で引き続き保存するこ とが好ましい。新たに採血した血液を用いる必要がなく；約！週間までの期間保 存した血液を用いることができる。１手順の説明においては、血液をクエン酸塩 及び／又はヘパリンのような抗凝固剤を含む試験管に取り、次いで約２４時間保 存した後に用いる。

Ｃ１化学ヌクレアーゼ 生物試料−溶解保存バッファー混合液をデオキシリポース部分に酸化攻撃してＤ ＮＡを単鎖切断することができる金属含有化学ヌクレアーゼとインキュベートす ることにより、溶解保存バッファー中のＤＮＡを断片化する（Ｓｉｇｍａｎ　＆ 　Ｃｈｅｎ。

＆　Ｄｏｉｂｒｏｓｋ−４，Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ 、　Ｓ、　Ａ、　８３　：５４６９（１９８６））　；金属|ルフィリン ルー１．ｌＯ−フェナントロリンの八面体の金属含有複合体、例えば、トリス（ ４゜７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）ルテニウム（Ｂａｒｔｏｎ 、５ｃｉｅｎｃｅ　２３３ニア２７（１９８６））とすることができる。バッフ ァー成分による阻害に対して感受性がないことから、化学ヌクレアーゼは１．ｌ Ｏ−フェナントロリン−銅複合体が好ましい。更に、ｌ、　Ｉ　Ｏ−フェナント ロリン−銅複合体は安価であり、切断の程度を制御するために、その反応をキレ ート剤によって効率よく失活させることができる。

他の化学ヌクレアーゼ、例えば、ＥＤＴＡ第一鉄、メチジウムプロピルーＥＤＴ Ａ−鉄、金属ポルフィリン及び４．７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリ ンの八面体の金属含有複合体は、バッファーによって実質的に阻害されなければ 有効である。

フェナントロリン−鋼化学ヌクレアーゼ試薬は、過酸化物の存在下に、ランダム −重鎖ニックを二本鎖ＤＮＡに導入する（Ｓｉｇｍａｎ　＆　Ｃｈｅｎ、　Ａｎ ｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｕ５９：２０７　（１９９０））。平均して、 １０個のランダム−重鎖切断がＤＮＡ分子に導入された後に１個の二本鎖切断が 起こることから、このヌクレアーゼはミニサークルを直鎖状にする連結キネドブ ラストＤＮＡを消化するために用いることができる。

１、１０−フェナントロリン−銅複合体を用いる化学ヌクレアーゼ反応は、典型 的には、次のように行われるコ生物試料と３モルの塩化グアニジニウム及び０． １モルのＥＤＴＡを含む溶解保存バッファーとの混合液ｌ容量に１モルのＭ　ｇ 　ＣＩ　ｔ、２００ミリモルのＣｕ５（Ｌ　、２０ミリモルのｌ、１０−フェナ ントロリン及び７．５％）１□０２（３０％貯蔵液から新たに希釈した）各０． １容量を加える。３−メルカプトプロピオン酸０．１容量を加えて反応を開始さ せ、３７℃で３０分間ＤＮＡの消化を進める。１．５モルの２．９−ジメチル− １，１０−フェナントロリン０．１容量を加えて反応を停止させる。他の化学ヌ クレアーゼを用いた反応は、それらが記載されている文献で説明されているよう に行われる。切断過程は、増幅過程で用いることができる断片にＤＮＡを切断す る。これらの断片は直鎖状にされ、典型的には約１〜約１．５ｋｂの長さを有す る。

１、１０−フェナントロリン−銅複合体は、高反応性酸化的化学種を作り、フェ ナントロリン−銅試薬とＤＮＡとの間の可逆複合体の形成によりＤＮＡと反応す ると思われる。反応は次の安定な産物を作製する＝５′−リン酸化末端、３′− リン酸化末端、遊離塩基及び５−メチレンフラノン並びに少量の３′−ホスホグ リコレート末端。優勢な反応には、ＤＮＡ結合配位複合体によるデオキシリボー スのＣ−１水素における初期酸化攻撃が必要である。酸化反応はＤＮＡの小湾内 で開始され、試薬はＡ型らせんのＤＮＡに相対するＢ型らせんのＤＮＡに好まし い反応性を示す。反応は開裂部位のヌクレオチドに特異的でないが、その速度は まさに局部配列に依存する。任意の配列位置におけるフェナントロリン−銅複合 体による切断の強度に最も重要な影響は、隣接する５′−ヌクレオチドである。

銅に対して高親和性を有するキレート剤、例えば、２．９−ジメチル−１，１０ −フェナントロリン、２．９−ジメチル−４，７−フェナントロリン又はＥＤＴ Ａを添加することにより、いつでも反応を終結させることができるので、局部配 列による反応性の変化を打ち消すことができる。反応を失活させるために用いら れるキレート剤は、２．９−ジメチル−１，ｌＯ−フェナントロリンであること が好ましい。

即ち、本明細書で記載した切断法は、実質的にＤＮＡ配列に依存せず、ヌクレア ーゼを用いた切断により作製された一本鎖ＤＮＡ断片のサイズは、キレート剤を 用いて消化時間を調節することにより効果的に制御される。

特に、初めは閉環状連結ミニサークルとして存在するクルーズトリパノゾーマキ ネトプラストＤＮＡを１．１０−フェナントロリン−銅複合体で切断すると、長 さ約１．４ｋｂの個々の直鎖状ＤＮＡ分子が得られる。

Ｄ、ＤＮＡ精製 引き続きプライマーＤＮＡ増幅を妨害することがある物質を除去するために、Ｄ ＮＡを精製することが好ましい。精製は、典型的には、（１）除タンパク；（２ ）ＤＮＡの沈降；及び（３）ろ過を包含する。精製産物は、ＰＣＲ又は別のプラ イマー増幅段階による増幅に適切である。

試料の除タンパクは、典型的には、タンパク質を変性し且つタンパク質を核酸か ら分離するフェノール又はフェノールとクロロホルムのｌ：ｌ混合液で抽出する ことにより行われる。除タンパクは、フェノールとクロロホルムのｌ＝１混合液 で抽出することにより行われることが好ましい。

ＤＮＡの沈降は、典型的にはグリコーゲンキャリヤの存在下にエタノールを用い て行われ、室温で約８０μｇ／ｍｌのグリコーゲン及び０，３モルの酢酸ナトリ ウムの存在下に行われることが好ましい。

最終精製段階は、ミクロコンセントレータ−でろ過することにより行われる。

適切なミクロコンセントレータ−は、Ａｍ１ｃｏｎ　（Ｂｅｖｅｒｌｙ、Ｍａｓ ｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）製のＣｅｎけ１ｃｏｎ−１００ミクロコンセントレータ −である。

精製に引き続いて、単離及び精製ＤＮＡは下記の系で増幅されるか又はノ＼イブ リッド形成プローブの作成又はクローニングベクターへの組込みのような高度に 精製されたＤＮＡ断片を用いる他の目的に用いられる。

！１．単離ＤＮＡの増幅 ＤＮＡ断片に対してハイブリッド形成する少なくとも２種類のオリゴヌクレオチ ドブライマーを用いる配列特定法により、精製及び断片化ＤＮＡを増幅すること ができる。かかる方法には、Ｍｕｌｌｉｓ等による米国特許第４．６８３．１９ ５号、同第４、６８３．２０２号、同第４．８００．１５９号及び同第４．９６ ５．１８８号に記載されているＭｕｌｌｉｓ等のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ 法）があるが、これに限定されない。これらの特許は、すべて参考として本明細 書に引用する。ＰＣＲ法は、Ｇｅ１ｆａｎｄ等による米国特許第４．８８９．８ １８号に記載されているサームスアクアチカス（乃μ！四ａｑｕａＨｃｕｓ）ポ リメラーゼＴａｑｌのような熱安定ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ、この特 許を参考として本明細書に引用する。更に、ＰＣＲ法についての詳細は、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　（ｌｔＡ、　Ｉｎｎ１ｓ等、　ｅｄｓ、　、　Ａｃａｄｅ ＋ｎｉ　ｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））に示さ黷■■ り、この文献を参考として本明細書に引用する。

欧州特許出願第３６８９０６号に記載されているＧｉｎｇｅｒａｓ等の転写増幅 系及び欧州特許出願第３２９８２２号に記載されているｐａｖｅｙ及びＭａｌｅ ｋの類似系のような他のプライマーを用いる配列特定核酸増幅系も既知であり、 両特許を参考として本明細書に引用する。これらの系は、プロモーター、バクテ リオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼのようなりＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ 及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を組込んでいるプライマー を用いてＤＮＡ−ＲＮＡのような交互サイクルの増幅を利用する。

これらの方法のいずれにおいても、増幅産物は分離している直鎖状ＤＮＡ断片又 は分離しているＤＮＡ断片の連続であり、これはアガロースゲルによる電気泳動 によって分離され、ＤＮＡをニトロセルロースフィルター又は他のフィルターに 移すことによる“サザンプロット”ハイブリッド形成のようなハイブリッド形成 法によって同定される。有効なハイブリッド形成法は、Ｅ、１ｔＳｕｔｔｅｒ、 “Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　Ａｍｏｎ ｇ　ＤＮＡ　Ｆｒａｇ＋＋＋ｅｎｔｓ　５ｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　Ｇｅ１Ｅｌ ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ″、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　９８：５０３（１ ９７５）に記載されており、この文献を参考として本明細書に引用する。ハイブ リッド形成は、典型的には、放射性的に標識したＤＮＡオリゴヌクレオチドプロ ーブを用いて行われる；これは増幅に用いたＤＮＡに最初に存在した特定の配列 を同定するために作用する。プローブが病原性細菌、ＤＮＡウィルス又はＲＮＡ ウィルスのＤＮＡプロウィルスのような疾患病原体と関連したＤＮＡからなる場 合、ハイブリッド形成法は最初の試料中の疾患病原体と関連したＤＮＡ配列、従 って疾患の存在を同定するために用いられる。

本発明のＤＮＡ保存、切断、精製及び増幅法は、寄生虫症、特にキネトプラスチ ドトリバノソームによる疾患の検出に有効である。

これらの疾患には、クルーズトリパノゾーマによるラテンアメリカにおいて主要 な医療課題であるシャガス病がある。シャガス病の診断のための現在の血清学的 及び外因診断法は、特に血液内での寄生虫の濃度が低いために、寄生虫が血液内 に容易に検出できず、できたとしてもごくわずかな慢性シャガス病の場合には信 頼性がない。

細胞のミトコンドリア内のＤＮＡ含有構造であるクルーズトリパノゾーマキネト ブラストは、連結ミニサークルとしてＤＮＡを含み、本発明の方法に従って化学 ヌクレアーゼで切断して精製すると、ＰＣＲ法又は別の配列特定プライマー増幅 法により効率よく増幅することができる。クルーズトリパノゾーマのキネドプラ ストミニサークル（ｋＤＮＡ）内の保存領域に特異的なオリゴヌクレオチドブ５ ｔｕｒｆｆｉ等、　’Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　ＰａｒａｓｉＬｏｌ、　３ ３：２０５（１９８９）；Ａｖｉ　Ｉａ等、　Ｍｏ１．Ｂ奄盾モ■■香B ＡＭＡＣ，Ｉｎｃ、　（シーンセット課、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、　ＭＢに所在） でも市販されている。

これは、種依存性及び株非依存性である一組の増幅ＤＮＡ断片を生じ、患者の血 液及び感染した昆虫媒介動物又はマウスのような感染した哺乳動物から得られた 生物試料においてクルーズトリパノゾーマＤＮＡの存在を検出するために用いる ことができる。

一般的に、本明細書で記載したように単離及び増幅したＤＮＡは、標準法を用い て、例えば、ＤＮＡにおける特定の配列に結合する放射性的に標識したプローブ を用いたＤＮＡハイブリッド形成により、ＤＮＡの存在と関連した疾患を検出本 発明の方法は、寄生虫ＤＮＡの保存、精製もしくは検出又はミニサークル状ＤＮ Ａに限定されない。使用される化学ヌクレアーゼが、典型的には、ＰＣＲに必要 とされる１０００塩基未満のプライマーを用いて増幅するのに最適なサイズであ る長さ約１〜約１．５ｋｂの直鎖状断片にＤＮＡを切断するので、本発明の溶解 、保存、切断及び精製方法を用いて血液、尿、喀痰又はリンパ液のような任意の 生物試料から問題の生物学的因子に特異的なりＮＡを検出することができる。検 出されたＤＮＡは、寄生性原虫、細菌又はウィルス、例えば、ヘルペスウィルス 、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）　、Ｂ型肝炎ウィルス、ヘルペスウィルス、 エプスタイン−バールウィルス又はトキソプラズマゴンジのＤＮＡを含む病原体 由来のものである。哺乳動物又はヒＨ）ＮＡ及びエイズ関連のヒト免疫不全ウィ ルス（ＨＩＶ）のＤＮＡのようなレトロウィルスＤＮＡを含む細胞ＤＮＡも検出 することができる。増幅は病原体に特異的なりＮＡの極めて少量を検出させるこ とができるので、従来の血清学的診断法より早く病原体による疾患の存在を検出 するために用いることができる。

本発明の方法に従ってＤＮＡを単離するために全血を使用する場合、同様の多重 ＰＣＲアッセイにおいて、寄生虫又は疾患の他の病原体の遺伝標識の他に宿主種 （動物又はヒト）の遺伝標識をアッセイすることができる。例えば、ヒトの場合 、アッセイされた遺伝標識には、種々の疾患に対する耐性及び自己免疫疾患に対 する感受性と関係することが示されている主要構造適合座（ＭＨＣ）遺伝子のよ うな免疫応答遺伝子のファミリーを含めることができる。多重ＰＣＲにおけるア ッセイに適切な他の遺伝子座には、リーシュマニア又はクルーズトリパノゾーマ によるもののような寄生虫症に対して耐性を与える動物モデルに見られる遺伝標 識のヒト相同染色体がある。適切なプライマーの選択及び単離ＤＮＡを用いる本 アッセイでの選択的増幅の場合、がん遺伝子及び抗がん遺伝子又は遺伝病に含ま れる遺伝子のような所望の遺伝子座を標的とすることができる。

ＲＮＡもまた、試料及び溶解保存バッファーの混合液中で細胞又はウィルスのよ うなＲＮＡ含有構造から単離及び保存することができる。次いで、ＲＮＡを逆転 写酵素により転写してＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを作成することができる。

次いで、ハイブリッド内のＲＮＡを二本鎖ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡ 鎖に特異的な酵素リボヌクレアーゼＨで分解し、得られたＤＮＡ鎖を適切なプラ イマーのハイブリッド形成及びＤＮＡポリメラーゼによるプライマーの伸長によ り二本鎖にした。

本発明の方法の追加の利点は、細菌細胞又はウィルス粒子の溶解またウィルス核 酸の切断によって感染力が実質的に破壊されるので、本発明の溶解保存バッファ ー及び化学ヌクレアーゼの使用が生物試料に存在するウィルス又は細菌のような 内在性感染微生物の感染力の低下の効果を示すことができることである。膜エン ベロープウィルスを１，１０−フェナントロリン−鋼化学ヌクレアーゼで処理す ると、その感染力を破壊する（Ｌｅｍｂｅｃｈ等、　Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、４４： １０７２（１９８５）。

下記実施例により、本発明を具体的に説明する。実施例は説明のためだけのもの であり、決して本発明の範囲を制限するものとして解釈されるべきではない。

ヒト静脈血を新たに採血し、同量の２ＸＧＥ溶解保存バツフアー（６Ｍ塩化グア ニジニウム、０．２Ｍ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）を含む試験管に採取した。得ら れたＧＥＢ　（グアニンニウム／ＥＤＴＡ／血液）溶解物を２５℃で少なくとも ２４時間、引き続いて４℃で６力月まで保存した。

ＧＥＢ溶解物中のＤＮＡの安定性を試験するために、プラスミドＤＮＡ、ｐＧＥ Ｍ７　Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を２試験管 のＧＥＢ溶解物に加えた。

各試験管を３７℃又は６５℃で保存した。各試験管から等価分量を４週間までの 種々の時間で採取した。これらの分量をフェノール／クロロホルム（１：　ｌ、 ｖ／ｖ）で１回抽出し、エノールで沈降させた。単離ＤＮＡを１％アガロースゲ ルで電気泳動して切れ目のある又は直鎖状のプラスミドＤＮＡの割合をめ、これ をゲルによる相対的に急速な移動度により、ゲルの上部に残る無傷連結体と対照 的に検出することができる。

結果を図１に示す；３７℃でインキュベートすることによって得られた電気泳動 パターンを（ＩＡ）に示し、６５°Ｃでインキュベートすることによって得られ た電気泳動パターンを（ＩＢ）に示す。対照レーンは１０ｍＭ）リス−ＨＣ１， Ｉ）Ｈ８，０，１ｍＭＥＤＴＡ　（ＴＥ）中のインキュベートしないプラスミド ＤＮＡである。

図１は、ＤＮＡが３７℃で少なくとも１力月無傷のままであることを示し、単鎖 切断又は分解が明らかでない。６５℃においては、閉環状ＤＮＡバンドの消失及 び単鎖切断環状バンドの増加で示されるように、２週間のインキュベーション後 にＤＮＡが単鎖切断されている。６５℃でさえ、１週間のインキュベーション後 にＤＮＡの少なくとも５０％が単鎖切断環状又は直鎖状で残った。４〜−２０℃ においては、少なくとも１年間ＤＮＡがＧＥＢ中で安定であることが示された。

これらの結果は、塩化グアニジニウム−ＥＤＴＡ試薬が血液に含まれる細胞を溶 解し且つ室温で実質的な時間ＤＮＡを保存するのに適切な媒体であることを明ら かに示している。

実施例２ １、１０−フェナントロリン−銅複合体を用いたキネドプラストＤＮＡの切断キ ネドブラストＤＮＡを含む０．５ｍｌのＧＥＢ溶解物に、各々０．０５ｎ＋１の 次の溶液：　ＩＭ　ＭｇＣＩｇ　、２００ＩＩＩＭＣｕＳＯ＋　、　２０ｍＭ１ ．　Ｉ　Ｏ−フェナントロリン及び７．５％Ｈｚ０２（３ｏ％貯蔵液から新たに 希釈した）を加えた。０．０５ｍｌの５８ｍＭ３−メルカプトプロピオン酸を加 えて、反応を開始した。ＤＮＡの消化を３７℃で３０分又は６０分間進めた。０ ．０５＋ｎｌの１．５Ｍ２．９−ジメチルーエ、１０−フェナントロリンを加え て、反応を停止した。クルーズトリパノゾーマキネトプラストＤＮＡを含むＧＥ Ｂ溶解物の場合、３７℃で６０分間消化を行い、一定分量を１０分毎に取り出し た。２．９−ジメチル−１，１０−フェナントロリンを加えて、反応を失活させ た。それらの分量をフェノール／クロロホルム（１：　１）で除タンパクし、エ タノールで沈降させた。ＤＮＡをグリオキサル／ＤＭＳＯで変性し、ＤＮＡをＮ ｙｔｒａｎフィルター１こ移した（Ｓｃｈｕｅｌｌ　ａｎｄ　５ｃｈｕｓｔｅｒ 、Ｋｅｅｎｅ、ＮｅｗＨａｍｐｓｈｉｒｅ）。全クルーズトリパノゾーマキネト ブラストＤＮＡを”Ｐ−ＡＴＰでニックトランスレーソヨンを行い、ハイブリッ ド形成プローブとして用いた。二に引用する。

トリス−ＥＤＴＡバッファー（ＩＯＩｒＩＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，０，１ｍ ＭＥＤＴＡ）中精製りルーズトリパノゾーマキネトプラストＤＮＡの切断の程度 を１％アガロースゲルによるアガロースゲル電気泳動で消化時間の関数としてモ ニターした（図２）。図２において、Ｍレーンはサイズマーカーとしてのバクテ リオファージλＤＮＡの）Ｉｉｎｄｌｌ＋断片及びバクテリオファージφＸ１７ ４ＲＦＤＮＡのＨａｅｌｌｌ断片を示す。時間の関数として、ウェルからｋＤＮ Ａの消失及び１．４ｋｂ直鎖状ミニサークルバンドの出現が見られれる。１０分 のインキュベーションの後、ＤＮＡがミニサークルに完全に切断された。

消化されない連結キネドブラストＤＮＡは、その大きなサイズの結果として、ゲ ルに入ることが不可能なために、ウェルに残った。１分の消化後、連結キネドブ ラストＤＮＡをウェル内に検出することができず、遊離した直鎖状ミニサークル ＤＮＡが１．４ｋｂバンドとして移動した（図２）。消化を続けると、ミニサー クルに対して複数の切断によって得られる低分子量スミア−が出現した。しかし ながら、反応は２，９−ジメチル−１，ｌ　Ｏ−フェナントロリンのような銅キ レート剤を加える任意の点で終結させることができた。

連結ネットワークから遊離した二重ミニサークルＤＮＡ断片が過度の一本鎖ニツ クを含む場合には、ＤＮＡはＰＣＲ増幅に適切な基質とはならない。変性の際、 −末鎖断片のサイズは、満足な増幅を得るために２種類のＰＣＲプライマーの間 の距離と少なくとも等しくなければならない。上記のように、ＤＮＡをＧＥＢ溶 解物中フェナントロリン−鋼化学ヌクレアーゼを用いて増加時間で切断し、切断 ＤＮＡを変性グリオキサルゲルで電気泳動して一本鎖断片のサイズ分布をめた。

ゲルをナイロン膜にプロットし、！２ｐ標識クルーズトリパノゾーマキネトプラ ス）ＤＮＡ　（ｋＤＮＡ）を用いてハイブリッド形成した。０時に、複製を行う わずかな連結ミニサークルがゲル内に１．４ｋｂバンドとして見ることができる 。切断後、ミニサークルが二本鎖直鎖状分子としてｋＤＮＡネットワークから遊 離した。直鎖状ミニサークルを変性することにより、消化時間の関数としてミニ サークルを著しく単鎖切断したことが見られる。図３は、インキュベーション時 間の増加に伴って単鎖切断による一本鎖断片のサイズが減少したことを示してい る。しがしながら、３０分後、ミニサークル断片の９０％が３１０塩基より大き がった。

６０分後、断片の５０％が３１０塩基より大きく、断片の８０％が１１８塩基よ り大きかった。血液溶解物の通常のフェナントロリン−銅消化の場合、３０分の インキュベーション時間を用いると、−末鎖断片の約９０％が３１０塩基より長 く、８３ｂｐ、１２２ｂｐ及び３３０ｂｐ（７）産物を生じる３組のＰｃＲプラ イマーに適切な増幅標的分子となった（上記、Ｓｔｕｒｍ等）。対照実験は、Ｇ ＥＢ溶解物中フェナントロリン−銅試薬を用いて標準条件下３０分間消化したキ ネドブラストＤＮＡがＰＣＲ増幅に適切な鋳型であることを示した。

クルーズトリパノゾーマのＧＥＢ溶解物をフェナントロリン−銅（ＯＰ−Ｃｕ” ）で３０分間消化し且つ反応を上記のように失活させた後、ミニサークル分子の 減少数（ＤＮＡ濃度から算出した）を含む５００μｌ量を取り出した。各５００ μｚ量を１００μｍのフェノール／クロロポルム（１：　Ｉ）で１回抽出した。

水相を４０μｇのグリコーゲン（２μｍの２０ｍｇ／ｍｌ貯蔵液）及び５０μｌ の３ＭＮａ０Ａｃを含むエッペンドルフ管に移した。ｌ＋＋＋Ｉのエタノールを 加え、ミクロ遠心機で管を２０分間攪拌することにより、ＤＮＡを室温で沈降さ せた。

沈降物を１ｍｌの水に再浮遊し、１ｍｌの水を含むＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（００ミ クロコンセントレータ−（Ａｉｉｃｏｎ）に移した。ミクロコンセントレータ一 単位を臨床検査用遠心機でｌ　０００ｘｇで１０分間遠心した。保持液を２ｍｌ の水で２回目を洗浄した。

２回目の１０分の遠心後、ミクロコンセントレータ−の製品に記述されているよ うに、１００μｌの濃縮保持液を集めた。この保持液を下記のＰＣＲ増幅に用い た。

７０μｌの保持物質を１００μｌのＰＣＲ反応で増幅した。反応条件は、次のよ うにした：１０ｒＦＭトリスーＨＣ１，ｐＨ８，３，５０ｍＫ（１，５ｍｌＪＭ 　ｇ　Ｃｌ　ｔ、Ｑ、　ｌ＋ｎｇ／ｎｌ　ＢＳＡ、　３単位のＴａｑＤＮＡポリ メラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）及び１００ピコモルの各プ ライマー。使用したプライマーは、Ｓｔｕｒｍ等、　Ｍｏｌ。

Ｂ　１ｏｃｈｅａ　Ｐａｒａｓ　ｉ　ｔｏ　１．３３　：　２０５（１９８９） 及びＡｖｒ　Ｉａ等、　Ｍｏ１．ＢｉｏｃｈｅｉＰａｒａｓ奄狽盾戟A４２：１ ７５ （１９９０）に記載されているように、３３０ｂｐのミニサークル可変部及び保 存領域ＤＮＡフラグメント及び８３ｂｐ及び１２２ｂｐの各保存領域フラグメン トを生じるクルーズトリパノゾーマミニサークル内の４個の保存領域に特異的な ３組のプライマーとし、両文献を参考として本明細書に引用する。２６塩基プラ イマー５３３Ａと２６塩基プライマー５３４Ａの組合わせは、８３ｂｐ保存領域 フラグメントの作成をもたらした。５３４Ａと２６塩基プライマーＳ６７の組合 わせは、１２２ｂｐ保存領域フラグメントの作成をもたらした。２６塩基プライ マー８３５と２１塩基プライマー５３６の組合わせは、３３０ｂｐ可変部フラグ メントの作成をもたらした（上記５ｔｕｒ＋＋＋等）。これらのプライマーは、 Ａｍａｃ、　Ｉｎｃ、　。

ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、　Ｍａｉｎｅでシーンセットとして市販されている。サイ クリングプロファイルは次のようにした：変性、アニーリング及び伸長は各々９ ４℃、６０℃及び７２℃とした；各段階を合計３０サイクルとして１分間進めた 。各反応から１５ｔｔＮｌをアガロース／Ｎｕｓｉｅｖｅ（ＦＭＣ，ＲｏｃｋＩ ａｎｄ、　Ｍａｉｎｅ）ゲルで分析した。

ＰＣＲ＝ミニサークルＤＮＡアッセイの感受性をめるために、２ｏクルーズトリ パノゾーマキネトブラストＤＮＡ連結ネツトワ−−りの等価物を１０ｍ１のＧＥ Ｂ溶解物に加えた。″ネットワークＤＮＡを実施例２で記載したようにフェナン トロリンー銅で切断した。切断後、ＧＥＢ溶解物をキネドブラストＤＮＡを含ま ないＧＥＢ溶解物で希釈して５００μｌのＧＥＢ溶解物の場合１〜１０．０００ ミニサークルのＤＮＡ濃縮物を得た。全ＤＮＡを実施例３で記載したようにこれ らの分量から単離し、ＰＣＲ増幅に供した；各ＰＣＲ反応物のＩ／６をゲルに装 填した。すべての場合において、Ｍレーンはサイズマーカーとしてバタテリオフ ァージφＸ１７４ＲＦＤＮＡのＨａ　ｅ　ＩＩＩ断片を示す。ある場合には、実 施例２で記載したようにゲルをプロットした後、放射性的に標識したプローブで ハイブリッド形成することによって得られた結果を示している。

図４Ａは、３５ＰＣＲサイクルを用いて８３ｂｐ断片を増幅することによって得 られた結果を示している；産物を２％アガロース／３％Ｎｕｓｉｅｖｅゲルによ る電気泳動にかけた。すべてのレーンに有する急速に移動するバンドは、ＰＣＲ プライマー又はプライマー二量体を表す。

図４Ｂは、３０ＰＣＲサイクルを用いて１２２ｂｐ断片を増幅することによって 得られた結果を示している；産物を１％アガロース／３％Ｎｕｓｉｅｖｅゲルに よる電気泳動にかけた。上のパネルは染色ゲルを示す、すべてのレーンに有する 低分子量はＰＣＲプライマーを表す。下のパネルは２ｔｐ標識５３４Ａオリゴヌ クレオチド内部プローブによるプロットのハイブリッド形成を示している（上記 、５ｔｕｒｒｎ等）。

図４０は、３０ＰＣＲサイクルを用いて３３０ｂｐ可変部及び保存領域フラグメ ントを増幅することによって得られた結果を示している：産物を１％アガロース ／３％Ｎｕｓｉｅｖｅゲルによる電気泳動にかけた。上のパネルは染色ゲルを示 す。

下のパネルは１２Ｐ標識Ｓ６７オリゴヌクレオチド内部プローブによるプロット のハイブリッド形成によって得られた結果を示している（上記、Ｓｔｕｒｍ等； Ａｖｉｌａ等。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐａｒａｓｉ　ｔｏｌ、４２：１７５（１９’ＪＯ ））。Ｃ１及びＣ２レーンは、３０ｍ１当たり１０ｋＤＮＡネツトワークを含む ５００μｌの消化されないＧＥＢ溶解物試料を、他のすべての試料で記載したＰ ＣＲ増幅のために処理したものを示している。

図４の電気泳動パターンで示されるように、５００μｍのＧＥＢ溶解物中少中央 とも１００ミニサークルを臭化エチジウム染色（８３ｂｐＰＣＲ産物）あるいは ３２ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブに対するハイブリッド形成（１２２ｂｐ 及び３３０ｂｐＰＣＲ産物）により検出した。従って、本方法は５００μｌのフ ェナントロリン−銅消化ＧＥＢ溶解物中１％のミニサークル含量のクルーズトリ パノゾーマ単細胞の等価物を検出する。これらの結果は、本方法が２０ｍ１の血 液においてクルーズトリパノゾーマ単細胞を検出するのに用いることができるこ とを示している。

心臓障害を示すエクアドルの４９才の女性患者は、２種類の血清学的試験におい てクルーズトリパノゾーマに陽性であったー外因診断法は陰性であった。血清学 的試験は補体結合（Ｓｏｍｍｅｒｗｉｒｔｈ、ＪａｒｅＬｔ、Ｇｒａｄｗｏｈ［ ’ｓ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｄｉ ａｇｎｏｓｔｓ（Ｃ，Ｖ、　Ｍｏ５ｂｙ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　１９８０） ）及びＥ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ（fｏｌｄｓｍｉ　ｔｈ 患者に加えた。第２．３．４及び５若虫及び成虫期を用いた。約１／３の半翅虫 を加え、排便スポットが患者に見られた。半翅虫を加えた３ｏ及び６０日後の顕 微鏡試験は、クルーズトリパノゾーマを示さなかった。

患者から１０１！ＩＪ試料の静脈血を採血し、ＧＥＢ溶解物として保存した。溶 解物のフェナントロリン−銅切断を行い、２つの５００ｍ１量からＤＮＡを単離 し、上記実施例２〜４で記載したようにＰＣＲ増幅した。

図５は、異なった２組のＰＣＲプライマーを用いた患者の血液のクルーズトリパ ノゾーマミニサークル配列の特異的増幅を示すものである。図５Ａはａａｂｐ断 片の増幅を示す：産物を１％アガロース／３％Ｎｕｓｉｅｖｅゲルで分析する。

レーンｌの陰性対照は、非シャガスドナーのＧＥＢ試料である。レーン２の陰性 対照は、ＰＣＲ反応においてｋＤＮＡを含まない試料である。Ｍレーンは、サイ ズマーカーとしてφＸｌ　７４ＲＦＤＮＡのＤＮＡＨａｅｌｌｌ断片を示す。図 ５Ｂは、２％アガロースゲルにかけ、プロットし、１２Ｐ標識Ｓ６７オリゴヌク レオチド内部プローブを用いてハイブリッド形成した３３０ｂｐ可変部及び保存 領域フラグメントの増幅を示すものである（上記５ｔｕｒ＋ｏ等、上記Ａｖｉｌ ａ等）。陽性対照は、１１００ｆゲル単離０Ｐ−Ｃｕ”−切断ｋＤＮＡである； 陰性対照は（Ａ）と同じである。

更に、４人の血清学的に陽性の慢性のシャガス病患者の血液試料（３人の患者は 外因診断陰性であり、１人は外因診断陽性であった）も、実施例１−４の標準方 法を用いたミニサークルＤＮＡのＰＣＲ増幅によるクルーズトリパノゾーマ寄生 虫試験が陽性であった。これらの結果は、本方法が慢性シャガス病の診断に有効 であることを示している。

ＤＮＡ保存、切断、精製及び増幅法は、昆虫媒介動物及び感染マウスの生検材料 まで広げることができる。２匹のＴ、ジミジアータ及び２匹のＲ，プロリキサス の腹部内容物を採取し、ＧＥバッファーで保存した。試料を実施例１−４で記載 したように処理した。図６は、昆虫腹部内容物のキネドブラストＤＮＡミニサー クル配列の特異的増幅を示すものである。３３０ｂｐのミニサークル可変部フラ グメントを増幅した。ＰＣＲ反応は全容量１００μｍを有した：１５μＩを２％ アガロースゲルに充填した。ＭレーンはサイズマーカーとしてのφＸ１７４ＲＦ ＤＮＡのＤＮＡＨａｅｌｌ＋断片を示す。陽性及び陰性対照は、ＰＣＲ反応にお いて各々ｌｐｇｋＤＮＡ及びｋＤＮＡなしである。

動物生検材料もまた、ＧＥに溶解及び保存した。感染及び非感染マウスから得ら れた小組織を食塩水で洗浄し、ＧＥバッファーで保存した。組織を時々激しく混 合しながらＧＥ中３７℃で２日間インキュベートして溶解した。溶解した組織を 実施例１−４で記載したように処理した。ミニサークル配列の特異的ＰＣＲ増幅 が感染マウスの小組織溶解物から見られたが、非感染対照からは見られなかった 。これらの結果は、本方法がシャガス病を検出する剖検材料に用いることができ ることを示している。

発明の利点 本発明の方法は、細菌、寄生虫及びウィルス性疾患の診断において種々の適用の 可能性がある。野外、病院及び保存条件が最適でない他の状態において、患者か ら材料を採取するのに特に有効である。クルーズトリパノゾーマ、シャガス病の 病原体のようなキネトブラスチドトリパノゾーマによる寄生虫症の診断に特に適 応される。これは、この病原体の連結キネドブラストミニサークルＤＮＡの特徴 がＰＣＨのような配列特定プライマー増幅手法により増幅に適切なサイズの直鎖 状断片に効率よく切断されるためである。本発明の方法は、少量の感染因子に特 異的なりＮＡを検出するのに実施が簡便であり、迅速であり、極めて効果的であ る。更に、感染因子を含む生物試料の感染力を、本発明の適用により低下させる 。

本発明を好ましいある特定の説明としてかなり詳細に記載してきたが、本発明の 真意及び範囲を逸脱することなく、上記で示した本発明の他の説明、修正及び変 更を行ってもよい。従って、本発明は添付の請求の範囲によってのみ制限される 。

ミニサークル数 ミニサークル数 フロントページの続き （７２）発明者　アーヴイラ　バーパートアメリカ合衆国　カリフォルニア州 ９００４９　ロサンゼルス　ノース　ケンターアベニュー　２２７

Claims (37)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡ含有構造を有する生物試料から生物学的に活性なＤＮＡを単離する方 法であって： （ａ）ＤＮＡ含有構造を含む生物試料を試料中のＤＮＡ含有構造を溶解するのに 十分な非両親媒性カオトロピック塩及びＤＡＮを分解させずに保存するキレート 剤を含む溶解保存バッファーと接触させて生物試料及び溶解保存バッファーの混 合液を作り； （ｂ）段階（ａ）で作った混合液をＤＮＡを切断する金属含有化学ヌクレアーゼ とインキュベートしてＤＮＡ断片を形成し；（ｃ）ＤＮＡ断片を精製する； ことを含む方法。
2. ２．ＤＮＡ含有構造内のＤＮＡが連結閉環状として存在する請求項１記載の方法 。
3. ３．ＤＮＡが寄生虫と関連したＤＮＡである請求項２記載の方法。
4. ４．寄生虫がキネトプラスト寄生虫である請求項３記載の方法。
5. ５．寄生虫がクルーズトリパノソーマである請求項４記載の方法。
6. ６．化学ヌクレアーゼが１，１０−フェナントロリン−銅複合体、ＥＤＴＡ第一 鉄の誘導体、金属ポルフィリン及び４，７−ジフェニル−１，１０−フェナント ロリンの八面体金属複合体からなる群より選ばれる請求項１記載の方法。
7. ７．化学ヌクレアーゼが１，１０−フェナントロリン−銅複合体である請求項６ 記載の方法。
8. ８．ヌクレアーゼの切断を該ＤＮＡ断片のサイズを制御する銅キレート剤によっ て停止させる請求項７記載の方法。
9. ９．生物試料が哺乳動物血液である請求項１記載の方法。
10. １０．哺乳動物血液がヒト血液である請求項９記載の方法。
11. １１．非両親媒性カオトロピック塩が塩化グアニジニウム及びチオシアン酸グア ニジニウムからなる群より選ばれたグアニジニウム塩である請求項１記載の方法 。
12. １２．グアニジニウム塩が塩化グアニジニウムである請求項１１記載の方法。
13. １３．塩化グアニジニウムを生物試料及び溶解保存バッファーの混合液中少なく とも約３モルの濃度で存在させる請求項１２記載の方法。
14. １４．キレート剤がＥＤＴＡである請求項１記載の方法。
15. １５．ＥＤＴＡを生物試料及び溶解保存バッファーの混合液中少なくとも約０． １モルの濃度で存在させる請求項１４記載の方法。
16. １６．（ｄ）ＤＮＡ断片に対してハイブリッド形成する少なくとも２種類のプラ イマーを用いる配列特定法によってＤＮＡを増幅する段階を更に含む請求項１記 載の方法。
17. １７．（ｅ）ＤＮＡを同定することによる増幅に供したＤＮＡの病原体内存在と 関連した疾患を検出する 段階を更に含む請求項１６記載の方法。
18. １８．ＤＮＡがＤＮＡハイブリッド形成を用いて同定される請求項１７記載の方 法。
19. １９．ＤＮＡが生物試料から単離された病原体の遺伝標識をコードする請求項１ 記載の方法。
20. ２０．ＤＮＡがウイルスと関連している請求項１記載の方法。
21. ２１．キネトブラスチド寄生虫による疾患の検出方法であって：（ａ）キネトプ ラスチド寄生虫による疾患に罹っていることが疑われる患者からの生物試料を試 料中の細胞を溶解するのに十分な非両親媒性カオトロピック塩及び細胞内のＤＡ Ｎを分解させずに保存するキレート剤を含む溶解保存バッファーと接触させて生 物試料及び溶解保存バッファーの混合液を作り；（ｂ）段階（ａ）で得られた混 合液を連結閉環状キネトブラストＤＮＡを直鎖状にする金属含有化学ヌクレアー ゼとインキュベートしてキネトブラストＤＮＡ断片を形成し； （ｃ）ＤＮＡ断片を精製して増幅に適切な精製キネトプラストＤＮＡ断片を形成 し； （ｄ）直鎖状ＤＮＡに対してハイブリッド形成することができる少なくとも２種 類のプライマーを用いる配列特定法により、精製キネトプラストＤＮＡ断片を増 幅し； （ｅ）プライマーに対応するので寄生虫のキネトプラストＤＮＡに特異的な配列 を有する増幅キネトプラストＤＮＡの存在を同定することにより、疾患を検出す る； 段階を含む方法。
22. ２２．生物試料が哺乳動物血液である請求項２１記載の方法。
23. ２３．哺乳動物血液がヒト血液である請求項２２記載の方法。
24. ２４．非両親媒性カオトロピック塩が塩化グアニジニウム及びチオシアン酸グア ニジニウムからなる群より選ばれたグアニジニウム塩である請求項２１記載の方 法。
25. ２５．グアニジニウム塩が塩化グアニジニウムである請求項２４記載の方法。
26. ２６．キレート剤がＥＤＴＡである請求項２１記載の方法。
27. ２７．化学ヌクレアーゼが１，１０−フェナントロリン−銅複合体、ＥＤＴＡ第 一鉄の誘導体、金属ポルフィリン及び４，７−ジフェニル−１，１０−フェナン トロリンの八面体金属複合体からなる群より選ばれる請求項２１記載の方法。
28. ２８．化学ヌクレアーゼが１，１０−フェナントロリン−銅複合体である請求項 ２７記載の方法。
29. ２９．キネトプラスチド寄生虫がクルーズトリパノソーマである請求項２１記載 の方法。
30. ３０．プライマーがクルーズトリパノソーマキネトプラストミニサークルＤＮＡ 内の保存領域に対してハイブリッド形成する請求項２１記載の方法。
31. ３１．ＤＮＡを細胞含有生物試料から単離及び保存する方法であって：（ａ）Ｄ ＮＡを細胞から遊離させるために、細胞に存在するＤＮＡを含む生物試料を溶解 保存バッファーと接触させ、溶解保存バッファーが：（ｉ）溶解バッファーが生 物試料と接触する際に生物試料中の細胞を溶解するのに十分な非両親媒性カオト ロピック塩の濃縮物；及び（ｉｉ）溶解バッファーが生物試料と接触する際にＤ ＮＡを分解せずに保存するのに十分なキレート剤の濃縮物： を含み； （ｂ）遊離したＤＮＡを混合液中約６５℃以下の温度で保存する；段階を含む方 法。
32. ３２．非両親媒性カオトロピック塩が生物試料及び溶解保存バッファーの混合液 中少なくとも約３モルの濃度で存在させる塩化グアニジニウムであり、キレート 剤が生物試料及び溶解保存バッファーの混合液中少なくとも約０．１モルの濃度 で存在させるＥＤＴＡである請求項３１記載の方法。
33. ３３．ＤＮＡを少なくとも約１年間保存するために、保存温度が約４℃以下であ る請求項３１記載の方法。
34. ３４．ＤＮＡが連結閉環状として細胞内に存在する請求項３１記載の方法。
35. ３５．キネトプラスチド寄生虫クルーズトリパノソーマによる疾患の検出方法で あって： （ａ）クルーズトリパノソーマ由来のキネトプラスチドＤＮＡを含んでいること が疑われる哺乳動物血液試料を６モルの塩化グアニジニウム及び０．２モルのＥ ＤＴＡ，ｐＨ８．０を含むほぼ同量の溶解保存バッファーと混合して混合液を作 り、この混合液を室温で少なくとも２４時間保存し；（ｂ）段階（ａ）で得られ た混合液をキネトプラストＤＮＡを切断する化学ヌクレアーゼ１，１０−フェナ ントロリン−銅複合体とインキュベートして直鎖状キネトプラストＤＮＡを形成 し； （ｃ）（ｉ）フェノールークロロホルム混合液で除タンパクし；（ｉｉ）グリコ ーゲンキャリヤとエタノール沈降させ；（ｉｉｉ）ミクロコンセントレーターで ろ過する；ことにより、直鎖状キネトプラストＤＮＡを精製して精製直鎖状キネ トプラストＤＮＡを形成し； （ｄ）クルーズトリパノソーマの連結閉環状キネトプラストＤＮＡの保存領域に 対してハイブリッド形成することができる少なくとも２種類のプライマーを用い る配列特定法により、精製直鎖状キネトプラストＤＮＡを増幅し；（ｅ）プライ マーに対応するのでプライマーに対するハイブリッド形成によってクルーズトリ パノソーマの連結閉環状キネトブラストＤＮＡに特異的な配列を有する増幅ＤＮ Ａの存在を同定することにより、クルーズトリパノソーマによる疾患を検出する ； 段階を含む方法。
36. ３６．直鎖状ＤＮＡが長さ約１〜約１．５ｋｂの断片を含む請求項３５記載の方 法。
37. ３７．配列特定増幅法がポリメラーゼ連鎖反応法である請求項３４記載の方法。