JPH08275799A - リーシュマニアの検出用ポリヌクレオチド及びリーシュマニア原虫の検出方法 - Google Patents
リーシュマニアの検出用ポリヌクレオチド及びリーシュマニア原虫の検出方法Info
- Publication number
- JPH08275799A JPH08275799A JP7079087A JP7908795A JPH08275799A JP H08275799 A JPH08275799 A JP H08275799A JP 7079087 A JP7079087 A JP 7079087A JP 7908795 A JP7908795 A JP 7908795A JP H08275799 A JPH08275799 A JP H08275799A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polynucleotide
- dna
- leishmania
- base sequence
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、リーシュマニア感染の有無および
種の同定を確実かつ迅速に、さらに大規模に判定可能と
する方法を提供することにある。 【構成】 ７種のリーシュマニアに共通の特異的なＤＮ
Ａを検索し、単離し、塩基配列を同定し、さらに該ＤＮ
Ａを増幅可能な検出用プローブとしてのポリヌクレオチ
ドを選択合成することにより、被検体のリーシュマニア
感染の有無、および種類を判断する。
種の同定を確実かつ迅速に、さらに大規模に判定可能と
する方法を提供することにある。 【構成】 ７種のリーシュマニアに共通の特異的なＤＮ
Ａを検索し、単離し、塩基配列を同定し、さらに該ＤＮ
Ａを増幅可能な検出用プローブとしてのポリヌクレオチ
ドを選択合成することにより、被検体のリーシュマニア
感染の有無、および種類を判断する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はリーシュマニア原虫に特
異的なＤＮＡ及び該ＤＮＡを利用してリーシュマニア原
虫を検索する方法に関するものである。
異的なＤＮＡ及び該ＤＮＡを利用してリーシュマニア原
虫を検索する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】リーシュマニア症は、 Leishmania 属の
原虫の感染によって引き起こされる疾患であり（例え
ば、医科学大辞典 ４９、ENCYCLOPEDIA OF MEDICAL SC
IENCES,1993, ４月発行、講談社）、世界で 1,200万人
以上の患者がいると推定されており、ＷＨＯの重要指定
疾患の１つに挙げられている。
原虫の感染によって引き起こされる疾患であり（例え
ば、医科学大辞典 ４９、ENCYCLOPEDIA OF MEDICAL SC
IENCES,1993, ４月発行、講談社）、世界で 1,200万人
以上の患者がいると推定されており、ＷＨＯの重要指定
疾患の１つに挙げられている。
【０００３】このリーシュマニア原虫は形態的には、ア
マスティゴート型とプロマスティゴート型の２型をとる
が、これらの原虫は適当な培地に移植されるとすべてプ
ロマスティゴート型となって増殖することが知られてい
る。
マスティゴート型とプロマスティゴート型の２型をとる
が、これらの原虫は適当な培地に移植されるとすべてプ
ロマスティゴート型となって増殖することが知られてい
る。
【０００４】さらにヒトに感染する種類は従来からドノ
バンリーシュマニア、熱帯リーシュマニアおよびブラジ
ルリーシュマニアの３種が知られている。
バンリーシュマニア、熱帯リーシュマニアおよびブラジ
ルリーシュマニアの３種が知られている。
【０００５】しかしながら、これら３種は形態的にはま
ったく区別がつけられなかったが、近年免疫学、生化学
的手法によりこれらの種には亜種や変種が存在すること
が明かとなってきた。
ったく区別がつけられなかったが、近年免疫学、生化学
的手法によりこれらの種には亜種や変種が存在すること
が明かとなってきた。
【０００６】この病原体の検出方法としては、直接原虫
を検出する方法と、免疫反応その他により間接的に原虫
の感染を推定する方法等が行われている。
を検出する方法と、免疫反応その他により間接的に原虫
の感染を推定する方法等が行われている。
【０００７】このうち、直接検出する方法は確実ではあ
るが、時間および操作の煩雑さなどから短時間で大規模
に実施することは困難である。
るが、時間および操作の煩雑さなどから短時間で大規模
に実施することは困難である。
【０００８】また間接的な検出方法としては、 Chopra
のアンチモン反応、Napierのアルデヒド反応、Branchar
i のユーグロブリン反応等が知られている。
のアンチモン反応、Napierのアルデヒド反応、Branchar
i のユーグロブリン反応等が知られている。
【０００９】さらに免疫学的方法としては、補体結合反
応、間接赤血球凝集反応、間接免疫蛍光法が知られてい
る。
応、間接赤血球凝集反応、間接免疫蛍光法が知られてい
る。
【００１０】また、最終的な種の同定には、免疫反応と
ともに、培養原虫を用いて Adler'stest,キネトプラス
トＤＮＡの Buoyant-Densityの測定、各種アイソザイム
isozymeの分析などによって行われている。
ともに、培養原虫を用いて Adler'stest,キネトプラス
トＤＮＡの Buoyant-Densityの測定、各種アイソザイム
isozymeの分析などによって行われている。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】以上まとめた従来のリ
ーシュマニア原虫のいくつかの検出方法は、精度、感
度、作業性等の点で実用的ではなく、そのためリーシュ
マニア感染を防ぐ有力な手段である集団検診には使用で
きないという問題点があった。
ーシュマニア原虫のいくつかの検出方法は、精度、感
度、作業性等の点で実用的ではなく、そのためリーシュ
マニア感染を防ぐ有力な手段である集団検診には使用で
きないという問題点があった。
【００１２】さらに最終的な種の同定は、特に感染後の
治療法の選択または確立にとって重要であるにもかかわ
らず、実用的に使用可能な同定方法はいまだ確立されて
いないという問題があった。
治療法の選択または確立にとって重要であるにもかかわ
らず、実用的に使用可能な同定方法はいまだ確立されて
いないという問題があった。
【００１３】本発明の目的は以上の問題点に鑑み、リー
シュマニア感染の有無および種の同定が、確実に、迅速
に、かつ大規模に判定可能である方法を提供することに
ある。
シュマニア感染の有無および種の同定が、確実に、迅速
に、かつ大規模に判定可能である方法を提供することに
ある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、各種のリーシ
ュマニアに特異的なＤＮＡを検索して単離し、塩基配列
を同定し、さらに該ＤＮＡを遺伝子増幅可能とする検出
用プローブを用いることで、被検体中のリーシュマニア
感染の有無、および種類を判断する手法を提供するもの
である。
ュマニアに特異的なＤＮＡを検索して単離し、塩基配列
を同定し、さらに該ＤＮＡを遺伝子増幅可能とする検出
用プローブを用いることで、被検体中のリーシュマニア
感染の有無、および種類を判断する手法を提供するもの
である。
【００１５】さらに詳しくは、本発明は、分子中に少な
くとも、 CTGTGTTAAT CTCAGTCGTC CTTCTCTTCT CTTCTGACTG GCTCGGCGCT CGGTACCGCT TCTCGTTTCG CTTTGAACGG GAGAGCGGAG GAGAACGAGG AGGTGGGCGT ATCTGCTGAT GAGAGCGGTC GGATCTGCAT GCATCACCGG TCCCTCGGAT GCACACACAT ACACACACAC TCGGCCCGCA GTCCCTCGCT TTGTGCCGCC TTTTTTCTTG TCTTGCCTTA CGCCATGTAC TGCGACCACC CACACACACA CAC の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチドに
関するものである。
くとも、 CTGTGTTAAT CTCAGTCGTC CTTCTCTTCT CTTCTGACTG GCTCGGCGCT CGGTACCGCT TCTCGTTTCG CTTTGAACGG GAGAGCGGAG GAGAACGAGG AGGTGGGCGT ATCTGCTGAT GAGAGCGGTC GGATCTGCAT GCATCACCGG TCCCTCGGAT GCACACACAT ACACACACAC TCGGCCCGCA GTCCCTCGCT TTGTGCCGCC TTTTTTCTTG TCTTGCCTTA CGCCATGTAC TGCGACCACC CACACACACA CAC の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチドに
関するものである。
【００１６】また、本発明は、分子中に少なくとも、上
記の塩基配列であるポリヌクレオチドとハイブリダイズ
する塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド
に係るものである。
記の塩基配列であるポリヌクレオチドとハイブリダイズ
する塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド
に係るものである。
【００１７】さらに、本発明は、分子中に少なくとも、
上記塩基配列と相補的な塩基配列であるポリヌクレオチ
ドとハイブリダイズする塩基配列を含むことを特徴とす
るポリヌクレオチドに関するものである。
上記塩基配列と相補的な塩基配列であるポリヌクレオチ
ドとハイブリダイズする塩基配列を含むことを特徴とす
るポリヌクレオチドに関するものである。
【００１８】また、本発明は、上記３種類の塩基配列か
ら選ばれる連続した少なくとも１５の塩基からなるポリ
ヌクレオチドまたは相補的ポリヌクレオチドに係るもの
である。
ら選ばれる連続した少なくとも１５の塩基からなるポリ
ヌクレオチドまたは相補的ポリヌクレオチドに係るもの
である。
【００１９】さらに、本発明は、塩基配列が、CTGACTGG
CT CGGCGCTCGG TAC であるポリヌクレオチドに係るもの
である。
CT CGGCGCTCGG TAC であるポリヌクレオチドに係るもの
である。
【００２０】また本発明は、塩基配列が、GGTCGCAGAA C
ATGGCGTAA GGであるポリヌクレオチドに係るものであ
る。
ATGGCGTAA GGであるポリヌクレオチドに係るものであ
る。
【００２１】さらに本発明は、分子中に少なくとも、 GTTCATGCAC GCCACTACTT GCAAGGGTCA CTCGGCATTT TGCGAGGATA AAGGGAAAGA GTTGACATTG CGGCGGAGGT TAGACATGCA AGTCAGGGCA CGGATGTGCG CCATCTCGTA CCCTG の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチドに
係るものである。
係るものである。
【００２２】また本発明は、分子中に少なくとも、上の
塩基配列であるポリヌクレオチドとハイブリダイズする
塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチドに関
するものである。
塩基配列であるポリヌクレオチドとハイブリダイズする
塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチドに関
するものである。
【００２３】さらに、本発明は、分子中に少なくとも、
上記に記載の塩基配列と相補的な塩基配列であるポリヌ
クレオチドとハイブリダイズする塩基配列を含むことを
特徴とするポリヌクレオチドに係るものである。
上記に記載の塩基配列と相補的な塩基配列であるポリヌ
クレオチドとハイブリダイズする塩基配列を含むことを
特徴とするポリヌクレオチドに係るものである。
【００２４】さらに本発明は、上記３種類のいずれかに
記載の塩基配列から選ばれる連続した少なくとも１５の
塩基からなるポリヌクレオチドまたは相補的ポリヌクレ
オチドに係るものである。
記載の塩基配列から選ばれる連続した少なくとも１５の
塩基からなるポリヌクレオチドまたは相補的ポリヌクレ
オチドに係るものである。
【００２５】また本発明は、塩基配列が、GTTCATGCAC G
CCACTACTT GCAAGGであるポリヌクレオチドに係るもので
ある。
CCACTACTT GCAAGGであるポリヌクレオチドに係るもので
ある。
【００２６】さらに本発明は、塩基配列が、CAGGGTACGA
GATGGCGCAC ATCCであるポリヌクレオチドに係るもので
ある。
GATGGCGCAC ATCCであるポリヌクレオチドに係るもので
ある。
【００２７】また本発明は、被検体に含有されるリーシ
ュマニア原虫由来のＤＮＡを鋳型とした遺伝子増幅反応
により増幅したリーシュマニア原虫由来のＤＮＡまたは
該ＤＮＡ由来のポリヌクレオチドを検出することによ
り、被検体中のリーシュマニア原虫由来のＤＮＡまたは
該ＤＮＡ由来のポリヌクレオチドを検出する方法に係る
ものである。
ュマニア原虫由来のＤＮＡを鋳型とした遺伝子増幅反応
により増幅したリーシュマニア原虫由来のＤＮＡまたは
該ＤＮＡ由来のポリヌクレオチドを検出することによ
り、被検体中のリーシュマニア原虫由来のＤＮＡまたは
該ＤＮＡ由来のポリヌクレオチドを検出する方法に係る
ものである。
【００２８】以下本発明をさらに詳しく説明する。
【００２９】（リーシュマニア原虫、種類、培養）本発
明に係るリーシュマニア原虫の種類は以下の７種類であ
る。
明に係るリーシュマニア原虫の種類は以下の７種類であ
る。
【００３０】 L. braziliensis panamensis (MHOM/PA/71/LS94) L. braziliensis braziliensis (MHOM/BR/75/M2904) L. braziliensis guyanensis (MHOM/BR/75/M4147) L. mexicana mexicana (MNYC/BZ/62/M379) L. mexicana aristedesi (MORY/PA/68/GML3) L. mexicana amazonensis (MHOM/BR/73/M2269) L. major (MHOM/SU/73/5ASKH) L. chagasi (MHOM/BR/74/PP75) （遺伝子（ＤＮＡ）の抽出）本発明においては、これら
の原虫からＤＮＡを分離精製する方法は特に制限されな
い。フェノールクロロフォルム法を好適に使用可能であ
る。
の原虫からＤＮＡを分離精製する方法は特に制限されな
い。フェノールクロロフォルム法を好適に使用可能であ
る。
【００３１】（アービトラリプライマー遺伝子増幅反応
用プライマー（ＡＰ−ＰＣＲプライマ））本発明におい
て、リーシュマニアに共通するＤＮＡを検索するため
に、遺伝子増幅方法を使用するが、このためのアービト
ラリプライマは特に制限されない。
用プライマー（ＡＰ−ＰＣＲプライマ））本発明におい
て、リーシュマニアに共通するＤＮＡを検索するため
に、遺伝子増幅方法を使用するが、このためのアービト
ラリプライマは特に制限されない。
【００３２】例えば本発明においては、任意選択して以
下の６種類のプライマーを使用する。
下の６種類のプライマーを使用する。
【００３３】 INV-1 (5'-ACCGGAATTCTTGGCTGTTGGCACGATGAG-3') INV-2 (5'-TTGCAAGCTTTTATCTGGTTATATTGACAG-3') LS-3 (5'-AAGTGTTGATACCCACTTTGT-3') LS-2 (5'-CAATGGGTTACTGTTACAAC-3') MS2-F (5'-CCTTAGGTTCTGGTAATGAC-3') MS2-R (5'-GGGTGCAATCTCACTGGGAC-3') これら６種類のプライマは、７種類のリーシュマニア原
虫に共通のＤＮＡと、ブラジル型リーシュマニアにのみ
特異的なＤＮＡを見いだす目的に使用可能である。
虫に共通のＤＮＡと、ブラジル型リーシュマニアにのみ
特異的なＤＮＡを見いだす目的に使用可能である。
【００３４】（遺伝子増幅反応の条件の検討）遺伝子増
幅の条件はSakai 等の方法（Sakai,et.al.,Science、23
0 、1350,1985 、Sakai,et.al.,Science, 2 39 ,487,198
8)、または成書（例えばMolecular Cloning, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press,2nd ed., 1989) に準じて
検討し、設定可能である。
幅の条件はSakai 等の方法（Sakai,et.al.,Science、23
0 、1350,1985 、Sakai,et.al.,Science, 2 39 ,487,198
8)、または成書（例えばMolecular Cloning, Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press,2nd ed., 1989) に準じて
検討し、設定可能である。
【００３５】本発明においては、この条件は例えば以下
のものが好適に使用可能である。
のものが好適に使用可能である。
【００３６】ＤＮＡポリメラーゼの条件として、 （１）９４℃、５分で１サイクル （２）９４℃、１分；３７℃、１分；７２℃、１分を１
０サイクル （３）９４℃、１分；６０℃、１分；７２℃、７分を３
０サイクル （４）７２℃、７分で１サイクル （５）１５℃で保存 が好適に使用可能である。
０サイクル （３）９４℃、１分；６０℃、１分；７２℃、７分を３
０サイクル （４）７２℃、７分で１サイクル （５）１５℃で保存 が好適に使用可能である。
【００３７】（リーシュマニア原虫ＤＮＡフラグメント
の検出）遺伝子増幅反応処理後の試料は、例えばポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離分析可能
であり（例えばMolecular Cloning, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 194-196, 1982 、６、３６章) 、
各バンドの同定は例えばエチジウムブロミド染色法（例
えばMolecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, 194-196, 1982 ）にて染色することにより可
能である。
の検出）遺伝子増幅反応処理後の試料は、例えばポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分離分析可能
であり（例えばMolecular Cloning, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 194-196, 1982 、６、３６章) 、
各バンドの同定は例えばエチジウムブロミド染色法（例
えばMolecular Cloning, Cold Spring Harbor Laborato
ry Press, 194-196, 1982 ）にて染色することにより可
能である。
【００３８】電気泳動パターンに基づき増幅されたＤＮ
Ａを比較することで、リーシュマニアに共通するＤＮ
Ａ、またはリーシュマニアの特定の型に特異的なＤＮＡ
を選びだすことが可能である。
Ａを比較することで、リーシュマニアに共通するＤＮ
Ａ、またはリーシュマニアの特定の型に特異的なＤＮＡ
を選びだすことが可能である。
【００３９】例えば、本発明においては、図１に示した
ように、上記の６種類のプライマのうち、ＬＳ−３プラ
イマを使用することにより特定のバンドのＤＮＡ（Ｆ４
とする）をすべてのリーシュマニアに共通して増幅し、
さらに特定のバンドのＤＮＡ（Ｆ１０とする）をブラジ
ル型リーシュマニアに共通して増幅することが可能とな
る。
ように、上記の６種類のプライマのうち、ＬＳ−３プラ
イマを使用することにより特定のバンドのＤＮＡ（Ｆ４
とする）をすべてのリーシュマニアに共通して増幅し、
さらに特定のバンドのＤＮＡ（Ｆ１０とする）をブラジ
ル型リーシュマニアに共通して増幅することが可能とな
る。
【００４０】（リーシュマニアに特異的なＤＮＡの塩基
配列決定）リーシュマニアに特異的な上記のＦ４、およ
びＦ１０のバンドのＤＮＡの塩基配列の決定方法は、本
発明においては特に制限されず、マキシムギルバート
法、サンガー法、ＤＮＡシークエンサー等による塩基配
列決定方法が使用可能である。
配列決定）リーシュマニアに特異的な上記のＦ４、およ
びＦ１０のバンドのＤＮＡの塩基配列の決定方法は、本
発明においては特に制限されず、マキシムギルバート
法、サンガー法、ＤＮＡシークエンサー等による塩基配
列決定方法が使用可能である。
【００４１】例えばＡＢＩ製のモデル３７３ＡＤＮＡシ
ーケンサーが好適に使用可能である。
ーケンサーが好適に使用可能である。
【００４２】例えば本発明においては、上記ＡＢＩ製の
モデル３７３ＡＤＮＡシーケンサーを使用して上記の２
種類のＤＮＡ、Ｆ１０，Ｆ４の塩基配列が決定され、そ
れぞれ配列表１、２に記載の塩基配列を得る。
モデル３７３ＡＤＮＡシーケンサーを使用して上記の２
種類のＤＮＡ、Ｆ１０，Ｆ４の塩基配列が決定され、そ
れぞれ配列表１、２に記載の塩基配列を得る。
【００４３】（リーシュマニアに特異的なＤＮＡの検出
用ポリヌクレオチドの選択）被検体中のリーシュマニア
に特異的なＤＮＡを遺伝子増幅反応を利用して検出する
ための検出用ポリヌクレオチドプライマー（フォワード
プライマー、バックプライマー）は、上記の方法で決定
されたリーシュマニアに特異的なＤＮＡの塩基配列から
選ぶことが可能である。
用ポリヌクレオチドの選択）被検体中のリーシュマニア
に特異的なＤＮＡを遺伝子増幅反応を利用して検出する
ための検出用ポリヌクレオチドプライマー（フォワード
プライマー、バックプライマー）は、上記の方法で決定
されたリーシュマニアに特異的なＤＮＡの塩基配列から
選ぶことが可能である。
【００４４】例えば本発明においては、ＤＮＡバンドＦ
４の検出用として塩基配列が配列表５および配列表６に
記載のポリヌクレオチドを選択することが可能である。
４の検出用として塩基配列が配列表５および配列表６に
記載のポリヌクレオチドを選択することが可能である。
【００４５】またＤＮＡバンドＦ１０の検出用として塩
基配列が配列表２および配列表３に記載のポリヌクレオ
チドを選択することが可能である。
基配列が配列表２および配列表３に記載のポリヌクレオ
チドを選択することが可能である。
【００４６】選択されたポリヌクレオチドは、ＤＮＡ自
動合成機等の方法で一般に合成可能である。
動合成機等の方法で一般に合成可能である。
【００４７】本発明においては、ＡＢＩ社製３９２ＤＮ
Ａ／ＲＮＡ合成機を使用して可能である。
Ａ／ＲＮＡ合成機を使用して可能である。
【００４８】さらに得られたリーシュマニアに特異的な
ＤＮＡの検出用ポリヌクレオチドプライマーを用いて、
各種の遺伝子増幅反応によりリーシュマニアに特異的な
ＤＮＡを増幅することが可能となる。
ＤＮＡの検出用ポリヌクレオチドプライマーを用いて、
各種の遺伝子増幅反応によりリーシュマニアに特異的な
ＤＮＡを増幅することが可能となる。
【００４９】（遺伝子増幅反応）本発明においては、本
発明に係る検出用ポリヌクレオチド、すなわちプライマ
ーを被検体に加えることにより、被検体中に目的とする
リーシュマニア原虫が存在すればプライマーの伸張反応
に基づくリーシュマニア遺伝子を増幅することが可能で
ある。
発明に係る検出用ポリヌクレオチド、すなわちプライマ
ーを被検体に加えることにより、被検体中に目的とする
リーシュマニア原虫が存在すればプライマーの伸張反応
に基づくリーシュマニア遺伝子を増幅することが可能で
ある。
【００５０】本発明においては、遺伝子増幅の方法は特
に制限されず、一般の方法が使用可能である。
に制限されず、一般の方法が使用可能である。
【００５１】一般には、該伸張反応は、４種類のヌクレ
オチド三リン酸ｄＮＴＰ（デオキシアデノシン三リン
酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシチミジン三リ
ン酸、デオキシグアノシン三リン酸）を基質として、該
ポリヌクレオチドプライマーに結合させることにより可
能である。
オチド三リン酸ｄＮＴＰ（デオキシアデノシン三リン
酸、デオキシシチジン三リン酸、デオキシチミジン三リ
ン酸、デオキシグアノシン三リン酸）を基質として、該
ポリヌクレオチドプライマーに結合させることにより可
能である。
【００５２】さらに使用可能な酵素としては、例えば大
腸菌（Escherichia coli, E.coli）のＤＮＡポリメラー
ゼＩ、E.coliＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメ
ント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性細菌由来のＴａ
ｑポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ｐｆＵポ
リメラーゼ等が好適に使用可能である。
腸菌（Escherichia coli, E.coli）のＤＮＡポリメラー
ゼＩ、E.coliＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメ
ント、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性細菌由来のＴａ
ｑポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ｐｆＵポ
リメラーゼ等が好適に使用可能である。
【００５３】特に高温度で酵素活性を保持する耐熱性細
菌由来のＤＮＡポリメラーゼを使用することが好まし
い。プライマーによる目的とするＤＮＡの塩基配列認識
の特異性を高めることが可能だからである（詳細は特開
平１−３１４９６５、特開平１−２５２３００を参
照）。
菌由来のＤＮＡポリメラーゼを使用することが好まし
い。プライマーによる目的とするＤＮＡの塩基配列認識
の特異性を高めることが可能だからである（詳細は特開
平１−３１４９６５、特開平１−２５２３００を参
照）。
【００５４】本発明においては、配列表５と６に記載の
プライマーの組合わせを用いて伸張反応を繰り返すこと
により、リーシュマニアに共通のＦ１０バンドのＤＮＡ
を効率的に増幅可能であり、さらに配列表２と３に記載
のプライマーの組合わせを用いて伸張反応を繰り返すこ
とにより、ブラジル型リーシュマニアに特異的なＦ４バ
ンドのＤＮＡを効率的に増幅可能である。
プライマーの組合わせを用いて伸張反応を繰り返すこと
により、リーシュマニアに共通のＦ１０バンドのＤＮＡ
を効率的に増幅可能であり、さらに配列表２と３に記載
のプライマーの組合わせを用いて伸張反応を繰り返すこ
とにより、ブラジル型リーシュマニアに特異的なＦ４バ
ンドのＤＮＡを効率的に増幅可能である。
【００５５】遺伝子増幅反応条件については、例えば次
の成書、Molecular Cloning 2nd ed.,1989, Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press chapter 4 、またはＰＣＲ
実験マニュアル ＨＢＪ出版社、実験医学 増刊Vol 8,
No.9,１９９０年羊土社を参照のこと。
の成書、Molecular Cloning 2nd ed.,1989, Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press chapter 4 、またはＰＣＲ
実験マニュアル ＨＢＪ出版社、実験医学 増刊Vol 8,
No.9,１９９０年羊土社を参照のこと。
【００５６】（被検体および検出法）本発明において
は、被検体は特に制限されず、上記のリーシュマニアに
特異的なＤＮＡの検出用ポリヌクレオチドを用いて７種
類のリーシュマニアに共通の特異的なＤＮＡバンドＦ４
とブラジル型に共通の特異的ＤＮＡバンドＦ１０とを、
遺伝子増幅により検出可能とする。
は、被検体は特に制限されず、上記のリーシュマニアに
特異的なＤＮＡの検出用ポリヌクレオチドを用いて７種
類のリーシュマニアに共通の特異的なＤＮＡバンドＦ４
とブラジル型に共通の特異的ＤＮＡバンドＦ１０とを、
遺伝子増幅により検出可能とする。
【００５７】被検体としては、例えば、臨床上外観より
リーシュマニア感染と見られる病巣周辺部の組織を採取
することで可能である。採取方法は例えば、成書、病理
標本の作り方（文光堂）の記載の方法に準じて可能であ
る。
リーシュマニア感染と見られる病巣周辺部の組織を採取
することで可能である。採取方法は例えば、成書、病理
標本の作り方（文光堂）の記載の方法に準じて可能であ
る。
【００５８】例えば、組織を採取後、コンパウンドにて
包埋し、液体窒素等で急速冷凍し、クリオスタットにて
凍結切片を作製し、得られた切片スライドを用いて遺伝
子増幅反応を行うことが可能である。
包埋し、液体窒素等で急速冷凍し、クリオスタットにて
凍結切片を作製し、得られた切片スライドを用いて遺伝
子増幅反応を行うことが可能である。
【００５９】この場合、該スライド数枚使用することに
よりリーシュマニア由来の遺伝子の存在の有無を検出可
能となる。
よりリーシュマニア由来の遺伝子の存在の有無を検出可
能となる。
【００６０】増幅された遺伝子は一般的な方法で検出可
能である。例えばアガロース電気泳動で分離した後、エ
テジウムブロミド等で染色し、紫外線照射により遺伝子
による各バンドを検出可能である。
能である。例えばアガロース電気泳動で分離した後、エ
テジウムブロミド等で染色し、紫外線照射により遺伝子
による各バンドを検出可能である。
【００６１】さらに、本発明における被検体としては、
採取した組織から抽出したＤＮＡを使用することも可能
である（例えば新細胞工学実験プロトコール、秀潤社に
記載の方法を参照）。
採取した組織から抽出したＤＮＡを使用することも可能
である（例えば新細胞工学実験プロトコール、秀潤社に
記載の方法を参照）。
【００６２】すなわちサザンブロット法（Southern.E.
M.,J.Mol.Biol.,98,503,1975 ）を応用するものである
（Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press,2nd ed.,1989 ）。
M.,J.Mol.Biol.,98,503,1975 ）を応用するものである
（Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
Press,2nd ed.,1989 ）。
【００６３】採取組織から得られたＤＮＡを適当な制限
酵素処理により断片とし、電気泳動により分離する。さ
らにＤＮＡをニトロセルロース等のメンブレンに転写
し、紫外線照射等によりＤＮＡをメンブレンに固定す
る。
酵素処理により断片とし、電気泳動により分離する。さ
らにＤＮＡをニトロセルロース等のメンブレンに転写
し、紫外線照射等によりＤＮＡをメンブレンに固定す
る。
【００６４】さらに、本発明に係るＦ４バンドＤＮＡ、
Ｆ１０バンドＤＮＡの一部の塩基配列（３６個から４２
個程度の連続した塩基配列が望ましい）を合成したもの
に検出用ラベル化したものと前記のメンブレンに固定さ
れたＤＮＡとハイブリダイゼーションさせることにより
リーシュマニア由来のＤＮＡを検出可能とするものであ
る。
Ｆ１０バンドＤＮＡの一部の塩基配列（３６個から４２
個程度の連続した塩基配列が望ましい）を合成したもの
に検出用ラベル化したものと前記のメンブレンに固定さ
れたＤＮＡとハイブリダイゼーションさせることにより
リーシュマニア由来のＤＮＡを検出可能とするものであ
る。
【００６５】ラベル化としては、例えば32Ｐ等の放射性
物質でラベル（例えば３’、５’末端いずれも可能であ
る）したり、またはビオチンであればアビジン（もしく
はストレプトアビジン）−酵素結合体、またはハプテン
であれば抗体−酵素結合体を用いて基質と反応させるこ
とにより検出可能となる。
物質でラベル（例えば３’、５’末端いずれも可能であ
る）したり、またはビオチンであればアビジン（もしく
はストレプトアビジン）−酵素結合体、またはハプテン
であれば抗体−酵素結合体を用いて基質と反応させるこ
とにより検出可能となる。
【００６６】さらに、ドットハイブリダイエーション法
を使用しても検出可能であり（Sakai,et.al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,86,6230-6234,1989,または特開平１−
３１４９６を参考) 。標識物質は特に制限はなく、蛍光
物質（フルオロセイン、フルオロセイニソチオシアネー
ト、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシア
ネート、テキサスレッド、フィコエリスリン等）、化学
発光物質（アクリジン、Ｅｕ−ＤＰＴＡ等）が、好適に
使用可能である。また間接法も使用可能であり、ビオチ
ン、ジオキシゲニン等も使用可能である。
を使用しても検出可能であり（Sakai,et.al.,Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,86,6230-6234,1989,または特開平１−
３１４９６を参考) 。標識物質は特に制限はなく、蛍光
物質（フルオロセイン、フルオロセイニソチオシアネー
ト、ローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシア
ネート、テキサスレッド、フィコエリスリン等）、化学
発光物質（アクリジン、Ｅｕ−ＤＰＴＡ等）が、好適に
使用可能である。また間接法も使用可能であり、ビオチ
ン、ジオキシゲニン等も使用可能である。
【００６７】例えば本発明においては、各検出用ポリヌ
クレオチドの５’末端にアミノリンク２（ＡＢＩ社製）
を結合することで可能となる。
クレオチドの５’末端にアミノリンク２（ＡＢＩ社製）
を結合することで可能となる。
【００６８】（感染の判断およびリーシュマニア感染種
の判断）上記説明したように、本発明に係る検出用ポリ
ヌクレオチドプライマーを使用して、上記のＦ４バンド
ＤＮＡおよび、Ｆ１０バンドＤＮＡを遺伝子増幅して検
出可能とし、Ｆ４が観測された場合にリーシュマニアに
感染していると判断可能であり、さらに、Ｆ１０を検出
した場合は、ブラジル型リーシュマニアに感染している
と判断可能である。
の判断）上記説明したように、本発明に係る検出用ポリ
ヌクレオチドプライマーを使用して、上記のＦ４バンド
ＤＮＡおよび、Ｆ１０バンドＤＮＡを遺伝子増幅して検
出可能とし、Ｆ４が観測された場合にリーシュマニアに
感染していると判断可能であり、さらに、Ｆ１０を検出
した場合は、ブラジル型リーシュマニアに感染している
と判断可能である。
【００６９】
【作用】本発明により、各種のリーシュマニアに特異的
なＤＮＡを検索可能となり、単離し、塩基配列を同定可
能とする。さらに該ＤＮＡを特異的に増幅可能とする検
出用プローブを選択し使用することにより、被検体中の
リーシュマニア由来のＤＮＡを検出し感染の有無、およ
び種類を判断する。
なＤＮＡを検索可能となり、単離し、塩基配列を同定可
能とする。さらに該ＤＮＡを特異的に増幅可能とする検
出用プローブを選択し使用することにより、被検体中の
リーシュマニア由来のＤＮＡを検出し感染の有無、およ
び種類を判断する。
【００７０】
【実施例】つぎに実施例を挙げて本発明を子右再に説明
するが、本発明はこの実施例に限定されるものではな
い。
するが、本発明はこの実施例に限定されるものではな
い。
【００７１】（１）リーシュマニア原虫遺伝子の抽出
（鋳型遺伝子） 以下の７種類の原虫を用いて検討した。
（鋳型遺伝子） 以下の７種類の原虫を用いて検討した。
【００７２】 L. braziliensis panamensis (MHOM/PA/71/LS94) L. braziliensis braziliensis (MHOM/BR/75/M2904) L. braziliensis guyanensis (MHOM/BR/75/M4147) L. mexicana mexicana (MNYC/BZ/62/M379) L. mexicana aristedesi (MORY/PA/68/GML3) L. mexicana amazonensis (MHOM/BR/73/M2269) L. major (MHOM/SU/73/5ASKH) L. chagasi (MHOM/BR/74/PP75) これらのリーシュマニアのプロマスティゴートをシュナ
イダー培地で培養した後、回収し、ＳＥ緩衝液（0.15M
NaCl, 0.1M EDTA(pH8.0)) に懸濁した。
イダー培地で培養した後、回収し、ＳＥ緩衝液（0.15M
NaCl, 0.1M EDTA(pH8.0)) に懸濁した。
【００７３】得られた懸濁液（サスペンジョン）にサル
コシールを加えて細胞を溶解した後プロテイナーゼＫを
加え６０℃で１時間反応させた。
コシールを加えて細胞を溶解した後プロテイナーゼＫを
加え６０℃で１時間反応させた。
【００７４】１時間後、16,000rpm にて９０分間４℃で
遠心分離した。
遠心分離した。
【００７５】得られた上清について、フェノールークロ
ロフォルム溶液を等量加えてタンパク質を除去した。
ロフォルム溶液を等量加えてタンパク質を除去した。
【００７６】その後2.5 倍量のエタノールを加えてー８
０℃で２０分間放置し、ＤＮＡを沈殿させた。
０℃で２０分間放置し、ＤＮＡを沈殿させた。
【００７７】さらに16,000rpm で１０分間の遠心分離の
後沈殿をＴＥ緩衝液(10mM Tris-HCl8pH8.0), 1mM EDTA)
に溶解し、鋳型（テンプレート）ＤＮＡとした。
後沈殿をＴＥ緩衝液(10mM Tris-HCl8pH8.0), 1mM EDTA)
に溶解し、鋳型（テンプレート）ＤＮＡとした。
【００７８】（２）遺伝子増幅反応用プライマー アービトラリプライマとして以下の６種類のプライマを
合成した。
合成した。
【００７９】合成はＤＮＡシンセサイザ（ＡＢＩ社製）
を用いて行った。
を用いて行った。
【００８０】 INV-1 (5'-ACCGGAATTCTTGGCTGTTGGCACGATGAG-3') INV-2 (5'-TTGCAAGCTTTTATCTGGTTATATTGACAG-3') LS-3 (5'-AAGTGTTGATACCCACTTTGT-3') LS-2 (5'-CAATGGGTTACTGTTACAAC-3') MS2-F (5'-CCTTAGGTTCTGGTAATGAC-3') MS2-R (5'-GGGTGCAATCTCACTGGGAC-3') （３）遺伝子増幅の条件の検討 （１）で調製した鋳型ＤＮＡ 50ng に対し、上記のアー
ビトラリプライマをそれぞれ 250ng加え、dNTPmix と 1
5.6 μM, 0.6ユニットの Taqポリメラーゼおよび 10mM
Tris-HCl(pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl 2 , 0.001%ゼ
ラチンを加えて最終容量を 25 μl にて遺伝子増幅を行
った。
ビトラリプライマをそれぞれ 250ng加え、dNTPmix と 1
5.6 μM, 0.6ユニットの Taqポリメラーゼおよび 10mM
Tris-HCl(pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl 2 , 0.001%ゼ
ラチンを加えて最終容量を 25 μl にて遺伝子増幅を行
った。
【００８１】遺伝子増幅条件は以下に示される。
【００８２】（ｉ）９４℃、５分：１サイクル （ｉｉ）９４℃、１分；３７℃、１分；７２℃、１分：
１０サイクル （ｉｉｉ）９４℃、１分；６０℃、１分；７２℃、７
分：３０サイクル （ｉｖ）７２℃、７分：１サイクル （ｖ）１５℃で保存 上記の遺伝子増幅反応後 5μl を用いて、6%ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で生成物を分離分析し、銀染色法
にて染色した。
１０サイクル （ｉｉｉ）９４℃、１分；６０℃、１分；７２℃、７
分：３０サイクル （ｉｖ）７２℃、７分：１サイクル （ｖ）１５℃で保存 上記の遺伝子増幅反応後 5μl を用いて、6%ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で生成物を分離分析し、銀染色法
にて染色した。
【００８３】（４）リーシュマニア原虫フラグメントの
検出 （３）の結果を、用いた（２）のプライマにより検討し
図１に示した。
検出 （３）の結果を、用いた（２）のプライマにより検討し
図１に示した。
【００８４】すなわち LS-3 のプライマを用いることに
より、L.braziliensisに特有に発現しているＦ１０バン
ドおよびL.braziliensisと L.mexicana の両方の原虫に
発現しているＦ４バンドを検出することができる。
より、L.braziliensisに特有に発現しているＦ１０バン
ドおよびL.braziliensisと L.mexicana の両方の原虫に
発現しているＦ４バンドを検出することができる。
【００８５】（５）Ｆ４バンドとＦ１０バンドのＤＮＡ
の塩基配列決定 各バンドは、目的のバンドをポリアクリルアミドゲルか
ら切出し，ボイル法（例えば、Molecular Cloning, Col
d Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.,1989 ）に
より抽出した。
の塩基配列決定 各バンドは、目的のバンドをポリアクリルアミドゲルか
ら切出し，ボイル法（例えば、Molecular Cloning, Col
d Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.,1989 ）に
より抽出した。
【００８６】この抽出した各バンドのＤＮＡをＴＡクロ
ーニングキット（Invitrogen社）を用いてベクターに組
込んだ。
ーニングキット（Invitrogen社）を用いてベクターに組
込んだ。
【００８７】このベクターのＤＮＡについて、Ｍ１３ユ
ニバーサルプライマーと、リバースプライマーを用い
て、モデル３７３ＡＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社製）
を用いてシーケンスを行った。
ニバーサルプライマーと、リバースプライマーを用い
て、モデル３７３ＡＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ社製）
を用いてシーケンスを行った。
【００８８】その結果配列表１および４に記載される塩
基配列を得た。
基配列を得た。
【００８９】 Ｆ１０バンドＤＮＡ CTGTGTTAAT CTCAGTCGTC CTTCTCTTCT CTTCTGACTG GCTCGGCGCT CGGTACCGCT TCTCGTTTCG CTTTGAACGG GAGAGCGGAG GAGAACGAGG AGGTGGGCGT ATCTGCTGAT GAGAGCGGTC GGATCTGCAT GCATCACCGG TCCCTCGGAT GCACACACAT ACACACACAC TCGGCCCGCA GTCCCTCGCT TTGTGCCGCC TTTTTTCTTG TCTTGCCTTA CGCCATGTAC TGCGACCACC CACACACACA CAC Ｆ４バンドＤＮＡ GTTCATGCAC GCCACTACTT GCAAGGGTCA CTCGGCATTT TGCGAGGATA AAGGGAAAGA GTTGACATTG CGGCGGAGGT TAGACATGCA AGTCAGGGCA CGGATGTGCG CCATCTCGTA CCCTG （６）検出用プライマーの合成 （５）で得られた塩基配列から、Ｆ４バンド、Ｆ１０バ
ンドＤＮＡの検出用プライマーとしてそれぞれ２種類づ
つ４種類（配列表２、３、および５、６に記のの塩基配
列）を選択し、これらを合成した。
ンドＤＮＡの検出用プライマーとしてそれぞれ２種類づ
つ４種類（配列表２、３、および５、６に記のの塩基配
列）を選択し、これらを合成した。
【００９０】合成は、ＤＮＡシンセサイザ（ＡＢＩ社
製）を用いて行った。
製）を用いて行った。
【００９１】（７）リーシュマニアに特異的なＤＮＡの
増幅 （６）で合成して得られたＦ４バンド検出用プライマー
（配列表５、６）およびＦ１０バンド検出用プライマー
（配列表２、３）を用い、（１）で得られた鋳型ＤＮＡ
を用いて遺伝子増幅反応を行った。
増幅 （６）で合成して得られたＦ４バンド検出用プライマー
（配列表５、６）およびＦ１０バンド検出用プライマー
（配列表２、３）を用い、（１）で得られた鋳型ＤＮＡ
を用いて遺伝子増幅反応を行った。
【００９２】反応の条件はプライマーを変えた以外は
（３）と同条件で行った。
（３）と同条件で行った。
【００９３】すなわち、（１）で調製した鋳型ＤＮＡ 5
0ng に対し、上記のプライマ（配列表５、６の組合わ
せ、または配列用２、３の組合わせ）をそれぞれ 250ng
加え、dNTPmix と 15.6 μM, 0.6ユニットの Taqポリメ
ラーゼおよび 10mM Tris-HCl(pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM
MgCl 2 , 0.001%ゼラチンを加えて最終容量を 25 μl
にて遺伝子増幅を行った。
0ng に対し、上記のプライマ（配列表５、６の組合わ
せ、または配列用２、３の組合わせ）をそれぞれ 250ng
加え、dNTPmix と 15.6 μM, 0.6ユニットの Taqポリメ
ラーゼおよび 10mM Tris-HCl(pH8.3), 50mM KCl, 1.5mM
MgCl 2 , 0.001%ゼラチンを加えて最終容量を 25 μl
にて遺伝子増幅を行った。
【００９４】遺伝子増幅条件は以下に示される。
【００９５】（ｉ）９４℃、５分：１サイクル （ｉｉ）９４℃、１分；６０℃、１分；７２℃、７分：
３０サイクル （ｉｉｉ）７２℃、７分：１サイクル （ｉｖ）１５℃で保存 上記の遺伝子増幅反応後 5μl を用いて、6%ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で生成物を分離分析し、銀染色法
にて染色した。
３０サイクル （ｉｉｉ）７２℃、７分：１サイクル （ｉｖ）１５℃で保存 上記の遺伝子増幅反応後 5μl を用いて、6%ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で生成物を分離分析し、銀染色法
にて染色した。
【００９６】Ｆ４検出用プライマー（配列表５、６）を
用いた場合、リーシュマニアすべての種類でＦ４バンド
のＤＮＡの増幅が認められた（図２）。
用いた場合、リーシュマニアすべての種類でＦ４バンド
のＤＮＡの増幅が認められた（図２）。
【００９７】一方Ｆ１０検出用のプライマー（配列表
２、３）を用いた場合は、リーシュマニアブラジル型の
みＦ１０バンドのＤＮＡの増幅が認められた（図３）。
２、３）を用いた場合は、リーシュマニアブラジル型の
みＦ１０バンドのＤＮＡの増幅が認められた（図３）。
【００９８】さらに類縁の寄生虫であるトリパノゾーマ
についても、Ｆ４バンド検出用およびＦ１０バンド検出
用プライマーを用いて増幅されるＤＮＡがあるかどうか
検討したところ、全く増幅が認められず（図４）、以上
の増幅はリーシュマニア原虫に特異的であることが確認
された。
についても、Ｆ４バンド検出用およびＦ１０バンド検出
用プライマーを用いて増幅されるＤＮＡがあるかどうか
検討したところ、全く増幅が認められず（図４）、以上
の増幅はリーシュマニア原虫に特異的であることが確認
された。
【００９９】
【発明の効果】以上説明したように、本発明により、リ
ーシュマニア原虫を検体から正確に検出出来ることか
ら、リーシュマニア原虫の感染かどうかを診断すること
が可能である。
ーシュマニア原虫を検体から正確に検出出来ることか
ら、リーシュマニア原虫の感染かどうかを診断すること
が可能である。
【０１００】さらには、リーシュマニアのブラジル型と
メキシコ型の区別が可能であることから、リーシュマニ
ア感染が判明した後の治療法に応用可能となる。
メキシコ型の区別が可能であることから、リーシュマニ
ア感染が判明した後の治療法に応用可能となる。
【０１０１】また本発明に係る方法により短時間で簡単
に一度に大量の検体を診断することが可能であるため。
リーシュマニア流行地域での大規模な集団検診が可能と
なる。
に一度に大量の検体を診断することが可能であるため。
リーシュマニア流行地域での大規模な集団検診が可能と
なる。
【０１０２】
配列番号：１ 配列の長さ：２６３ 配列の型：核酸 トポロジー：２本鎖 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CTGTGTTAAT CTCAGTCGTC CTTCTCTTCT CTTCTGACTG GCTCGGCGCT CGGTACCGCT TCTCGTTTCG CTTTGAACGG GAGAGCGGAG GAGAACGAGG AGGTGGGCGT ATCTGCTGAT GAGAGCGGTC GGATCTGCAT GCATCACCGG TCCCTCGGAT GCACACACAT ACACACACAC TCGGCCCGCA GTCCCTCGCT TTGTGCCGCC TTTTTTCTTG TCTTGCCTTA CGCCATGTAC TGCGACCACC CACACACACA CAC 配列番号：２ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CTGACTGGCT CGGCGCTCGG TAC 配列番号：３ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 トポロジー：２本鎖 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＧＧＴＣＧＣＡＧＡＡ ＣＡＴＧＧＣＧＴＡＡ ＧＧ 配列番号：４ 配列の長さ：１２５ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 ＧＴＴＣＡＴＧＣＡＣ ＧＣＣＡＣＴＡＣＴＴ ＧＣＡＡＧＧＧＴＣＡ ＣＴＣ
ＧＧＣＡＴＴＴ ＴＧＣＧＡＧＧＡＴＡ ＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡ ＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧ ＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴ ＴＡＧＡＣＡＴＧＣＡ ＡＧＴ
ＣＡＧＧＧＣＡ ＣＧＧＡＴＧＴＧＣＧ ＣＣＡＴＣＴＣＧＴＡ ＣＣＣＴＧ 配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：２本鎖 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GTTCATGCAC GCCACTACTT GCAAGG 配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CAGGGTACGA GATGGCGCAC ATCC
ＧＧＣＡＴＴＴ ＴＧＣＧＡＧＧＡＴＡ ＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡ ＧＴＴＧＡＣＡＴＴＧ ＣＧＧＣＧＧＡＧＧＴ ＴＡＧＡＣＡＴＧＣＡ ＡＧＴ
ＣＡＧＧＧＣＡ ＣＧＧＡＴＧＴＧＣＧ ＣＣＡＴＣＴＣＧＴＡ ＣＣＣＴＧ 配列番号：５ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：２本鎖 配列の種類：ＤＮＡ 配列 GTTCATGCAC GCCACTACTT GCAAGG 配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＤＮＡ 配列 CAGGGTACGA GATGGCGCAC ATCC
【図１】ＬＳ−３プライマを用いたＰＣＲ法により増幅
されたＤＮＡを示す電気泳動パターンを示す図である。
されたＤＮＡを示す電気泳動パターンを示す図である。
【図２】Ｆ４検出用プライマー（配列表５、６）を用い
た場合、リーシュマニアすべての種類でＦ４バンドのＤ
ＮＡの増幅が認められることを示す図である。
た場合、リーシュマニアすべての種類でＦ４バンドのＤ
ＮＡの増幅が認められることを示す図である。
【図３】Ｆ１０検出用のプライマー（配列表２、３）を
用いた場合、リーシュマニアブラジル型のみＦ１０バン
ドのＤＮＡの増幅が認められることを示す図である。
用いた場合、リーシュマニアブラジル型のみＦ１０バン
ドのＤＮＡの増幅が認められることを示す図である。
【図４】類縁の寄生虫であるトリパノゾーマについて、
Ｆ４バンド検出用およびＦ１０バンド検出用プライマー
を用いても増幅されるＤＮＡが存在しないことを示す図
である。
Ｆ４バンド検出用およびＦ１０バンド検出用プライマー
を用いても増幅されるＤＮＡが存在しないことを示す図
である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡ
Claims (14)
- 【請求項１】 分子中に少なくとも、 CTGTGTTAAT CTCAGTCGTC CTTCTCTTCT CTTCTGACTG GCTCGGCGCT CGGTACCGCT TCTCGTTTCG CTTTGAACGG GAGAGCGGAG GAGAACGAGG AGGTGGGCGT ATCTGCTGAT GAGAGCGGTC GGATCTGCAT GCATCACCGG TCCCTCGGAT GCACACACAT ACACACACAC TCGGCCCGCA GTCCCTCGCT TTGTGCCGCC TTTTTTCTTG TCTTGCCTTA CGCCATGTAC TGCGACCACC CACACACACA CAC の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
- 【請求項２】 分子中に少なくとも、請求項１に記載の
塩基配列であるポリヌクレオチドとハイブリダイズする
塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。 - 【請求項３】分子中に少なくとも、請求項１に記載の塩
基配列と相補的な塩基配列であるポリヌクレオチドとハ
イブリダイズする塩基配列を含むことを特徴とするポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項４】 請求項１から３のいずれかに記載の塩基
配列から選ばれる連続した少なくとも１５の塩基からな
るポリヌクレオチドまたは相補的ポリヌクレオチド。 - 【請求項５】 塩基配列が、 CTGACTGGCT CGGCGCTCGG TAC であるポリヌクレオチド。
- 【請求項６】 塩基配列が、 GGTCGCAGAA CATGGCGTAA GG であるポリヌクレオチド。
- 【請求項７】 分子中に少なくとも、 GTTCATGCAC GCCACTACT GCAAGGGTCA CTCGGCATTT TGCGAGGATA AAGGGAAAGA GTTGACATTG CGGCGGAGGT TAGACATGCA AGTCAGGGCA CGGATGTGCG CCATCTCGTA CCCTG の塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
- 【請求項８】 分子中に少なくとも、請求項７に記載の
塩基配列であるポリヌクレオチドとハイブリダイズする
塩基配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。 - 【請求項９】分子中に少なくとも、請求項７に記載の塩
基配列と相補的な塩基配列であるポリヌクレオチドとハ
イブリダイズする塩基配列を含むことを特徴とするポリ
ヌクレオチド。 - 【請求項１０】 請求項７から９のいずれかに記載の塩
基配列から選ばれる連続した少なくとも１５の塩基から
なるポリヌクレオチドまたは相補的ポリヌクレオチド。 - 【請求項１１】 塩基配列が、 GTTCATGCAC GCCACTACTT GCAAGG であるポリヌクレオチド。
- 【請求項１２】 塩基配列が、 CAGGGTACGA GATGGCGCAC ATCC であるポリヌクレオチド。
- 【請求項１３】 被検体に含有されるリーシュマニア原
虫由来のＤＮＡを鋳型とした遺伝子増幅反応により、請
求項１〜３または７〜９のいずれかに記載の塩基配列を
少なくとも含むポリヌクレオチドを特異的に増幅したリ
ーシュマニア原虫由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡ由来のポ
リヌクレオチドを検出することにより、被検体中のリー
シュマニア原虫由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡ由来のポリ
ヌクレオチドを検出する方法。 - 【請求項１４】 被検体に含有されるリーシュマニア原
虫由来のＤＮＡを鋳型とし、 請求項４〜６または１０〜１２のいずれかに記載のポリ
ヌクレオチドを少なくとも１つ用いる遺伝子増幅反応に
より特異的に増幅し；上記により増幅されたリーシュマ
ニア原虫由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡ由来のポリヌクレ
オチドを検出することにより、被検体中のリーシュマニ
ア原虫由来のＤＮＡまたは該ＤＮＡ由来のポリヌクレオ
チドを検出する方法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7079087A JPH08275799A (ja) | 1995-04-04 | 1995-04-04 | リーシュマニアの検出用ポリヌクレオチド及びリーシュマニア原虫の検出方法 |
| PCT/JP1996/000893 WO1996031623A1 (fr) | 1995-04-04 | 1996-04-02 | Polynucleotides permettant de deceler des leishmanies et procede de detection du protozoaire de la leishmanie |
| US08/930,797 US6022690A (en) | 1995-04-04 | 1996-04-02 | Polynucleotides for detecting leishmanias and method of detection of leishmanial protozoan |
| EP96907751A EP0819766A4 (en) | 1995-04-04 | 1996-04-02 | POLYNUCLEOTIDS FOR DETECTING LEISHMANIOSIS AND METHOD FOR DETECTING PROTOZOES OF LEISHMANIOSIS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7079087A JPH08275799A (ja) | 1995-04-04 | 1995-04-04 | リーシュマニアの検出用ポリヌクレオチド及びリーシュマニア原虫の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08275799A true JPH08275799A (ja) | 1996-10-22 |
Family
ID=13680108
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7079087A Pending JPH08275799A (ja) | 1995-04-04 | 1995-04-04 | リーシュマニアの検出用ポリヌクレオチド及びリーシュマニア原虫の検出方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6022690A (ja) |
| EP (1) | EP0819766A4 (ja) |
| JP (1) | JPH08275799A (ja) |
| WO (1) | WO1996031623A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2169966B1 (es) * | 1999-08-03 | 2003-11-01 | Univ Granada | Kit para diagnostico especifico de las leishmaniosis causadas por "leishmania infantum" por la tecnica de pcr-elisa. |
| CN111549160A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-18 | 刘东立 | 一种用于检测利什曼原虫的引物组、试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1984001174A1 (en) * | 1982-09-20 | 1984-03-29 | Harvard College | Identification of microorganisms |
| US4908308A (en) * | 1985-06-19 | 1990-03-13 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Method for detecting animal-infective protozoa in vitro and a method for detecting agents which block the differentiation thereof |
| GB8921878D0 (en) * | 1989-09-28 | 1989-11-15 | Ici Plc | Prosthetic devices |
| BR9206341A (pt) * | 1991-08-06 | 1994-11-08 | World Health Org | Processo de isolamento de DNA |
-
1995
- 1995-04-04 JP JP7079087A patent/JPH08275799A/ja active Pending
-
1996
- 1996-04-02 WO PCT/JP1996/000893 patent/WO1996031623A1/ja not_active Application Discontinuation
- 1996-04-02 US US08/930,797 patent/US6022690A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-04-02 EP EP96907751A patent/EP0819766A4/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0819766A4 (en) | 2000-01-12 |
| US6022690A (en) | 2000-02-08 |
| WO1996031623A1 (fr) | 1996-10-10 |
| EP0819766A1 (en) | 1998-01-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6238866B1 (en) | Detector for nucleic acid typing and methods of using the same | |
| US5834189A (en) | Method for evaluation of polymorphic genetic sequences, and the use thereof in identification of HLA types | |
| Singh | Molecular methods for diagnosis and epidemiological studies of parasitic infections | |
| US5496699A (en) | Detection of allele - specific mutagens | |
| EP0359789B1 (en) | Amplification and detection of nucleic acid sequences | |
| EP0777747B1 (en) | Nucleotide sequencing method | |
| US5384242A (en) | Diagnostic kit, primer composition and their use for replication or detection of nucleic acids | |
| WO2000031306A9 (en) | Multiplex amplification of short tandem repeat loci | |
| JP2802125B2 (ja) | 核酸の検出方法 | |
| WO1995015400A1 (en) | Genotyping by simultaneous analysis of multiple microsatellite loci | |
| US20080241827A1 (en) | Methods For Detecting A Mutant Nucleic Acid | |
| Sjöroos et al. | Time-resolved fluorometry based sandwich hybridisation assay for HLA-DQA1 typing | |
| AU8846898A (en) | Method and kit for hla class i typing dna | |
| JPH06261758A (ja) | マラリアの検出 | |
| WO1991002091A1 (en) | Method of identifying herpesviruses and oligonucleotides for use therein | |
| JPH08275799A (ja) | リーシュマニアの検出用ポリヌクレオチド及びリーシュマニア原虫の検出方法 | |
| US6855522B2 (en) | Species-specific PCR assay for detection of Leishmania donovani in clinical samples of kala-azar and post kala-azar dermal leishmaniasis | |
| KR102076343B1 (ko) | 실시간 lamp법을 이용한 아데노바이러스 55형 검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| KR20000064350A (ko) | 진균류의 검출용 재료 및 검출방법 | |
| KR101925974B1 (ko) | 게놈 dna 기반의 장 pcr 프라이머 세트를 포함하는 신경섬유종증 진단용 조성물 | |
| KR102571496B1 (ko) | 홍게와 대게의 판별을 위한 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| EP3458603A1 (en) | Penta e polymorphisms for human identification | |
| US6207810B1 (en) | TRT1 polynucleotides, host cells and assays | |
| US20020172945A1 (en) | Materials and methods for detection of pathogenic guignardia citricarpa | |
| CN116463449A (zh) | 一种用于检测栝楼品种的ssr标记引物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050228 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050628 |