KR102571496B1 - 홍게와 대게의 판별을 위한 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

홍게와 대게의 판별을 위한 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 홍게와 대게를 판별할 수 있는 기술에 대한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였을 때 비특이적 결합 밴드가 없으면서도, 홍게와 대게를 정확하게 판별할 수 있음을 확인한 바, 이를 수산 산업에 있어서 홍게와 대게를 판별하는데 유용하게 활용할 수 있다.

Description

홍게와 대게의 판별을 위한 멀티플렉스용 프라이머 세트 및 이의 용도{Multiplex primer sets for identification between Chionoecetes japonicus and Chionoecetes opilio, and uses thereof}
본 발명은 홍게와 대게를 정확하게 판별할 수 있는 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
게는 절지동물 중 갑각류에 속하는 수산물로, 전 세계에는 4,500여종이, 우리나라에는 약 183종이 분포하는 것으로 알려져 있다. 또한 우리 식생활에 주요하게 쓰이는 해양자원 중 하나로, 찌거나 삶는 것 외에도 맛살, 소시지 등 가공식품의 원료로도 흔히 이용된다.
일반적으로, 게를 포함한 갑각류는 색이나 집게발, 부속지 등 외형을 분석해 종을 판별해왔다. 하지만 게는 종간 표현형이 유사하며, 가공시 집게발과 부속지 등을 제거하기 때문에 기존의 구별법을 적용하기 어렵다. 때문에 우리나라에서는 홍게가 상대적으로 값이 비싼 대게로 판매되는 경우가 있다.
붉은 대게로도 불리는 홍게(Chionoecetes japonicus)는 우리나라에서 주로 소비되는 게로, 해양수산부에 따르면 2016년 전체 갑각류 생산량 중 약 29%를 차지한다는 통계가 발표된 바 있다.
대게(Chionoecetes opilio)는 대게속(genus Chionoecetes)의 냉수성 갑각류에 속하며, 해저 200 내지 800m에서 서식하고, 홍게는 이보다 깊은 해저 500 내지 2300m 부근에서 서식하는 것으로 알려져 있다.
상기 두 종은 형태학적으로 갑피의 색깔, 갑피의 돌기 등이 분류형질로써 구분이 가능하지만, 가식 부위만을 골라내어 가공할 경우 육안으로 식별이 불가능하다.
따라서 외적인 특징을 간직하고 있는 원물이나, 가공식품 모두에서 신속하고 정확하게 두 종을 판별할 수 있는 방법이 필요하다. 기존 형태적인 종 판별법 이외에도 기존에는 주로 단백질을 이용한 방법이 갑각류의 종을 판별하기 위해 사용되었다. 등전점 전기영동(Isoelectric focusing; IEF), 모세관 전기영동(Capillary electrophoresis; CE), 면역 시스템(Immunoassay system) 등 단백질을 이용한 방법들은 주로 신선하거나 급속 동결된 조직을 분석하는 방법으로, 조직이 고열로 가공되거나 건조되면 단백질의 생화학적 특성이나 구조가 변형되어 분석할 수 없다는 단점이 있다.
또한, 단백질의 발현은 같은 생물이라도 조직에 따라 다르며, 상업적으로 쓰이는 방법은 대부분 혈장단백질을 검출하기 때문에 다른 종과 혼합되는 제품의 경우에는 오염될 가능성이 있어 분석이 어렵다. 효소면역 측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)같은 방법은 열가공된 제품도 분석하는 것이 가능하지만, 근연종인 경우 항체가 교차반응을 일으킬 수 있다. 또한 특정 단백질에 따라 특이적인 항체를 개발해야 하며, 상업적으로 이용되는 항체는 종을 판별하는데 적용하기 어렵다는 단점이 있다. DNA는 단백질에 비하여 대체로 더 안정하고, 열가공시 분해될 가능성도 더 낮다. 또한 모든 생물 조직에 존재하며 소량의 샘플만 있어도 분석이 가능하다는 장점이 있다.
중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)은 특정 유전자의 원하는 부분을 한 쌍의 프라이머를 이용해 증폭하는 방법으로, 실험 방법이 간단하면서도 신속 정확하여 널리 사용되고 있다.
상기와 같이 유전자를 기반으로 한 대게와 홍게 판별용 프라이머가 개발된 바 있다(한국 등록특허 10-1918124 참고). 그러나 상기 프라이머는 정방향 프라이머의 말단 부분의 염기서열이 A와 T로 구성되어 있고, 역방향 프라이머의 말단 부분은 종간 염기서열의 차이가 없어 비특이적 결합의 위험성이 상시 존재하며, PCR 시에 종에 따라 어닐링(anealing) 온도가 다르기 때문에 시료 소모성 및 경제적인 측면이 다소 떨어지는 단점이 있다.
따라서 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 홍게와 판별을 신속하고 정확하게 판별할 수 있으며 비특이적 결합의 위험성이 없고 경제적인 측면도 향상된 판별용 조성물의 개발이 필요하다.
본 발명자들은 홍게와 대게를 정확하게 판별할 수 있는 기술에 대하여 연구하던 중, 홍게와 대게에 대한 종 특이적 프라이머를 제작하고, 이를 이용한 멀티플렉스 PCR(Multiplex PCR)을 수행하였을때 각 개체를 정확하게 판별할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 홍게 또는 대게 판별용 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 홍게 또는 대게 판별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 홍게 또는 대게 판별 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 홍게 또는 대게 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 홍게 또는 대게 판별용 키트를 제공한다.
또한 상기 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 홍게 또는 대게 판별 방법을 제공한다.
본 발명은 멀티플렉스 PCR에 적용할 수 있는 홍게 또는 대게 판별용 프라이머 세트에 대한 것으로, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였을 때 비특이적 결합 밴드가 없으면서도, 홍게와 대게를 정확하게 판별할 수 있음을 확인한 바, 이를 수산 산업에 있어서 홍게와 대게를 판별하는데 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 홍게와 대게의 증폭된 마이토콘드리아 시토크롬 산화효소 서브유니트 1(Cytochrome c Oxidase 1, CO1) 유전자 서열을 나타낸 도이다.
도 2는 홍게와 대게의 증폭된 내부 전사 스페이서(internal transcribed spacer, ITS) 유전자 서열을 나타낸 도이다.
도 3은 홍게와 대게의 CO1 및 ITS 유전자 영역의 PCR 증폭 산물을 확인한 도이다.
도 4는 홍게와 대게의 CO1 유전자에 있어서, 확인된 SNP 부위를 기반으로 제작된 프라이머의 타겟 부위를 나타낸 도이다.
도 5는 홍게와 대게의 ITS 유전자에 있어서, 확인된 SNP 부위를 기반으로 제작된 프라이머의 타겟 부위를 나타낸 도이다.
도 6은 홍게와 대게의 CO1 유전자 및 ITS 유전자에 있어서, 본 발명에 따른 프라이머 쌍이 생성하는 PCR 산물의 크기를 나타낸 도이다.
도 7은 홍게와 대게 샘플에 대하여, 본 발명에 따른 프라이머 쌍을 이용한 멀티플렉스 PCR 결과이다.
도 8은 상기 멀티플렉스 PCR 결과에 있어서, 생성된 밴드를 가시화하여 각 밴드의 크기를 확인한 결과이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 홍게 또는 대게 판별용 프라이머 세트를 제공한다.
보다 구체적으로 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머쌍, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 프라이머쌍으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
더불어 상기 서열번호 1 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머쌍은 홍게의 CO1 유전자를 증폭하며, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 프라이머쌍은 대게의 CO1 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 한다.
또한 상기 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어진 프라이머쌍은 홍게 또는 대게의 ITS 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 "마이토콘드리아 시토크롬 산화효소 서브유니트 1(Cytochrome c Oxidase 1, CO1)" 은 미토콘드리아에 존재하는 유전자로 생물종마다 다른 핵산서열을 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 "내부 전사 스페이서(internal transcribed spacer, ITS)"는 rRNA가 코딩되는 영역 사이의 공간을 의미한다. 생물체내에 리보좀은 매우 중요한 기능을 하므로 rRNA의 서열은 매우 잘 보존되어 있는 반면, ITS는 종 간의 변이가 매우 심하게 나타날 수 있는 영역이다.
본 발명의 프라이머 세트에 포함되는 상기 서열번호 1 내지 5에 기재된 염기서열은 이에 제한되지 않으며, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 내지 5의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계 시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기 프라이머의 길이는 일반적으로 주형과 안정한 혼성체를 형성하는 온도와 밀접한 관계를 가지는데 일반적으로 길이가 길어질수록 온도는 높아지게 된다. 사용 목적에 따라 달라질 수는 있으나 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 15 내지 25 뉴클레오티드이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 프라이머 서열은 주형과 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 주형과 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
또한 본 발명의 프라이머 서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 상기 프라이머는 분광학, 광화학, 생화학, 면역화학 또는 화학적 수단을 이용하여 검출될 수 있는 표지를 포함할 수 있다. 유용한 표지는 32P, 형광 염료, 전자 밀집 시약, 효소(일반적으로 ELISA 에 이용되는 것), 바이오틴 또는 합텐 및 항혈청 또는 단일클론성 항체가 이용가능한 단백질을 포함한다.
본 발명의 프라이머는 적절한 서열의 클로닝 및 제한효소 분해 및 나랭(Narang)등의 포스포트리에스테르 방법(1979, Meth, Enzymol. 68:90-99), 보카지(Beaucage)등의 디에틸포스포라미다이트 방법(1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862), 및 미국 특허 제 4458066호의 고형물 지지 방법과 같은 직접적인 화학적 합성법을 포함하는 임의의 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.
본 발명에서 "정방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 유전자 증폭반응에 의해 증폭되는 유전자의 특정 부위의 3'-말단 및 5'-말단에 각각 결합하여 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머를 의미한다.
본 발명에 따른 홍게 또는 대게 판별용 프라이머 세트를 이용하면, 1 회의 검사만으로 홍게 또는 대게 중에서 gDNA의 유래를 신속하고 정확하게 식별해 낼 수 있다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 홍게 또는 대게 판별용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 홍게 또는 대게 판별용 키트는 본 발명에 따른 프라이머 세트를 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조할 수 있다. 더불어 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 통상적으로 증폭 반응에 첨가될 수 있는 시약이라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 DNA 폴리머라제, dNTPs 또는 버퍼를 포함할 수 있다. 이에 시약 및 도구로서 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등을 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트는 병, 통 (tub), 작은 봉지 (sachet), 봉투 (envelope), 튜브, 앰플 (ampoule) 등과 같은 형태를 취할 수 있으며, 이들은 부분적으로 또는 전체적으로 플라스틱, 유리, 종이, 호일, 왁스 등으로부터 형성될 수 있다. 용기는, 처음에는 용기의 일부이거나 또는 기계적, 접착성, 또는 기타 수단에 의해 용기에 부착될 수 있는, 완전히 또는 부분적으로 분리가 가능한 마개를 장착할 수 있다. 용기는 또한 주사바늘에 의해 내용물에 접근할 수 있는, 스토퍼가 장착될 수 있다. 더불어 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
상기 키트는 다중 중합소연쇄반응(multiplex PCR) 키트, 중합효소 연쇄반응(PCR) 키트, 리가아제 연쇄 반응(LCR) 키트, Gap-LCR, 복구연쇄반응(repair chain reaction) 키트, 전사-중재 증폭(TMA) 키트, 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication) 키트, 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences) 키트, 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(CP-PCR) 키트, 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (AP-PCR) 키트, 핵산 염기서열 기반 증폭(NASBA) 키트, 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 키트, 고리-중재 항온성 증폭(LAMP) 키트, 이중 중합효소연쇄반응(nested-PCR) 키트, 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested-PCR) 키트, 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 역 중합효소연쇄반응(inverse PCR) 키트, 실시간 중합효소연쇄반응(RT-PCR) 키트, 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(RQ-PCR) 키트로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 상기 다중 중합소연쇄반응(multiplex PCR) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용한, 홍게 또는 대게 판별 방법을 제공한다.
보다 구체적으로, 상기 방법은 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 시료에서 게놈 DNA를 추출하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법 (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980), 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하거나 단지 배양액을 증류수에 희석시켜 끓이는 방법으로도 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “증폭 반응”은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 의미한다. 본 발명에 따른 홍게 또는 대게 판별 방법에서 게놈 DNA의 증폭은 당업계에 공지된 방법으로 수행될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction, multiplex PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction, LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification, TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction, CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응 (arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification, NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction, nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction, single tube nested-PCR), 다중 역전사-중합효소연쇄반응(multiplex reverse transcription Polymerase chain reaction, multiplex RT-PCR), 단일 역전사-중합효소연쇄반응 (reverse transcription Polymerase chain reaction, RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(realtime Polymerase chain reaction, RT-PCR), 및 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction, RQ-PCR)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 방법을 들 수 있다. 바람직하게는 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction, multiplex PCR)의 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “다중 중합효소연쇄반응 PCR(Multiplex PCR)”은 복수의 프라이머 세트를 사용하여 동시에 1개의 반응 튜브 내에서 PCR 증폭하는 방법이다. 일반적으로 Multiplex PCR을 수행하는 경우에는 각각의 PCR 반응을 수행하는 경우에 비해 PCR 산물의 생성 효율이 감소하지만, 본 발명의 프라이머 세트의 경우에는 이를 하나의 튜브에 넣고 멀티플렉스 PCR을 수행해도 각각의 PCR 산물이 정확하게 생성되는 특징이 있다.
더불어 상기 판별 방법에 있어서, 상기 프라이머 세트의 농도는 2.5 내지 15 pmol/μl일 수 있으며, 보다 바람직하게는 10 pmol/μl일 수 있다.
또한 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 분석하고자 하는 시료에서 추출된 게놈 DNA와 본 발명에 따른 프라이머 세트 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물(dH2O)을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 준다. 바람직하게는 1.5-2.5 mM의 범위로 사용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로 Mg2+가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 Triton X-100이 추가로 포함될 수도 있다.
또한 본 발명의 PCR 조건에 있어서, 상기 증폭 반응은, 92 내지 97℃에서 10초 내지 1분, 45 내지 65℃에서 20초 내지 1분, 65 내지 75℃에서 20초 내지 1분을 한 세트로 30 내지 40 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하며, 65 내지 75℃, 3분 내지 10분을 한 세트로 1 사이클(cycle)의 조건으로 반응을 진행하는 것을 특징으로 한다.
보다 바람직하게는 상기 증폭 반응은 95℃에서 30초간, 57℃에서 30초, 72℃에서 30초를 한 세트로 총 30회 반복한 후 72℃에서 5분간 1 사이클의 조건으로 수행할 수 있다.
상기 증폭 반응에서 온도 및 시간 조건은 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR을 수행할 때 산물을 생성하기 위해 설정된 수치로, 실험방법 및 기기의 변경 등에 따라 통상의 당업자의 적절한 선택에 의한 타당한 수치로 변경될 수 있다.
상기 '증폭'은 홍게 또는 대게 샘플로부터 추출된 DNA 내에 혼합된 CO1유전자 또는 ITS 유전자의 DNA를 주형(Template)으로 하여, 상기 주형 내의 특정 DNA 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트를 사용하여 반복하여 시험관 내에서 해당 DNA 부위를 대량 합성하도록 반응시킨 후, 전기영동에서 뚜렷한 밴드로 가시화하여 판별하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 '검출'은 증폭된 표적 서열에 검출가능한 표지 물질로 표지함으로써, 수행될 수 있다. 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 검출에 사용될 수 있는 상기 표지 물질은 Cy5 또는 Cy3일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 Cy5 또는 Cy3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지시킬 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy5 또는 Cy3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 홍게 또는 대게 판별용 프라이머 세트를 이용하여 멀티플렉스 PCR 증폭시, 서열번호 1 및 서열번호 3의 프라이머쌍은 홍게의 CO1 유전자에 대하여 358bp 크기의 산물을 증폭하고, 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍은 대게의 CO1 유전자에 대하여 471bp 크기의 산물을 증폭하였다. 또한, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머쌍은 ITS 유전자에 있어, 대게에서는 124bp 크기의 산물을 증폭하였고, 홍게에 있어서는 67bp 크기의 산물을 증폭하는 것을 통해 홍게 또는 대게를 판별할 수 있음을 확인하였다.
상술한 본 발명의 내용은 상호 모순되지 않는 한, 서로 동일하게 적용되며, 당해 기술분야의 통상의 기술자가 적절한 변경을 가해 실시하는 것 또한 본 발명의 범주에 포함된다.
이하 본 발명을 실시예를 통해 상세하게 설명하나 본 발명의 범위가 하기 실시예로만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 게놈 DNA 추출
2020년 6월 경상북도 영덕군 강구면 강구리의 동해안에 위치한 강구항 연안에서 포획한 자연산 홍게와 대게를 각각 5개체씩 사용하였다. 상기 개체의 다리 부분을 약 1cm 정도 절단한 후 기존 공지된 페놀 추출법을 이용하여 게놈 DNA(genomic DNA, gDNA)를 추출하고, 추출된 총 gDNA를 희석하여 100ng/μl로 정량하였다.
실시예 2. 타겟 유전자 증폭
대게와 홍게의 CO1 유전자를 증폭시킬 수 있는 공통 프라이머와 ITS 유전자 서열을 증폭시킬 수 있는 공통 프라이머를 각각 새로 제작하여, 두 종의 미토콘드리아 DNA의 CO1 유전자와 핵 DNA의 ITS 유전자 서열 정보를 확보하였다. 공통 프라이머의 경우, CO1 유전자 영역은 GenBank에서 이용 가능한 홍게와 대게의 유전정보를 이용하였으며, ITS 염기서열의 경우, 차세대 염기서열 분석(next-generation sequencing, NGS)를 통해 얻은 서열을 참고하였다. 프라이머 제작에 사용된 염기서열들은 BioEdit 7.0.1의 ClustalW를 이용한 다중염기서열정리(multiple alignment)를 통하여, 두 종에게서 공통으로 발견되는 보존성 높은 염기서열 부분을 참고하여 프라이머 제작에 이용하였다. 홍게와 대게의 CO1 유전자와 ITS 유전자 서열 증폭에 사용된 공통 프라이머 염기서열은 하기 표 1에 기재하였다.
프라이머 이름 프라이머 염기서열(5'-3') 프라이머 길이(mer) 증폭 크기(bp)
CO1_Fw F: CTATCGCCTATATTCAGCCAC 21 1,609
CO1_Rw R: CTTCCTGGTAGGAGCTTAAAYC 22
its_Fd F: TCGAGCTGACGGAAAGATGTCC 22 562
its_Rd R: CGCAACAGTCTACTGCTGATGG 22
20 μl 용적의 AccuPower PCR Premix Kit(Bioneer, Korea)에 gDNA 100 ng과 CO1 및 ITS 유전자 영역을 증폭할 수 있는 상기 표 1의 공통 프라이머를 각각 10 pmole을 첨가하였다. 95℃에서 30초의 초기 변성 반응을 유도한 후, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환 반응을 35회 실시하였고, 최종적으로 72℃에서 7분간 신장 반응을 수행하였다. 이에 따라 증폭된 홍게와 대게의 CO1 유전자와 ITS 유전자 서열은 도 1 또는 도 2에 나타내었다.
실시예 3. 증폭된 유전자의 염기서열 분석
증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로오스 겔(agarose gel)에서 전기영동하여 종 특이적 밴드의 유무를 확인하였다(도 3 참고). 이후, CO1 및 ITS 유전자 영역의 PCR 증폭 산물은 MG PCR 정제 키트(Cancer Rop Co., Ltd, Korea)로 정제한 후, 동일한 공통 프라이머를 이용하여 염기서열분석기 ABI 3730xl(Applied Biosystems, USA)을 통해 직접순서결정(direct sequencing) 방법으로 염기서열을 결정하였다.
염기서열 분석 결과, CO1 유전자는 약 1,534 bp가 모든 개체에서 성공적으로 증폭되었고, ITS 유전자 서열도 약 518 bp가 모든 개체에서 성공적으로 증폭되었다. 분석된 염기서열을 BioEdit 7.0.1의 ClustalW를 이용하여 다중염기서열정렬을 수행하였으며, 이를 통하여 국내산 대게 CO1 유전자 영역의 염기서열, 국내산 홍게의 CO1 유전자 영역의 염기서열, 국내산 대게의 ITS 유전자 영역의 염기서열, 국내산 홍게의 ITS 유전자 영역의 염기서열을 최종적으로 결정하였다.
실시예 4. 홍게와 대게간의 종 특이적 프라이머 제작
확보된 CO1 및 ITS 유전자의 양방향 염기서열 데이터에 대하여 Sequencher ver.5.4.6을 이용하여 트리밍(trimming)을 실시한 후, BioEdit ver. 7.0.9 소프트웨어의 clustalW를 이용하여 다중염기서열정리를 수행하였다. 이후, DNA 서열 다형성 소프트웨어(DNA sequence Polymorphism (DnaSP, ver. 5.10.01)를 사용하여 두 종의 단상성(Haplotype)을 분석하였다. 이를 통하여, 홍게와 대게 간에 차이를 나타내는 단일염기 다형성 유전자 부위(single nucleotide polymorphis, SNP)를 확인하였다(하기 표 2 내지 표 6 참조).
상기 확인된 SNP 부위를 통하여 CO1 유전자는 약 120 bp 차이의 종 판별 프라이머를 제작하였으며, ITS 유전자 영역은 단일염기 유전자 결실 부위를 바탕으로 약 120 bp 이상의 염기서열 차이를 나타내는 종 판별 프라이머를 제작하였다(도 4 및 도 5 참고).상기 제작한 종 판별 프라이머의 서열은 하기 표 7에 나타내었다.
유래
유전자		 프라이머 이름 프라이머 염기서열 (5`-3`) 방향 프라이머 길이
(mer)		 증폭 크기 (bp) 서열
번호
CO1 CJ_CO1_F CTTCATGGGGCTCAAATCAATTATAGC 정방향 27 358 1
CO_CO1_F CCATATGTTCACTGTAGGGATAGAC 정방향 25 471 2
COCJ_CO1_R GCATCTGGGTAGTCTGAATAACGACGC 역방향 27 - 3
ITS COCJ_its_F GTACGTGAGTACGTGTGTG 정방향 19 67, 124 4
COCJ_its_R GGTAGTGGTAGTATGTATG 역방향 19 5
보다 구체적으로 상기 표 7의 프라이머는 대게와 홍게의 CO1 유전자 및 ITS 유전자에 있어 특정 크기의 산물을 증폭하도록 제작되었다(도 6 참고). 서열번호 1 및 서열번호 3의 프라이머쌍은 홍게의 CO1 유전자에 대하여 358bp 크기의 산물을 증폭하도록 제작되었다. 더불어 서열번호 2 및 서열번호 3의 프라이머쌍은 대게의 CO1 유전자에 대하여 471bp 크기의 산물을 증폭하도록 제작되었다.
또한, 서열번호 4 및 서열번호 5의 프라이머쌍은 ITS 유전자에 있어, 대게에서는 124bp 크기의 산물을 증폭하도록 제작되었고, 홍게에 있어서는 67bp 크기의 산물을 증폭하도록 제작되었다.
실시예 5. 제작된 종 특이 프라이머의 검증
상기 표 7의 프라이머가 실제 홍게와 대게를 식별할 수 있는지 확인하기 위하여 멀티플렉스 PCR을 수행하였다. 홍게 및 대게의 준비(각 5개체) 및 이로부터 gDNA를 추출하는 방법은 상기 실시예 1과 동일하게 수행하였다. 20 μl 용적의 AccuPower Gold multiplex PCR Premix Kit(Bioneer, Korea)에 gDNA 100 ng과 표 4의 프라이머를 각각 10 pmole 첨가한 후, 95℃에서 30초의 변성 반응을 유도하고 57℃에서 30초, 72℃에서 30초의 순환 반응을 30회 실시한 후, 최종적으로 72℃에서 5분간 신장 반응을 수행하였다.
멀티플렉스 PCR 반응의 성공 여부는 1차적으로 Eco dye(Biofact, Korea)로 염색된 1.5% 아가로오스 겔에 전기영동하여 확인하였으며, 최종적으로 단편 분석기(Fragment analyzer (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)에서 전기영동하고, PRO size 3.0.1.6 소프트웨어(Agilent Technologies Inc., Waldbronn, Germany)를 이용하여 종 특이적 밴드를 확인하였다. 그 결과 대게 5개체에서 약 471 bp의 CO1 유전자에 대한 멀티플렉스 PCR 산물과 약 124 bp의 ITS 유전자 영역의 멀티플렉스 PCR 산물을 확인할 수 있었다. 더불어 홍게 5개체에서 약 358 bp의 CO1 유전자에 대한 멀티플렉스 PCR 산물과 약 67 bp의 ITS 유전자 영역의 멀티플렉스 PCR 산물을 확인할 수 있었다(도 7 및 도 8 참고).
그러므로, 본 발명에 따른 홍게와 대게의 미토콘드리아 DNA의 CO1 유전자와 핵 DNA의 ITS 유전자 영역을 이용하여 개발한 프라이머 세트는 신속하면서도 정확하게 홍게와 대게를 판별할 수 있음을 확인하였다.
종합적으로 본 발명은 홍게와 대게의 미토콘드리아 DNA의 CO1 유전자와 핵 DNA의 ITS 유전자 영역을 이용하여 개발한 프라이머 세트에 대한 것으로, 상기 프라이머 세트를 이용한 멀티플렉스 PCR을 통해 비특이적 결합 밴드가 없으면서도, 홍게와 대게를 정확하게 판별할 수 있음을 확인한 바, 이를 수산 산업에 있어서 홍게와 대게를 판별하는데 유용하게 사용할 수 있다.
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Claims (10)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트;
    서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트; 및
    서열번호 4 및 서열번호 5로 표시되는 프라이머 세트를 포함하는, 홍게 또는 대게 판별용 멀티플렉스(multiplex) PCR용 프라이머 세트.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트는 홍게의 CO1 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 서열번호 2 및 서열번호 3으로 표시되는 프라이머 세트는 대게의 CO1 유전자를 증폭하는 것을 특징으로 하는, 프라이머 세트.
  4. 제 1항에 따른 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약;을 포함하는 홍게 또는 대게 판별용 키트.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것을 특징으로 하는, 판별용 키트.
  6. 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제 1항에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적서열을 증폭하여 증폭 산물을 생성하는 단계; 및
    상기 증폭 산물을 검출하는 단계를 포함하는, 홍게 또는 대게 판별 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 증폭 반응은 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR)을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 판별 방법.
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 프라이머 세트의 농도는 2.5 내지 15 pmol/μl인 것을 특징으로 하는, 판별 방법.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는, 판별 방법.
  10. 삭제
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