KR102327643B1 - 녹각 판별을 위한 분자 마커 및 이의 용도 - Google Patents

녹각 판별을 위한 분자 마커 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102327643B1
KR102327643B1 KR1020210036057A KR20210036057A KR102327643B1 KR 102327643 B1 KR102327643 B1 KR 102327643B1 KR 1020210036057 A KR1020210036057 A KR 1020210036057A KR 20210036057 A KR20210036057 A KR 20210036057A KR 102327643 B1 KR102327643 B1 KR 102327643B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antlers
derived
primer
seq
present
Prior art date
Application number
KR1020210036057A
Other languages
English (en)
Inventor
조형권
성락선
최봉석
김성주
Original Assignee
주식회사 한풍네이처팜
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 한풍네이처팜 filed Critical 주식회사 한풍네이처팜
Priority to KR1020210036057A priority Critical patent/KR102327643B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102327643B1 publication Critical patent/KR102327643B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 녹각 판별을 위한 분자 마커인 프라이머 및 이를 이용한 녹각 판별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 마커는 매화록, 마록, 대록 및 순록을 특이적으로 판별할 수 있는 바, 대한민국약전외한약(생약)규격집 및 식품공전에 등재된 기원종 유래 뿔과 순록의 뿔을 판별함으로써 효과적으로 위품 또는 혼용 위품을 제외할 수 있다.

Description

녹각 판별을 위한 분자 마커 및 이의 용도{Molecular markers for identification of antlers and their use}
본 발명은 녹각 판별을 활용하여 종(species)분류를 위한 분자 마커인 프라이머 및 이를 이용한 녹각 판별 방법에 관한 것이다.
녹각은 사슴의 각질화(골질화)된 뿔로써, 새로 자라기 시작한 사슴의 뿔이 시간이 지나 가을이 되면서 내부의 칼슘이 단단하게 각질화된 것을 의미한다. 늦봄에 새로 자라기 시작한 사슴의 뿔인 녹용과 구분되며, 녹용이 시간이 지나 가을이 되면서 각질화되면 이를 녹각이라고 부른다. 대한민국약전외한약(생약)규격집(KHP)과 식품공전에서는 녹각의 기원은 매화록(Cervus nippon Temminck), 마록(Cervus elaphus Linnι) 또는 대록(Cervus canadensis Erxleben)의 골질화된 뿔로 규정되어 있다.
녹각의 성질은 <신농본초경>에는 "따뜻하다"로 되어 있고, <명의별록>에는 "맛은 짜고 성질은 조금 따뜻하며 독이 없다"고 되어 있다. 또한 녹각의 약효로는 <신농본초경>에는 "악창옹종>(惡瘡擁腫)을 다스리며, 사악기(邪惡氣)와 음(陰) 속에 들어 있는 혈(血)을 제거한다고 기록되어 있으며, <명의별록>에는 아랫배의 혈급통(血急痛), 허리와 등이 아픈 증세, 절상악혈(折傷惡血)을 제거하며 익기(益氣)한다고 기록되어 있다. <본초강목>에는 "녹각을 생것을 쓰면 산열행혈(散熱行血), 소종피사(消腫)한다. 찐 것을 쓰면 익신보허(益腎補虛), 강정활혈(强精活血)한다. 상(霜)이나 바짝 졸여 고(膏)로 만들어 먹으면 오로지 자보(滋補)한다"고 기록되어 있는 바, 한약재로 널리 사용되고 있다.
그러나, 녹각은 기원종인 매화록, 마록, 대록 유래 녹각과 위품 또는 혼용 위품으로 사용되는 순록(Rangifer tarandus)의 녹각을 육안으로 감별하기 어려워 품질관리에 많은 어려움이 있을 뿐만 아니라, 신제품 개발시에도 기원에 적합한 녹각을 사용함에 있어서 신중을 기할 필요가 있으므로, 이에 따라 기원종 유래 녹각을 구별하기 위한 방법의 개발 필요성이 지속적으로 대두되어 왔다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 녹각 판별을 위한 분자 마커를 개발하고 이를 이용하여 대한민국약전외한약(생약)규격집 및 식품공전에 등재되어 있는 기원종 유래 녹각과 순록의 녹각을 효과적으로 구별할 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 녹각 판별용 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 (a) 녹각으로부터 추출된 미토콘드리아 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머를 이용하여 미토콘드리아 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭된 산물의 DNA 단편 크기를 측정하여 녹각이 유래한 종을 결정하는 단계;를 포함하는, 녹각 판별 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 세트, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는, 녹각 판별용 키트를 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는, 녹각 판별용 프라이머를 제공한다.
본 발명에서 용어, "녹각(antlers)"은 사슴의 각질화(골질화)된 뿔로써, 새로 자라기 시작한 사슴의 뿔이 시간이 지나 가을이 되면서 내부의 칼슘이 단단하게 각질화된 것을 의미한다. 대한민국약전외한약(생약)규격집(KHP)과 식품공전에서는 녹각의 기원은 매화록(Cervus nippon Temminck), 마록(Cervus elaphus Linnι) 또는 대록(Cervus canadensis Erxleben)의 골질화된 뿔로 규정되어 있다.
한약재는 건조하여 마쇄 또는 절단되어 유통되므로, 형태학적으로 판별하기 어렵다. 특히 녹각의 경우, 기원종인 매화록, 마록, 대록 유래 녹각과 위품 또는 혼용 위품으로 사용되는 순록(Rangifer tarandus)의 녹각을 구분하기 어려워 경제적으로 막대한 손실이 있어 왔으며, 이에 따라 기원종 유래 녹각을 구별하기 위한 방법의 필요성이 지속적으로 대두되어 왔다.
이에, 본 발명은 기원종 유래 녹각과 순록의 녹각을 효과적으로 구별할 수 있는 분자 마커를 최초로 발굴하여, 이를 이용한 분자유전학적 방법을 통해 소량의 샘플만으로 녹각의 기원종을 확인함으로써, 위품 또는 혼용 위품을 구별할 수 있도록 한 것에 의의가 있다.
본 발명에서 용어, "프라이머(primer)"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 의미하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 하며, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라, 온도, 시간 및 이온 강도와 같은 이용 조건에 의존할 것이다. 구체적 예로, 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 Guanine 및 cytosine의 함량(GC contents), ATGC 염기 배열, 어닐링(annealing) 온도 및 이온 강도 등 여러 조건을 고려하여 결정해야 한다.
본 발명에서 프라이머로 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 구체적인 예로써 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent) 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머는 매화록, 마록, 대록 및 순록 유래 녹각을 각각 특이적으로 검출하여 구별하는 것일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머는 매화록 유래 녹각, 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머는 마록 유래 녹각, 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머는 대록 유래 녹각 및 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머는 순록 유래 녹각을 각각 특이적으로 검출하는 것일 수 있다.
본 발명의 프라이머는 DNA 증폭을 위하여 이용될 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머; 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머; 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머; 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머; 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상은 DNA 증폭을 위하여 이용될 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상 또는 4종 이상 모두 사용될 수 있고, 다수의 프라이머가 동시에 사용됨으로써 보다 빠르게 녹각을 판별할 수 있다.
상기 프라이머는 미토콘드리아 COI(cytochrome c oxidase subunit 1) 구간에서 염기서열 분석을 통하여 해당 종에만 특이적으로 나타나는 단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)를 탐색하고, 이의 말단을 미스매치(mismatch)시켜 디자인된 SNP 프라이머일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 프라이머는 범용성 프라이머로써 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 판별의 대상이 되는 녹각은 매화록, 마록, 대록 및 순록으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 본 발명의 프라이머를 사용한 다중 대립 유전자-특정 PCR(Multiplex allele-specific PCR)을 이용하면 이로부터 복제된 PCR 산물의 밴드 크기로부터 매화록, 마록, 대록 및 순록을 특이적으로 판별할 수 있음을 확인하였다(도 1). 구체적으로, 본 발명의 서열번호 1의 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA의 단편 크기가 361 내지 371 bp, 보다 구체적으로 366 bp이면 매화록, 서열번호 2의 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA의 단편 크기가 316 내지 326 bp, 보다 구체적으로 321 bp이면 마록, 서열번호 3의 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA의 단편 크기가 199 내지 209 bp, 보다 구체적으로 204 bp이면 대록, 서열번호 4의 프라이머를 이용하여 증폭된 DNA의 단편 크기가 111 내지 121 bp, 보다 구체적으로 116bp이면 순록으로 판별할 수 있다.
즉, 본 발명의 SNP 프라이머를 이용하여 다중 대립 유전자-특정 PCR을 수행할 경우 매화록, 마록, 대록 및 순록 유래 녹각을 동시에 분석할 수 있으면서도 각각 특이적으로 판별할 수 있어 종래 기술에 비해 우수하다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 녹각으로부터 추출된 미토콘드리아 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머를 이용하여 미토콘드리아 DNA를 증폭하는 단계; 및 (b) 상기 증폭된 DNA의 단편 크기를 측정하여 녹각이 유래한 종을 결정하는 단계;를 포함하는, 녹각 판별 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 (a) 단계에서 녹각으로부터 미토콘드리아 DNA를 추출하는 방법은, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있다. 예컨대, CRAB 방법, 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법 등을 이용하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (a) 단계에서 프라이머는, 전술한 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 프라이머를 의미한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 프라이머는 1종 이상, 2종 이상, 3종 이상 또는 4종 이상 모두 사용될 수 있고, 다수의 프라이머가 동시에 사용됨으로써 보다 빠르게 녹각을 판별할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 프라이머는, 범용성 프라이머로써 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 (a) 단계에서 미토콘드리아 DNA의 증폭은 중합효소연쇄반응(PCR), 다중 대립 유전자-특정 PCR(Multiplex allele-specific PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system) 또는 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification)를 통한 증폭 혹은 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 제한없이 사용할 수 있고, 구체적으로 상기 (a) 단계에서 미토콘드리아 DNA는 다중 대립 유전자-특정 PCR(Multiplex allele-specific PCR)을 이용하여 증폭하는 것일 수 있다. 상기 다중 대립 유전자-특정 PCR은 단일 PCR에서 본 발명의 프라이머를 이용하여 DNA의 증폭과 동시에 녹각의 유래 종을 판별할 수 있다.
본 발명에 있어서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이며, 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용할 수도 있다. 상기 PCR 반응 혼합액은 국내 밀 품종에서 추출된 미토콘드리아 DNA와 본 발명에 따른 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및/또는 물을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 (b) 단계는 상기 증폭 산물을 분석하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 증폭된 산물의 분석은 DNA 칩, 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 랩 온어 칩 (lab-on-a-chip) 전기영동을 수행할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다. 또한, 은염색 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 가시화될 수 있다.
상기 (b) 단계에서는 상기 증폭된 DNA의 단편 크기를 측정하여 녹각이 유래한 종을 결정할 수 있다.
구체적으로, 상기 증폭된 DNA의 단편 크기가 361 내지 371 bp, 보다 구체적으로 366 bp인 경우, 녹각이 매화록으로부터 유래된 것으로 결정할 수 있다.
상기 증폭된 DNA의 단편 크기가 316 내지 326 bp, 보다 구체적으로 321 bp인 경우, 녹각이 마록으로부터 유래된 것으로 결정할 수 있다.
상기 증폭된 DNA의 단편 크기가 199 내지 209 bp, 보다 구체적으로 204 bp인 경우, 녹각이 대록으로부터 유래된 것으로 결정할 수 있다.
상기 증폭된 DNA의 단편 크기가 111 내지 121 bp, 보다 구체적으로 116bp인 경우, 녹각이 순록으로부터 유래된 것으로 결정할 수 있다.
본 발명의 목적상, 상기 판별의 대상이 되는 녹각은 매화록, 마록, 대록 및 순록으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 프라이머, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액을 포함하는, 녹각 판별용 키트를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 키트에서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 및 이들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 프라이머일 수 있다.
또한 완충용액은 PCR 반응에 필요할 수 있고, 이는 당업계에서 통상적으로 공지된 조성을 가지며, 예를 들면 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 PCR 산물의 증폭 여부 및 이의 크기를 확인할 수 있는, 전기영동에 필요한 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 프라이머를 이용한, 녹각 선별 방법을 제공한다.
본 발명의 마커는 매화록, 마록, 대록 및 순록을 특이적으로 판별할 수 있는 바, 기원종 유래 녹각과 순록의 녹각을 판별함으로써 효과적으로 위품 또는 혼용 위품을 제외할 수 있다.
도 1은 본 발명의 프라이머를 사용하여 증폭된 PCR 산물의 전기영동 결과를 나타낸 도이다. 왼쪽부터 1~6 lane: 매화록, 7~9 lane: 마록, 10~12 lame: 대록, 13~21 lane: 순록.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 녹각 특이적 분자 마커 발굴
기원종인 매화록(Cervus nippon Temminck), 마록(Cervus elaphus Linnι) 또는 대록(Cervus canadensis Erxleben) (사슴과 Cervidae)과 위·혼용 위품으로 사용되는 순록(Rangifer tarandus) 녹각의 미토콘드리아 COI(cytochrome c oxidase subunit 1) 구간에서 염기서열 분석을 통하여 해당 종에만 특이적으로 나타나는 염기서열[단일 염기 다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)]을 탐색하고, 이를 바탕으로 특이 프라이머 CN_F, CE_F, CC_F 및 RT_F를 디자인하였다. 각 SNP 프라이머는 말단을 미스매치(mismatch)시켜 디자인하였으며(Gaudet et al., Single Nucleotide Polymorphismspp 415:424., 2009; Liu et al., Plant Methods 2012, 8:34), 특이 프라이머 CN_F, CE_F, CC_F 및 RT_F는 각각 하기 표 1과 같이 디자인하였다. 염기서열에서 밑줄 친 뉴클레오티드는 의도적으로 도입된 추가 미스매치를 나타낸다.
Primer
name		 Nucleotide sequences (5’-> 3’) Location Specificity
LCO1490(F) GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG(서열번호 5)
 COI Universal
primer
HCO2198(R) TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA(서열번호 6) COI Universalprimer
CN_F AGGAACAGGCTGAACTGTA g AC(서열번호 1) 320-342 C. nippon
CE_F TATTTTTTCTTTACACTTAGCA c G C(서열번호 2) 363-387 C. elaphus
CC_F ATCACAATATCAAACCCCTTTA g TC(서열번호 3) 480-504 C. canadensis
RT_F ATTACAATACTACTAACAGACCGA AAT(서열번호 4) 566-592 R.tarandus
실시예 2. 녹각 특이적 분자 마커를 이용한 녹각 판별
실시예 1에서 미토콘드리아 COI 구간으로부터 디자인된 특이 프라이머를 사용한 다중 대립 유전자-특정 PCR(Multiplex allele-specific PCR)을 이용하여 매화록(C. nippon), 마록(C. elaphus), 대록(C. canadensis) 및 순록(R. tarandus)을 판별하였다.
구체적으로, CN_F, CE_F, CC_F, RT_F 및 양성대조군으로 범용성 프라이머(LCO1490(F) 및 HCO2198(R))를 이용하여 매화록, 마록, 대록 및 순록을 특이적으로 판별할 수 있는지를 확인하기 위해, AccuPower® HotStart PCR PreMix(Bioneer, K-5050, Lot. No.: 2029211K)를 사용하여 표 2의 #1 내지 #7로 표시되는 주형 DNA을 50 ng으로 포함하는 총 20 μl의 반응물을 제조하고, 이에 CN_F, CE_F, CC_F, RT_F 및 범용성 프라이어(LCO1490(F) 및 HCO2198(R))를 각각 0.2 μM, 0.2 μM, 0.1 μM, 0.2 μM, 0.2 μM, 0.2 μM로 포함하는 프라이머 조성물을 혼합하였다. 이를 94℃에서 5 min 1 cycle, 94℃에서 30 sec로 변성, 52.6℃에서 30 sec로 어닐링, 72℃에서 30 sec로 35 cycle 중합, 72℃에서 10 min로 신장 단계를 수행하였다. 이후, PCR 산물을 3% 아가로스 겔에서 150V로 45분 동안 전기영동하여 밴드를 확인하였다.
Figure 112021032703686-pat00001
그 결과, 범용성 프라이어(LCO1490(F) 및 HCO2198(R))로부터 확인된 양성 밴드는 709bp, CN_F, CE_F, CC_F, RT_F에 대한 밴드는 각각 366 bp, 321 bp, 204 bp, 116bp 임을 확인하였다(도 1).
이를 통해 본 발명의 프라이머를 통해 매화록, 마록, 대록 및 순록을 특이적으로 판별할 수 있음을 알 수 있다.
상기 실시예의 결과로부터, 본 발명의 프라이머를 이용하여 매화록, 마록, 대록 및 순록을 특이적으로 판별할 수 있음을 확인한 바, 실시예와 같이 기원종 유래 녹각과 순록의 녹각을 판별하여 효과적으로 위품 또는 혼용 위품을 제외할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> HANPOONG NATURE PHARM Co., Ltd. <120> Molecular markers for identification of antlers and their use <130> KPA201813-KR <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CN_F <400> 1 aggaacaggc tgaactgtag ac 22 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CE_F <400> 2 tattttttct ttacacttag cacgc 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CC_F <400> 3 atcacaatat caaacccctt tagtc 25 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RT_F <400> 4 attacaatac tactaacaga ccgaaat 27 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LCO1490(F) <400> 5 ggtcaacaaa tcataaagat attgg 25 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCO2198(R) <400> 6 taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

Claims (5)

  1. 서열번호 1 내지 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 4종의 프라이머; 및 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트를 포함하는, 다중 대립 유전자-특정 PCR(Multiplex allele-specific PCR)용 녹각 판별용 프라이머 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 조성물은 매화록, 마록, 대록 및 순록 유래 녹각을 구별하는 것으로써,
    상기 서열번호 1의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머는 매화록(Cervus nippon Temminck) 유래 녹각을 검출하고;
    상기 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머는 마록(Cervus elaphus Linnι) 유래 녹각을 검출하고;
    상기 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머는 대록(Cervus canadensis Erxleben) 유래 녹각을 검출하고; 또는
    상기 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머는 순록(Rangifer tarandus) 유래 녹각을 검출하는 것인, 프라이머 조성물.
  3. (a) 녹각으로부터 추출된 미토콘드리아 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 조성물을 이용하여 미토콘드리아 DNA를 증폭하는 단계; 및
    (b) 상기 증폭된 DNA의 단편 크기를 측정하여 녹각이 유래한 종을 결정하는 단계;를 포함하는, 녹각 판별 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (b) 단계는,
    증폭된 DNA의 단편 크기가 361 내지 371 bp인 경우, 녹각이 매화록으로부터 유래된 것으로 결정하고;
    상기 (b) 단계는 증폭된 DNA의 단편 크기가 316 내지 326 bp인 경우, 녹각이 마록으로부터 유래된 것으로 결정하고;
    상기 (b) 단계는 증폭된 DNA의 단편 크기가 199 내지 209 bp인 경우, 녹각이 대록으로부터 유래된 것으로 결정하고; 또는
    상기 (b) 단계는 증폭된 DNA의 단편 크기가 111 내지 121 bp인 경우, 녹각이 순록으로부터 유래된 것으로 결정하는 것인, 방법.
  5. 제1항의 프라이머 조성물, DNA 중합효소, dNTPs 및 완충용액으로 구성된, 녹각 유래 종(species) 분류용 키트.
KR1020210036057A 2021-03-19 2021-03-19 녹각 판별을 위한 분자 마커 및 이의 용도 KR102327643B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210036057A KR102327643B1 (ko) 2021-03-19 2021-03-19 녹각 판별을 위한 분자 마커 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210036057A KR102327643B1 (ko) 2021-03-19 2021-03-19 녹각 판별을 위한 분자 마커 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR102327643B1 true KR102327643B1 (ko) 2021-11-17

Family

ID=78703259

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210036057A KR102327643B1 (ko) 2021-03-19 2021-03-19 녹각 판별을 위한 분자 마커 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102327643B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114231644A (zh) * 2022-01-21 2022-03-25 中国农业科学院特产研究所 一种与梅花鹿茸重性状相关的snp分子标记及其检测引物、试剂盒和应用
KR20230102536A (ko) 2021-12-30 2023-07-07 주식회사 한풍네이처팜 저분자녹각콜라겐 및 저분자녹각콜라겐추출복합물을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물 및 이를 포함한 건강식품

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070005401A (ko) * 2005-07-06 2007-01-10 한국 한의학 연구원 붉은 사슴, 일본 사슴, 엘크 및 순록의 유전자에 특이적인프라이머 및 상기 프라이머를 이용하여 녹용 품종을식별하는 방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070005401A (ko) * 2005-07-06 2007-01-10 한국 한의학 연구원 붉은 사슴, 일본 사슴, 엘크 및 순록의 유전자에 특이적인프라이머 및 상기 프라이머를 이용하여 녹용 품종을식별하는 방법

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20230102536A (ko) 2021-12-30 2023-07-07 주식회사 한풍네이처팜 저분자녹각콜라겐 및 저분자녹각콜라겐추출복합물을 유효성분으로 함유하는 피부건강 개선용 식품 조성물 및 이를 포함한 건강식품
CN114231644A (zh) * 2022-01-21 2022-03-25 中国农业科学院特产研究所 一种与梅花鹿茸重性状相关的snp分子标记及其检测引物、试剂盒和应用
CN114231644B (zh) * 2022-01-21 2023-08-18 中国农业科学院特产研究所 一种与梅花鹿茸重性状相关的snp分子标记及其检测引物、试剂盒和应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101403494B1 (ko) 고구마의 품종판별을 위한 ｓｓｒ 프라이머 및 이를 이용한 고구마의 품종 판별 방법
KR102327643B1 (ko) 녹각 판별을 위한 분자 마커 및 이의 용도
KR102320249B1 (ko) 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 판별방법
KR101835124B1 (ko) 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20140039866A (ko) 참외 계통 또는 품종의 구별을 위한 ｓｓｒ 프라이머 세트 및 이들의 용도
KR102461815B1 (ko) 밀 고분자 글루테닌 조성 분석용 TaqMan 분자표지 및 이의 용도
KR100842432B1 (ko) 귤에서 유래된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR101858960B1 (ko) 단일염기다형성 마커를 이용한 양배추 품종식별 방법 및 키트
KR101826732B1 (ko) 단일염기다형성 (snp) 마커를 이용한 국화 품종식별 방법 및 키트
KR101747266B1 (ko) 단일염기다형성(snp) 마커를 이용한 참깨 품종식별 방법 및 키트
KR102207825B1 (ko) 백수오와 이엽우피소 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별방법
KR20230109925A (ko) 대용량 고효율의 밀 품종 식별을 위한 snp 마커, 프라이머 세트, 및 이의 용도
KR102174274B1 (ko) 대추 품종 &#39;보은&#39;과 &#39;추석&#39;을 판별하기 위한 분자마커 및 이의 용도
KR100920369B1 (ko) ＣｈｉＶＭＶ저항성 고추 품종을 선별하기 위한 프라이머세트, 방법 및 키트
KR102296889B1 (ko) 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별용 분자마커 및 이를 이용한 토마토 점무늬병 저항성 또는 이병성 품종 판별방법
KR102267332B1 (ko) 고구마 품종 판별용 snp 마커 및 이를 이용한 품종 판별 방법
KR20100079527A (ko) 팥에서 분리된 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR100769367B1 (ko) 기장에서 유래한 ｓｓｒ 프라이머 및 이의 용도
KR102412793B1 (ko) 국산 밀 품종 판별을 위한 snp 유전자 마커와 프라이머 세트 및 이의 용도
KR102592643B1 (ko) 농어와 점농어 종 판별을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용하여 농어와 점농어를 판별하는 방법
JP3685478B2 (ja) 米試料の品種判別方法
KR102009627B1 (ko) 야생종 토마토 및 재배종 토마토 판별용 토마토 삽입-결실 마커 프라이머 세트
KR102313439B1 (ko) 진교, 진범, 흰진범 판별용 분자마커
KR102185435B1 (ko) 백수오와 이엽우피소 판별용 조성물 및 이를 이용한 판별방법
KR20100087891A (ko) 땅콩에서 유래한 에스에스알 프라이머 및 그 용도

Legal Events

Date Code Title Description
GRNT Written decision to grant