KR102320249B1 - 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 판별방법 - Google Patents

도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 판별방법 Download PDF

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Abstract

도라지 꽃색을 판별할 수 있는 프라이머 세트가 개시된다. 본 발명은 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트 및 조성물 그리고 도라지 꽃색 판별방법에 관한 것이다.

Description

도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트 및 이를 이용한 판별방법{Primer set for discriminating flower color of Platycodon grandiflorus and method for discriminating flower color of Platycodon grandiflorus}
본 발명은 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트, 이를 포함하는 키트, 그리고 도라지 꽃색 판별방법에 관한 것이다.
초롱꽃과(Campanulaceae family)의 도라지(Platycodon grandiflorus)는 식용과 약용뿐만 아니라 화훼용(관상용)으로도 널리 재배되고 있다. 주로 꽃색이 보라색과 분홍색인 도라지가 화훼용으로 재배되고 있다. 화색을 조기에 판별하는 것은 화훼 소비자의 취향을 다양한 측면에서 충족시킬 수 있고, 원하는 화색의 도라지를 선별하여 재배할 수 있으므로 화훼농가의 노동력 감소에 도움이 될 것이다. 그러나, 도라지는 꽃색을 제외한 다른 표현형은 동일하므로, 개화전까지는 실제 꽃색을 판별할 수 없는 문제가 있다.
따라서 도라지 꽃의 색을 종자 및 생육 초기에 판별할 수 있는 분자표지의 개발이 필요하다.
대한민국 등록특허 10-1912192호
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 도라지 꽃색을 판별할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 또는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는, 도라지 꽃색 판별방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일실시예는 서열번호 1 및 2로 표시되는 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트이다.
상기 도라지 꽃색은 흰색, 보라색 또는 분홍색일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 서열번호 1 및 2로 표시되는 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트를 포함하는 도라지 꽃색 판별용 키트이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 서열번호 1 및 2로 표시되는 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트를 포함하는 도라지 꽃색 판별용 조성물이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 (a) 도라지 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계, (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하는 단계, 그리고 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 도라지 꽃색 판별 방법이다.
상기 도라지 시료는 도라지의 종자, 뿌리, 잎, 줄기 및 꽃으로 이루어진 군에서 유래된 1종 이상의 조직일 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 꽃이 피기 전인 종자 또는 생육 초기에 도라지 꽃색을 판별하여 도라지 신품종 육종에 활용할 수 있다.
도 1은 도라지의 꽃색 간 차이를 보이는 9개 변이 지역(SNP)의 주성분분석(PCA) 결과를 나타내는 이미지이고,
도 2는 본 발명에 따른 분자표지 M1의 PCR 산물 전기영동 결과이고,
도 3은 본 발명에 따른 분자표지 M1의 PCR 산물 염기서열 분석결과이고,
도 4는 본 발명에 따른 분자표지 M1의 PCR 산물을 제한효소로 처리하고 전기영동한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 구체적인 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
본 발명의 일실시예는 서열번호 1 및 2로 표시되는 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트이다.
본 명세서에 사용된 용어, "프라이머(primer)"는 자유 3' 말단에 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 짧은 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형의 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액, 중합반응을 위한 시약, 상이한 4가지 뉴클레오티드 트리포스페이트(nucleotide triphosphate) 및 DNA 중합효소 또는 역전사효소의 존재 하에 적절한 온도에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명에서 상기 프라이머 세트에 포함되는 프라이머는 올리고뉴클레오티드가 이용될 수 있고, 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 도라지 꽃색은 흰색, 보라색 또는 분홍색일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 상기 프라이머 세트를 포함하는 도라지 꽃색 판별용 키트이다.
본 발명의 키트에서, 상기 프라이머 세트 이외에 상기 증폭반응을 수행하기 위한 시약을 포함할 수 있으며, 구체적으로 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한 본 발명의 또 다른 실시예는 상기 프라이머 세트를 포함하는 도라지 꽃색 판별용 조성물이다.
본 발명의 또 다른 실시예는 (a) 도라지 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계,
(b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 반응을 수행하는 단계, 그리고 (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 도라지 꽃색 판별방법이다.
본 발명에서 상기 도라지 시료는 도라지의 종자, 뿌리, 잎, 줄기 및 꽃으로 이루어진 군에서 유래된 1종 이상의 조직일 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 (a)는 도라지 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계로 사용될 수 있는 시료의 예는 상기에서 설명한 바와 같으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 도라지 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 DNA 추출 키트를 사용할 수 있으며, 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 용이하게 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 (b)는 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 표적서열을 증폭 시키는 것이다.
본 발명에서 표적서열을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chainreaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Q 복제효소(Q replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법을 사용할 수 있고, 당업계에 공지된 방법을 당업자에 의해 적절하게 변형하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일실시예에서는 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통해 표적 서열을 증폭시켰다.
본 발명에서 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 가장 바람직하게는, 6% 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5, Cy-3 또는 6-FAM을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행 시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 구체적인 실시예를 들어 설명한다.
실시예 1 : 도라지의 꽃색 관련 변이지역 탐색
흰색, 보라색, 분홍색의 꽃색을 가지는 도라지 식물체들의 전사체를 차세대염기서열분석(Next-generation sequencing, NGS) 기술을 이용하여 분석하였고, 이로부터 생산된 sequencing data를 장백 도라지 품종의 유전체 서열(포스트게놈 다부처유전체사업단 생산)에 mapping하였다. 이를 이용하여 꽃색 간의 변이를 탐색하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
SNP 정보 대립유전자
(Allele)		 대립유전자 빈도
(Minor allele frequency)
SNP no. 참조게놈
서열ID
(Reference genome sequence ID)		 참조게놈
위치
(Reference genome sequence position)		 Ref Alt Minor allele Major allele 분홍꽃
유전자
(pink flower allele)		 흰꽃
유전자
(white flower allele)		 보라색꽃
유전자
(purple flower allele)
1 Scaffold1316 87539 A T T A 1.000 0.275 0.100
2 Scaffold187 140322 C T T C 0.075 0.800 0.200
3 Scaffold196 181643 A G A G 0.000 0.875 0.425
4 Scaffold255 99603 G C G C 0.025 0.075 0.625
5 Scaffold4413 31488 G A A G 0.000 0.125 0.625
6 Scaffold4413 43747 C T C T 0.000 0.375 0.825
7 Scaffold4490 42390 G C C G 0.050 0.700 0.175
8 Scaffold4532 49599 A G G A 0.850 0.200 0.050
9 Scaffold4640 216155 T C C T 0.825 0.050 0.111
10 Scaffold1057 84712 A G A G 0.000 0.306 0.775
11 Scaffold1204 75758 A T A T 0.000 0.600 0.725
12 Scaffold1268 96234 T A A T 0.675 0.125 0.050
13 Scaffold1347 65547 C T T C 0.825 0.150 0.100
14 Scaffold150 69594 T G G T 0.875 0.150 0.225
15 Scaffold1683 35588 G C C G 0.975 0.200 0.325
16 Scaffold1753 370703 C G C G 0.975 0.300 0.211
17 Scaffold182 154011 G T T G 0.000 0.625 0.750
18 Scaffold187 146561 A T T A 0.100 0.800 0.275
19 Scaffold193 74047 A C C A 0.025 0.711 0.605
20 Scaffold2049 323782 C G G C 0.775 0.050 0.150
21 Scaffold2120 93936 C G G C 0.000 0.125 0.600
22 Scaffold2310 168712 T C T C 0.075 0.750 0.658
23 Scaffold2440 2091 G C G C 0.000 0.800 0.675
24 Scaffold3239 5728 T C C T 0.026 0.825 0.611
25 Scaffold3584 94674 A T T A 0.737 0.050 0.125
26 Scaffold40 161124 C T T C 0.800 0.100 0.150
27 Scaffold4276 255981 C T T C 0.000 0.050 0.525
28 Scaffold4387 255504 C T T C 0.000 0.675 0.575
29 Scaffold4452 83629 T A T A 0.025 0.725 0.722
30 Scaffold4494 202888 T C C T 0.800 0.150 0.206
31 Scaffold4513 11242 C T T C 0.775 0.200 0.075
32 Scaffold4610 254441 T G G T 0.750 0.125 0.175
33 Scaffold4652 54329 T C T C 0.000 0.526 0.900
34 Scaffold4745 15115 A G A G 0.000 0.600 0.850
35 Scaffold4801 521953 A C C A 0.875 0.300 0.150
36 Scaffold4841 26920 C G G C 0.775 0.175 0.150
37 Scaffold4887 195639 A G G A 0.900 0.175 0.200
38 Scaffold4887 195728 A G G A 0.750 0.175 0.100
39 Scaffold599 68092 G A A G 0.675 0.079 0.050
40 Scaffold644 41036 G T T G 0.868 0.184 0.225
41 Scaffold889 88178 A T T A 0.900 0.150 0.325
상기 표 1을 살펴보면, 세 종류의 도라지 꽃색 간에 차이를 보이는 41개 변이 지역(single nucleotide polymorphism, SNP) 후보를 확인할 수 있다.
실시예 2 : 도라지의 꽃색 판별용 분자표지 설계
상기 실시예 1에서 세 종류의 도라지 꽃색 간에 차이를 보이는 변이 지역 중 9개 변이 지역을 하기 표 2에 나타내었으며, 9개의 변이 지역을 주성분 분석(principal component analysis, PCA)하고, 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다.
SNP 정보 대립유전자
(Allele)		 대립유전자 빈도
(Minor allele frequency)
SNP no. 참조게놈
서열ID
(Reference genome sequence ID)		 참조게놈
위치
(Reference genome sequence position)		 Ref Alt Minor allele Major allele 분홍꽃
유전자
(pink flower allele)		 흰꽃
유전자
(white flower allele)		 보라색꽃
유전자
(purple flower allele)
1 Scaffold1316 87539 A T T A 1.000 0.275 0.100
2 Scaffold187 140322 C T T C 0.075 0.800 0.200
3 Scaffold196 181643 A G A G 0.000 0.875 0.425
4 Scaffold255 99603 G C G C 0.025 0.075 0.625
5 Scaffold4413 31488 G A A G 0.000 0.125 0.625
6 Scaffold4413 43747 C T C T 0.000 0.375 0.825
7 Scaffold4490 42390 G C C G 0.050 0.700 0.175
8 Scaffold4532 49599 A G G A 0.850 0.200 0.050
9 Scaffold4640 216155 T C C T 0.825 0.050 0.111
상기 표 2 및 도 1을 참조하면, 9개의 변이 지역에서 세 종류의 도라지 꽃색을 구분할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3 : 프라이머 세트 설계
실시예 2에서 확인한 9개의 변이 지역 중, Scaffold4532 서열 내 49,599bp에 위치하는 변이를 선택하였고, 이를 PCR로 증폭하고 Sanger sequencing 분석함으로써 꽃색 연관 genotype을 확인할 수 있도록 하기 위해 SNP 주변 500bp 지역에서 프라이머 세트를 설계(M1)하였으며, 이를 하기 표 3에 나타내었으며, 해당 변이지역(SNP)에 제한효소(CviKI1)의 자리가 존재하므로, Cleaved Amplified Polymorphic Sequence (CAPS) 분자표지로도 사용될 수 있음을 확인하였다.
Marker 정보 대립유전자
(Allele)		 대립유전자 빈도
(Minor allele frequency)		 CAPS 분석을 위한 제한효소
Marker ID Primer (5'-3') Tm
(℃)		 Minor allele Major allele 분홍꽃
유전자
(pink flower allele)		 흰꽃
유전자
(white flower allele)		 보라색꽃
유전자
(purple flower allele)		 CAPS 분석을 위한 제한효소
M1 F TGGAGGCTTCACTATTCAGAGC
(서열번호 1)		 59.83 G A 0.850 0.200 0.050 CviKI1
M1 R TTGCAGGGAAGGGAGAAAATGA(서열번호 2) 59.89
실시예 4 : PCR 증폭
흰색, 보라색, 분홍색의 꽃색을 가지는 도라지 표준 식물체 각 3개체의 잎으로부터 genomic DNA를 추출하고 분자표지 M1의 프라이머 세트를 이용하여 genomic DNA PCR을 수행하였다. 구체적으로 도라지 genomic DNA를 주형으로 각 20ng씩 사용하였고, 1x PCR 버퍼, 0.2 mM dNTP, 1.25 units Taq DNA polymerase, 0.4 pmole 정방향 프라이머, 0.4 pmole 역방향 프라이머를 이용하여 증폭반응을 실시하였다.
단계 온도 및 시간 비교
초기변성 95℃, 5 분
변성 95℃, 20 초 30회 반복
혼성화 60℃, 20 초
중합 72℃, 25 초
중합 72℃, 7 분
실시예 5 : 분자표지 검증
실시예 4에서 증폭한 PCR 산물을 2.5% agarose gel에서 100 volt 40분간 전기영동하고 safety gel stain 시약 (Inclone)으로 염색하고 UV illuminator 하에서 관찰함으로써 PCR 증폭 결과를 확인하였으며, 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다. 또한, 분자표지 M1의 PCR 산물의 direct ABI Sanger sequencing을 진행함으로써 염기서열과 SNP 변이를 확인하였으며, 이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 2를 참조하면, 분자표지 M1은 흰색, 보라색, 분홍색의 꽃색을 가지는 도라지 표준 식물체 genomic DNA를 이용한 PCR 분석에서 모두 특이적인 단일 크기의 증폭산물(PCR product)을 생성한 것을 확인할 수 있다.
또한, 도 3을 참조하면, 분자표지 M1의 증폭산물(408bp)에서는 10개의 SNP와 1개의 InDel 변이가 확인되었으며, SNP 모두는 분홍색만이 다른 염기서열이었고, 보라색과 흰색은 같은 염기서열이었고, InDel에서도 분홍색만이 T 하나가 소실되어 있었다. 서열분석으로부터 4곳의 CviKI1 제한효소 자리를 찾을 수 있었고, 이중 2곳은 분홍색에서만 발견되는 2개의 SNP 지역에 위치한 것을 확인할 수 있다.
실시예 6 : 제한효소 처리 후 분자표지 검증
실시예 4의 분자표지 M1 PCR 산물을 SNP 유래 제한효소 자리에 맞는 제한효소(~5 units)를 3시간 정도 처리하고 2.5% agarose gel에서 100 volt 40분간 전기영동하고 safety gel stain 시약 (Inclone)으로 염색하고 UV illuminator 하에서 관찰함으로써 절단된 band 크기 차이를 확인하였으며, 이에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, 분홍색 꽃색 도라지 식물체에서 약 200bp 정도는 DNA 단편을 생성하고 다른 꽃색(흰색, 보라색) 도라지 식물체에서는 약 400bp DNA 단편을 생성하므로, 분홍색 꽃색을 다른 꽃색(흰색, 보라색)과 구분할 수 있음을 확인할 수 있다.
이와 같이 본 발명인 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하는, 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트를 사용하면 도라지의 꽃이 피기 전에 도라지 꽃의 색을 판별할 수 있다.
이상으로 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명하였다. 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미, 범위 및 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for discriminating flower color of Platycodon grandiflorus and method for discriminating flower color of Platycodon g grandiflorus <130> DP20200115 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 forward primer <400> 1 tggaggcttc actattcaga gc 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1 reverse primer <400> 2 ttgcagggaa gggagaaaat ga 22

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트로서,
    상기 도라지 꽃색 판별은 분홍색 꽃색을, 흰색 꽃색 또는 보라색 꽃색과 구분하는 것을 특징으로 하는 도라지 꽃색 판별용 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 도라지 꽃색 판별용 키트로서,
    상기 도라지 꽃색 판별은 분홍색 꽃색을, 흰색 꽃색 또는 보라색 꽃색과 구분하는 것을 특징으로 하는 도라지 꽃색 판별용 키트.
  4. 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 도라지 꽃색 판별용 조성물로서,
    상기 도라지 꽃색 판별은 분홍색 꽃색을, 흰색 꽃색 또는 보라색 꽃색과 구분하는 것을 특징으로 하는 도라지 꽃색 판별용 조성물.
  5. (a) 도라지 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계,
    (b) 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1 및 2로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR 증폭 반응을 수행하는 단계, 그리고
    (c) 상기 (b) 단계의 증폭된 산물을 검출하는 단계를 포함하는 도라지 꽃색 판별방법으로서,
    상기 도라지 꽃색 판별은 분홍색 꽃색을, 흰색 꽃색 또는 보라색 꽃색과 구분하는 것을 특징으로 하는 도라지 꽃색 판별방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 도라지 시료는 도라지의 종자, 뿌리, 잎, 줄기 및 꽃으로 이루어진 군에서 유래된 1종 이상의 조직인 것을 특징으로 하는 도라지 꽃색 판별방법.
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