KR101835124B1 - 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

고추 병 저항성 품종 판별을 위한 snp 기반 kasp용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 SNP 기반 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 KASP용 프라이머 세트를 이용하면, 고추에서 발생하는 주요 질병에 대한 저항성 또는 감수성 품종 판별을 매우 간단하고 경제적인 방법으로 정확하게 판별할 수 있으므로, 고추 병 저항성 육종 소재 선별 등 분자육종 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

Description

고추 병 저항성 품종 판별을 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도{KASP primer set based on SNP for discriminating pepper disease-resistant cultivar and uses thereof}
본 발명은 고추 병 저항성 또는 감수성 품종 판별을 위한 KASP용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 고추 병 저항성 또는 감수성 품종 판별을 위한 KASP용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 고추의 병 저항성 또는 감수성 품종 판별 방법에 관한 것이다.
고추는 가지과 작물로 전 세계 인구의 3/4 정도가 식품 첨가물과 향신료로 이용하고 있는 가장 중요한 채소 중 하나이며, 전체 채소 중 가장 많은 재배면적을 차지하는 작물이다. 고추의 원산지는 남아메리카이며 콜롬버스가 신대륙 발견 이후 유럽으로 전파되었고 우리나라에는 17세기 초에 일본으로부터 도입되었다. 최근에는 고추의 용도가 식용뿐만 아니라 가공되어 공업용으로도 그 이용이 급격하게 증가되고 있는 추세로서, 주로 고추의 매운맛 성분과 붉은 색소 성분을 이용한 다양한 제품들이 개발되어 이용되고 있다. 고추의 주요성분인 캡사이신은 항암, 항산화 작용이 뛰어나며, 지방분해 효과도 탁월하여 최근 기능성 식품 및 의약품으로의 개발이 가속화 되고 있고, 붉은 색소는 가축의 사료용은 물론 다양한 공업용 천연 색소로서의 역할을 다하고 있다.
우리나라의 고추 육종 기술은 현재 세계적으로 그 능력을 인정받고 있으며 특히, 웅성불임성을 이용한 일대잡종 종자생산 기술과 다양한 병 저항성 품종 개발 기술 등에 있어서 세계적인 우위를 점하고 있다. 고추의 여러 가지 병해충 및 과실 관련 형질에 대한 다양한 분자표지가 개발되어 품종 개발에 이용되고 있으나, 분자표지에 해당하는 DNA 단편을 분석하기 위하여 중합효소 반응 후 전기영동 등 번거로운 절차를 거쳐야 하기 때문에 분석에 많은 시간이 소요되는 등 신속 대량 검정에는 한계가 있다.
전기영동 없이 유전형질을 검정하는 방법 중 HRM(High-resolution melting) 분석은 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, 이하 SNP)을 이용한 PCR 기반의 분석 기법으로 SNP 형태에 따라 형광시료가 감소하는 양상을 해리곡선(melting curve)으로 나타내어 유전형을 구분하는 방법으로 다수의 연구에 널리 사용되고 있다. 그러나 HRM을 이용한 유전형 분석은 그래프의 모양으로 다형성을 검정하는데, PCR 증폭이나 형광시료의 감소 반응이 제대로 이루어지지 않을 경우, 시료의 검정이 불분명하다는 단점이 있다. 최근 PCR 기반의 분석 방법 중 하나로 형광시료를 이용한 KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)이 대두되고 있다. SNP와 같은 염기서열의 차이를 포함한 두 가지의 정방향 프라이머와 공통된 염기서열의 역방향 프라이머를 이용하여 두 개의 DNA 단편을 증폭시키고, 이 때 SNP의 차이에 따른 각기 다른 형광시료가 반응하는 현상으로 유전형을 구분할 수 있다. KASP는 HRM과 비교하였을 때, 실험에 소모되는 시간은 비슷하나 그래프 형태가 아닌 형광물질의 차이를 통해 유전형을 분석할 수 있어 좀 더 명확하다는 장점이 있다.
한편, 한국등록특허 제1531950호에는 '고추 병 저항성 품종 선발용 프라이머 세트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1571791호에는 '고추 품종 구분 연관 SNP 분자마커 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 SNP 기반 KASP용 프라이머 세트 및 이의 용도에 대한 내용은 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고추에서 발생하는 주요 병해충에 대한 병 저항성 또는 감수성 품종 판별에 유용한 SNP 마커를 보다 명확하게 검출할 수 있는 형광시료를 이용한 KASP용 프라이머 세트를 제작하여, 다양한 고추 병 저항성과 관련된 주요 형질들을 신속하게 검정함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 8 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 14 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 21 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및 서열번호 26 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 12 및 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 18 및 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 18 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및 서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 감수성 품종 판별을 위한 KASP용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 병 저항성 또는 감수성 품종 판별을 위한 KASP용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 이용하여 고추의 병 저항성 또는 감수성 품종을 판별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 이용하면, 오이모자이크바이러스(CMV)병, 담배식각바이러스(TEV)병, 고추잎맥모틀바이러스(PVMV)병, 고추마일드반점바이러스(PMMoV)병, 세균성 점무늬병(BS) 또는 고추 역병 등 고추에서 발생하는 주요 질병에 대한 저항성 또는 감수성 품종 판별을 매우 간단하고 경제적인 방법으로 정확하게 판별할 수 있으므로, 고추 병 저항성 육종 소재 선별 등 분자육종 연구에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 오이모자이크바이러스(CMVP0) 저항성에 대한 HRM 프라이머 세트를 이용한 고추 품종 판별 결과이다.
도 2는 오이모자이크바이러스(CMVP0) 저항성에 대한 KASP 프라이머 세트를 이용한 고추 품종 판별 결과이다. Cmr, 저항성; Cmr1/cmr1, 저항성; cmr, 감수성.
도 3은 오이모자이크바이러스(CMVP1) 저항성에 대한 HRM 프라이머 세트를 이용한 고추 품종 판별 결과이다.
도 4는 오이모자이크바이러스(CMVP1) 저항성에 대한 KASP 프라이머 세트를 이용한 고추 품종 판별 결과이다. cmr2, 저항성; heter, 이병성; Cmr2+, 이병성.
도 5는 담배식각바이러스(TEV)에 저항성을 가지는 pvr1 유전자의 유전형을 구분할 수 있는 KASP 프라이머 세트를 이용한 고추 품종 판별 결과이다. pvr1 1 or pvr1 2 , 열성저항성; hetero, (pvr1 1 or pvr1 2 )/(pvr1 + or pvr1), 저항성 혹은 이병성; pvr1 + or pvr1, 저항성 혹은 이병성.
도 6은 고추잎맥모틀바이러스(PVMV)에 대한 저항성을 가진 고추 품종을 판별하기 위해 KASP 프라이머 세트를 이용해 실험한 결과이다. pvr6, 열성저항성; hetero, (pvr6/pvr6 + ), 이병성; pvr6 + , 이병성.
도 7은 토바모바이러스에 대해 저항성을 보이는 L 4 유전자를 가진 고추 품종을 판별하기 위해 KASP 프라이머 세트를 이용해 실험한 결과이다. L4, 담배모자이크바이러스(TMV), 고추마일드반점바이러스(PMMoV) 및 토마토모자이크바이러스(ToMV) 저항성 유전자; H, L4 대립유전자좌 이형접합체; L0, 토바모바이러스 이병성 유전자; L1, 담배모자이크바이러스(TMV), 토마토모자이크바이러스(ToMV) 저항성 유전자; L2, 담배모자이크바이러스(TMV), 토마토모자이크바이러스(ToMV) 저항성 유전자; L3, 담배모자이크바이러스(TMV), 고추마일드반점바이러스(PMMoV), 토마토모자이크바이러스(ToMV) 저항성 유전자.
도 8은 세균성 점무늬병에 대해 KASP 프라이머 세트를 이용한 고추 품종 판별 결과이다. R, 저항성; S, 감수성.
도 9는 고추 역병에 대해 HRM 프라이머 세트를 이용한 고추 품종 판별 결과이다.
도 10은 고추 역병에 대해 KASP 프라이머 세트를 이용한 고추 품종 판별 결과이다. Susceptible, 감수성, Hetero, 저항성; Resistance, 저항성.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 8 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 11 및 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 14 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 21 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및 서열번호 26 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 9 및 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 12 및 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 15 및 서열번호 16의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 18 및 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 18 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및 서열번호 27 및 서열번호 28의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 감수성 품종 판별을 위한 KASP용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"는 PCR 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다.
본 발명의 상기 KASP용 프라이머 세트는 고추 병 저항성 또는 감수성 유전자좌에서 특이적으로 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커의 염기 타입을 검출하는 프라이머 세트이다.
본 발명의 상기 고추 병은 오이모자이크바이러스(CMV)병, 담배식각바이러스(TEV)병, 고추잎맥바이러스(PVMV)병, 고추마일드반점바이러스(PMMoV)병, 세균성 점무늬병(BS) 또는 고추 역병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 KASP용 프라이머 세트는 동일한 역방향 프라이머에 형광시료와 염기서열이 일부 상이한 두 개의 정방향 프라이머를 조합하여 고추 병에 대한 저항성 및 감수성 품종을 판별할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 5의 역방향 프라이머에 서열번호 3의 정방향 프라이머를 사용하면 오이모자이크바이러스(CMV)에 대한 저항성 품종을, 서열번호 5의 역방향 프라이머에 서열번호 4의 정방향 프라이머를 사용하면 오이모자이크바이러스(CMV)에 대한 감수성 품종을 판별할 수 있는 것이다.
본 발명의 상기 KASP용 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라, 서열번호 3 및 5; 서열번호 4 및 5; 서열번호 8 및 10; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 13; 서열번호 12 및 13; 서열번호 14 및 16; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 19; 서열번호 18 및 19; 서열번호 17 및 20; 서열번호 18 및 20; 서열번호 21 및 23; 서열번호 22 및 23; 서열번호 26 및 28; 및 서열번호 27 및 28 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(24개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 3 및 5; 서열번호 4 및 5; 서열번호 8 및 10; 서열번호 9 및 10; 서열번호 11 및 13; 서열번호 12 및 13; 서열번호 14 및 16; 서열번호 15 및 16; 서열번호 17 및 19; 서열번호 18 및 19; 서열번호 17 및 20; 서열번호 18 및 20; 서열번호 21 및 23; 서열번호 22 및 23; 서열번호 26 및 28; 및 서열번호 27 및 28의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트들은 각각의 고추 병에 대한 총 8개의 SNP 마커들을 기반으로 제작되었으며, 상기 SNP 마커들이 고추 병 저항성 품종 판별에 사용될 수 있는 것은 병 저항성 유전자좌의 각 SNP 변이 위치에서 저항성 및 감수성 품종에 따라 특정 염기가 존재하는 확률이 높은 것에 근거한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 병 저항성 또는 감수성 품종 판별을 위한 KASP용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기 프라이머 세트외에 내부대조군(internal control) 프라이머쌍을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 고추 시료에서 분리한 게놈 DNA와 상기 프라이머 세트를 이용하여 고추의 병 저항성 또는 감수성 품종을 판별하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 구체적으로는, (a) 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및 (c) 상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 페놀:클로로포름 추출에 후속한 에탄올 침전화 방법을 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 DNA 중합효소를 첨가하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 상기에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
발명의 방법에 있어서, 상기 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 표지 물질은 FAM, HEX, VIC, JOE, ROX, TAMRA, Cy3 또는 Cy5 등일 수 있다. 표적 서열의 증폭시 프라이머의 5'-말단에 상기 표지 물질을 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 고추 재료 및 SNP 마커 정보
본 발명에 사용한 다양한 품종의 고추 품종들은 캡시쿰 애늄(Capsicum annuum) 계통 '부강'(몬사톤 코리아, CMV 저항성), 'Dempsey'(미국 코넬대, TEV 저항성), 'ECW30R'(경북대, 세균성 점무늬병 저항성) 및 'CM334'(서울대 보유, 역병 저항성), 캡시쿰 치넨세(Capsicum chinense) 'PI159236'(미국 코넬대, PVY 저항성) 그리고 캡시쿰 차코엔세(Capsicum chacoense) 'PI152225'(국립유전자원센터, PMMoV 저항성) 품종이다. 또한, 고추에서 오이모자이크바이러스(CMV), 담배식각바이러스(TEV), 감자바이러스 Y(PVY), 고추잎맥모틀바이러스(PVMV), 고추마일드반점바이러스(PMMoV), 세균성 점무늬병(BS) 및 고추 역병 저항성 및 감수성 품종 판별에 관련된 8개의 SNP 정보와 관련하여 CMV 관련 SNP 정보는 강 등(2010, Theor Appl Genet, 120:1587-1596)의 논문, TEV 및 PVY 관련 SNP 정보는 강 등(2005, The Plant J. 42:392-405)의 논문, PVMV 관련 SNP 정보는 Ruffel 등(2006, J Gen Virol, 87:2089-2098)의 논문을 참고하거나 고추 유전체 데이터베이스(http://peppergenome.snu.ac.kr)에서 얻은 후보서열의 염기서열 분석을 통하여 확인한 SNP를 사용하였다.
2. SNP 마커 검출용 KASP 프라이머 디자인
KASP 유전형 분석을 위해서는 두 개의 정방향 프라이머와 한 개의 역방향 프라이머가 필요하기 때문에, 본 발명의 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 KASP용 프라이머는 두 개의 정방향 프라이머 끝 부분에 SNP와 같은 염기서열의 차이가 구분되도록 디자인하였다. 또한, 두 개의 정방향 프라이머는 5' 말단에 FAM 또는 HEX와 같은 각기 다른 형광물질이 붙어있다. 그리고 두 개의 대립유전자에 동일하게 염기쌍을 이룰 수 있는 역방향 프라이머를 디자인하였다. PCR을 수행하면 두 개의 정방향 프라이머의 5' 말단에 각기 다른 형광물질이 붙은 채로 증폭되므로, 형광물질의 파장 차이에 따라 유전형을 분석하였다.
3. SNP 마커 검출을 위한 KASP 반응 조건
로슈사의 LightCycler 480 Real-time PCR 시스템을 사용하였으며, 실험에 필요한 시약 및 방법은 LGCgenomics(Laboratory of the Government Chemist genomics)에서 권고한 것을 참고하여 실시하였다.
실험에 사용한 시약은 KASP 2X Master mix 및 KASP Assay mix 이며, 마커 특성상 염화마그네슘(MgCl2) 2.5mM(PCR 반응시 최종농도)과 DMSO가 별도로 사용되기도 하였는데, DNA 염기서열에 A/T가 많을 경우 염화마그네슘을 첨가하여야 하고, G/C가 많을 경우에는 DMSO를 첨가하였다. KASP Assay mix는 PCR에 필요한 프라이머 혼합시약인데, LGC에서 KASP Assay mix를 제작하거나 바이오니아(한국)에서 프라이머 올리고 합성한 것을 직접 혼합하여 사용하였다. 합성된 프라이머 올리고를 직접 사용할 경우, 두 개의 정방향 프라이머는 각각 12pmole, 역방향 프라이머는 30pmole로 삼차 증류수에 희석 혼합하여 사용하였다. KASP 반응에 사용된 혼합물의 조성은 하기 표 1과 같으며, PCR은 하기 표 2와 같은 조건으로 수행하였으며 PCR 증폭양이 적은 경우, 3 사이클을 추가적으로 더 행하였다.
KASP 반응시약 조성표
조성 사용양 (㎕)
DNA (5ng/㎕) 5.0
KASP 2X Master mix 5.0
KASP Assay mix (primer mix) 0.14
MgCl2 또는 DMSO (0.06)
총량 10.14 (10.20)
KASP 수행 조건
스텝 온도 시간 사이클(횟수)
Hot-start activation 94℃ 15 초 1
Denature 94℃ 20 초 10
Annealing/Elongation 61-55℃
(사이클 당 0.6℃ 감소)		 1 분
Denature 94℃ 20 초 26
Annealing/Elongation 55℃ 1 분
추가
수행시		 Denature 94℃ 20 초 3
Annealing/Elongation 57℃ 1 분
실시예 1. 오이모자이크바이러스( Cucumber mosaic virus , CMV)에 대한 병 저항성 판별
1-1. Cmr1 (CaTm-1_intr3)
CMV는 가지과 식물을 감염시키는 바이러스 중 하나로 고추에 침입하여 병을 일으키며 생산에 큰 피해를 주고 있다. CMV의 증상은 매우 다양하나 대표적으로 엽색과 모양이 변형되고, 생장이 저해되어 수확량이 감소한다.
CMV 저항성에 관한 기존의 연구를 통해 한국의 고추 품종 '부강(Bukang)'이 두 개의 CMV 계통, CMVKorean과 CMVFNY(이 두 병원체를 통틀어 CMVP0라 한다)에 저항성을 가지는 단일 우성 유전자 Cmr1을 가지고 있다는 것을 확인하였다. Cmr1 유전자는 토마토 염색체 2번의 토마토모자이크바이러스(Tomato Mosaic Virus, TMV) 저항성 유전자 Tm-1과 동일한 염색체 상에 위치하고 있다는 사실을 토대로 고추 EST(Expressed Sequence Tags) 유사 서열을 이용하여 세 번째 인트론 내에 '부강' 품종의 양친에서 다형성을 가지는 HRM 프라이머를 개발하였다. 이 프라이머를 '부강' 품종의 F2 집단에서 확인한 결과 Cmr1 유전자에서 약 2 cM 이내에 위치할 것으로 나타났다.
본 발명은 CMV에 저항성을 가지는 품종 '부강'의 양친과 이병성을 나타내는 품종인 '제주재래'에서 차이를 보이는 SNP 마커를 이용하여 KASP 프라이머를 제작하였다.
CMV 저항성 선별을 위한 HRM 및 KASP용 프라이머
마커명 종류 프라이머 서열정보(5'→3')
CaTm-int3HRM SNP 정방향 TGGTGTTTTTATCAGCCTTAGC (서열번호 1)
역방향 GAAGGACAAGAATTCATGATATGG (서열번호 2)
CaTm-1_intr3 SNP 정방향 (FAM) ATAACCAGCAACCTATCGGTAAGG (서열번호 3)
정방향 (HEX) CATAACCAGCAACCTATCGGTAAGA (서열번호 4)
역방향 GCGACTTATGATTGATCTTATCTCAGGAA (서열번호 5)
그 결과, HRM 프라이머를 이용한 결과에서는 저항성을 가진 Cmr1 유전형 개체의 형광물질이 먼저 해리되고, 이병성을 보이는 cmr1 유전형의 개체는 나중에 해리되며, 두 유전형을 모두 가지는 개체는 형광물질이 가장 먼저 감소하는 양상을 보여주었다(도 1). 또한, KASP 프라이머를 이용한 결과에서는 Cmr1 유전형(저항성)을 가진 계통은 HEX 형광물질로 인해 y축에 붙어 나타나고, cmr1 유전형(이병성)을 가진 계통은 FAM 형광물질로 인해 x축에 가깝게 위치하며, 두 유전형을 모두 가지고 있어 저항성을 보이는 개체는 y축과 x축의 중간 즈음에 나타나는 것을 확인하였다(도 2).
1-2. cmr2 (Affy4)
고추의 생산에 막대한 피해를 입히는 바이러스 중 하나인 CMV는 CMVKorean과 CMVFNY의 두 가지 바이러스 계통 CMVP0에 저항성을 가지는 유전자 Cmr1이 밝혀진 후 이를 이용한 품종 육성의 필요성이 대두되어 왔다. 그러나 Cmr1은 다른 CMV 계통인 CMVP1에 저항성을 가지지 않으며, CMVP1는 CMVKorean과 CMVFNY에 저항성을 가지는 품종에 병을 일으킬 수 있다. Cmr1과 달리 단일 열성 저항성 유전자인 cmr2는 CMVP0뿐만 아니라 CMVP1에도 저항성을 가진다. cmr2는 고추의 1번 염색체에 위치한 사실이 밝혀졌으며 이 유전자를 가진 저항성 고추를 선별하기 위한 HRM 마커로 유전적 거리가 약 2.5 cM 떨어진 CVMV2가 작성되었다.
CMVP1에 저항성을 가지는 것으로 밝혀진 캡시쿰 애늄(Capsicum annuum) 계통 'LAM32'와 이병성을 보이는 '제주재래'에서 다형성을 보이는 SNP를 이용하여 KASP 프라이머 세트 Affy4를 작성하였다.
CMVP1 저항성 선별을 위한 HRM 및 KASP용 프라이머
마커명 종류 프라이머 서열정보(5'→3')
CVMC2 SNP 정방향 TGAATACGGTCCAGCGATTA (서열번호 6)
역방향 ATTGTGCTTCGCTAGCCATT (서열번호 7)
Affy4 SNP 정방향 (FAM) CCGACTTCGAGCAAGCCTACAT (서열번호 8)
정방향 (HEX) CGACTTCGAGCAAGCCTACAG (서열번호 9)
역방향 CGTCCTGACCCGCCTGCCAT (서열번호 10)
그 결과, HRM 프라이머를 이용한 결과에서는 저항성을 가진 cmr2 유전형의 개체는 이병성 Cmr2+ 유전형의 개체보다 형광물질이 먼저 감소하며, 이형 접합체가 가장 먼저 해리된다(도 3). 또한, KASP 프라이머를 이용한 결과에서는 cmr2 유전형의 개체가 HEX 형광물질을 가지고있어 y축에, Cmr2+ 유전형의 개체는 FAM을 가지고있어 x축에, 두 유전형을 모두 가진 이형 접합체는 x축과 y축 사이 중간에 위치하는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 2. 포티바이러스(Potyvirus)에 대한 병 저항성 판별
2-1. 담배 식각 바이러스( Tobacco etch virus, TEV), 감자 바이러스 Y( Potato virus Y, PVY) - pvr1 1 , pvr1 2 (pvr11-1)
포티바이러스(potyvirus)는 다양한 식물에 바이러스 병을 일으키는 바이러스 속 중 하나로서 전 세계적으로 농작물에 피해를 입혀 심각성이 대두되었다. 포티바이러스에 속하는 바이러스는 유전체에 결합된 단백질 VPg를 가지고 있으며 이것은 식물의 번역개시인자(translation initiation factor) eIF4E와 결합하여 바이러스 병을 일으킨다고 알려져 있다. eIF4E에 돌연변이가 일어나는 경우 VPg와 결합하지 않으며 이때 식물은 저항성을 가지게 된다.
고추의 경우 포티바이러스 중 TEV에 저항성을 가지는 pvr1 유전자 또한 eIF4E를 암호화하는 것이 밝혀진 바 있으며, pvr1 유전자의 대립유전자로는 바이러스에 감수성을 가지는 Pvr1 +와 열성 저항성을 가지는 pvr1 1 , pvr1 2 가 있다. pvr1 유전자는 TEV 계통 중 TEV-HAT, TEV-NW, TEV-N에 저항성을 가지고, pvr1 2 는 TEV-HAT, TEV-WN, TEV-Mex21에 저항성을, pvr1 1 은 TEV-HAT을 포함한 몇몇 TEV 계통에만 불완전한 저항성을 보인다.
pvr11-1 마커는 Pvr1+ 및 pvr1 두 유전자와 구분할 수 있는 pvr1 1 과 pvr1 2 가 암호화하는 eIF4E 단백질의 아미노산 치환 서열을 기반으로 하여 작성하여 TEV에 저항성을 가지는 고추 계통을 선별할 목적으로 발명되었다. pvr11-1는 pvr1 1 을 가진 고추 'Yolo Y'와 pvr1 2 를 가진 'Dempsy'와 'DRB', 그리고 TEV 감수성 계통 'ECW'와 'Habanero'의 단일 염기 다형성(SNP)의 유전형을 검정할 수 있는 KASP 프라이머를 제작하였다.
포티바이러스 저항성 고추 선별을 위한 KASP 프라이머
마커명 종류 프라이머 서열정보(5'→3')
pvr11-1 SNP 정방향 (FAM) GCTGCTTGGGGTAGCTCGCT (서열번호 11)
정방향 (HEX) CTGCTTGGGGTAGCTCGCG (서열번호 12)
역방향 CAGTGGAGAAAGTGTAGACGTTGCG (서열번호 13)
그 결과, 도 5와 같이 pvr1 1 혹은 pvr1 2 의 유전형을 가진 계통은 HEX 형광물질을 가지고있어 y축에 위치하며, pvr1 혹은 pvr1 + 의 유전형을 가진 계통은 FAM 형광물질로 인해 x축에, pvr1 1 혹은 pvr1 2 의 유전형 중 하나와 pvr1 혹은 pvr1 + 의 유전형 중 하나를 가지는 이형 접합체는 두 축의 사이에 나타나는 것을 확인하였다.
2-2. 고추잎맥모틀바이러스( Pepper veinal mottle virus, PVMV) - pvr6 (pvr6-1)
PVMV는 포티바이러스에 속하며 고추 잎맥에 백화현상이나 모자이크 증상, 잎의 주름 등 형태 변화를 일으켜 생장을 저하시키고 과실을 맺지못하게 하는 증상을 가지고 있다.
PVMV에 저항성을 가지는 유전자로는 pvr1 2 와 pvr6가 있으며, 이 두 유전자가 모두 열성으로 존재하여야 바이러스에 저항성을 띠게 된다. 선행 연구에 따르면 pvr1 2 와 pvr6는 TEV와 같이 다른 포티바이러스처럼 번역개시인자 eIF4E와 eIF(iso)4E에 돌연변이를 가지므로 저항성을 보이게 되는데, pvr6의 eIF(iso)4E는 아미노산으로 번역되는 상보적 DNA 염기 서열의 총 길이 609bp 중 82개의 염기서열이 상실되어 정상적인 eIF(iso)4E 단백질을 합성하지 못한다고 알려져 있다. PVMV 저항성 계통 'Yolo Wonder', 'Yolo Y' 및 'FloridaVR2'와 이병성 계통 'Perennial' 및 'DH801'에서 이 유전자 서열을 비교하여, 268번째 염기가 G에서 A로, 483번째 염기가 C에서 A로, 537번째 염기가 C에서 T로 치환되는 세 개의 SNP를 밝혀낸 바 있다.
본 발명에서는 PVMV 저항성 유전자 중 하나인 pvr6에서 밝혀진 세 개의 SNP 중 268번째 염기의 SNP를 기반으로 하여 KASP 프라이머를 작성하였다. 저항성 계통으로는 'Perennial'을 사용하였고, 이병성 계통으로는 'Dempsey'와 'Yolo Wonder'를 사용하였다.
PVMV 저항성 고추의 선별을 위한 KASP 프라이머
마커명 종류 프라이머 서열정보(5'→3')
pvr6-1 SNP 정방향 (FAM) CCCATTTGGGCTCAATCCCAGT (서열번호 14)
정방향 (HEX) CCATTTGGGCTCAATCCCAGC (서열번호 15)
역방향 CCAGCAAGTTGACTGTTAATGCGG (서열번호 16)
그 결과, 도 6과 같이 PVMV에 이형성을 보이는 pvr6 + 유전형의 계통은 FAM 형광물질로 인해 x축에 위치하며, pvr6 유전형의 계통은 HEX 형광물질로 인해 y 축에, 두 유전형을 모두 가지는 이병성의 이형 접합체는 두 축의 사이에 위치하였다.
실시예 3. 토바모바이러스(Tobamovirus)에 대한 병 저항성 판별
3-1. 고추 마일드 반점 바이러스( Pepper mild mottle virus, PMMoV) - L 4 (L4-3UTR-94, L4-3UTR-113)
토바모바이러스(tobamovirus)는 고추, 담배, 감자와 같은 식물들에 감염을 일으켜 괴사와 같은 방식으로 식물체의 잎이나 일부 조직의 세포자살이 일어나는 과민 반응(hypersensitive response) 이나 혹은 과실의 수확량을 감소시키는 등의 피해를 입힌다. 고추는 토바모바이러스 중 담배모자이크바이러스(Tobacco mosaic virus, TMV), 고추마일드반점바이러스(Pepper mild mottle virus, PMMoV) 및 토마토모자이크바이러스(Tomato mosaic virus, ToMV) 등에 감염이 될 수 있으며, 각각의 바이러스에 대해 저항성을 보이는 L 유전자를 가지고 있다.
L 유전자는 NBS-LRR(Nucleotide Binding Site-Leucine Rich Repeat) 단백질을 암호화하는 유전자 군에 속한다. L 대립유전자는 감수성을 보이는 L 0 부터 저항성 유전자 L 1 , L 2 , L 3 및 L 4 가 있는데, 이 유전자들은 토바모바이러스 병원형태의 종류에 따라 저항성을 보이는 것으로 분류할 수 있다(표 7). 이 중 L 4 유전자좌는 TMV와 ToMV, PMMoV 등을 포함한 바이러스에 대해 저항성을 가진다고 알려져 있다.
고추 유전체에서 L 4 유전자의 정확한 위치는 알려진 바 없으나 L 4 유전자를 동정하기 위해 많은 연구가 수행되었다. L 4 후보 유전자의 LRR 영역에서 작성한 L4seqF&R 마커는 여러 상업 품종들에 적용해 보았을 때 L 4 유전자의 유전형을 명확하게 구분할 수는 없었으나 토바모바이러스 저항성 고추를 신뢰성 있게 분석할 수 있었다. 연관 분석을 통하여 이 마커의 염기서열을 포함한 후보 유전자가 실제 유전자에서 0.3 cM의 유전적 거리를 가지고 있는 것을 밝혀내었다. L 4 후보유전자의 cDNA 서열을 기반으로 하여 토바모바이러스의 종류별로 저항성을 갖는 L 유전자좌를 구분하기 위하여 L 3 유전자와 L 0 , L 1 , L 2 및 L 4 후보 유전자를 분류할 수 있는 HRM 마커 L4RP-3F/L4RP-3R와 L4RP-3F/3'end를 작성하였다(Yang et al., 2012, Mol Breeding, 30:819-829).
본 발명에서는 이전에 밝혀진 L4seqF&R 마커를 포함한 후보 유전자 영역을 사용하여 L 4 대립 유전자좌를 구분할 수 있는 KASP 프라이머를 작성하였다. 캡시쿰 치넨세(Capsicum chinense)의 스캐폴드 서열(http://peppergenome.snu.ac.kr)로부터 얻은 L 4 후보유전자 염기서열의 LRR 영역과 829bp 떨어져있는 3' UTR 부분에서 다른 L 유전자 혹은 후보 유전자 서열 간의 SNP를 찾아내었고, 이것으로 KASP 프라이머 세트 'L4-3UTR-94'와 'L4-3UTR-113'을 개발하였다. 상기 프라이머 세트는 L 4 대립유전자좌에 이형접합체를 판별할 수 있다. 마커 작성을 위하여 사용한 고추 재료는 병원형에 따라 저항성을 가지는 5 개의 고추 계통이며(표 8), L 4 후보유전자에 대해 재조합 개체가 적게 나타난다고 알려진 '명성' 품종 F2 집단을 사용하여 확인하였다.
토바모바이러스 종류에 따른 저항성 유전자좌 L의 분류 (ISF: 고추 tobamovirus differential set_2012)
병원형 P0 P1 P1-2 P1-2-3 P1-2-3-4



유전자		 TMV : 0
ToMV : 0
TMGMV : 0
BPMoV : 0		 TMV : 1
TMGMV : 1
PaMMV : 1		 PMMoV : 1.2 PMMoV : 1.2.3 PMMoV : 1.2.3.4
L 0 S S S S S
L 1 R S S S S
L 2 R R S S S
L 3 R R R S S
L 4 R R R R S
(S, 감수성; R, 저항성)
L 4 유전자를 구분할 수 있는 KASP 프라이머 세트 제작에 사용한 식물 재료
L 유전자 L 0 L 1 L 2 L 3 L 4
고추계통 ECW Special Tabasco PI159236 PI260429
L 4 유전자를 가진 고추를 예측하기 위한 KASP 프라이머
마커명 종류 프라이머 서열정보(5'→3')
L4-UTR-94 SNP 정방향 (FAM) ATTCCTTGTTATGAAGCTTGGAAAG (서열번호 17)
정방향 (HEX) GTTCCTTGTTATGAAGCTTGGAAAG (서열번호 18)
역방향 GTTCAATCAATTTGCAGAACCACT (서열번호 19)
L4-UTR-113 SNP 정방향 FAM과 HEX 프라이머 서열은 L4-UTR-94와 동일
역방향 GCACAAATGCTTGAAGAATGAAAT (서열번호 20)
그 결과, 도 7과 같이 L 0 유전형을 가진 개체는 증폭되지 않으며, L 1 , L 2 및 L 3 유전형을 가진 개체는 FAM 형광물질로 인해 x축에, L 4 유전형을 가진 개체는 HEX 형광물질로 인해 y축에 위치하여 나타났다.
실시예 4. 세균성 점무늬병(Bacterial spot disease)에 대한 병 저항성 판별
4-1. Bs2 - (Bs2_KASP)
고추의 세균성 점무늬병은 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris pv. vesicatora, Xcv)라는 세균에 의하여 발병된다. 병징은 잎에 갈색의 점무늬가 나타나고, 병이 진전될 경우 병반의 중심부가 흰색으로 변하여 잎이 말라 떨어진다.
세균성 점무늬병 저항성 유전자로 비대립 우성 저항성 유전자 Bs1, Bs2, Bs3가 알려져 있으며 이들은 각각 Xcv의 여러 레이스 중 저항성을 보이는 레이스 종류가 조금씩 다르다. Bs1은 레이스 2, Bs2는 레이스 0, 1, 2, 3에 저항성을 가지고, Bs3는 레이스 1에 저항성을 가진다. 이 중 Bs2가 다른 유전자에 비해 더 지속성이 있으므로, 이 저항성 유전자를 가진 고추 계통을 이용한다면 세균성 점무늬병 내병성 고추를 육성할 수 있다.
본 발명은 Bs2 유전자를 가진 저항성 고추 계통 'ECW20R'과 이병성 고추 계통 'CM334'에서 확인할 수 있는 SNP 마커를 이용하여 KASP 프라이머를 제작하였다. 고추 계통의 Bs2 유전자는 기존 토마토 Bs2 연구에서 밝혀진 캡시쿰 차코엔세(Capsicum chacoense)의 Bs2 mRNA 서열을 캡시쿰 애늄(Capsicum annuum)의 게놈서열과 비교하여 유추하였다. CDS 지역은 반복서열이 다수 존재하였다. 이 반복서열 중에서 후보 지역을 선발하였고, 이 지역들의 염기서열을 분석하여 총 3 개의 후보 HRM 마커를 개발하였다. 이 중 다형성이 보이는 지역을 기반으로 KASP 프라이머를 개발하였으며 개발한 프라이머는 Bs2 에서 5' 방향으로 50kb 떨어져 있다.
세균성 점무늬병에 저항성을 보이는 고추를 선별하기 위한 KASP 프라이머
마커명 종류 프라이머 서열정보(5'→3')
Bs2_KASP SNP 정방향 (FAM) GGTGGTGTAGCCTCGTGGC (서열번호 21)
정방향 (HEX) GGTGGTGTAGCCTCGTGGA (서열번호 22)
역방향 GGTGGTCGTAGCACAACTAAACTC (서열번호 23)
그 결과, 이병성 개체는 FAM 형광물질로 인해 x축에, 저항성 개체는 HEX 형광물질로 인해 y축에 가깝게 나타나는 것을 확인하였다(도 8).
실시예 5. 고추 역병에 대한 병 저항성 판별
5-1. QTL 5-1(Phyto5NBS1_KASP)
고추의 역병은 파이토프소라 캡사이시(Phytophthora capsici) 균에 의해 발병한다. 고추는 역병균이 침입하게 되면 뿌리가 썩고 식물이 말라 죽게 되는 증상을 보인다.
고추 역병 저항성 계통은 둘 이상의 유전자에 의해 유전되는 양적 형질 유전자좌(Quantitative trait Loci, QTL)를 가지고 있다. 역병 저항성 QTL 주동 유전자좌는 염색체 5번에 위치한다고 보고되었다. 최근 이 QTL 유전자를 동정하기 위한 연구가 수행되었다. 마이크로어레이를 이용한 BSA(Bulked Segregant Analysis)를 통해서 5번 염색체에 위치한 EST 기반의 후보 unigene 서열을 얻었고, 여기에서 작성한 SPP(Single Position Polymorphism) 마커 중 QTL 유전자에 가장 가까운 'Phyto5SAR'을 찾을 수 있었다. 이 마커를 포함한 스캐폴드 서열(C. annuum 게놈 데이터베이스, http://peppergenome.snu.ac.kr)에서 찾은 역병 저항성 후보 유전자 3개를 통해 SNP 마커를 작성하였는데 'Phyto5NBS1'이 역병 저항성 계통을 검정하는데 있어 가장 정확도가 높았다. 이 마커는 낮은 병원성을 보이는 역병 균주(MY-1)에 약 90%의 정확성으로 저항성을 보이고, 중간 병원성의 JHAI1-7에는 73%의 정확성을 보였다. 따라서 Phyto5NBS1은 QTL 5-1 저항성 유전자를 가지는 계통을 검정하는데 있어 신뢰할 수 있는 분자마커이다. Phyto5NBS1은 역병 저항성 계통인 'CM334' 품종의 물리적 지도와 대조하였을 때 28Mbp 정도에 위치할 것이라고 보고되었다.
Phyto5NBS1이 가지고 있는 SNP 위치를 통하여 HRM 프라이머가 개발되었으나, 본 발명에서는 효율적인 유전형 검정을 위하여 KASP 프라이머로 전환하였다. KASP 프라이머로 발명하기 위하여 고추 역병에 대해 낮은 병원성에 저항성을 갖는 계통 'YT-RIL'과 저항성 계통 'CM334', 'YCM334, 'PI201234' 및 'AC2258' 그리고 이병성 계통 '제주재래', '태안' 및 'ECW30R'과 F1 상업 품종에 대한 검증을 실시하였다.
그 결과, Liu 등(2014, Theor Appl Genet, 127:2503-2513)의 HRM용 프라이머를 사용한 경우에 역병 저항성과 이병성 개체는 각각 형광물질의 감소 양상의 차이로 구분할 수 있었다. 저항성 개체의 PCR 증폭서열에서 형광물질이 먼저 해리되고, 이병성 개체에서 나중에 해리되며 이형 접합체에서는 가장 먼저 해리되는 것을 확인할 수 있었다(도 9). 반면, 본 발명의 KASP용 프라이머를 사용한 경우에는 저항성 개체는 FAM 형광물질로 인해 x축에, 이병성 개체는 HEX 형광물질로 인해 y축에 가깝게 나타났고, 이형 접합체는 두 축의 사이에 위치하는 것으로 확인되었다(도 10).
고추 역병 저항성 검정을 위한 HRM 및 KASP 프라이머
마커명 종류 프라이머 서열정보(5'→3')
Phyto5NBS1_HRM SNP 정방향 TTGATAGCCCTGGTAAAGA (서열번호 24)
역방향 CCCGTTTGAATATCACCAC (서열번호 25)
Phyto5NBS1_KASP SNP 정방향 (FAM) AAGAATGCAATATAGAGCTTCTGCTGA (서열번호 26)
정방향 (HEX) GAATGCAATATAGAGCTTCTGCTGG (서열번호 27)
역방향 TGACAACTGTCTGGTTTGCCAGAATAATT (서열번호 28)
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> KASP primer set based on SNP for discriminating pepper disease- resistant cultivar and uses thereof <130> PN15403 <160> 28 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tggtgttttt atcagcctta gc 22 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gaaggacaag aattcatgat atgg 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ataaccagca acctatcggt aagg 24 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cataaccagc aacctatcgg taaga 25 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcgacttatg attgatctta tctcaggaa 29 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgaatacggt ccagcgatta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 attgtgcttc gctagccatt 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccgacttcga gcaagcctac at 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cgacttcgag caagcctaca g 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 cgtcctgacc cgcctgccat 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gctgcttggg gtagctcgct 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ctgcttgggg tagctcgcg 19 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cagtggagaa agtgtagacg ttgcg 25 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cccatttggg ctcaatccca gt 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ccatttgggc tcaatcccag c 21 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ccagcaagtt gactgttaat gcgg 24 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 attccttgtt atgaagcttg gaaag 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gttccttgtt atgaagcttg gaaag 25 <210> 19 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 gttcaatcaa tttgcagaac cact 24 <210> 20 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gcacaaatgc ttgaagaatg aaat 24 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggtggtgtag cctcgtggc 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggtggtgtag cctcgtgga 19 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 ggtggtcgta gcacaactaa actc 24 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ttgatagccc tggtaaaga 19 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 cccgtttgaa tatcaccac 19 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 aagaatgcaa tatagagctt ctgctga 27 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gaatgcaata tagagcttct gctgg 25 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tgacaactgt ctggtttgcc agaataatt 29

Claims (6)

  1. 서열번호 17 및 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 17 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및 서열번호 21 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 저항성 품종 판별을 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트.
  2. 서열번호 18 및 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 서열번호 18 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍; 및 서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드로 이루어지는 프라이머쌍을 포함하는 고추 병 감수성 품종 판별을 위한 KASP(kompetitive allele specific PCR)용 프라이머 세트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 고추 병은 고추마일드반점바이러스(PMMoV)병 또는 세균성 점무늬병(BS)인 것인 프라이머 세트.
  4. 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 고추 병 저항성 또는 감수성 품종 판별을 위한 KASP용 키트.
  5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 완충액을 포함하는 것인 키트.
  6. (a) 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 이용하여 KASP를 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 KASP의 증폭산물을 분석하는 단계를 포함하는, 고추의 병 저항성 또는 감수성 품종을 판별하는 방법.
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