KR102142389B1

KR102142389B1 - Cmv-p1 저항성 고추 품종의 판별을 위한 분자마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102142389B1
Application number: KR1020190064674A
Authority: KR
Inventors: 강병철; 이종호
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2019-05-31
Filing date: 2019-05-31
Publication date: 2020-08-07

Abstract

본 발명은 CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별용 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

CMV-P1 저항성 고추 품종의 판별을 위한 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for discrimination of CMV-P1 resistant pepper cultivar and uses thereof}

본 발명은 CMV (Cucumber mosaic virus)-P1 저항성 고추 품종의 판별을 위한 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고추의 CMV-P1 저항성 유전자인 cmr2 (CMV resistance gene 2) 연관 분자마커에 관한 것이다.

식물 바이러스는 전세계적으로 작물의 생산과 품질의 손실에 주요하게 영향을 미친다. 고추(Capsicum spp.) 생산은 60개 이상의 바이러스를 포함한 다양한 식물병원균에 의해 방해받는다. 식물 바이러스는 넓은 기주 범위를 가지고, 다양한 매개충이 존재하기 때문에 그 방제가 매우 어렵다. 따라서 식물 바이러스병을 방제하는 가장 효율적인 방법은 저항성 품종을 이용하는 것이다. 그러므로 강력하고 지속 가능한 저항성 품종을 육성하기 위하여 바이러스 저항성 유전자를 찾고, 그 저항성 기작을 확인하는 것은 매우 중요한 일이다.

식물에서 바이러스 저항성은 4가지 카테고리에 의해 나뉘는데, RNA silencing 반응, PAMP(pathogen-associated molecular pattern)에 의해 유도되는 면역(PAMP-trigger immunity, PTI), 저항성 단백질에 의한 면역(R protein-mediated resistance)과 기주인자의 돌연변이로 인한 열성저항성으로 나눌 수 있다. RNA silencing 반응에서는 기주의 antiviral RNA surveilance system이 double-stranded viral RNA에 의해 시작된다. 비록 반응이 느리고 완벽하게 바이러스의 증식을 막지는 못하지만, 이로 인해 유도된 antiviral RNA silencing machinery (RNAi)는 거의 모든 RNA와 DNA 바이러스들을 방어할 수 있다. 이와 대조적으로 PAMP에 의해 유도되는 면역반응은 병원균의 보존된 구조적 모티프에 반응하는 식물의 선천적인 반응의 첫 번째이다. 다양한 바이러스의 저항성 기작을 고려하는 PTI 반응에 대한 선행연구는 매우 미비하다. anti-viral PTI에 의해 발현되는 신호전달 모듈은 다른 비바이러스 병원균의 PTI 반응과 매우 유사하게 나타난다. 예를 들면, transmembrane immune receptor는 바이러스의 공격에 방어하기 위해 host translational suppression을 활성화한다. 또한 애기장대에서의 최근 연구는 바이러스 복제 시 생성되는 dsRNA(double strand RNA)에 의해 PTI 반응이 유도되며, 이 dsRNA 반응 경로가 SERK1(SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1)과 연관되어 있다고 확인하였다. 또 다른 애기장대를 이용한 선행연구에서는 식물 바이러스에 대한 PTI반응은 BRI1(BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1)-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1(BAK1/SERK3)에 의존적이라는 것을 밝혀내었다.

저항성 단백질에 의한 면역(R protein-mediated resistance)에서는 단일 우성 저항성 유전자가 병원균의 intracellularly-secreted effector를 특이적으로 인지하며, 견고한 방어 반응(effector-triggered immunity)을 일으킨다. 대부분의 식물 저항성 유전자(R gene)는 nucleotide-binding과 leucine-rich-repeat domain을 가지고 있다. 저항성 단백질에 의한 면역을 이용한 식물의 방어 전략은 비바이러스 병원균뿐만 아니라 바이러스 병원균에게도 매우 효율적이다. 지금까지 약 20개 이상의 anti-viral R 유전자를 이용한 우성 저항성 유전자가 동정되었다. 저항성 단백질에 의한 effector의 인지는 직접 혹은 간접적인 ligand-receptor 상호작용을 통해 일어나는 것으로 받아들여지고 있다.

또 다른 저항성의 유형으로는 바이러스의 증식에 필수적인 기주인자에 변이가 일어나거나 결실이 일어나 생기는 열성저항성이 있다. 보고된 식물바이러스 저항성 유전자의 약 반 정도가 열성유전을 하는 것으로 알려져 있으며, 열성저항성은 비바이러스 병원균보다 바이러스의 보편적 방어 기작으로써 알려져 있다. 이론적으로 열성저항성은 우성저항성에 비해 넓은 기주 범위에 대한 저항성을 가지며 더 견고한 것으로 알려져 있다. 예를 들면, eIF4E(eukaryotic translation initiation factor 4E)와 eIF4G는 포티 바이러스(Potyvirus)를 포함한 다양한 바이러스의 감염에 필수적으로 필요한 기주인자이며, 이로 인해 이 기주인자의 돌연변이는 작물의 열성저항성을 갖도록 해준다. 또 다른 예로는 TYLCV(Tomato yellow leaf curl virus) 열성저항성 유전자인 Pelo (ty5)가 있다. 저항성 ty5 토마토 계통에서는 Pelo의 기능이 망가짐으로써 단백질 합성과 리보솜 recycling-phase가 저해되어 바이러스의 증식을 억제하게 된다.

Cucumber mosaic virus (이하, CMV)는 Bromoviridae 과 Cucumovirus 속에 속하는 바이러스로써, 온대 기후에서 작물 생산에 심한 피해를 주는 바이러스 중 하나이다. CMV는 매우 넓은 기주 범위를 가지고 있는데, 약 1,200개 이상의 식물에 병을 일으킬 수 있으며, 80종 이상의 진딧물에 의해 바이러스 전이가 일어난다. CMV 감염은 고추를 포함한 다양한 작물의 경제적 손실에 영향을 미친다. 애기장대의 우성 유전자인 RCY1은 CMV yellow 아종(strain)(CMV-Y)에 gene-for-gene 관계를 통한 저항성을 주는 것으로 보고되었다. CMV가 감염되면 강낭콩(P. vulgaris CMV RESISTANCE 1, PvCMR1)의 우성 저항성 유전자에 의해 담배(Nicotiana benthamiana)에서 괴사 반응(systemic necrosis)을 일으키며, 콩과 식물의 저항성 유전자도 이와 같은 기능을 한다는 것을 밝혀내었다. 게다가, VPS41(Vacuolar Protein Sorting 41) 단백질의 돌연변이는 멜론에서 CMV 저항성에 기여한다는 것 또한 보고되었다. 명백하게도, CMV 저항성 품종 육성은 작물 육종의 중요한 목표 중 하나라고 할 수 있다.

지난 몇 년 간, 다양한 CMV 저항성 유전자원이 고추(Capsicum spp.)에서 발견되었다. 대부분의 유전자원은 복수의 유전자에 의한 다인적 저항성을 보였다. 다양한 기작이 CMV 저항성 유전자원의 저항성에 관여할 것으로 알려져 있는데, 그 예로는 바이러스 복제의 억제, 세포 간 이동 억제, 바이러스 입자의 원거리 이동에 대한 억제 등이 있다. CMV 저항성에 기여하는 유전적 위치를 확인하기 위하여 유전 분석이 수행되었으며, 몇몇 품종에서 다양한 QTL(quantitative trait locus)에 의해 저항성이 조절된다는 것을 확인하였다. QTL에 의한 저항성은 다양한 바이러스 아종(strain)에 식물이 방어할 수 있다는 이점이 있지만, 이 QTL을 육종에 이용하기가 단일저항성 유전자보다 까다롭다는 단점이 있다.

CMV는 또한 한국에서 가장 많이 발생하는 바이러스 중에 하나로, 중국의 C. annuum 품종 'Likeumjo'는 CMV-P0에 저항성을 가지며, 단일우성저항성 유전자 Cmr1 (Cucumber mosaic resistant 1)에 의해 조절되는 희귀한 CMV 저항성 유전자원 중 하나이다. Cmr1은 염색체 2번에 위치하며, Cmr1과 연관된 마커가 개발되어 육종에 오랫동안 사용되었다. 하지만, 비교적 최근에 Cmr1 유전자에 의한 저항성이 새로운 CMV 아종(strain)인 CMV-P1에 의해 극복되는 것이 보고되었다. CMV-P1 아종은 RNA helicase 도메인에 변이가 생김으로써 Cmr1에 의한 저항성을 극복할 수 있게 되었다.

본 발명에서는 새로운 CMV 저항성 유전자인 CMV-P1에 열성저항성을 갖는 CMV resistance gene 2 (cmr2)를 보고하였다. cmr2의 유전자지도를 완성하고 분자마커를 개발하기 위하여, 본 발명자는 F₂ 집단을 재료로 bulked segregant analysis (BSA) 방법을 amplified fragment-length polymorphisms (BSA-AFLP)와 고추 EST 서열 (Hill et al., (2013) PloS ONE 8(2):e56200)을 기반으로 한 Affymetrix chip (BSA-Affymetrix)에 응용하였다. 이 두 방법을 이용하여 본 발명자는 cmr2와 연관된 분자마커를 개발하였다. 또한 CMV-P1 저항성 유전자원을 추가적으로 확보하기 위하여, 고추(Capsicum) 유전자원에 CMV-P1 검정을 수행하였다. 이를 통해 추가적으로 확보된 저항성 유전자원은 모두 cmr2를 가지고 있는 것으로 보여지며, 따라서 cmr2는 CMV-P1 저항성을 가지는 자연적으로 존재하는 유전자원이며, CMV-P0 아종에 저항성을 가지는 우성저항성 유전자 Cmr1과는 다르다는 것을 확인하였다.

한편, 한국등록특허 제1046960호에는 '고추에서 CMV 저항성을 진단하기 위한 프라이머 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0520994호에는 'CMV 저항성 연관 분자 표지 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 CMV-P1 저항성 고추 품종의 판별을 위한 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자는 CMV (Cucumber mosaic virus)의 아종(strain)인 CMV-P1에 저항성을 갖는 인도 재래종(Capsicum annuum) 'Lam32'과 'Jeju'의 교배로부터 유전 양상 분석을 통해 CMV-P1 저항성이 단일열성유전자에 의해 조절되는 것을 확인하였고, 이를 cmr2 (CMV resistance gene 2)로 명명하였다. cmr2의 염색체 내 위치를 확인하기 위해 BSA-AFLP 방법을 이용하여 cmr2로부터 16 cM 떨어진 cmvAFLP 마커를 개발하였으며, BSA-Affy를 이용하여 염색체 8번에 cmr2로부터 2.3 cM 떨어진 SNP 기반의 Affy4 마커를 개발하였다. 또한, 4,197개의 고추 유전자원 병리검정을 통해 CMV-P1에 저항성을 가지는 유전자원을 확인하였고, 유전분석 및 Affy4 마커를 이용한 대립유전자 검정을 통해 CMV-P1에 저항성을 가지는 고추 유전자원은 모두 cmr2를 가지고 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진, CMV (Cucumber mosaic virus) 아종(strain) CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5; 및 서열번호 6 및 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, CMV 아종 CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 HRM(High-resolution melting)용 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, CMV 아종 CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, CMV 아종 CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.

단일 저항성 유전자의 발견은 성공적인 저항성 품종 육성에 매우 중요한데, 이는 이병성 elite line에 단일 유전자를 도입시키는 것이 다인자를 도입시키는 것에 비해 용이하기 때문이다. 이러한 측면에서, 본 발명의 cmr2 유전자에 대한 연구는 고추 육종 프로그램에 이용될 수 있는 단일 저항성 유전자로써 중요한 가치가 있다. 또한, 본 발명의 분자마커는 CMV-P1에 저항성을 나타내는 고추 품종을 효율적으로 판별 및 육성할 수 있어 육종에 소요되는 시간, 비용 및 노력을 절감하는데 매우 유용할 것으로 기대된다.

도 1은 7개의 CMV 아종(strain)에 대한 고추의 저항성 반응을 분석한 것으로, (A)는 저항성 식물체 'Lam32'와 이병성 식물체 'Jeju', 이병성 식물체 'Bukang'에서 20 dpi에 상엽에서 촬영한 CMV-P1 병징 모습이고, (B)는 ELISA assay (405 nm 흡광도)에서 확인한 접종엽 및 상엽에서의 CMV coat protein의 축적 정도를 보여주는 그래프이다. 양성대조군(positive control; PC)는 Agdia ELISA 키트에서 사용하였으며, 음성대조군(negative control; NC)는 버퍼만 접종한 잎 샘플을 사용하였다. Mf: CMV-MSf; Ls: CMV-Ls; Pa: CMV-Pa; Kor: CMV-Kor; Fny: CMV-Fny; Pepper: CMV-pepper; P1: CMV-P1. y축의 값은 세 개의 식물체로부터 pooling한 각 시료의 삼반복의 평균이고, 오차막대는 405 nm에서의 흡광도 평균의 표준편차를 나타내며, 알파벳 소문자는 유의미한 흡광도의 차이를 의미한다(analysis of variance (ANOVA) P≥0.05).
도 2는 C. annuum 'Jeju'와 'Lam32'에서 CMV-GFP의 위치를 확인한 것으로, CMV-FNY-GFP를 접종한 'Jeju'와 'Lam32'의 떡잎의 형광 이미지이다. GFP 형광은 두 조직[표피세포층(epidermal layer; A, C, E, G)과 엽육세포층(B, D, F, H)]에서 2 dpi (A-D)와 6 dpi (E-H)에 공초점 레이저 조사 현미경(confocal laser scanning microscopy)로 관찰하였다. 모든 이미지는 7-15 슬라이스로 "Z projections" 처리되었다. 녹색 형광 신호는 GFP의 발현을, 빨간색 형광 신호는 자가형광(autofluorescence)를 의미한다. Scale bars = 50 μm.
도 3은 BSA-AFLP 마커를 SNP 기반 HRM 마커로 변환한 결과이다. (A)는 AFLP 분석 결과로, 노란색 화살표는 12개의 저항성 시료와 13개의 이병성 시료 간에 다형성을 나타낸다. 다형성이 있는 AFLP fragment(화살표)는 이병성 대조군 'Jeju'의 증폭산물로부터 회수되어 추후 분석에 사용되었다. (B)는 'Jeju' AFLP fragment와 'Jeju', 'Lam32'의 dideoxy sequencing 산물 간에 서열 분석을 수행한 결과로, 빨간 밑줄은 cmvAFLP HRM amplicon의 프라이머 위치를 나타내고, 빨간 상자는 HRM amplicon 지역의 SNP 위치를 나타낸다. (C)는 cvmAFLP HRM 마커의 normalized melting curve 결과이다.
도 4는 cmr2 연관 마커의 유전자 지도와 물리적 지도로, 점선은 지도 상에서 공통적으로 연관된 마커를 의미한다. 왼쪽부터, 'Jeju'×'Lam32' F_2:3, AC99 지도(Livingstone et al., (1999) Genetics 152(3):1183-1202; Park et al., (2014) Mol Breed 34(3):963-975), C. annuum 'CM334'의 물리적 지도(Affy4 마커가 존재하는 스캐폴드 서열의 정보는 상자 안에 나타냄)이다.
도 5는 25 dpi에서 CMV-P1 감염에 대한 저항성/이병성 반응을 분석한 것으로, (A)는 'Jeju'(a)와 'Bukang'(b)는 이병성 대조군이며, 'Lam32'(c)는 저항성 대조군이고, 유전자원 (d-j)는 CMV 병징(mosaic 혹은 chlorotic 병징)을 보이지 않았다. (B)는 CMV-P1 저항성 유전자원 상엽에서의 CMV coat protein의 축적 정도를 ELISA로 분석한 결과로, y축 값은 세 개의 식물체로부터 pooling한 각 시료의 삼반복의 평균으로 나타내었고, 오차막대는 405 nm에서의 흡광도 평균의 표준편차를 나타내며, 알파벳 소문자는 유의미한 흡광도의 차이를 의미한다(analysis of variance (ANOVA) P≥0.05).
도 6은 cmr2 마커(Affy4)를 이용한 KASP (Kompetitive Allele-Specific PCR) 유전형 분석 결과로, x축은 FAM 형광시료(465-510 nm), y축은 HEX 형광시료(533-580 nm)를 의미한다. 각각의 색은 이병성 시료 'Jeju'(노란색), 이형접합 'Jeju' × 'Lam32' F₁(빨간색), 저항성 시료 'Lam32'(파란색)를 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진, CMV (Cucumber mosaic virus) 아종(strain) CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 KASP(Kompetitive Allele Specific PCR)용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 용어 "KASP(kompetitive allele specific PCR)"는 PCR 기반의 분석 방법 중 하나로, 상동의(homogenous) 그리고 형광(fluorescence) 기반의 유전형 분석 기술이다. KASP는 대립형질(allele)-특이적 올리고 연장(extension) 및 신호생성을 위한 형광공명에너지전이(fluorescence resonance energy transfer)를 기반으로 하는 기술이다. PCR 기반의 분석 방법 중 하나로 형광시료를 이용한 KASP는 SNP와 같은 염기서열의 차이를 포함한 두 가지의 정방향 프라이머와 공통된 염기서열의 역방향 프라이머를 이용하여 두 개의 DNA 단편을 증폭시키고, 이 때 SNP의 차이에 따른 각기 다른 형광시료가 반응하는 현상으로 유전형을 구분할 수 있다.

본 발명의 상기 KASP용 프라이머 세트는 CMV (Cucumber mosaic virus) 아종(strain) CMV-P1에 대해 저항성을 부여하는 cmr2 (CMV resistance gene 2)에서 특이적으로 차별화되는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 마커의 염기 타입을 검출하는 프라이머 세트이다. 본 발명에 따른 KASP용 프라이머 세트에 있어서, SNP 위치는 표 1에 []로 표시하였다.

본 발명은 또한, 서열번호 4 및 서열번호 5; 및 서열번호 6 및 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, CMV 아종 CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 HRM(High-resolution melting)용 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명의 용어 "HRM(High-resolution melting)"은 전기영동 없이 유전형질을 검정하는 분석방법으로, SNP를 이용한 PCR 기반의 분석 기법으로 SNP 형태에 따라 형광시료가 감소하는 양상을 해리곡선(melting curve)으로 나타내어 유전형을 구분하는 방법이다.

본 발명의 상기 KASP용 프라이머 또는 HRM용 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 내지 서열번호 7 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상, 23개 이상, 24개 이상, 25개 이상, 26개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(22개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상의 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 7의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 복제하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity) 뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, CMV 아종 CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 완충액 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, CMV 아종 CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, CTAB 방법을 이용할 수도 있고, Wizard prep 키트(Promega 사)를 이용할 수도 있다. 상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다. 이 중에서, PCR이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 HRM 분석, DNA 칩, 형광 측정, 인광 측정 또는 방사성 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

HRM 분석 기술은 핵산 서열에서의 변이를 확인하기 위해 사용된 상대적으로 새로운 포스트 PCR 분석 방법이다. 이 방법은 PCR 해리곡선에서 작은 차이를 감지하는 것을 기초로 한다. 이것은 RT-PCR 기기와 연결되어 사용된 염료를 갖는 dsDNA의 온도에 따른 해리 정도의 차이를 HRM 분석을 위해, 특이적으로 고안된 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하고 처리한다. 또한, 증폭 산물을 검출하는 방법 중 하나로서, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABI Sequencer를 이용할 수 있다.또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

인도 재래종(C. annuum) 'Lam32'와 한국재래종 'Jeju'가 각각 저항성과 이병성 양친으로 사용되었다. Cmr1 유전자를 가지고 있는 상용 F₁ 품종 'Bukang'이 대조군으로 사용되었다. 'Lam32'의 저항성 유전자의 유전 양상 분석을 위해서 'Lam32'와 'Jeju'로부터 F₁ 종자를 확보하였다. F₂ 집단은 이 F₁ 식물체를 자가교배하여 진전시켰으며, 상기 F₂ 집단을 이용하여 'Lam32'의 CMV 저항성 유전자 연관 지도를 작성하였다. 추가적인 CMV-P1 저항성 유전자원을 확인하기 위하여, 농촌진흥청의 농업유전자원센터로부터 분양받은 총 4,197개의 고추 계통이 사용되었다. 이 중, CMV-P1에 저항성을 보이는 고추 계통은 CMV 저항성의 유전 양상 분석을 위해 'Jeju'와 교배하였다. 또한, 대립유전자 검정을 위해서 CMV-P1에 저항성을 보이는 모든 계통을 'Lam32'와 교배하였다. 종자 수확 및 식물 재배는 서울대학교부속농장(수원, 대한민국)에서 수행되었다.

2. 바이러스 접종

CMV-P1이 고추보다 담배(Nicotiana rustica)에서 좀 더 병원성이 좋기 때문에 CMV-P1 아종(strain)은 N. rustica에 접종하여 유지하였다. 바이러스 접종원을 만들기 위해서 1 g의 감염된 N. rustica 잎을 수확한 후, 0.1M phosphate buffer (pH 7.0)와 함께 갈아서 준비하였다. 매번 병리검정을 수행하기 10-14일 전에 CMV-P1 냉동 접종원을 N. rustica에 증식하였다. 바이러스의 돌연변이를 줄이기 위해서 항상 N. rustica 식물체에는 같은 냉동 접종원을 사용하여 접종하였다. 접종원은 항상 얼음 위에서 준비하여 차가운 상태를 유지하였고, 카보런덤(Carborundum) #400 (Hayashi Pure Chemical Co., Ltd. Japan)을 고추 떡잎 2장에 뿌린 후, 잎을 문질러 접종하였다. 접종 후 10분이 지나면 수돗물을 사용하여 접종된 식물체의 카보런덤 #400을 씻어주었다. 바이러스의 이탈(escape)을 방지하기 위하여 접종 일주일 후에 한 번 더 본엽에 같은 방법으로 접종하였다. 접종된 식물은 23℃ 온도 조건 하에서 16시간 명/8시간 암 조건을 유지하였다. 또한 CMV-P1에 돌연변이가 생겨 병원성이 변할 경우를 대비하기 위하여 매 검정 시에 CMV-P0 저항성 유전자 Cmr1을 가지고 있는 'Bukang' F₁ 식물체에도 5 점 이상 같이 접종하여 병원성을 확인하였다.

CMV-P1의 감염성 클론(infectious clone)을 만들기 위해서, CMV-FNY RNA genome 컨스트럭트 (pSNU1::CMV-RNA1, GFP가 달려있는 pSNU1::CMV-RNA2, pSNU1::CMV-RNA3) (Seo et al., (2009) Virology 383, 248-260; Kang et al., (2012) PLoS ONE 7(8):e43136)를 준비하여 접종에 사용하였다. 세 개의 CMV 컨스트럭트는 OD₆₀₀값을 1.0으로 맞추어, 1:1:1의 비율로 혼합하였다. CMV 컨스트럭트는 상온에서 1시간 동안 10 mM MES/10 mM MgCl₂ 버퍼에 희석하였다. 이 후, 1 ㎖ 주사기를 사용하여 CMV 컨스트럭트의 혼합물을 고추 식물체 내로 주입하였다.

3. CMV 검정

CMV 검정을 위해서 Double antibody sandwich-enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA)를 사용하였다(Agdia, USA). ELISA를 위해서 25 dpi(days post inoculation)의 잎 disc 시료 두 장을 사용하였다. 시료는 Zenith 200 ELISA reader(Anthos, Austria) 기계를 이용해 405 nm의 흡광도를 측정하였으며, 그 최대값은 4로 설정하였다(Kang et al., (2012) PLoS ONE 7(8):e43136). 통계 분석을 위해서 양성 대조군과 음성 대조군을 비교하여 던컨의 다중검정(Duncan's multiple tests)을 사용하였다. 세 식물체를 길렀으며, 잎 시료는 세 번의 독립적인 반복실험에서 각각 다른 시기에 수확하였다.

4. BSA-AFLP

본 발명자는 고추 유전체 내에 cmr2의 위치를 확인하기 위해 BSA-AFLP를 사용하였다. Genomic DNA(gDNA)는 CTAB 방법을 이용해 발달 단계의 초기 잎에서 추출하였다. 'Jeju' × 'Lam32' 교배로부터 유래한 F₂ 집단 내에서 12개의 저항성 식물체와 13개의 이병성 식물체를 선발하여 DNA를 준비한 후, 이들의 분석을 위해 각각 저항성/이병성 집단으로 pooling하였다. AFLP(Amplified fragment length polymorphism) PCR, gDNA digestion(제한효소 처리), adapter ligation, re-amplification, 및 selective amplification은 기존에 보고된 방법에서 약간 변형하여 실시하였다. 간단히 설명하자면, pooling된 DNA를 EcoRI과 MseI으로 자른 후, 제한효소 처리에 의해 만들어진 overhanging sticky ends에 adpater를 ligation하였다. 상기 ligation 산물을 512개의 프라이머 조합을 이용하여 selective amplification을 수행하였다(512 개의 프라이머 조합은 'ANN' 혹은 'CNN' (N은 프라이머 서열 내 특정 뉴클레오타이드를 지칭)의 추가적인 서열을 갖고있는 특정 adpater 서열을 인지하는 프라이머 쌍이므로, 2×4×4×4×4 = 512개의 프라이머 조합이 된다). Selective amplification을 이용해 선별된 PCR 산물의 다형성은 표현형과 마커의 유전형 간 상관관계를 계산하기 위하여 각 개체에 적용되었다. 자세한 과정과 방법은 조 등(Kor J Hortic Sci Technol (2014) 32(1):66-76)에 기술되어 있다.

5. BSA 방법을 응용한 Affymetrix chip

기존에 서술된 바와 같은 방법을 이용하여 Affymetrix array를 사용하여 BSA single-feature polymorphisms(SFP)을 확인하였다(Sim et al., (2009) BMC Genomics 10(1):466). 이 분석을 위하여 'Jeju' × 'Lam32' 유래 F₂ 집단으로부터 표현형을 기준으로 24개의 저항성/8개의 이병성 식물체를 선발하였고, 각각 분석을 위하여 pooling을 하였다. Bulked DNA (30 ㎍/array)는 DNaseⅠ을 이용하여 100-200 bp의 크기로 임의로 조각내었다(randomly fragmentation). 이 조각난 DNA는 기존 방법과 같이 labeling 하였다(Liu et al., (2014) Theor Appl Genet 127(11):2503-2513). Bulked DNA 샘플은 4 반복으로 custom Affymetrix pepper chip array (Affymetrix, USA)에 혼성화를 수행하였다. Pepper chip array에 사용된 probe chip은 UC Davis로부터 제작된 Expressed sequence tag(EST) sequence에 기반하였다(Hill et al., (2013) PloS ONE 8(2):e56200). Probe 신호는 probe set 내에서 각각 probe의 신호 강도가 일정하지 않게 떨어질 경우(non-uniform drop)를 기준으로 하여 분석하였다(Li and Durbin, (2009) Bioinformatics 25(14):1754-1760). Dstat value가 3 이상 혹은 3 이하를 보이는 SFP를 확인하기 위하여 R package (http://www.bioconductor.org/)가 기존 방법과 같이 사용되었다(Liu et al., 2014). SFPs와 일치하는 EST 서열은 C. annuum genome 데이터베이스 첫 번째 버전으로부터 확인되었다(http://peppergenome.snu.ac.kr).

6. HRM (High-resolution melting)을 이용한 다형성 분석

두 부모 계통, 'Jeju'와 'Lam32' 간에 다형성 검정을 위하여 SNP (Single nuleotide polymorphism) 마커가 사용되었다. SNPs는 Rotor-Gene 6000 thermocycler (Qiagen, Germany)의 HRM 분석을 통하여 검정되었다. PCR은 총 20 ㎕의 부피로 수행되었으며, 그 안에 50 ng의 주형 gDNA, 1×HIPI buffer (ELPIS-Biotech, Korea), 0.2 mM dNTPs, 500 mM 의 양방향 프라이머 (Bioneer, Korea), 1.5 μM SYTO9 (Invitrogen, USA), 및 0.6 units의 home-made Taq DNA 중합효소가 사용되었고, PCR 조건은 다음과 같다: 초기 변성 94℃ 2분; 35 사이클의 94℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 1분. HRM 분석을 위한 PCR은 총 20 ㎕의 부피에 20 ng의 주형 gDNA, 6 pmol의 양방향 프라이머, 2× HRM master mix (Roche, Basel, Switzerland)를 이용하였고, HRM 조건은 다음과 같다: 94℃ 4분; 45 사이클의 94℃ 10초, 56℃ 30초, 72℃ 30초.

7. Kompetitive Allele-Specific PCR (KASP) 마커 분석

'Jeju' × 'Lam32' F₂ 유전자 지도 내에 cmr2 유전자 위치를 확인하기 위하여 HRM 마커(Affy4)를 KASP 마커로 전환하였다. KASP 검정을 위한 thermocycling과 endpoint genotyping은 Roche LC480 (Roche Applied Science)으로 진행하였다. 분리집단의 유전형 분석을 위해서, 1 ㎕ 식물 gDNA (100ng)을 5 ㎕ KASP reaction mix와 0.14 ㎕의 gene-specific KASP primer mix를 혼합하여 총 10 ㎕의 부피를 만들었다. KASP 반응은 96-웰 qPCR 플레이트에서 수행되었고, 조건은 다음과 같다: hot start 94℃ 15분; 1번 사이클 총 10번 수행(94℃ 20초, 61℃ 60초; 이 사이클 내에서 annealing temperature가 61℃에서부터 55℃까지 한 사이클을 돌 때마다 0.6℃씩 떨어짐.) 2번 사이클 26번 수행(94℃ 20초, 55℃ 60초); 3번 사이클 3번 반복(94℃ 20초, 57℃ 60초). Post-melt cycles은 다음과 같다: 57℃ 10초; cooling 20℃. 유전형이 잘 분리되지 않은 신호의 경우에는 5개의 사이클을 추가하였다(94℃ 20초, 57℃ 60초).

8. SNP-based 마커의 연관분석

두 부모 집단에서 다형성을 보이는 SNP 마커는 연관분석에 사용되었다(표 1). 마커 간 연관분석은 Carthagene software(De Givry et al., 2005)가 사용되었다. 재조합빈도를 계산하기 위하여 Kosambi mapping function이 사용되었고, 최소 LOD 값 3.0과 maximum distance 30 cM이 threshold 값으로써 사용되었다.

cmr2 유전자와 연관된 분자마커 목록

	Affy4	IBP160	cmvAFLP
유형	KASP	HRM	HRM
프라이머 (5'→3')	FAM)CCGACTTCGAGCAAGCCTACA[T] (서열번호 1) HEX)CGACTTCGAGCAAGCCTACA[G] (서열번호 2)	정방향) CTTGACGTTGGACCCATCAA (서열번호 4)	정방향) TGCAGTTGGAGCAGAAGATG (서열번호 6)
프라이머 (5'→3')	Common) CGTCCTGACCCGCCTGCCAT (서열번호 3)	역방향) TGGACGTTCCCAATCAGAGA (서열번호 5)	역방향) CATGGAAAGACTCCCAAGGAAC (서열번호 7)
산물 크기	119 bp	252 bp	242 bp
맵핑 집단*	JⅹL F_2:3	JⅹL F_2:3	JⅹL F_2:3
재조합/ 총 F₂ 개체수	9/195	52/195	64/195

*, JⅹL F_2:3: C. annuum 'Jeju' ⅹ C. annuum 'Lam32' 195 F_2:3 population.

실시예 1. 'Lam32' 내 CMV 저항성 확인

세 개의 C. annuum 'Jeju'(이병성), 'Bukang'(CMV-P0 저항성, 대조군으로 사용), 및 'Lam32' (CMV-P1 저항성)의 떡잎에 CMV-P1을 각각 접종하였다. 20 dpi에 전형적인 CMV 병징인 황화(yellowing), 시들음(wilting), 모자이크 증상이 매우 확연하게 'Jeju'와 'Bukang'의 상엽에서 발견되었다(도 1A). 'Bukang'의 CMV-P1에서의 이병성은 CMV-P0 아종(CMV-Kor 및 CMV-Fny)에 대한 'Bukang'의 저항성이 Cmr1에 의해 매개되며, 이것이 CMV-P1 아종에 의해 극복된다는 것을 의미한다(도 1A 및 1B). 대조적으로 'Lam32'는 CMV 병징을 전혀 보이지 않았다(도 1A). 이 결과의 정량적 측정을 위해, 7개의 다른 CMV-P0와 P1 아종에 대해 바이러스의 축적 정도를 ELISA 실험으로 확인하였다. 'Lam32'는 접종엽 및 상엽 모두에서 모든 CMV 아종의 축적이 확인되지 않았다(도 1B). 이러한 결과는 'Lam32'가 CMV-P0와 CMV-P1에 대해서 모두 저항성을 갖는다는 것을 증명하였다.

cmr2에 의해 CMV 저항성이 조절되는 기작을 자세히 알아보기 위하여, pSNU1 벡터 내에 GFP가 태킹 되어있는 CMV-FNY를 사용하여 'Lam32'와 'Jeju'에 접종하였다. 'Jeju'에서 GFP 신호는 6 dpi에 표피세포와 엽육세포에서 모두 관찰되었지만(도 2E 및 2F), 'Lam32'에서는 GFP 신호가 접종 상처를 제외하고는 발견되지 않았다(도 2G 및 2H). 이러한 결과는 'Lam32'가 CMV-P1의 이동을 억제함으로써 저항성을 갖게 된다는 것을 부분적으로 보여준다. 이를 확실히 증명하기 위해서는, CMV-P1의 세포 내 위치에 대한 더욱 다양한 시간대의 실험이 고추 내에 cmr2 저항성 기작을 밝히는 데 도움을 줄 수 있을 것이라 생각되었다.

실시예 2. 'Lam32' 내 CMV 저항성의 유전 양상 분석

'Lam32' 내에 CMV 저항성의 유전 양상을 확인하기 위하여 'Lam32'와 'Jeju' 교배로부터 유래된 F₂와 BC₁ 집단의 저항성 분리비를 관찰하였다. 129개의 F₂ 집단에서, 저항성(resistant, R)과 이병성(susceptible, S)은 1 : 3의 비율로 분리되었다. 이병성 개체와의 여교배 집단(BCs, 'Jeju' × 'Lam32' F₁을 다시 'Jeju'와 교배한 집단) 분리비는 0R : 1S로, 저항성 개체와의 여교배 집단(BCR, 'Jeju' × 'Lam32' F₁을 다시 'Lam32'와 교배한 집단)의 분리비는 1R : 1S로 확인되었다(표 2). 이러한 유전 양상 분석은 'Lam32' 내의 CMV-P1 저항성이 단일열성유전자에 의해 조절되는 것을 보여주며, 본 발명자는 이를 CMV resistance gene 2 (cmr2)로 명명하였다.

'Jeju'와 'Lam32'간 교배된 집단 내에서의 CMV 저항성 분리비

집단	예측된 비율 (R : S)	관찰된 비율		X^2b	P^o
집단	예측된 비율 (R : S)	R	S
Jeju	0:1	0	15	-	-
Lam32	1:0	15	0	-	-
F₁ Jeju × Lam32	0:1	0	20	-	-
F₂ Jeju × Lam32	1:3	37	92	0.038	0.308
BC₁F₁ (Jeju × Lam32) × Jeju	0"1	0	50	-	-
BC₁F₁ (Jeju × Lam32) × Lam32	1:1	198	162	3.6	0.058

실시예 3. cmr2 의 염색체 내 위치 확인

cmr2의 염색체 내 위치를 확인하기 위하여, 512개의 프라이머 조합으로 BSA-AFLP를 수행하였다. F₂ 개체의 표현형과 유전형 간의 상관관계를 확인하여 AFLP fragments를 선별하였다. 512개의 검정된 마커 중에서 하나의 AFLP fragment(cmvAFLP)가 12개 저항성/13개 이병성 개체의 예상 유전형과 일치하는 다형성을 보였다(도 3A). AFLP fragment를 클로닝하여 서열 분석을 수행한 결과 서열 내에서 하나의 SNP을 발견하였고, 이를 이용해 242bp의 증폭 산물을 가지는 cmvAFLP HRM 마커를 개발하였다(도 3B). 상기 HRM 마커는 세 개의 용융 곡선(melting curve) 형태를 이용하여 세 개의 유전형(저항성 동형접합, 이병성 이형접합, 이병성 동형접합)으로 구분할 수 있다(도 3C). 추후 연관분석에 개발된 HRM 마커를 사용하였고, 이를 통해 'AC99' 유전자 지도(Livingstone et al., (1999) Genetics 152(3):1183-1202; Park et al., (2014) Mol Breed 34(3):963-975) 내 염색체 1번(혹은 8번)에 cmr2를 위치시킬 수 있었다. 염색체 1번(혹은 8번)에 위치한 몇몇 마커의 정확한 위치는 C. annuum의 순화 과정에서 염색체 1번과 8번 간의 염색체 전좌(translocation) 현상으로 인해 특정 짓기가 매우 어렵다(Wu et al., (2009) Theor Appl Genet 118(7):1279-1293). 따라서 9개의 cmvAFLP 연관 마커들은 염색체 1번으로, 5개의 cmvAFLP 연관 마커들은 염색체 8번에 위치하였다.

실시예 4. CMV-P1 저항성 연관 마커들의 미세 유전자지도 작성

본 발명의 HRM 마커가 완벽하게 cmr2 유전자와 연관되지 않기 때문에, cmr2와 가깝게 연관된 마커를 추가적으로 개발하였다. 먼저, 마이크로어레이 기술을 이용하여 BSA-SFP 분석을 수행하였다. 이를 위해서, 'Jeju' × 'Lam32' F₂ 집단으로부터 24개의 저항성/8개의 이병성 개체를 선발하였다. 총 881개의 콘티그(contig)에서 저항성 형질과 이병성 형질 간에 유의미한 신호 차이가 관측되었다. 이로부터 각각 하나의 unique EST 서열로부터 유래하는 중복되지 않는 68개의 콘티그를 선별하였고, 이 콘티그 서열 내의 SNP를 이용하여 HRM 마커를 제작하였다(Affy1 ~ Affy68). 68개의 마커 중에서 29개의 마커만이 'Jeju'와 'Lam32' 내에서 다형성이 확인되었고, 이를 195개의 'Jeju' × 'Lam32' F₂ 집단에 적용하여 유전형 분석을 수행하였다. 그 결과, CAPS_CONTIG.1005로부터 유래한 Affy4 마커가 cmr2 유전자와 가장 가깝게 연관된 것으로 확인되었다. 이 마커를 KASP 마커로 전환하였고, 이 KASP 마커를 통해서 저항성과 이병성 개체 간에 다형성을 확연하게 구분할 수 있었다. 또한 CAPS_CONTIG.1005의 염기서열 분석 결과, cmr2는 rRNA-rich 지역 부근에 가깝게 위치한 것을 확인할 수 있었다.

AC99 지도로부터 얻어진 추가 마커들을 이용하여 미세 유전자 지도 작성을 수행하였다. cmvAFLP와 가깝게 연관된 여러 마커들을 검정하여 'Jeju'와 'Lam32' 간에 다형성을 확인한 후에, IBP160이라 명명된 추가 분자마커를 선발하였다. 세 마커(cmvAFLP, IBP160, Affy4)의 유전적 및 물리적 거리로부터, cmvAFLP와 IBP160은 C. annuum CM334 염색체(Hulse-Kemp et al., (2018) Hortic Res 5:4) 8번에 위치하며, Affy4는 cmr2 유전자로부터 2.3 cM 떨어진 곳에 위치한다는 것을 확인할 수 있었다(도 4).

실시예 5. 새로운 CMV-P1 저항성 유전자원 검정

총 4,197개의 고추(Capsicum) 유전자원과 이병성 대조군 'Jeju'와 'Bukang' 그리고 저항성 대조군 'Lam32'를 이용하여 CMV-P1 검정을 수행하였다. 발아 후 8-10일이 지난 고추 떡잎에 CMV-P1을 접종하였고, 병징을 매일 관찰하였다. 첫 번째 고추 유전자원 검정 결과 명백하게 저항성으로 보이는 21점의 후보 유전자원을 선발할 수 있었다. 이 중에 18점은 C. annuum 종이었으며, 3점은 C. frutescens 종이었다(표 3). 21개의 저항성 후보 유전자원에 대하여 접종엽과 상엽 모두 ELISA를 수행하여 CMV의 축적 정도를 확인하였다. 21개 유전자원 중 7개에서 CMV가 확인되지 않았고 CMV 병징 또한 관찰되지 않았다(도 5A 및 5B). 요약하면, 고추(Capsicum) 유전자원 생물검정을 통하여 본 발명자는 새로운 CMV-P1 저항성 유전자원 7개를 추가로 확인하였다.

CMV-P1 아종에 대한 고추 유전자원 검정 결과

Capsicum species	Total number of accessions	Number of accessions
		at 21 dpi
		Susceptible	Resistant
Capsicum annuum	2594	2576	28
Capsicum baccatum	248	248	0
Capsicum chinense	208	208	0
Capsicum frutescens	146	143	3
Capsicum pubescens	2	2	0
Total	4197	4176	21

실시예 6. 저항성 유전자원의 유전 양상 분석과 대립유전자 검정

CMV-P1 저항성이 확인된 7개의 고추 유전자원의 CMV 저항성 유전 양상 분석과 cmr2의 대립유전자 검정을 위하여 각각 이병성 개체인 'Jeju'와 저항성 개체인 'Lam32'에 교배하였다. 약 10개~20개의 '7개의 저항성 유전자원' × 'Jeju' F₁ 개체에 CMV-P1을 접종한 후, 25 dpi에 병징을 관찰하였다. 모든 F₁ 식물체는 CMV-P1에 이병성인 것으로 관찰되었으며, 따라서 7개의 저항성 유전자원 모두 CMV-P1 저항성이 열성유전한다는 것을 확인하였다(표 4).

새로운 CMV-P1 저항성 유전자원에 대한 유전 양상 분석 결과

Parent lines and populations	Number of plants			Expected ratio (R : S)
Parent lines and populations	Total	Resistant (R)	Susceptible (S)	Expected ratio (R : S)
Jeju	10	0	10	0:1
IT221660	7	7	0	1:0
IT221661	6	6	0	1:0
IT221885	10	10	0	1:0
IT236359	7	7	0	1:0
IT236402	6	6	0	1:0
IT248570	10	10	0	1:0
IT264081	10	10	0	1:0
F₁ IT221660 × Jeju	10	0	10	0:1
F₁ IT221661 × Jeju	10	0	10	0:1
F₁ IT221885 × Jeju	10	0	10	0:1
F₁ IT236359 × Jeju	5	0	5	0:1
F₁ IT236402 × Jeju	18	0	18	0:1
F₁ IT248570 × Jeju	19	0	19	0:1
F₁ IT264081 × Jeju	20	0	20	0:1

7개의 저항성 유전자원과 cmr2 유전자 간에 대립유전자 관계를 확인하기 위하여, 7개의 저항성 유전자원과 'Lam32' (cmr2/cmr2) 간에 검정교배를 실시하였다. 7개의 저항성 유전자원 × 'Lam32' F₁ 식물체에 CMV-P1 검정을 실시하였으며, 모든 F₁ 식물체가 CMV-P1에 저항성인 것으로 확인되었다(표 5). 유전적 상보성 검사(Genetic complementation test) 결과, 7개의 저항성 유전자원에서 보이는 CMV-P1 저항성은 아마도 cmr2 유전자좌에서 유래되었을 것으로 생각되었다.

'Lam32'와 저항성 유전자원 간 교배된 집단 내에서의 CMV 저항성

Parent lines and populations	Number of plants			Expected ratio (R : S)
Parent lines and populations	Total	Resistant (R)	Susceptible (S)	Expected ratio (R : S)
Lam32	10	10	0	1:0
IT221660	7	7	0	1:0
IT221661	6	6	0	1:0
IT221885	10	10	0	1:0
IT236359	7	7	0	1:0
IT236402	6	6	0	1:0
IT248570	10	10	0	1:0
IT264081	10	10	0	1:0
F₁ IT221660 × Lam32	10	10	0	1:0
F₁ IT221661 × Lam32	10	10	0	1:0
F₁ IT221885 × Lam32	10	10	0	1:0
F₁ IT236359 × Lam32	5	5	0	1:0
F₁ IT236402 × Lam32	19	19	0	1:0
F₁ IT248570 × Lam32	20	20	0	1:0
F₁ IT264081 × Lam32	18	18	0	1:0

7개의 저항성 유전자원이 같은 저항성 유전자를 가지고 있을 것이라 예상되었기 때문에, 본 연구진은 cmr2 유전자의 대립유전자를 확인하기 위하여 'Affy4' 마커를 사용하였다. 이 마커는 저항성 식물체와 이병성 식물체 'Jeju', 그리고 둘을 교배한 F₁ 식물체를 분석하는데 사용되었다. 모든 저항성 유전자원은 'Lam32'와 같은 유전형을 보였으며(도 6), 이를 통해서 본 발명에서 확인된 모든 CMV 저항성 유전자원은 같은 단일열성 CMV 저항성 유전자(cmr2)를 갖고 있는 것으로 확인되었다.

<110> Seoul National University R&DB Foundation <120> Molecular marker for discrimination of CMV-P1 resistant pepper cultivar and uses thereof <130> PN18574 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ccgacttcga gcaagcctac a 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgacttcgag caagcctaca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgtcctgacc cgcctgccat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cttgacgttg gacccatcaa 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tggacgttcc caatcagaga 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tgcagttgga gcagaagatg 20 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 catggaaaga ctcccaagga ac 22

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서열번호 4 및 서열번호 5; 및 서열번호 6 및 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는, CMV (Cucumber mosaic virus) 아종(strain) CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 HRM(High-resolution melting)용 프라이머 세트.
제2항의 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, CMV (Cucumber mosaic virus) 아종(strain) CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 키트.
제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 및 완충액을 포함하는 것인 키트.
고추 시료에서 게놈 DNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계를 포함하는, CMV (Cucumber mosaic virus) 아종(strain) CMV-P1에 대해 저항성 또는 이병성을 가지는 고추 품종을 판별하기 위한 방법.
제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 HRM 분석, DNA 칩, 형광 측정, 인광 측정 또는 방사성 측정을 통해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.