KR101748366B1 - 토마토 잎곰팡이병 저항성 선별용 분자마커 및 그를 이용한 선별방법 - Google Patents

토마토 잎곰팡이병 저항성 선별용 분자마커 및 그를 이용한 선별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성과 Cf-5 이병성 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs) 부위를 검출할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용하여 토마토 곰팡이병 Cf-5 저항성과 Cf-5 이병성을 간단하고 정확하게 판별할 수 있는 선별방법에 관한 것이다.

Description

토마토 잎곰팡이병 저항성 선별용 분자마커 및 그를 이용한 선별방법{Molecular marker for selecting tomato leaf mold resistant and selection method using the same molecular marker}
본 발명은 토마토 잎곰팡이병 저항성 선별용 분자마커 및 그를 이용한 선별방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성과 Cf-5 이병성 유전자에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs) 부위를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였으며, 상기 프라이머 세트를 이용하여 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성과 Cf-5 이병성을 간단하고 정확하게 판별할 수 있는 선별방법에 관한 것이다.
가지과(Solanaceae)에 속하는 토마토(Solanum lycopersicum)는 라이코펜(lycopene), β-카로틴(β-carotene), 푸코잔틴(fucoxanthin), 루테인(lutein) 등의 항암·항산화 물질이 다량 함유되어 있어 소비자들에게 건강식품으로 인식되면서 생산량 증대와 품질 향상을 위해 시설재배가 꾸준히 증가하고 있다(Kang B.R., et al., 2011, Plant Dis., 17:142-147.).
최근 시설재배에 따른 연작으로 많은 농가에서는 잎곰팡이병에 의한 피해를 겪고 있으며, 이를 해결하기 위한 방법으로는 주로 살균제 처리에 의한 화학적 방제가 널리 이용되어 왔으나 인축에 대한 독성 및 환경오염 등에 대한 사회적 관심이 증가하고 친환경 농산물에 대한 수요가 증가함에 따라 비기주 작물을 재배하거나 잎곰팡이병균(Cladosporium fulvum, Cf) 저항성 유전자가 도입된 잎곰팡이병 저항성 토마토 품종을 재배하는 방법을 선호하고 있다(Enya J. K., et al., 2009, Plant Pathol., 75:76-79.; Takken F.L.W., et al., 1998, Plant J., 14:401-411.; Kim Y.S., et al., 2011, CTRS, cheonan, korea.).
잎곰팡이병의 저항성은 약 100년 전부터 Cf 저항성 유전자에 의해 결정된다고 보고되었으며, 이후 야생 토마토 근연종으로부터 Cf 저항성 유전자를 재배 품종에 도입해 왔다. 토마토 재배 품종에 도입된 Cf 저항성 유전자는 Cf-2, Cf-4, Cf-5, Cf-6, Cf-9, Cf-11이 있는데, Cf-2, Cf-9와 Cf-11은 S. pimpinellifolium에서, Cf-5는 S. lycopersicum var. cerasiforme로부터, Cf-4는 Lycopersicon habrochaites로부터 발견되어 잎곰팡이병 저항성 품종을 육성하는데 이용되고 있다(Enya J. K., et al., 2009, Plant Pathol., 75:76-79.; Takken F.L.W., et al., 1998, Plant J., 14:401-411.). 그러나, 저항성 유전자가 도입된 내병성 품종을 육종하는데 있어서 우수한 저항성 개체를 선별하는 병리검정 과정은 많은 시간과 비용이 소요되며, 전문적인 병리검정 시스템과 전문인력, 그리고 전문기술이 요구되는 문제가 있었다. 이에 잎곰팡이병에 대한 분자표지(molecular marker) 개발은 상기 문제점 해결에 있어서 시급하고 중요한 사항이다.
한편, 단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)은 개체마다 차이를 나타내는 외형적 특성, 유전병의 원인, 맞춤약 처방 등 유전정보상의 중요한 실마리를 제공하므로 유전정보학문의 초기부터 많은 연구가 이루어져왔다. 특히 현재까지 사람의 게놈에서 20만개 이상의 단일염기다형성 부위(SNP)가 발견되었으며, 점차 그 양은 엄청난 속도로 축적되고 있다(Wang, D.G., et al., 1998, Science, 280:1077-1082.). 이러한 염기서열의 변화는 비암호화 영역(non-coding region)에서 가장 높게 나타나며, 암호화 영역(coding region) 안에서는 인트론 영역이 엑손 영역에 비해 서열변화의 정도가 높은 것으로 알려져 있다(Ching, A., et al., 2002, BMC Genet., 3:19.; Van Deynze, A.E., et al., 2007b, In Plant and Animal Genome XV. San Diego, CA. Scherago International.). 즉, 인트론의 서열은 서로 다른 종간에도 동일한 형태로 보존되어 있는 경우가 많기 때문에 SNP를 찾기 위하여 인트론이나 비암호화 영역으로부터 SNP를 만드는 방법이 이용된다(Fourmann, M.P., et al., 2002, Theor. Appl. Genet., 105:1196-1206.). 이러한 염기서열의 차이를 이용한다면 매우 가까운 품종 간에도 구분이 가능한 분자표지를 개발할 수 있다.
이에 본 발명자들은 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성과 Cf-5 이병성을 구별할 수 있는 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs) 마커를 개발하기 위해 노력한 결과, 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성과 Cf-5 이병성 유전자에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 4개의 SNP 마커를 확인하고, 이 SNP 마커의 염기를 검출할 수 있는 프라이머 세트를 개발하였으며, 상기 프라이머 세트를 이용하여 토마토 곰팡이병 Cf-5 저항성과 Cf-5 이병성을 간단하고 정확하게 판별할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성을 선별하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성과 Cf-5 이병성을 판별하는 것을 포함하는 토마토 잎곰팡이병 저항성 및 이병성을 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 39 또는 서열번호 40의 염기서열, 또는 이의 상보적인 염기서열로 구성된 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별용 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 서열번호 39 또는 서열번호 40의 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 이의 cDNA를 포함하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별용 마이크로어레이를 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성을 선별하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 Cf-5 저항성 유전자와 Cf-5 이병성 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs)을 포함하여 증폭할 수 있도록 고안된 서열번호 3의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 41의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 이루어진 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 단일염기다형성(SNPs)은 서열번호 41로 이루어진 Cf-5 저항성 유전자의 상보적 염기서열 중 S(609번째 염기), Y(610번째 염기), M(669번째 염기) 및 R(697번째 염기)에 위치하는 SNP 마커로, 특정 염기의 빈도에 따라 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 또는 Cf-5 이병성의 표현형을 결정할 수 있는 마커이다. 여기서, 상기 서열번호 41은 미국 국립생물정보센터(national center for biotechnology information, NCBI)에 "AF053993.1"로 등록된 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 유전자 염기서열의 상보적 염기서열이다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성을 선별하기 위한 키트 또는 분자마커로 이용될 수 있다.
하나의 구체적 양태로서, Cf-5 저항성 유전자의 염기서열과 Cf-5 이병성 유전자의 염기서열을 비교 분석하여 단일염기다형성(SNPs) 부위를 포함하여 PCR 증폭이 가능한 19개의 프라이머 세트를 제조하였으며, 이 중 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트는 HRM(high-resolution melting) 중합효소연쇄반응(PCR)을 통해 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성과 Cf-5 이병성 간에 0.5℃의 융해(melting) 값의 차이를 나타내므로 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성을 선별하는데 사용할 수 있다. 또한, 상기 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 증폭시킨 산물의 염기서열은 서열번호 41로 이루어진 Cf-5 저항성 유전자의 상보적 염기서열 중 S(609번째 염기), Y(610번째 염기), M(669번째 염기) 및 R(697번째 염기)를 포함하며, 상기 S, Y, M 및 R은 Cf-5 저항성 유전자와 Cf-5 이병성 유전자의 SNPs임을 확인하였다. 아울러 상기 S, Y, M 및 R이 각각 C, C, G 및 C의 유전자형을 갖는 토마토는 잎곰팡이병에 대하여 저항성을 나타내며, S, Y, M 및 R이 각각 G, G, C 및 G의 유전자형을 갖는 토마토는 잎곰팡이병에 대하여 이병성을 나타냄을 확인하였다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "프라이머"는 카피하려는 핵산가닥에 상보적인 단일가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 주형-지시적 DNA 합성을 개시할 수 있는 개시점으로서 작용하는 것을 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 18개 이상, 바람직하게는 20 내지 200개, 보다 바람직하게는 20 내지 100개, 보다 더 바람직하게는 20 내지 30개의 연속된 뉴클레오티드로 구성되며, 주형과 충분히 안정된 염기쌍을 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
또한, 상기 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예컨대, 호스래디쉬 옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예컨대, 32P), 형광성 분자, 화학그룹 (예컨대, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "염기"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드(deoxyribonucleotide) 또는 리보뉴클레오티드(ribonucleotide)이며, 특별히 다르게 언급되어 있지 않는한 자연의 뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "선별"은 Cf-5 저항성 유전자 또는 Cf-5 이병성 유전자를 갖는 토마토를 선택하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트를 사용하여 Cf-5 저항성 유전자 또는 Cf-5 이병성 유전자를 증폭하는 경우, 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충용액, DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg2+), dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH2O)를 포함할 수 있다. 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등이 추가로 포함할 수 있다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성을 선별하는 방법에 관한 것이다:
(a) 토마토 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형과 상술한 프라이머 세트를 혼합하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 산물로부터 Cf-5 저항성 유전자 및 Cf-5 이병성 유전자 사이의 단일염기다형성(SNPs)을 검정하여 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 또는 Cf-5 이병성을 판별하는 단계.
이하에서는, 본 발명에 따른 선별방법을 각 단계에 따라 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(a) 토마토 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계이다.
본 발명에 있어서, 상기 토마토 시료는 Cf-5 저항성 유전자를 아그로박테리움법, 원형질세포법 또는 입자총법 등을 이용하여 인위적으로 도입하거나 토마토 잎곰팡이병 저항성(R) 계통과 이병성(S) 계통을 교배시킨 토마토이다.
본 발명에 있어서, 상기 게놈 DNA는 토마토의 종자 또는 토마토 전체, 바람직하게는 토마토 종자를 파하고 출아한 후 어린 식물체의 잎으로부터 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 분리하거나 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
(b) 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계이다.
상기 (a) 단계에서 분리한 게놈 DNA를 주형으로 하고, 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 사용하여 Cf-5 저항성 유전자와 Cf-5 이병성 유전자에서 특이적으로 차별화되어 나타나는 4개의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs)을 포함하는 표적서열을 증폭하는 단계이다.
상기 표적서열의 증폭은 (ⅰ) 초기 변성(pre-denaturation) 과정; (ⅱ) 변성(denaturation) 과정, 프라이머 대상 핵산결합(annealing) 과정 및 신장(elongation) 과정으로 이루어지는 한 싸이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 과정; 및 (ⅲ) 최종 열처리 과정 또는 이들 과정을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 이루어진다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "사이클"은 표적 핵산의 1 카피(copy)를 생성하는 과정을 말한다.
본 발명에 있어서, 상기 변성, 프라이머의 대상 핵산결합단계 및 신장 단계에서의 온도 및 시간 조건은 특정의 범위로 한정되지는 않고, 당업자가 적합한 조건을 선택할 수 있으나, 바람직하게는 (ⅰ) 90 내지 98℃에서 1 내지 7분 동안 게놈 DNA를 충분히 변성하는 개시변성과정, (ⅱ) 90 내지 98℃에서 30 내지 60초 동안의 변성과정, (ⅲ) 50 내지 70℃에서 30 내지 60초 동안 프라이머의 대상 핵산결합과정, (ⅳ) 65 내지 75℃에서 30 내지 60초 동안 신장과정으로 이루어지는 1 사이클을 30회 반복 수행하는 단계, 및 (ⅴ) 65 내지 75℃에서 5 내지 10분 동안 추가 신장단계를 포함할 수 있다. 각 단계의 시간과 사이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
본 발명에 있어서, 중합효소연쇄반응은 본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 이외에 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 적당량의 DNA 중합효소(예를 들어, Thermus aquatiucs(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Phyrococcus furiosis(Pfu)로부터 얻은 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합효소 조인자(Mg2+), 완충용액, dNTPs(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 물(dH2O)를 포함할 수 있다. 상기 완충용액은 이에 제한되지는 않으나 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100), 디메틸설폭사이드(dimethylsufoxide, DMSO), Tween20, nonidet P40, PEG 6000, 포름아마이드 및 소혈청 알부민(BSA) 등을 추가로 사용하여 이루어질 수 있다.
(c) 중합효소연쇄반응에 의해 증폭된 표적서열을 분석하여 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성을 판별하는 단계이다.
상기 (b) 단계를 통해 증폭된 표적서열의 염기서열을 결정하고, 상기 결정된 염기서열 중 4개의 단일염기다형성(SNPs)을 검정함으로써 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성을 판별하는 단계이다.
본 발명에 따라 증폭된 표적서열은 서열번호 41로 이루어진 Cf-5 저항성 유전자의 상보적 염기서열 중 S(609번째 염기), Y(610번째 염기), M(669번째 염기) 및 R(697번째 염기)를 포함하며, 상기 S, Y, M 및 R이 각각 C, C, G 및 C인 경우 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성으로 판별하고, 상기 증폭된 표적서열이 S, Y, M 및 R이 각각 G, G, C 및 G인 경우 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 이병성으로 판별한다.
본 발명에 있어서, 상기 증폭된 표적서열의 염기서열 결정은 염기서열 분석법(direct sequencing), DNA 마이크로어레이(microarray), TGGE(temperature gradient gel electroresis), SSCP(single strand conformation polymorphism), DHPLC(denaturing high performance liqueid chromatography), HRM(high-resolution melting) 분석 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석을 이용하여 탐색할 수 있으며, 바람직하게는 염기서열 분석법(direct sequencing) 또는 HRM(high-resolution melting) 분석을 사용하는 것이 좋다.
하나의 구체적 예로, 잎곰팡이병 저항성 토마토로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 사용하고, 본 발명에 따라 제작된 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 다음 HMR 기술을 이용하여 분석을 실시한 결과, 79.5℃ 내지 80.0℃, 바람직하게는 79.6℃ 내지 79.9℃, 보다 바람직하게는 79.7℃ 내지 79.8℃의 융해(melting) 값을 나타내는 경우 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 이병성으로, 80.0℃ 내지 80.5℃, 바람직하게는 80.1℃ 내지 80.4℃, 보다 바람직하게는 80.2℃ 내지 80.3℃의 융해(melting) 값을 나타내는 경우 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성으로 판단한다(도 2 참조). 또한, 잎곰팡이병 저항성 토마토로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하고 본 발명에 따라 제조된 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 산물의 염기서열을 분석을 실시하여 S, Y, M 및 R의 염기가 C, C, G 및 C인 경우 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성으로 판단하고, S, Y, M 및 R의 염기가 G, G, C 및 G인 경우 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 이병성으로 판단한다(도 3 참조).
상술한 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 포함하는 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 선별방법은 토마토의 과실이 완전히 성숙하기 전에 간단하고 정확하게 잎곰팡이병에 대한 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성을 선별 및 특정할 수 있으므로, 실제 저항성을 가지는 토마토를 재배함에 있어서 시간 및 노동력을 절감시킬 수 있는 효과가 있다. 또한, 종래 전기영동이나 제한효소의 처리 등의 과정을 추가적으로 수행할 필요가 없기 때문에 시간과 비용을 크게 절약할 수 있다.
한편, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 39 또는 40의 염기서열, 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 또는 Cf-5 이병성 선별용 프로브에 관한 것이다.
본 발명의 명세서에서, 용어 "프로브"란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 39 또는 서열번호 40의 염기서열은 본 발명에 따른 프라이머 세트에 의해 증폭된 다형성 서열(polymorphic sequence)이다. 상기 다형성 서열이란 폴리뉴클레오티드 서열 중에서 SNPs를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말하며, 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA가 될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 39 또는 서열번호 40의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열은 토마토 시료로부터 추출한 게놈 DNA와 혼성화시켜 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 또는 Cf-5 이병성을 선별할 수 있다.
하나의 구체적 양태로서, 토마토 시료로부터 추출한 게놈 DNA가 서열번호 39의 염기서열에 혼성화(hybridization)되는 경우 토마토 잎곰팡이병에 대한 Cf-5 저항성 품종으로 판별하며, 토마토 시료로부터 추출한 게놈 DNA가 서열번호 40의 염기서열에 혼성화되는 경우 토마토 잎 곰팡이병에 대한 Cf-5 이병성 품종으로 판별할 수 있다.
또한, 상기 서열번호 39 또는 40의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 이의 cDNA를 포함하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 또는 Cf-5 이병성 선별용 마이크로어레이를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 마이크로어레이는 당분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 예컨대, 상기 뉴클레오티드는 아미노 실란(amino-silane), 폴리-L-리신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법은 압전(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법(micropipetting), 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
본 발명에 따라 고안된 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 토마토 잎곰팡이병 저항성 및 이병성의 선별방법은 Cf-5 저항성 유전자 및 Cf-5 이병성 유전자의 유무를 표현형 분석없이 확인할 수 있으며, 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 관련 유전자형을 빠른 시간에 적은 비용으로 구분할 수 있으므로, 실제 잎곰팡이병에 대한 저항성을 가지는 품종의 개발 및 육종함에 있어서 시간 및 노동력을 절감시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 Cf-5 저항성 토마토(R) 및 Cf-5 이병성 토마토(S)로부터 분리한 DNA를 주형으로 하고, Cf-5 저항성 유전자 정보를 바탕으로 설계한 19개의 SNP 관련 프라이머 세트를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시한 후, 아가로오스 겔에 전기영동한 결과이다.
도 2는 Cf-5 저항성 토마토(R) 및 Cf-5 이병성 토마토(S)로부터 분리한 DNA를 본 발명에 따른 프라이머 세트(서열번호 3 및 서열번호 4)를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시한 후, HRM 분석을 통해 잎곰팡이병 저항성과 이병성 간의 융해(melting)값을 측정한 결과이다.
도 3은 Cf-5 저항성 토마토(R) 및 Cf-5 이병성 토마토(S)로부터 분리한 DNA를 본 발명에 따른 프라이머 세트(서열번호 3 및 서열번호 4)를 이용하여 중합효소연쇄반응을 실시하여 증폭시킨 DNA의 염기서열을 Cf-5 저항성 유전자의 상보적 염기서열을 주형으로 정렬하여 비교한 그림이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 토마토 Cf-5 저항성 유전자의 탐색 및 토마토 게놈(genome) 상의 위치 확인
NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) gene bank에 등록되어 있는 토마토(Lycoperisicon hirsutum)의 Cf -5 저항성 유전자(AF053993.1)에 대한 유전정보를 탐색하였고, 유전자에 대한 아미노산 시퀀스를 Sol Genomics Network data base (http://solgenomics.net/)에서 BLASTP로 검색하여 토마토 유전자 정보 및 염색체 내 위치를 확인하였다. 또한, Cf-5 저항성 유전자의 정확한 염색체 내 위치를 확인하고자 Cf-5 저항성 유전자 아미노산 서열을 Sol Genomics Network data base (http://solgenomics.net/)에서 BLASTP 검색을 실시하였다.
그 결과, 968 aa 크기의 아미노산 정보를 확인하였으며, Cf-5 저항성 유전자는 토마토 게놈(SL2.40)의 6번 염색체 상에서 2,161,780bp와 2,165,345bp 사이에 Cf-5 유전자 위치를 확인하였다.
실시예 2 : 토마토 Cf-5 저항성 토마토(R) 및 이병성 토마토(S) 육종
Cf-5 저항성을 나타내는 토마토(Lycoperisicon esculentum cv. Moneymaker) 동종교배(inbred line)하여 얻은 F2 집단의 Cf-5 저항성 계통(R) 및 이병성 계통(S)의 토마토 종자를 각각 여과지(No. 1, Whatman, Germany)가 포함된 페트리 디쉬(petri dish) 안에 넣고 여과지를 덮은 후 여과지가 완전히 젖을 정도로 증류수를 부어 주었다. 그 다음 25℃(16일 light/8일 dark)가 유지되는 그린하우스에서 종자를 발아시켰다. 그 후 상기 종자를 모종흙이 담긴 플라스틱 화분(지름 7.5cm)에 옮겨 심은 후 4장의 본엽(true leaf)이 나올 때까지 재배하였다.
실시예 3 : 토마토 Cf-5 저항성 토마토(R) 및 이병성 토마토(S) 선별을 위한 마커 제조
상기 실시예 1의 Cf-5 저항성 유전자 정보를 Tomato marker database를 활용하여 영역 내에 존재하는 SNP 관련 시퀀스를 탐색하였다(http://marker.kazusa.or.jp/Tomato/). 선택한 SNP 관련 시퀀스를 바탕으로 19개의 프라이머 세트를 설계한 후 마크로젠에 의뢰하여 프라이머를 합성하였다. 상기 프라이머 세트들의 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
그 후 Cf-5 저항성 선별에 적합한 프라이머 세트를 찾기 위해 토마토 Cf-5 저항성(R) 및 Cf-5 이병성(S)의 DNA를 주형으로 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1에서 재배한 Cf-5 저항성 토마토(R) 및 Cf-5 이병성 토마토(S)로부터 잎을 채취한 후 질소용액을 이용하여 파쇄하였다. 그 다음 DNA 추출 키트(plant mini kit, Cat. no. 69104, Qiagen, USA)를 사용하여 사용메뉴얼에 따라 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였다. 그 다음 상기 CF-5 저항성 토마토(R) 및 이병성 토마토(S)의 게놈 DNA(10 ㎍)에 2x DNA 중합효소(Emerald PCR premix, Takara, Japan) 및 상기에서 제작한 프라이머(10pM) 세트를 각각 첨가한 후 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하여 Cf-5 저항성 유존자 및 이병성 유전자 부위를 증폭하였다. 상기 중합효소연쇄반응은 유전자 증폭기(TP3000 Takara Shuzo Co., Tokyo, Japan)를 사용하여 94℃에서 5분 동안 변성시킨 다음 94℃에서 30초 동안 변성(denaturation), 55℃에서 30초 동안 증폭(annealing), 72℃에서 30초 동안 연장(extension)을 40 사이클을 실시한 후, 후기 연장(post-extension)을 72℃에서 5분 동안 실시하였다. 그 다음 상기 증폭된 DNA 및 100 bp DNA ladder(M, 3407A, Takara, USA)는 1.2% 아가로오스 겔(agrose gel)에 전기영동한 후 EDTA로 염색하여 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
No. 프라이머 서열(53) 크기(bp)
1 F TGCTTCTTCCTCCTTTGCAT(서열번호 1) 239
R GGTTGTGGCAAAGATCCTGT(서열번호 2)
2 F TGCTTCTTCCTCCTTTGCAT(서열번호 3) 321
R CCCTCAAGGACCTCAATTCC(서열번호 4)
3 F ACAGGATCTTTGCCACAACC(서열번호 5) 297
R CATAGCGATCCGTGTGCTTA(서열번호 6)
4 F GGAATTGAGGTCCTTGAGGG(서열번호 7) 322
R ACAAAGGGATTGGAGCTTGA(서열번호 8)
5 F GATCTCCCAGGACAGAAGGA(서열번호 9) 346
R GGAACTTTGCCAGAGCTGAG(서열번호 10)
6 F TTCAAGCTCCAATCCCTTTG(서열번호 11) 261
R GGAACTTTGCCAGAGCTGAG(서열번호 12)
7 F AAACATGATTTCAGCCCCTG(서열번호 13) 331
R TCTGGAGGGAGCAATACCAC(서열번호 14)
8 F GTGGTATTGCTCCCTCCAGA(서열번호 15) 297
R TTATTCCTGCTTCATTCGGC(서열번호 16)
9 F CCTTCAAATTGTTTCTCGGC(서열번호 17) 277
R GCTTCATTGGGGAATCTGAA(서열번호 18)
10 F GCAGATTTCTCATATTGCCGA(서열번호 19) 323
R TATTCCTGCTTCATTGGGGA(서열번호 20)
11 F TTCAGATTCCCCAATGAAGC(서열번호 21) 339
R GGTGAGAATGCTCTTAATGGCT(서열번호 22)
12 F GCCATTAAGAGCATTCTCACC(서열번호 23) 286
R TATTCCTGCTTCATTGGGGA(서열번호 24)
13 F AATGAAGCAGGAATAGAGCCA(서열번호 25) 297
R GCTTCATTGGGGAATCTGAA(서열번호 26)
14 F TTCAGATTCCCCAATGAAGC(서열번호 27) 323
R TCAGGAACAATTCCACCACA(서열번호 28)
15 F AAGCTTGGCTAGTGAACCGA(서열번호 29) 297
R TCCTTTTTGGCTTCATGGAC(서열번호 30)
16 F TGTGGTGGAATTGTTCCTGA(서열번호 31) 347
R GTTGCATTTGCTTCGACTGA(서열번호 32)
17 F GTCCATGAAGCCAAAAAGGA(서열번호 33) 274
R TCTTCCCTGATAGCAACCAAA(서열번호 34)
18 F TCAGTCGAAGCAAATGCAAC(서열번호 35) 282
R TGGCAACTTTGACTCAGTCCT(서열번호 36)
19 F TCAGTCGAAGCAAATGCAAC(서열번호 37) 320
R AGAGTGGTCATGATCATTGTGTG(서열번호 38)
실험결과, 9, 10, 11, 12, 13 및 14번의 프라이머 세트를 제외한 나머지 프라이머 세트는 저항성(R)과 이병성(S)의 유전자를 증폭시키는 것을 확인하였다.
실시예 4 : 토마토 Cf-5 저항성 유전자(R) 및 이병성 유전자(S) 내 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP) 탐색을 위한 HRM(high-resolution melting) 분석
상기 실시예 3에서 추출한 Cf-5 저항성 토마토(R) 및 Cf-5 이병성 토마토(S)의 게놈 DNA 5㎍에 상기 실시예 3에서 설계한 1~8번 프라이머 세트 및 15~19번의 프라이머 세트(5pM), 25mM MgCl2 및 2x 반응용액(High resolution melting master mix?)을 각각 넣고 최종 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 첨가한 다음 Lightcycler(Lightcycler 480? Roche Diagnostics, Penzberg, Geermany)를 사용하여 95℃에서 10분 동안 변성시킨 다음 95℃에서 20초 동안 변성(denaturation), 55℃에서 20초 동안 프라이머 결합(annealing), 72℃에서 20초 동안 연장(extension)을 40 사이클을 실시하였고, High Resolution Melting 단계에서 72℃에서 1초, 그리고 97℃에서 1초(continuous)로 PCR을 종결하였다 그 결과를 도 2에 나타내었다.
실험결과, 13개의 프라이머 세트(1~8번 및 15~19번의 프라이머 세트) 중 2번의 프라이머 세트(서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트)는 HRM PCR을 통해 저항성(R)과 이병성(S) 간에 0.5℃의 융해(Melting) 값의 차이를 보이므로 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 관련 유전자형의 구분이 가능함을 확인하였다.
실시예 5 : 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 단일염기다형성(single nucleotide polymorphism, SNP)를 포함하는 Cf-5 저항성 유전자(R) 및 이병성 유전자(S) 클로닝 및 염기서열 확인
상기 실시예 3에서 확인된 밴드 중 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트(2번)를 이용하여 증폭시킨 저항성 및 이병성 밴드(321bp)를 DNA 정제키트(purification kit, Promega)를 사용하여 정제하였다. 그 다음 상기 정제된 DNA를 양 끝이 반듯이 절단되어 있는 블런트(blunt) 벡터(TOPcloner™ Blunt kit, EZ002S, Enzynomics, Korea)에 클로닝 하였다. 그 다음 상기 벡터를 막투과성이 증가된 대장균, 즉 형질전환세포에 형질전환시킨 후 플라스미드 DNA 정제 키트(plasmid mini kit, 12125, Qiagen, USA)를 이용하여 Cf-5 저항성 유전자가 포함된 벡터를 추출하였다. 그 다음 상기 추출한 Cf-5 저항성 유전자가 포함된 벡터는 마크로젠(macrogen crop., Korea)에 의뢰하여 벡터에 있는 M13 프라이머를 사용하여 염기서열 분석을 의뢰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
실험결과, 2번의 프라이머 세트를 이용하여 증폭시킨 Cf-5 저항성 유전자의 염기서열은 서열번호 39의 폴리뉴클레오티드로 분석되었고, Cf-5 이병성 유전자의 염기서열은 서열번호 40의 폴리뉴클레오티드로 분석되었다.
또한, 상기 분석된 Cf-5 저항성 유전자 및 Cf-5 이병성 유전자의 염기서열과 NCBI에 등록된 Cf-5 저항성 유전자(NCBI accession no. AF053993.1)의 상보적 염기서열(서열번호 41)을 얼라인먼트(aligment)를 수행한 결과, Cf-5 저항성 유전자와 Cf-5 이병성 유전자에서 차이가 있는 4개의 SNPs(서열번호 41의 염기서열 중 609번째, 610번째, 669번째 및 697번째 염기)를 확인하였다.
<110> Sunchon University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Molecular marker for selecting tomato leaf mold resistant and selection method using the same molecular marker <130> PA-14-0215 <160> 41 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 1 of Cf-5 resistant gene <400> 1 tgcttcttcc tcctttgcat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 1 of Cf-5 resistant gene <400> 2 ggttgtggca aagatcctgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 2 of Cf-5 resistant gene <400> 3 tgcttcttcc tcctttgcat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 2 of Cf-5 resistant gene <400> 4 ccctcaagga cctcaattcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 3 of Cf-5 resistant gene <400> 5 acaggatctt tgccacaacc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 3 of Cf-5 resistant gene <400> 6 catagcgatc cgtgtgctta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 4 of Cf-5 resistant gene <400> 7 ggaattgagg tccttgaggg 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 4 of Cf-5 resistant gene <400> 8 acaaagggat tggagcttga 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 5 of Cf-5 resistant gene <400> 9 gatctcccag gacagaagga 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 5 of Cf-5 resistant gene <400> 10 ggaactttgc cagagctgag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 6 of Cf-5 resistant gene <400> 11 ttcaagctcc aatccctttg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 6 of Cf-5 resistant gene <400> 12 ggaactttgc cagagctgag 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 7 of Cf-5 resistant gene <400> 13 aaacatgatt tcagcccctg 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 7 of Cf-5 resistant gene <400> 14 tctggaggga gcaataccac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 8 of Cf-5 resistant gene <400> 15 gtggtattgc tccctccaga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 8 of Cf-5 resistant gene <400> 16 ttattcctgc ttcattcggc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 9 of Cf-5 resistant gene <400> 17 ccttcaaatt gtttctcggc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 9 of Cf-5 resistant gene <400> 18 gcttcattgg ggaatctgaa 20 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 10 of Cf-5 resistant gene <400> 19 gcagatttct catattgccg a 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 10 of Cf-5 resistant gene <400> 20 tattcctgct tcattgggga 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 11 of Cf-5 resistant gene <400> 21 ttcagattcc ccaatgaagc 20 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 11 of Cf-5 resistant gene <400> 22 ggtgagaatg ctcttaatgg ct 22 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 12 of Cf-5 resistant gene <400> 23 gccattaaga gcattctcac c 21 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 12 of Cf-5 resistant gene <400> 24 tattcctgct tcattgggga 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 13 of Cf-5 resistant gene <400> 25 aatgaagcag gaatagagcc a 21 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 13 of Cf-5 resistant gene <400> 26 gcttcattgg ggaatctgaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 14 of Cf-5 resistant gene <400> 27 ttcagattcc ccaatgaagc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 14 of Cf-5 resistant gene <400> 28 tcaggaacaa ttccaccaca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 15 of Cf-5 resistant gene <400> 29 aagcttggct agtgaaccga 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 15 of Cf-5 resistant gene <400> 30 tcctttttgg cttcatggac 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 16 of Cf-5 resistant gene <400> 31 tgtggtggaa ttgttcctga 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 16 of Cf-5 resistant gene <400> 32 gttgcatttg cttcgactga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 17 of Cf-5 resistant gene <400> 33 gtccatgaag ccaaaaagga 20 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP d primer 17 of Cf-5 resistant gene <400> 34 tcttccctga tagcaaccaa a 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 18 of Cf-5 resistant gene <400> 35 tcagtcgaag caaatgcaac 20 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 18 of Cf-5 resistant gene <400> 36 tggcaacttt gactcagtcc t 21 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP forward primer 19 of Cf-5 resistant gene <400> 37 tcagtcgaag caaatgcaac 20 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SNP reverse primer 19 of Cf-5 resistant gene <400> 38 agagtggtca tgatcattgt gtg 23 <210> 39 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cf-5 resistant gene polymorphic sequence <400> 39 tgcttcttcc tcctttgcat aataattttg tgttccagtt cttcaatgat tcttgcaagc 60 catcttagat ttccagtcga gatcaagaaa tatattatgg atatgccaat acacagtcca 120 cttccatagc ccatcagagc tgctttccaa aaatcattga aaaatttaga attgctttct 180 tgatcttcta gcgcagacac tgtatagttt ttctctgaca caggatcttt gccacaacct 240 tttgaaactg gatatccacg taatccatca ttacctatat atgaattgct ctcaaaggta 300 cggaattgag gtccttgagg g 321 <210> 40 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cf-5 susceptibility gene polymorphic sequence <400> 40 tgcttcttcc tcctttgcat aataattttg tgttccagtt cttcaatgat tcttgcaagc 60 catcttagat ttccagtcga gatcaagaaa tatattatgg atatgccaat acacagtcca 120 cttccatagc ccatcagagc tgctttggaa aaatcattga aaaatttaga attgctttct 180 tgatcttcta gcgcagacac tgtatacttt ttctctgaca caggatcttt gccagaacct 240 tttgaaactg gatatccacg taatccatca ttacctatat atgaattgct ctcaaaggta 300 cggaattgag gtccttgagg g 321 <210> 41 <211> 3979 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lycopersicon esculentum disease resistance protein (Cf-5) gene complementary sequence <400> 41 ggatccgata aatgcataca tatcattcaa taaacacaac atttattgta tatcatcaaa 60 attcataata ttacattttc ccaactgaag aaaagcttat aaaactaaaa atctaatcca 120 acatcataag ctgcaacaca ggaagaagca aatcctttac accagcgtct tcttattctt 180 ggctcctgaa aatctggaaa aataagaaag tgagtcacac aactataaat ttttagcctt 240 tgttatatat cacaacttcc aactgattac tagcaatttg tctcaagcgt taataagtat 300 ttgttgataa aaaaaaaaac atatattagt tgttagaata aactaaaaaa gataagtgtt 360 agaggttagc ttgaatacct gaagttctga aatcaaatct ttctgtattg gtaacttgtc 420 tagaagcgat tatttcttct tctgtaattt ctttgacctc gctgcttctt tctcctttgc 480 acgataattt tgtgttccag ttcttcaatg attcttgcaa gccatcttag atttccagtc 540 gagatcaaga tatatattat ggatatgcca atacacagtc cacttccata gcccatcaga 600 gctgctttcc aaaaatcatt gaaaaattca gaattgcttt cttgatcttc tagcgcagac 660 actgtatagt ttttctctga cacaggatct ttgccacaac cttttgaaac tggatatcca 720 cgtaatccat cattaccttc atatgaattg ctctcaaagg tacggaattg aggtccttga 780 gggatgcatc cttggagata attgtgggag agatttaaga cttcaagaaa cgtaagagaa 840 gcaagttgtt gtggtatctc tcccgaaagt tggttaaacg aaaggtctag tgattccagt 900 atagataaac ttccaagtga tgatggtata tagccttgca atgcattatg agatacatta 960 agtacacgga tcgcaatgag atctcccagg acagaaggaa tatgtccttc aaatttgttg 1020 cttgaaagat cgataattgt gtacaaagac agaattctca caatttcaag ctccaatccc 1080 tttgtcacaa ctaccaccga gtcatcgtaa tagctttcat aacttggttc ctccattgtt 1140 ttatcaactg tcctcatccc tttcaaatgt tcaaatagac tcgttggtaa gtcttgcgag 1200 aatgcattgc gagagagatc tatgattcgg agatcaggaa acatgatttc agcccctgat 1260 gatcttatag gtccatgcaa tttattcgat gtcaacctta aaactctcag ctctggcaaa 1320 gttcccaacc acatgggaaa tgtgtcgttg agttgattgt ctcctaaatc aagaacttgc 1380 agctttttgc aattgtccaa agaccgaggg atttcatctg ctagttcatt gccatgcaag 1440 ttgagactta tcagtgaaca tccaatgcta aaatttgttg gaagagtccc agaaagtttg 1500 ttattctgca tatcaaaaac ctggaggcta ctaatattgc caaaaaattg tggtattgct 1560 ccctccagat tgtttctgcc aaaatcaagt atttttagtg atgttaaatt ggaaatagat 1620 gaagggagct ctcctctgaa actattagat gacatcgaca aaatgtgaag gtcactgata 1680 ttacccaaac attgcggaac ttttcccttc aaattgtttc tcgacatata caacacttcc 1740 agtgatgtca aattgcacac aaatgaagga atttccccaa tgagatcgtt atcactgaga 1800 aacagagttt gcagatttct catattgcca aatgaagcag gaatagagcc agaaagctga 1860 ttattgtaaa gatacaacct agacaagttg tttagattcc ccaatgaagc aggaatagag 1920 ccattaagag agttattacc caaaaatagt tcagtaagag aactcaggta acctatttct 1980 tcaggaatag agccagaaag ctgattattg taaagataca acataaacaa gttgttcaga 2040 ttccccaatg aagcaggaat agagccatta agagagttat tacccaaata tagttcagta 2100 agagaactca ggtaacctat ttcttcagga atagagccag aaagctgatt attgtaaaga 2160 tacaacataa acaagttgtt cagattcccc aatgaagcag gaatagagcc attaagagca 2220 ttctcaccca aatctaggta agtaagagac cttaggtaac ctatttcttc aggaatagag 2280 ccagaaagct tattattgta aagatccaac ctagacaagt tgtttagatt ccccaatgaa 2340 gaaggaatag agccattaag agcattctca cccaaatcta ggtaagtaag agaccttagg 2400 taacctattt cttcaggaat agagccagaa agcttattat tgtaaagatc caacctagac 2460 aagttgttta gattccccaa tgaagcagga atggaaccac taagaaagtt gatacccaaa 2520 gatagcttag taagtgacct taggtaacct atttcttcag gaatagagcc agaaagctga 2580 ttattgtaaa gatacaaaaa agacaagttg ttcagattcc ccaatgaagc aggaatggaa 2640 ccactaagaa agttgatatc caaagatagc ttagtaagag accttaggta acctatttct 2700 tcaggaataa agccagaaag ctgattttca taaagaaata aaaaagacaa gttggtcata 2760 ttgcccaatg aagcaggaat agaaccacta agaaagttga tacccaaaga tagcttagta 2820 agagacctta ggtaacctat ttcttcagga ataaagccat ttaaatgatt gttaaatatg 2880 cggatgatct gaagcttggc tagtgaaccg atttgtggtg gaattgttcc tgaaatctga 2940 ttggtgttca agtcaagata gacaagattt gtgagattac caatctcagg tggaatggta 3000 ccagagatat tgttgttgct aagatcaaga ttctcgagaa aagggaggga tgaaaatgga 3060 aaagcataaa gtgtaccaat gacactggca tttgtaatat tcaacgtgtt taccctacca 3120 ttcaagcata caactccata ccagtccttg catgcattag aacttgtcgt ccatgaagcc 3180 aaaaaggaat tattctggtt cttgaaagtt gctttccatt tcaagagggc agttgcctcc 3240 tcagtcgaag caaatgcaac tgtaaagagg tagaaaacag tgaaaaactg aagtgaagag 3300 aatactttgc tagtaaccat catcatagtg tgagtttatt gtttccgatt caataggata 3360 ttgtacgtta cttatactaa ttagagatca acaagacaca cgttttttcc aaatttgcta 3420 atttggttgc tatcagggaa gaaaatgttg tcattctcaa gtcaactttt ggactgttgt 3480 gttagaggtc taatttagcc aaggactgag tcaaagttgc caaaatagtt ttgttatcac 3540 acaatgatca tgaccactct tagtgtataa tacatttggt tcaaaattct cttctctcac 3600 atgttttgtt tttgtctttg agaaaatgtt agtcattttt caatctttct ttgtcatgtt 3660 gagaagggta ttttattttt atgggaccta cttgatattt gatgtcttat gatgtggaac 3720 ttttgaaaaa tgaatattca aataaatgaa gagcaaagaa tatcaagaga taatggtcag 3780 aattaaattt gaatatcact tttttttttt tgcaagtttt atattcaaat aataagttat 3840 ttattttccc tacttgaact atcgtcaact caataaagtc gtgttgtaaa gggtatttta 3900 tttttatgac acctccattt caaatttttc atgctcaaat attttgataa aattaaattg 3960 caatgactct aaaatcgat 3979

Claims (8)

  1. 서열번호 3 및 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별용 키트로서, 상기 프라이머 세트는 서열번호 41로 이루어진 Cf-5 저항성 유전자의 상보적 염기서열 중 609번째 염기, 610번째 염기, 669번째 염기 및 697번째 염기를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 것을 특징으로 하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별용 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 Cf-5 저항성 유전자의 염기서열 중 609번째 염기, 610번째 염기, 669번째 염기 및 697번째 염기는 Cf-5 저항성 유전자와 Cf-5 이병성 유전자의 단일염기다형성(single nucleotide polymorphisms, SNPs)인 것을 특징으로 하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별용 키트.
  3. (a) 토마토 시료로부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리된 게놈 DNA를 주형과 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 혼합하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 증폭된 산물의 염기서열을 결정하여 토마토 잎곰팡이병 저항성 또는 이병성을 판별하는 단계;를 포함하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 증폭된 산물의 염기서열 결정은 HRM(high resolution melting) 분석 또는 염기서열 분석법(direct sequencing)을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 (c) 단계에서 토마토 잎곰팡이병 저항성 또는 이병성의 판별은 서열번호 41로 이루어진 Cf-5 저항성 유전자 염기서열에서 609번째 염기, 610번째 염기, 669번째 염기 및 697번째 염기가 각각 C, C, G 및 C인 경우 잎곰팡이병에 대한 저항성을 가지는 토마토이며, 서열번호 41로 이루어진 Cf-5 저항성 유전자 염기서열에서 609번째 염기, 610번째 염기, 669번째 염기 및 697번째 염기가 각각 G, G, C 및 G인 경우 잎곰팡이병에 이병성을 가지는 토마토로 판별하는 것을 특징으로 하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별방법.
  6. 서열번호 39 또는 서열번호 40으로 이루어진 염기서열, 또는 이의 상보적인 염기서열로 구성된 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별용 프로브.
  7. 제6항에 있어서, 상기 서열번호 39 또는 40의 염기서열은 서열번호 3 및 4의 염기서열로 구성된 프라이머 세트에 의하여 증폭되는 염기서열인 것을 특징으로 하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별용 프로브.
  8. 서열번호 39 또는 서열번호 40으로 이루어진 염기서열, 이의 상보적인 염기서열, 이에 의해 코딩되는 폴리펩타이드 또는 이의 cDNA를 포함하는 토마토 잎곰팡이병 Cf-5 저항성 및 Cf-5 이병성 선별용 마이크로어레이.
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