KR101395645B1 - 고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 ｒａｐｄ 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법 - Google Patents

고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 ｒａｐｄ 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 RAPD 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법에 관한 것이다. 본 발명의 RAPD 프라이머는 고온 스트레스 저항성 배추를 용이하게 선별할 수 있고, 빠른시간에 적은 비용으로 고온 스트레스 저항성을 갖는 배추 품종을 개발 및 육종할 수 있는 장점이 있다.

Description

고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 ＲＡＰＤ 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법{RAPD primer and method for selecting Chinese Cabbage having heat stress tolerance}
본 발명은 고온 스트레스 저항성 배추의 선별을 위한 RAPD 프라이머 및 이를 이용한 고온 스트레스 저항성 배추의 선별방법에 관한 것이다.
배추는 우리나라의 4대 채소작물 중의 하나이고, 연간 230만 톤 생산으로 약 1조원의 시장으로 추정되는 주요 경제작물이다.
여러 비 생물체에 의한 스트레스(abiotic stress)는 배추작물의 생산력에 가장 큰 제한요인으로 작용할 수 있다. 예를 들어 생육 적정온도보다 낮은 온도에 의한 피해, 반대로 높은 온도에 의한 피해, 수분부족에서 오는 피해, 토양의 과다 염류로 인한 피해 등은 예측이 어려운 재해이므로 이러한 여러 비 생물체에 의한 스트레스 저항력이 높은 품종의 개발이 필요하다.
전통육종 방법을 사용하여 새로운 품종을 개발할 때 원하는 형질을 표현형 검정과정으로 선발하게 된다. 하지만 표현형 검정이 어렵거나 긴 시간을 요구하기도 한다. 또한 선발과정에서 원치 않는 형질도 같이 도입될 수 있다. 그러므로 육종과정에서 선발과 제거는 여러 형질에서 동시에 이루어져야 하지만 많은 표현형의 동시검정은 어려운 과제이다. 이러한 부분에서 분자마커의 개발은 표현형 검정 단계를 마커 확인으로 대신할 수 있다. 따라서 표현형 검정의 단계를 쉽고 빠르게 진행할 수 있는 분자마커의 개발이 품종개발 기술 확립에 필수적이다.
배추작물에 있어서 고온 스트레스에 저항성을 가지는 유전자에 위치하거나 또는 가까이 인접한 분자마커의 개발은 전통육종 기술에 분자마커 활용 기술을 접목하여 빠른 시간에 적은 비용으로 품종을 개발할 수 있는 장점을 가지므로 반드시 개발되어야 할 분야이다.
한편, 최근 들어 분자생물학 분야의 급진적인 발전과 더불어 식물의 속, 종간 또는 종내 품종간 분류에 분자생물학적인 방법들이 다양하게 사용되고 있다. 이를 위하여 핵산(DNA) 수준에서 유전자원의 다양성(genetic diversity) 연구를 가능케 하는 핵산 지문 분석 방법 및 다양한 DNA 마커들이 개발되고 있다. 분자생물학 수준에서의 DNA 분석에 의한 변종의 감별은 그 변종의 양적수준과 더불어 다수의 특성을 파악하여 알 수 있으며 환경의 영향을 배제할 수 있는 장점이 있다. 그 중에서 RFLP(제한효소 단편 장다형, Restriction Fragment Length Polymorphism)는 일련의 DNA 사슬을 제한효소로 처리했을 때 생기는 DNA 단편들이 개체간의 유전적 조성의 차이 즉, 염기 서열상의 차이에 따라서 그 수나 길이가 서로 다르게 나타난다는 사실에 기초한 것으로써 다양하게 이용되고 있다. 하지만 RFLP는 순도가 높은 DNA가 다량으로 필요하며 시간과 노력과 비용이 많이 소요될 뿐 아니라 시험과정이 복잡하고 방사성 동위원소를 이용해야 하는 단점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 방법으로 기술적으로 단순하고 다형상성(Polymorphism)의 추적이 용이한RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA) 방법이 개발되었다. RAPD 방법은 신속하게 결과를 도출하며 적용하기 쉽고 사전에 염기 서열 정보를 가질 필요가 없다. 이를 이용한 기술로서, 대한민국 등록특허 제10-0264743호에 “marker RAPD를 이용한 벼의 유묘 내냉성에 관여하는 양적 형질 유전자 지도(QTL)와 저온저항성 벼품종 선발 방법”이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-0215084호에 “RAPD 표식에 의한 고려인삼의 산지 판별방법 및 그 방법에 사용되는 프라이머”가 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-0764561호에 “ＲＡＰＤ 표지인자를 이용한 양파의 웅성불임회복 유전자판별 방법”이 개시되어 있다.
이에 본 발명자는 고온 스트레스의 저항성을 갖는 배추를 선별하고 육종하기 위하여, 고온 스트레스 저항성을 갖는 배추의 특정 부위를 특이적으로 증폭하는 RAPD 프라이머 서열을 개발함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 서열번호 14의 염기서열로 구성된 고온 스트레스 저항성 배추 선별용 RAPD(random amplified polymorphic DNAs) 프라이머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머를 포함하는 고온 스트레스 저항성 배추 선별용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머를 이용하여 고온 스트레스 저항성 배추를 선별하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 서열번호 14의 염기서열로 구성된 고온 스트레스 저항성 배추 선별용 RAPD(random amplified polymorphic DNAs) 프라이머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머를 포함하는 고온 스트레스 저항성 배추 선별용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머를 이용하여 고온 스트레스 저항성 배추를 선별하는 방법을 제공한다.
본 발명의 RAPD 프라이머는 고온 스트레스 저항성 배추를 용이하게 선별할 수 있고, 빠른시간에 적은 비용으로 고온 스트레스 저항성을 갖는 배추 품종을 개발 및 육종할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 서열번호 14의 염기서열로 구성된 RAPD 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후, 전기영동 결과를 확인한 도이다.
도 2는 서열번호 1 내지 14에 의하여 증폭된 서열의 유전자 지도를 나타낸 도이다.
도 3은 서열번호 1 내지 14에 의하여 증폭된 서열이 고온 스트레스 저항성과 연관된 정도를 나타낸 도이다.
본 발명은 서열번호 14의 염기서열로 구성된 고온 스트레스 저항성 배추 선별용 RAPD(random amplified polymorphic DNAs) 프라이머를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 고온 스트레스 저항성으로 알려진 배추 계통 "92"와 고온 스트레스 감수성으로 알려진 "93" 계통을 교배하여 F1세대 및 F1의 자가수분 세대인 "91" 개체의 F2 집단을 육성하였다. 이 후, 520개의 RAPD 프라이머를 이용하여 92, 93 및 F2 집단에 대하여, PCR을 수행한 후, 전기영동을 하였다. 고온 스트레스 저항성 배추 계통의 "92" 및 F2 집단 중 고온 스트레스 저항성의 표현형을 갖는 배추에서만 나타나는 서열번호 14에 의하여 증폭되는 서열인 Z08_420 부위의 전기영동 밴드를 확인하였다. 상기 밴드의 DNA 서열 분석결과 서열번호 15의 염기서열을 갖는 것을 확인하였다. 또한, 서열번호 1 내지 14에 의해 증폭된 서열과 서열번호 15의 유전자 지도를 작성한 후, 고온 스트레스 저항성과의 연관도를 분석한 결과, 서열번호 14에 의하여 증폭된 서열번호 15의 염기서열이 고온 스트레스 저항성과 연관되어 있는 것을 확인하였다. 따라서, 서열번호 14의 RAPD 프라이머를 이용하여, 고온 스트레스 저항성 배추를 선별할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 RAPD란 무작위적으로 합성한 DNA 서열을 의미하고, 이를 프라이머로 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어인 프라이머란 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP (deoxynucleoside triphosphate)의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 효소 (예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제), 방사성 동위원소(예를 들어, 32P), 형광성 분자, 화학그룹 (예를 들어, 바이오틴) 등이 있다.
본 발명의 RAPD 프라이머에 의하여 증폭된 서열은 서열번호 15의 염기서열인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 "선별"은 특정 표현형을 갖는 배추를 선택하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 14의 염기서열로 구성된 RAPD 프라이머를 포함하는 고온 스트레스 저항성 배추의 선별용 PCR 키트를 제공한다.
상기 고온 스트레스 저항성 배추의 선별용 PCR 키트는 상기의 프라이머 세트 이외에, PCR 키트에 포함되는 통상적인 구성성분을 포함할 수 있다. 상기 키트에 포함되는 통상적인 구성성분은 반응완충액, 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP) 및 Mg2 +와 같은 조인자 등일 수 있다. 다양한 DNA 중합효소가 본 발명의 증폭 단계에 이용될 수 있으며, E. coli DNA 중합효소 I의 클레나우 단편, 열안정성 DNA 중합효소 및 박테리오파아지 T7 DNA 중합효소를 포함한다. 바람직하게는, 중합효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소이고, 이는 Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis, 및 Pyrococcus furiosus (Pfu)를 포함한다. 상기 중합효소 대부분은 박테리아 그 자체로부터 분리될 수 있고 또는 상업적으로 구입할 수 있다. 또한, 본 발명에 이용되는 중합효소는 중합효소를 암호화하는 클로닝 유전자의 높은 레벨을 발현하는 세포로부터 수득할 수 있다. 중합 반응을 실시할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 제공하는 것이 바람직하다. 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다.
증폭 반응에 이용되는 모든 효소들은 동일한 반응 조건에서 활성 상태일 수 있다. 사실, 완충액은 모든 효소들이 최적의 반응 조건에 근접하도록 한다. 따라서, 본 발명의 증폭 과정은 반응물의 첨가와 같은 조건의 변화 없이 단일 반응물에서 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은
1)서열번호 14의 염기서열로 구성된 RAPD 프라이머와 배추로부터 추출한 DNA 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계; 및
2)상기 1)단계의 증폭된 시료를 전기영동 하는 단계;를 포함하는 고온 저항성 배추의 선별방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 서열번호 14의 RAPD 프라이머 서열에 의하여 증폭되는 서열번호 15의 염기서열을 고온 스트레스 저항성 배추를 식별하는 마커로 사용할 수 있다.
상기 서열번호 15의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 프로브로 이용할 수 있다. 본 발명에서 프로브란 혼성화 프로브를 의미하는 것으로, 핵산의 상보성 가닥에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 이를 이용하여, 배추의 게놈 DNA를 추출하여, 상기 서열번호 15의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 프로브로, 배추의 게놈 DNA와 혼성화 시킬 수 있다. 고온 스트레스 저항성 배추의 경우, 상기 서열번호 15의 염기서열에 의하여 혼성화되는 배추를 고온 스트레스 저항성 배추로 결정할 수 있다.
본 발명의 상기 서열번호 15의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열을 포함하는 마이크로어레이를 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 마이크로어레이는 당분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
예컨대, 상기 뉴클레오티드는 아미노 실란(amino-silane), 폴리-L-리신(poly-L-lysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 기판 상에 고정될 수 있다. 또한, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 및 플라스틱으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법은 파이조 일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅법(micropipetting), 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시 예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 고온 스트레스 저항성 배추 선별을 위한 특이적 프라이머 및 이에 의하여 증폭되는 서열 탐색
1. 배추 계통 교배
고온 스트레스 저항성으로 알려진 배추 계통 "92"와 고온 스트레스 감수성으로 알려진 "93" 계통을 교배하여 F1세대 및 F1의 자가수분 세대인 "91" 개체의 F2 집단을 육성하였다. 상기 F2 세대를 이용하여 실험을 진행하였다.
2. 각 배추 계통의 DNA 추출
92, 93 및 91 계통의 F2 개체에서 배추 잎을 채취한 후, 동결건조 후 CTAB(cetyltrimethylammonium bromide) 방법을 이용하여 DNA를 추출하였다.
보다 구체적으로 추출 방법은 분쇄기로 15분 분쇄하였고, 수조에서 65℃로 10분 가열하였다. 5M의 암모늄아세테이트 250㎕를 넣어준 후, 원심분리를　10분동안 실시하였다. 원심 분리 후, 상층액을 취하여 차가운 EtOH를 900㎕ 가하고, 10분 동안 -70℃를 유지시켰다. 이 후, 알코올로 건조시키고, 증류수를 가하였다. 이렇게 추출한 DNA를 분광 측정기를 이용하여 농도를 측정하고, 최종농도를 10ng/㎕로 희석하였다.
3. 추출한 DNA 의 PCR 증폭
당업계에서 통상적인 방법으로 제조한 520 종류의 RAPD(Random amplified polymorphic DNA) 프라이머(A01~Z20)를 이용하여 상기 실시예 1의 2에서 추출한 DNA를 PCR 증폭시켰다. 총량 15㎕(증류수 6.02㎕, dNTP 0.4㎕, Etaq 중합효소 0.08㎕, 10x Etaq 완충용액 1.5㎕, 프라이머 2㎍/㎕, DNA 5㎕)의 용액을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행은 최초 변성을 95℃, 3분간 실시한 후, 변성은 95℃에서 15초, 어닐링 과정은 36℃에서 30초, 신장 과정은 72℃에서 2분 수행하였으며, 50번 반복 수행하였다.
4. 전기영동 분석
520 종류의 RAPD 프라이머를 이용하여 증폭한 시료를 각각, 에티디움 브로마이드(1.5 μg/mL)가 포함된 1.5% 아가로오스겔을 이용한 전기영동을 수행하였다. 이 중, 밴드가 명확하고 다형성을 보이는 프라이머 세트를 선택하였고, 이의 서열을 하기의 표 1에 나타내었다. 이하의 QTL 분석에서 가장 고온 스트레스와 연관된 것으로 나타난 서열번호 14의 프라이머로 증폭한 경우의 전기 영동 분석 결과를 도 1에 나타내었다.
A12 TCGGCGATAG 서열번호1
C13 AAGCCTCGTC 서열번호2
E11 GAGTCTCAGG 서열번호3
F03 CCTGATCACC 서열번호4
J05 CTCCATGGGG 서열번호5
K03 CCAGCTTAGG 서열번호6
N16 AAGCGACCTG 서열번호7
M04 GGCGGTTGTC 서열번호8
P14 CCAGCCGAAC 서열번호9
Q14 GGACGCTTCA 서열번호10
Q15 GGGTAACGTG 서열번호11
R12 ACAGGTGCGT 서열번호12
X01 CTGGGCACGA 서열번호13
Z08 GGGTGGGTAA 서열번호14
도 1에 나타낸 바와 같이, 고온 스트레스 저항성을 갖는 92 개체와 F2 세대 중 고온 스트레스에 대해 저항성을 보이는 개체에서만 나타난 DNA 밴드 부위를 확인하였다. 상기 밴드 부위를 Z08_420이라고 하고, 이의 염기서열을 서열번호 15에 나타내었다. 따라서, 상기 서열번호 14의 프라이머는 고온 스트레스 저항성 배추를 선별하는데 사용할 수 있다는 것을 확인하였고, 이에 의하여 증폭된 서열은 고온 스트레스 저항성과 연관된 서열임을 확인하였다.
실시예 2 유전자 지도 작성 및 QTL 분석
상기 표 1의 RAPD 프라이머로 증폭된 서열에 대하여 Joinmap 4.0 (Van Ooijen, 2006)프로그램을 사용하여 연관 분석을 통한 유전자 지도를 작성하였고,
MAPQTL 5.0 (Van Ooijen, 2004)프로그램의 multiple QTL model 방법으로Z08_420과 고온에 대한 스트레스 저항성(내서성)과의 연관정도를 분석하였다.
상기의 유전자 지도는 도 2에 나타내었고, 배추의 내서성 표현형과 연관정도를 도 3에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 15의 Z08_420은 서열번호 10, 11의 Q14 및 Q15로 증폭된 서열(Q14_590 및 Q15_483)의 사이에 존재한다.
또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 서열번호 15와 배추의 내서성과 연관정도가 가장 우수하였고, 서열번호 15와 유전적으로 가까운 거리에 존재하는 Q14_590 및 Q15_483이 내서성 표현형과 연관정도가 우수하였다.
따라서, 서열번호 15의 Z08_420을 검출함으로써, 고온 스트레스 저항성이 있는 배추를 선별할 수 있음을 확인하였다.
또한, 서열번호 15의 염기서열은 고온 스트레스 저항성 배추에서 특이적으로 검출되는 바, 이를 고온 스트레스 저항성 배추에 대한 프로브로 이용할 수 있음을 확인하였다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

  1. 서열번호 14의 염기서열로 구성된 고온 스트레스 저항성 배추 선별용 RAPD(random amplified polymorphic DNAs) 프라이머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 14의 염기서열에 의하여 증폭되는 염기서열은 서열번호 15의 염기서열인 것을 특징으로 하는, 고온 스트레스 저항성 배추 선별용 RAPD 프라이머.
  3. 제1항의 RAPD 프라이머를 포함하는 고온 저항성 배추 선별용 PCR 키트
  4. 1)서열번호 14의 염기서열로 구성된 RAPD 프라이머와 배추로부터 추출한 DNA 시료를 혼합하여 PCR을 수행하는 단계; 및
    2)상기 1)단계의 증폭된 시료를 전기영동하는 단계;를 포함하는 고온 저항성 배추의 선별방법.
  5. 서열번호 15의 염기서열 또는 이의 상보적인 염기서열로 구성된 고온 스트레스 저항성 배추 선별용 프로브.
  6. 제5항에 있어서, 상기 서열번호 15의 염기서열은 서열번호 14의 염기서열로 구성된 프라이머에 의하여 증폭되는 염기서열인 것을 특징으로 하는, 고온 스트레스 저항성 배추 선별용 프로브.
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