CN113502347A - 一种用于鉴别辣椒抗感cmv的引物对及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别辣椒抗感CMV的引物对及其应用。一种用于鉴别辣椒抗感CMV的引物对，正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。利用辣椒基因组DNA对该标记进行PCR扩增；如果有214 bp的分子标记条带，则为抗病植株；如果有220bp的分子标记条带，则为感病植株。利用该标记可以精准高效的筛选抗CMV育种材料，在杂交和回交群体中可高效、准确的筛选携带抗性基因的后代单株，相较于常规抗CMV育种，可显著加快抗CMV育种材料的创制和新品种的选育。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术工程领域，涉及一种用于鉴别辣椒抗感CMV的引物对及其应用。
背景技术
黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是世界十大植物病毒之一，可侵染超过100个科1200种植物。刘勇等（2019）调查显示辣椒中检出的33种病毒中，CMV检出率高达20.29%，超越烟草花叶病毒（检出率14.64%）成为危害我国辣椒生产的第一大优势病毒。CMV作为威胁我国辣椒生产的优势病毒，培育抗性品种是防治CMV最经济有效的方法，也是我国辣椒抗病育种的主攻目标。
国内外育种家通过抗性转育，育成了一系列中抗或耐CMV的辣椒品种，但高抗CMV品种稀缺。很多新的CMV病毒株系可突破原有抗性，导致现有品种已无法满足产业需求。鉴定和应用新的抗CMV基因或将多个抗性基因聚合，育成广谱、持久、高抗CMV 的辣椒品种是解决高抗品种稀缺最有效的方法。辣椒抗CMV 基因的鉴定、克隆及抗性机理解析有助于抗性基因的转育应用，一直是辣椒抗CMV 研究的重点和热点。辣椒上已鉴定出30余个抗CMV相关的QTL和基因，除单显性基因Cmr1外，其他抗性基因均未转育应用，根本原因在于抗性基因和抗性机理模糊不清。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于鉴别辣椒抗感CMV的引物对。
本发明的另一目的是提供该引物对的应用。
本发明的又一目的是提供一种鉴定辣椒抗CMV的方法。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种用于鉴别辣椒抗感CMV的引物对，正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述的引物对在鉴别辣椒抗、感CMV品种中的应用。
本发明所述的引物对在制备鉴别辣椒抗、感CMV品种的试剂中的应用。
一种鉴定辣椒抗CMV的方法，该方法包括使用本发明所述的引物对进行检测的步骤。
作为本发明的一种优选，所述的方法包括利用本发明所述的引物对对辣椒基因组DNA进行PCR扩增；如果扩增产物有214 bp的条带且没有220bp条带，则为抗病植株；如果有220bp的分子标记条带且没有214bp条带，则为感病植株。
作为本发明的一种优选， PCR反应体系15μl，包括7.5μl 2×Taq Master Mix，2μlgDNA模板，正反向引物分别为0.25μl，ddH2O补足至15μl。
作为本发明的一种优选，PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸7 min。
作为本发明的一种优选，PCR产物利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果有214bp的条带的植株为抗病植株；如果有220 bp的条带且没有214bp条带，则为感病植株；二者同时存在为杂合单株。
有益效果：
申请人在辣椒抗源材料C. frutescens cv. PBC688的2号染色体上定位到1个抗CMV主效QTL（qCmr2.1），实时荧光定量PCR和VIGS等技术明确了CA02g19570为qCmr2.1的候选基因；启动子序列分析显示该区域包含光信号、激素应答和逆境胁迫响应等多种顺式作用元件，抗感材料间存在多个响应元件的差异，起始密码子上游277bp处感病材料存在1个6-bp 插入导致该区域内存在3个串联的胁迫响应原件 STRE，而抗病材料PBC688和CM334中只有2个STRE。基于以上研究基础，开发出1个位于启动子区的InDel标记qCmr2.1-P，用于辣椒抗CMV种质材料筛选、在杂交和回交转育CA02g19570的过程中辅助筛选携带抗性基因的后代单株，用于种质资源创制。
该标记位于抗性基因CA02g19570的启动子区域，距离起始密码子只有277 bp左右，与抗性基因连锁极为紧密，基本不会发生重组，对该抗性基因的筛选效率可达到100%。该标记是一个基于PCR技术的共显性标记，基于该标记开发的引物对可应用于苗期抗CMV选择，相对于抗CMV人工接种鉴定和田间鉴定，省时、省力、高效，从而加速抗CMV种质创制和育种进程。
附图说明
图1. CM334、PBC688和G29间qCmr2.1的启动子区6 bp碱基的插入/缺失
图2. 标记qCmr2.1-P 在抗感材料及回交群体中扩增情况
S：感病材料G29；R：抗病材料PBC688；1-60：回交群体BC2 60个单株
具体实施方式
实施例1
课题组前期研究发现实时荧光定量PCR和VIGS等技术明确了CA02g19570为qCmr2.1的候选基因，该基因对CMV具有抗性。抗CMV材料PBC688为母本，感病材料G29为父本，杂交获得F1杂交种，G29为回交父本回交2代获得BC2群体。
分子标记的引物设计： 根据起始密码子上游277 bp处感病材料存在1个6-bp 插入（图1），取该InDel位点两翼各150 bp碱基长度，共300 bp长度用于引物设计。采用Primer5.0 进行引物设计，上游引物设计范围在1～150 bp，下游引物设计范围为 156～300 bp，产物大小为150～250 bp之间，退火温度在52～60 ℃。
分子标记的引物序列为：
qCmr2.1-P-F：AAGGGGGAGTATGATTATTGTT（SEQ ID NO.1）；
qCmr2.1-P-R：TATTTATTTACCGCCTACGAGT（SEQ ID NO.2）；
利用新型快速植物基因组DNA提取试剂盒提取gDNA（Bioteke, Cat#DP3112），取植株幼嫩叶片0.2 g左右，液氮冷冻研磨，按照试剂盒说明书进行基因组DNA提取。1%琼脂糖凝胶电泳检测gDNA质量，紫外微量分光光度计检测gDNA浓度，调整浓度为20 ng/μL，置于-20℃冰箱保存备用。
PCR反应体系15μl，包括7.5μl 2×Taq Master Mix (Tsingke BiologicalTechnology ) ，2μl gDNA模板，正反向引物分别为0.25μl（100 μmol/L），ddH2O补足至15μl。PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸7 min。
PCR产物利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果有214bp的条带的植株为抗病植株；如果有220 bp的条带且没有214bp条带，则为感病植株；二者同时存在为杂合单株。
为了检测该标记是否可用于杂交和回交群体抗性单株的辅助筛选，本试验应用抗性材料PBC688和感病材料G29 及一个包含60个单株的BC2群体进行验证。结果如图2所示：该标记在抗感材料间具有明显差异，而回交群体基因型与G29相同的为33株，基因型为杂合体的有27株，基本符合1:1的遗传分离比。田间抗CMV鉴定发现27株杂合单株未发现明显CMV症状，33株基因型与母本相同的单株25株表现出明显的系统花叶症状，8株表现出新叶明脉和叶片黄化等轻微症状。以上结果说明该标记引物用于鉴别CMV抗性、感性植株是可行的。
Claims (9)
1.一种用于鉴别辣椒抗感CMV的引物对，其特征在于正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示。
2.权利要求1所述的引物对在鉴别辣椒抗、感CMV品种中的应用。
3.权利要求1所述的引物对在制备鉴别辣椒抗、感CMV品种的试剂中的应用。
4.一种鉴定辣椒抗CMV的方法，其特征在于该方法包括使用权利要求1所述的引物对进行检测的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于利用权利要求1所述的引物对对辣椒基因组DNA进行PCR扩增；如果扩增产物有214 bp的条带，则为抗病植株；如果有220bp的分子标记条带且没有214bp条带，则为感病植株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于 PCR反应体系15μl，包括7.5μl 2×TaqMaster Mix，2μl gDNA模板，正反向引物分别为0.25μl，ddH2O补足至15μl。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸7 min。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于PCR产物利用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，如果有214bp的条带的植株为抗病植株；如果有220 bp的条带且没有214bp条带，则为感病植株；二者同时存在为杂合单株。
9.权利要求1所述的引物对在辣椒抗CMV分子标记辅助育种中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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