CN111575398B - 玉米第4号染色体雄性不育相关基因的分子标记及其应用 - Google Patents

玉米第4号染色体雄性不育相关基因的分子标记及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了玉米第4号染色体雄性不育相关基因的分子标记及其应用。本发明提供了检测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米育性中的应用；所述Zm00001d053895@243,231,250位点为序列1第20位；所述Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为CC或TT或TC。本发明在玉米自交系中首次发现控制核雄性不育的隐性单基因Zm00001d053895，并且根据该基因上的SNP位点的基因型鉴定玉米的育性，该位点的基因型为培育或者筛选雄性不育育种资源创造了基础。

Description

玉米第4号染色体雄性不育相关基因的分子标记及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种玉米第4号染色体雄性不育相关基因的分子标记及其应用。
背景技术
玉米作为应用杂种优势最成功的作物之一，其产量在世界范围内有了显著的提高。 人工去雄是避免母株自花授粉的传统方法，但这种方法不仅费时费力，而且也不经济。更重要的是，由于上部叶片的损伤，这种方法可能导致杂交种的产量下降。因此，利 用雄性不育系是玉米杂交种生产中最可行的选择之一。
细胞质雄性不育(CMS)是由细胞核与线粒体相互作用引起的，在作物杂交生产 中得到了广泛的应用。不同类型的CMS存在育性恢复、遗传多样性差和对某些疾病 的感染性增加等问题，在一定程度上限制了其应用。因此，在杂交种生产中需要更实 用的方法。
由细胞核基因控制的核雄性不育(GMS)能够解决与细胞质雄性不育相关的所有实际生产问题，因此已有大量研究围绕鉴定玉米中细胞核基因控制的核雄性不育 (GMS)的调控基因展开并取得了一定成果。迄今为止，研究人员已经发现了数百个 玉米GMS突变体，有17个GMS基因被克隆和鉴定。这些基因在玉米花药中从减数 分裂前到减数分裂后的不同发育阶段中起着重要作用，包括孢原细胞形成、花药体细 胞分裂、绒毡层发育、花粉母细胞减数分裂、花粉形成和花药开裂。已经证实，大多 数已鉴定的GMS基因作为转录因子或参与脂多糖代谢和其他过程，从而与绒毡层或 小孢子发育相关。在拟南芥中，DYT1-TDF1-AMS-MS188-MS1的遗传途径和相关的 调控网络已经被证实介导绒毡层的发育。AMS基因编码bHLH转录因子可以直接调控 多个调节花粉壁形成的靶点，如MS188、EXL5、TEK等。其突变体在酚类化合物积 累、孢粉素沉积和小孢子释放方面存在缺陷，表明其在复杂的调控花粉壁结构转录网 络中的中心作用。尽管人们对模式植物雄性生殖发育的遗传基础有了深入的了解，但 玉米中的这种转录途径仍然不清楚。
尽管GMS在各种种质中稳定且普遍存在，但在商业环境下难以通过自交产生大 量的雄性不育系。因此，人们已经开发了几种生物技术策略利用GMS进行玉米杂交 种的生产。例如，智能核不育技术(SPT)和多控制不育(MCS)系统已经通过利用 Ms45、ZmMs7、Ms30和ZmMs33等基因应用于玉米杂交种的生产。这些方法十分巧 妙地克服了利用GMS基因的困难。因此，研究我国优良种质中的新GMS基因，对我 国玉米依赖雄性不育生产的发展具有重要意义。京科968是我国玉米的主要品种之一， 累计种植面积超过600万公顷，具有高产、多抗、广适等优点。基于S型细胞质雄性 不育的三系系统已成功应用于京科968的商业化生产，但在回交群体中也发现育性不 稳定的现象，这可能危害种子纯度。然而，迄今为止，在其母本京724中还没有发现 GMS突变体，因此为京科968的商业化生产而建立基于生物技术的雄性不育系统的理 论基础仍然比较有限。
发明内容
本发明的一个目的是提供检测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点基因型的物质的用途。
本发明提供的检测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米育性中的应用；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点为序列1第20位；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为CC或TT或TC。
本发明还提供了检测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点基因型的物质在选育或辅助选育或鉴定或辅助鉴定雄性不育玉米中的应用；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点为序列1第20位；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为CC或TT或TC。
上述应用中，所述检测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点基因型的物质如下1)或2)：
1)为成套引物，所述成套引物由序列表中序列3所示的单链DNA分子或其衍生 物、序列表中序列4所示的单链DNA分子或其衍生物和序列表中序列5所示的单链 DNA分子组成；
2)含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒。
上述应用中，所述序列表中序列3所示的单链DNA分子的衍生物为序列3所示 的单链DNA分子的5'端连接一种荧光序列，在本发明的实施例中，连接FAM荧光序 列；
所述序列表中序列4所示的单链DNA分子的衍生物为序列表中序列4所示的单 链DNA分子的5'端连接另一种荧光序列，在本发明的实施例中，连接HEX荧光序列。
本发明另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定玉米育性的方法。
本发明提供的方法，为检测待测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为CC还是TT还是TC，
若所述Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为TT，则所述待测玉米为雄性不育玉米；
若所述Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为CC或TC，则所述待测玉 米为可育玉米；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点为序列1第20位。
本发明第3个目的是提供一种选育或辅助选育雄性不育玉米的方法。
本发明提供的方法，为检测待测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为CC还是TT还是TC，选择基因型为TT的待测玉米进行培育，得到雄 性不育玉米；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点为序列1第20位。
上述方法中，所述检测待测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为CC还是TT还是TC的方法为用上述成套引物对待测玉米基因组DNA进行 PCR扩增，对得到的PCR扩增产物进行基因分型。
上述方法中，所述基因分型的方法为采用荧光酶标仪照射后，若所述PCR产物仅显示序列3所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则待测玉米基因组中 Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为C:C；若所述PCR产物仅显示序列4 所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则待测玉米基因组中 Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为T:T；
若所述PCR产物显示序列3所示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色和序列4所 示DNA分子5'端连接荧光序列的颜色，则待测玉米基因组中 Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为T:C。
本发明第3个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定玉米育性的物质。
本发明提供的物质，为上述检测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点基因型的物质；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点为序列1第20位；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为CC或TT或TC。
上述待测玉米为雄性不育的4624与其余玉米(如B73)杂交的后代，雄性不育的4624为将玉米4624F2 CGMCC NO.19092种子播种,生长至抽雄期，调查雄穗表型，表 现为雄花干瘪无散粉的植株，则为雄性不育的4624。
本发明在玉米自交系中首次发现控制核雄性不育的隐性单基因Zm00001d053895，并且根据该基因上的SNP位点的基因型鉴定玉米的育性，该位点的基因型为培育或者 筛选雄性不育育种资源创造了基础。根据该位点，本发明的发明人还设计了KASP标 记，该标记可以加快速准确判断SNP位点的基因型，并根据该基因型有效筛选雄性不 育玉米，加快玉米育种。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：玉米Zea mays
生物材料的编号：4624F2
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生 物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2020年05月07日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.19092
附图说明
图1为可育和不育玉米在分离群体中的表型比较；A、抽穗后7天可育和不育个 体的雄穗主枝的花药外露情况；B、来自可育和不育植株的15个未开放小花的代表图 像；C、可育和不育小花的解剖结构；D、从可育和不育小穗中花药的大小比较；各图 比例尺的尺寸如图所示。
图2为花粉碘-碘化钾染色与小孢子发育；A、可育植株花粉的代表性图像，黑色 染色的圆形花粉为正常花粉；B、未从不育植株中采集到花粉；C、花药横切面的石蜡 切片显示可育植株小孢子发育正常；D、横切面显示不育植株花药中没有小孢子发育； 各图比例尺代表200μm。
图3为ED相关值在染色体上的分布；A、ED在全基因组上分布的代表性图像S1vs.F1；染色体显示在X轴上；B、C和D；分别从S1和F1、S2和F2以及S3和F3 获得的扩大的4号染色体上的ED分布；点代表每个SNP的ED值；实线是拟合的ED 值；虚线表示重要关联的阈值；X轴显示4号染色体上的物理位置。
图4为候选基因Zm0001d053895在不育植株中的表达和突变；A、Zm0001d053895 在不育和可育未成熟雄穗混池中的平均FPKM值；直方图表示三个转录组的平均值± 标准方差；*表示在0.01水平上的统计显著性；B、雄性不育京724中Zm0001d053895 序列的变化。蓝方块和黑折线分别代表外显子和内含子；红线表示非同义SNP的位置。
图5为用KASP法在整个定位群体中验证潜在的SNP突变；对BSR混池定位中 鉴定的非同义SNP开发了KASP标记；A、对Zm00001d053895中潜在致突变SNP设 计的KASP标记分析；B、在候选区另一基因Zm00001d053952上设计的KASP标记 分析，作为试验负对照；每个表型所对应的基因型如图所示。近原点的黑色数据点表 示无模板对照(NTC)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
含有雄性不育位点的玉米植株4624F2的种子，已于2020年05月07日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为CGMCC No. 19092，分类命名为玉米Zea mays。
实施例1、与玉米雄性不育相关基因的SNP标记的获得
含有雄性不育位点的玉米植株4624：将玉米4624F2 CGMCC NO.19092种子播种,生长至抽雄期，调查雄穗表型，表现为雄花干瘪无散粉的植株，则为雄性不育的4624， 已经鉴定为雄性不育。
雄性不育的玉米M2植株4611：对京724花粉进行EMS诱变后，授粉产生M1种 子，M1植株自花授粉产生M2种子，得到雄性不育的M2植株4611，已经鉴定为雄性 不育。
玉米B73记载在如下文献中：Schnable PS,Ware D,Fulton RS,et al.The B73maize genome:complexity,diversity,and dynamics[published correction appearsin Science.2012 Aug 31；337(6098):1040].Science.2009；326(5956):1112–1115. doi:10.1126/science.1178534。
一、与玉米雄性不育相关基因的SNP位点的发现
1、F2群体的获得
将上述2株雄性不育的含有雄性不育位点的玉米植株4624和雄性不育的玉米M2植株4611，分别与B73杂交，再自交，构建得到4624的F2定位群体和4611的F2定 位群体。两个F2群体分别由288株(4624)和184株(4611)植株组成，抽穗后对雄 性不育表型进行了评价。产生花粉(花药外露且开裂)的植株被记录为可育，而不产 生花粉(花药不外露)的植株则被认为是不育的(图1A)。在288株4624的F2群体 中，共鉴定出75株不育系；在184株4611的F2群体中，共鉴定出94株不育株。因 此，卡方检验值(χ2)分别为0.17(p>0.2)和66.78(p<0.01)，表明4624的F2定位 群体的分离遵循3:1，不育表型是由基因组的隐性单基因突变引起的，而4611的F2定 位群体则不是由单基因导致的不育表型。
为了进一步评估4624的F2定位群体中单一突变引起的不育性，从F2群体中收集 花药外露前的小穗，可育小穗和内部花药明显大于不育植株(图1B、C和D)。为了 研究可育和不育花药之间的结构差异，观察了花药的解剖，这表明可育植株的小孢子 和绒毡层是正常发育的(图2A和图2B)，但不育植株中存在无小孢子的塌陷绒毡层(图 2C和图2D)，表明该突变体小孢子的发生和发育受到严重的影响，无花粉产生，为雄 性不育植株。
2、转录组分析和QTL定位
为了定位突变株雄性不育的遗传位点，从4624的的F2定位群体中收集了75株不育株和90株可育株的幼穗样本，具体如下：
群体的小穗在抽穗初期收集，液氮冷冻，贮藏在-80℃下。收集的小穗根据雄穗成熟后花药外露和开裂后确定的雄性不育表型分为不育或可育。选取不育株75个以及可 育株90个构成三对BSR混池群体,每对包含30不育株和30可育株。用Trizol试剂盒 分别从90个可育小穗和75个不育小穗中提取RNA，用Agilent2100(Agilent，Santa Clara， CA)评价其浓度和完整性。只有RIN值大于6.8的RNA用于以下分析。从不育小穗 中提取的RNA分成3个混池，每池30个样品，分别命名为S1、S2和S3。类似地， 来自可育小穗的RNA被分成混池F1、F2和F3。一共进行了三组BSR测序，每一组 包含一个不育池和一个可育池。样品检测合格后，则启动文库构建，首先用带有Oligo (dT)的磁珠富集真核生物mRNA，然后加入fragmentation buffer将mRNA进行随机 打断，以mRNA为模板，合成cDNA双链，cDNA纯化后再进行末端修复、加A尾 并连接测序接头、片段大小选择，最后通过PCR富集得到cDNA文库。文库经质检合 格后通过Illumina HiSeqTM进行测序。在Biomarker Technologies利用Illumina HiSeq4000高通量测序平台进行上述共6个混池转录组测序，得到三对可育-不育池的 转录组结果。
综合三对可育-不育池的转录组分析，利用ED算法，根据不育群体和可育群体之间的SNP，确定了与导致雄性不育基因连锁的基因组位点。在所有三组BSR中，都在 位于4号染色体末端区域观察到了ED的一个显著峰值(图3)。当使用所有位点拟合 值的中值+3SD作为显著阈值时，尽管三组BSR定位QTL的大小不同，但是只有这一 个与雄性不育相关的基因区段被定位到。在S2和F2中检测到的QTL最小，包含47 个非同义基因、31个差异表达基因和107个非同义SNP(表1)。
表1.三组BSR所获取的在候选区间内的重要基因和SNP数量
Figure BDA0002512833320000061
对3组BSR定位到的重叠的非同义基因根据差异表达筛选，其中不育和可育基因差异表达的基因只有5个，上调4个，下调1个。
转录组学分析表明，其中一个基因Zm00001d053895在可育植株中的表达比不育植株高80倍(图4A)。还有一个基因Zm00001d053952在可育植株中的表达比不育植 株高66倍。
图4B为雄性不育京724中Zm0001d053895序列的变化。
3、突变位点的发现
BSR测序显示不育系和可育系有1个非同义SNP锚定在Zm00001d053895上，但 该位点的位置是基于B73参考基因组确定的。该1个非同义SNP位于B73参考基因 组(RefSeqGCF_000005005.2，2017年2月)的243,231,250位置上，其在不育系中 为将非同义C突变为T。
因此，该非同义SNP命名为Zm00001d053895@243,231,250，其位于玉米B73参 考基因组第243,231,250位或位于序列1的第20位，该SNP位点的基因型为CC、TT 或CT；序列1：CAAGCTCAGGTCGCTCGTCyCGAACATCTCCAAGGTCGGTGTCCG， y为C或T。
将该SNP位点在4624的F2定位群体中的不育系和可育株系关联，结果如表2所 示：
表2为SNP位点在4624的F2定位群体中的分离
Figure BDA0002512833320000071
结果表明，SNP位点Zm00001d053895@243,231,250的基因型仅为T：T时，玉 米表型为雄性不育(无花粉产生)；SNP位点Zm00001d053895@243,231,250的基因型 为C：C或T：C时，玉米表型为可育(有花粉产生)。
对照SNP位点：BSR测序显示不育系和可育系有SNP位点锚定在 Zm00001d053952上，将一个SNP位点命名为SNP Zm00001d053952@244,167,795， 其位于玉米B73参考基因组第244,167,795位，该SNP位点的基因型为A：A、C：C 或A：C；该位点为序列2的第18位；序列2：AGCCGCCATCAGCAGCCmGTACCTCTTCCTCTGCACGCACG，m为A或C。
二、检测SNP Zm00001d053895@243,231,250的方法的建立
1、检测SNP Zm00001d053895@243,231,250的引物组
为了进一步验证点突变与育性表型之间的关系，对该可能的功能SNP在整个定位群体进行KASP分析，设计引物如下：
根据SNP Zm00001d053895@243,231,250在序列1前后的核苷酸序列，设计测SNPZm00001d053895@243,231,250位点的KASP引物组如下：
上游引物：F5’-CAAGCTCAGGTCGCTCGTCC-3’(序列3)，
上游引物：F5’–ACAAGCTCAGGTCGCTCGTCT-3’(序列4)，
下游引物：R5’-CGGACACCGACCTTGGAGATGTT-3’(序列5)。
在序列3所示的上游引物的5’端添加特异荧光序列FAM： 5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，得到5’端添加特异荧光序列FAM的上游引物；
在序列4所示的上游引物的5’端添加特异荧光序列HEX：F5’ -GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，得到5’端添加特异荧光序列HEX的上游引物。
上述5’端添加特异荧光序列FAM的上游引物(序列3添加FAM后)与序列5所 示的单链DNA分子扩增SNP Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为C:C的片 段，携带FAM的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色；
上述5’端添加特异荧光序列HEX的上游引物(序列4添加HEX后)与序列5所 示的单链DNA分子扩增SNP Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为T:T的片段， 携带HEX的序列PCR扩增后的产物经荧光照射显示红色。
上述5’端添加特异荧光序列FAM的上游引物、5’端添加特异荧光序列HEX的上 游引物和序列5所示的单链DNA分子扩增SNP Zm00001d053895@243,231,250位点基 因型为T:C的片段，PCR扩增后的产物经荧光照射照射显示绿色。
2、对照SNP Zm00001d053952@244,167,795的引物组
根据SNP Zm00001d053952@244,167,795在序列2前后的核苷酸序列，设计测SNPZm00001d053952@244,167,795位点的KASP引物组如下：
上游引物：F5’-AGCCGCCATCAGCAGCCC-3’(序列6)，
上游引物：F5’–CAGCCGCCATCAGCAGCCA-3’(序列7)，
下游引物：R5’-CGTGCGTGCAGAGGAAGAGGTA-3’(序列8)。
在序列6所示的上游引物的5’端添加特异荧光序列FAM： 5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’，得到5’端添加特异荧光序列FAM的上游引物 1；
在序列7所示的上游引物的5’端添加特异荧光序列HEX：F5’ -GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’，得到5’端添加特异荧光序列HEX的上游引物 1。
上述5’端添加特异荧光序列FAM的上游引物1与序列8所示的单链DNA分子扩 增SNP Zm00001d053952@244,167,795位点基因型为C:C的片段，携带FAM的序列 PCR扩增后的产物经荧光照射显示蓝色；
上述5’端添加特异荧光序列HEX的上游引物1与序列8所示的单链DNA分子扩 增SNP Zm00001d053952@244,167,795位点基因型为A:A的片段，携带HEX的序列 PCR扩增后的产物经荧光照射显示红色。
上述5’端添加特异荧光序列FAM的上游引物1、5’端添加特异荧光序列HEX的 上游引物1和序列5所示的单链DNA分子扩增SNP Zm00001d053952@244,167,795 位点基因型为A:C的片段，PCR扩增后的产物经荧光照射照射显示绿色。
3、检测SNP Zm00001d053895@243,231,250的方法的建立
提取玉米单株基因组DNA作为模板，用上述1中的5’端添加特异荧光序列FAM 的上游引物、5’端添加特异荧光序列HEX的上游引物和序列5所示引物进行PCR扩 增。
上述PCR扩增的1μL PCR反应体系包括：12μmol/L(体系终浓度)5’端添加 特异荧光序列FAM的上游引物、12μmol/L(体系终浓度)5’端添加特异荧光序列 HEX的上游引物和30μmol/L(体系终浓度)序列5所示引物，0.5μL 2x KASP MasterMix(LGC公司)，其余为水。
将模板DNA30ng点在1536孔板(LGC公司)中，经过55℃干燥后，再将1μL 上述PCR反应体系加入；PCR扩增反应在高通量水浴锅(LGC公司)上进行，水浴 锅到达温度后，将PCR板竖向插入提篮。采用Touch down PCR扩增程序为：
94℃预变性15min；跟随10个Touch down循环，94℃变性20s，61℃退火60s， 每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性20s，55℃退火60s，32个循 环。
将得到的PCR扩增产物在PHERAstarplus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCallerTM软件读取分型后的数据。
若PCR扩增产物仅显示红色图像(序列4所示DNA分子5'端连接的荧光颜色)， 则待测玉米SNP Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为T:T，待测玉米为雄性 不育玉米；
若PCR扩增产物仅显示蓝色图像(序列3所示DNA分子5'端连接的荧光颜色)， 则说明SNP Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为C:C，待测玉米为可育玉米；
若PCR扩增产物显示绿色图像，则说明Zm00001d053895@243,231,250SNP位 点基因型为T:C，待测玉米为可育玉米。
实施例2、SNP Zm00001d053895@243,231,250位点检测玉米育性
1、SNP位点检测
1)SNP位点Zm00001d053895@243,231,250
提取4624的F2定位群体中276份单株(表3所示)基因组DNA作为模板，用5’ 端添加特异荧光序列FAM的上游引物、5’端添加特异荧光序列HEX的上游引物和序 列5所示引物进行PCR扩增。
上述PCR扩增的1μL PCR反应体系包括：12μmol/L 5’端添加特异荧光序列FAM 的上游引物、12μmol/L 5’端添加特异荧光序列HEX的上游引物和30μmol/L序列5 所示引物，0.5μL 2x KASP MasterMix(LGC公司)，其余为水。
将模板DNA30ng点在1536孔板(LGC公司)中，经过55℃干燥后，再将上述 PCR反应体系加入；PCR扩增反应在高通量水浴锅上进行，水浴锅到达温度后，将 PCR板竖向插入提篮。采用Touch down PCR扩增程序为：
94℃预变性15min；跟随10个Touch down循环，94℃变性20s，61℃退火60s， 每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性20s，55℃退火60s，32个循 环。
将得到的PCR扩增产物在PHERAstarplus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCallerTM软件读取分型后的数据。
若PCR扩增产物仅显示红色图像(序列4所示DNA分子5'端连接的荧光颜色)， 则待测玉米SNP Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为T:T，待测玉米为雄性 不育玉米；
若PCR扩增产物仅显示蓝色图像(序列3所示DNA分子5'端连接的荧光颜色)， 则说明SNP Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为C:C，待测玉米为雄性不育 玉米；若PCR扩增产物显示绿色图像，则说明Zm00001d053895@243,231,250SNP 位点基因型为T:C，待测玉米为可育玉米。
检测结果如表3所示。
2)对照SNP位点SNP Zm00001d053952@244,167,795
提取4624的F2定位群体中276份单株(表3所示)基因组DNA作为模板，用5’ 端添加特异荧光序列FAM的上游引物1、5’端添加特异荧光序列HEX的上游引物1 和序列8所示引物进行PCR扩增。
上述PCR扩增的1μL PCR反应体系包括：12μmol/L浓度5’端添加特异荧光序 列FAM的上游引物1、12μmol/L浓度5’端添加特异荧光序列HEX的上游引物1和 30μmol/L浓度序列8所示引物，0.5μL 2x KASP MasterMix(LGC公司)，其余为水。
将模板DNA30ng点在1536孔板(LGC公司)中，经过55℃干燥后，再将上述 PCR反应体系加入；PCR扩增反应在高通量水浴锅上进行，水浴锅到达温度后，将 PCR板竖向插入提篮。采用Touch down PCR扩增程序为：
94℃预变性15min；跟随10个Touch down循环，94℃变性30s，61℃退火60s， 每个循环退火温度下降0.6℃；(扩增程序)94℃变性20s，55℃退火60s，32个循 环。
将得到的PCR扩增产物在PHERAstarplus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在KlusterCallerTM软件读取分型后的数据。
检测结果如表3所示。
2、育性检测
将表3所示的276份单株进行育性检测田间育性鉴定，主要是对雄穗的观察，产 生花粉的为可育植株，不产生花粉的为雄性不育植株，结果如表3所示。
表3为整个群体中两个KASP标记和育性表型的关联
Figure BDA0002512833320000111
Figure BDA0002512833320000121
Figure BDA0002512833320000131
Figure BDA0002512833320000141
Figure BDA0002512833320000151
Figure BDA0002512833320000161
Figure BDA0002512833320000171
Figure BDA0002512833320000181
Figure BDA0002512833320000191
上表中，第1列为4624的F2定位群体单株编号，第2列为 Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型，第3列为 Zm00001d053952@244,167,795位点的基因型，第4列为育性结果，其中S为雄性不 育，F为可育。
上述表3中可以看出，在276份可用植物样本中，72份不育植物均含有基因型为 TT的Zm00001d053895@243,231,250位点，而204份可育植物中均含有基因型为C： C或C:T的Zm00001d053895@243,231,250位点，无一例外(图5和表3)。
用对照位点(Zm00001d053952@244,167,795)发现Zm 00001d053952@244,167,795的SNP是随机的与育性没有相应的关联模式。
SEQUENCE LISTING
<110>北京市农林科学院
<120> 玉米第4号染色体雄性不育相关基因的分子标记及其应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(20)
<223> y is c, or t
<400> 1
caagctcagg tcgctcgtcy cgaacatctc caaggtcggt gtccg 45
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> m is a, or c
<400> 2
agccgccatc agcagccmgt acctcttcct ctgcacgcac g 41
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
caagctcagg tcgctcgtcc 20
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
acaagctcag gtcgctcgtc t 21
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
cggacaccga ccttggagat gtt 23
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
agccgccatc agcagccc 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
cagccgccat cagcagcca 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
cgtgcgtgca gaggaagagg ta 22

Claims (2)

1.检测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点基因型的物质在选育或辅助选育或鉴定或辅助鉴定雄性不育玉米中的应用，
所述Zm00001d053895@243,231,250位点为序列1第20位；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点基因型为CC或TT或TC；
所述检测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点基因型的物质如下1）或2）：
1）为成套引物，所述成套引物由序列表中序列3所示的单链DNA分子、序列表中序列4所示的单链DNA分子和序列表中序列5所示的单链DNA分子组成；
2）含有所述成套引物的PCR试剂或试剂盒；
所述序列3所示的单链DNA分子的5'端连接FAM荧光基团；
所述序列表中序列4所示的单链DNA分子的5'端连接HEX荧光基团；
所述FAM荧光基团的序列为5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3’；
所述HEX荧光基团的序列为5’ -GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3’。
2.一种选育或辅助选育雄性不育玉米的方法，为检测待测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为CC还是TT还是TC，选择基因型为TT的待测玉米进行培育，得到雄性不育玉米；
所述Zm00001d053895@243,231,250位点为序列1第20位；
所述检测待测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为CC还是TT还是TC的方法为用权利要求1中的所述成套引物对待测玉米基因组DNA进行PCR扩增，对得到的PCR扩增产物进行基因分型；
所述基因分型的方法为采用荧光酶标仪照射后，若所述PCR产物仅显示序列3所示DNA分子5'端连接荧光基团的颜色，则待测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为C:C；若所述PCR产物仅显示序列4所示DNA分子5'端连接荧光基团的颜色，则待测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为T:T；
若所述PCR产物显示序列3所示DNA分子5'端连接荧光基团的颜色和序列4所示DNA分子5'端连接荧光基团的颜色，则待测玉米基因组中Zm00001d053895@243,231,250位点的基因型为T:C。
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