CN117402991A - 一种玉米雄性不育基因zmms2085的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种玉米雄性不育基因zmms2085的分子标记及其应用。本发明所提供的分子标记由SEQ ID NO:1‑2所示的引物扩增得到。利用本发明所提供的分子标记，只需通过常规的PCR和PAGE胶电泳即可完成对玉米雄性不育基因zmms2085的基因分型。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高目标性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择育种的需求。本发明提供的玉米雄性不育新基因zmms2085的分子标记可用于玉米杂交种的母本不育化选择，具有巨大的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术领域，具体地说，涉及一种玉米雄性不育基因zmms2085的分子标记及其应用。
背景技术
玉米在中国乃至全世界的粮食生产中有着举足轻重的地位。2013年，中国玉米的总产量达到2.15亿吨，占据粮食总产量的35％，首次超过水稻成为第一大粮食作物。玉米是杂种优势利用的典范，其中杂交育种和制种技术的关键均在于母本的去雄。人工去雄相对容易，可以使用机械去雄、化学杀雄等方法，但是这些策略也存在一些问题：一方面使用这些方法大大增加了制种的成本，另一方面因人工去雄的不彻底或不及时，会降低杂交种的纯度，造成生产上的大面积减产，最终造成经济损失。因此，提高杂交种种子纯度是当前玉米生产上急待解决的问题，而利用雄性不育系制种是提高杂交种质量最为有效的途径之一。
玉米核雄性不育材料是一种宝贵的种质资源，对玉米杂交种生产具有极其重要的意义，但长期以来，由于纯合核雄性不育系无法繁殖保持等问题，这类材料在实际生产上一直没有得到有效的利用。随着新的核雄性不育材料的不断发现，玉米育种家对其进行了多方面的研究和应用方面的尝试，如利用标记性状与不育性的紧密连锁关系，开发了粒色标记系统法、黄绿苗连锁标记法和多花丝连锁标记体系等，但是由于标记性状与不育性连锁不完全、标记性状鉴定困难、鉴定时期滞后等问题，这些方法和尝试核不育材料在玉米生产中的应用并没有得到推广。
DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组遗传差异的特异DNA片段。对于基因组中核苷酸序列已知的小片段插入缺失类型的遗传差异一般可使用特异引物PCR标记进行检测，例如STS(sequnce-tagged site)标记，引物扩增受阻突变体系PCR标记，CAPS(Clea ved Am plif ied Polymorphism Seq uences)标记，d CAPS(Derived Clea vedAmplified Polymorphic Sequences)标记等(管峰，艾君涛，杨利国.一种SNP检测新方法:四引物扩增受阻突变体系PCR技术.生命的化学，2004，24(6)：514-516；王忠华，RedusMARC，贾育林.玉米抗稻瘟病基因Pi-ta共显性分子标记的建立.中国玉米科学，2005，19(6)：483-488；玉米紫色果皮的延迟遗传及Pb基因功能标记开发.中国玉米科学，2014，28(6)：605-611；张亚东，周丽慧，郑佳，等。2016，一种鉴定玉米粒长基因qGL3等位基因变异的PCR分子标记方法，专利号：CN103882145B；丁丹，张亚东，郑佳.玉米粒长基因GS3和qGL3功能标记的设计及应用.江苏农业学报，2014，30(6)：1191-1197)。
ZmMS2085是海南波莲基因基因科技有限公司克隆的玉米雄性不育新基因，目前还没有开发相应的分子标记或检测试剂盒，鉴于隐性核雄性不育材料在育种中潜在的巨大商业价值及运用前景，针对zmms2085突变体的碱基序列，设计与该隐性核雄性不育表型共分离，且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉的分子标记，将可以高效、快速利用该雄性不育基因。
发明内容
本发明的目的在于高效、快速地利用克隆的雄性不育新基因，提供一种玉米雄性不育基因zmms2085的分子标记。
玉米材料2085是海南波莲水稻基因科技有限公司于2015年6月在湖南省农业科学院用钴60辐射京科糯2000后，经多世代筛选而获得的一个由单基因(zmms2085)控制的雄性花粉败育，雄性器官正常的突变体材料。该突变体在第6号染色体上的Zm00001eb261800基因的编码区第5外显子的第1890位碱基后插入了GA两个碱基，造成其后的碱基移码突变。该不育系育性稳定，只受核编码的单基因调控，不受光温环境的影响。该不育系的育性恢复基因广泛存在于玉米种质资源中，也可以通过转野生型基因恢复育性，也可以通过转野生型基因恢复雄性育性，在生产上具有重要的应用价值。
第一方面，本发明提供的玉米雄性不育基因zmms2085的分子标记，通过核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示的引物扩增得到。
在本发明中，所述玉米雄性不育基因zmms2085为野生型B73的Zm00001eb261800基因的编码区第5外显子的第1890位碱基后插入GA两个碱基。
第二方面，本发明提供用于检测玉米雄性不育基因zmms2085的特异性引物组合，所述特异性引物组合含有如SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列。
本发明上述引物组合是针对野生型第6号染色体上的Zm00001eb261800基因的编码区第5外显子的第1890位碱基后插入的GA两个碱基设计、筛选后获得。正向引物2085_F1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；反向引物2085_R1，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。当用2085_F1和2085_R1扩增野生型基因组时产生61bp条带，扩增突变型基因组时产生63bp条带。
第三方面，本发明请求保护含有上述的特异性引物组合的试剂或试剂盒。
根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护上述的分子标记或上述的特异性引物组合或上述的试剂或试剂盒在鉴定玉米雄性不育基因zmms2085基因型中的应用。
以及，上述的分子标记或上述的特异性引物组合或上述的试剂或试剂盒在筛选或培育雄性不育玉米突变体中的应用。
以及，上述的分子标记或上述的特异性引物组合或上述的试剂或试剂盒在玉米种质资源改良中的应用。
以及，上述的分子标记或上述的特异性引物组合或上述的试剂或试剂盒在玉米育种中的应用。
本发明提供了检测玉米雄性不育基因zmms2085基因型及其是否存在于某一特定玉米种质资源中的方法，首先对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO：1所示的正向引物、SEQ ID NO：2所示的反向引物进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析。若扩增产物只出现63bp条带，则表明待测样品具有纯合突变基因型zmms2085；若只出现61bp条带，则表明待测样品为纯合野生基因型ZmMS2085；若同时出现63bp和61bp条带，则表明待测样品为杂合基因型。
61bp条带的参考序列如SEQ ID NO：3所示，63bp条带的参考序列如SEQ ID NO：4所示。本领域技术人员应当理解，由于玉米品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。
进一步地，PCR的反应体系为：康为世纪的2×Flash PCR MasterMix(Dye)5μL，10μM的一个正向、两个反向引物各0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL；
PCR反应条件为：94℃2min；94℃20s，56℃20s，72℃30s，共35个循环，接着72℃5min，最后16℃1min。
在本发明的实施例中，是通过PAGE胶胶电泳对PCR扩增产物长度进行判断，PAGE胶电泳条件为：6％PAGE胶，U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。
第四方面，本发明请求保护检测玉米雄性育性调控基因ZmMS2085基因型的方法，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO：1-2所示的引物组合进行PCR，对PCR扩增产物进行PAGE胶电泳，根据电泳条带确定ZmMS2085的基因型；
优选地，若扩增产生61bp条带，则待测样本的ZmMS2085基因型为野生型；若扩增产生63bp条带，则待测样本的ZmMS2085基因型为野生型。
第五方面，本发明还请求保护一种检测玉米雄性不育基因zmms2085的方法，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO：1-2所示的引物组合进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，根据PCR产物大小推测玉米是否含有雄性不育基因zmms2085；
优选地，若PCR扩增产物为63bp，则待测样本含有雄性不育基因zmms2085。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现了一种玉米雄性不育突变基因，具体地，所述玉米雄性不育突变基因为：在野生型B73的Zm00001eb261800基因的编码区第5外显子的第1890位碱基后插入了GA两个碱基。
本发明基于野生型B73的Zm00001eb261800基因的编码区第5外显子的第1890位碱基后插入的GA两个碱基，设计并开发了一种扩增片段短、特异性强的物分子标记。利用该标记，只需通过简单的PCR即可完成对玉米雄性不育基因zmms2085的基因分型，预测玉米是否雄性不育。本发明具有操作简便、分型快速、结果准确、成本低廉等优势，能提高性状选择效率，满足大规模分子标记辅助选择的需求。
附图说明
图1是实施例1的分子标记的引物设计示意图。
图2是实施例1设计标记的共分离验证。
图3是实施例2的用本发明分子标记鉴定玉米品种/品系的ZmMS2085基因型的PAGE胶电泳图。泳道1-24分别为zmms2085、B104、昌72、Mo17、掖478、郑58、黄C、黄早四、丹340、P178、P138、综3、综31、京92、京724、掖107、8112、87-1、K12、DH351、浚单20、先玉335、京科968、川单99。PCR产物大小标记在胶图右侧。
图4是实施例3的杂交转育的技术路线图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明的应用范围。下述实施例中的所有技术和科学术语，如无特殊说明，均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。除非有相反指明，本发明所使用或提及的技术均为本领域普通技术人员公认的标准技术。所述试验材料，如无特别注明，均为本发明领域通用的试验材料。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下文通过说明和阐述提供了更为详细的描述，但这并非意欲对本发明的范围加以限制。
实施例1玉米雄性不育基因zmms2085的引物设计及扩增片段分析
1、引物设计
参考野生型B73的ZmMs1和突变体的zmms2085基因序列差异设计了能够鉴别隐性核雄性不育表型和正常育性表型的引物组合：2085_F1：AGGCTTCACACAATTCATCCC(SEQ IDNO:1)和2085_R1：TTCTCCGTGGTACTTGCTTCGT(SEQ ID NO:2)(图1)。
2、扩增片段分析
用上述引物组合对玉米隐性核雄性不育基因zmms2085进行扩增，不育材料只能扩出一条63bp的条带，可育材料能扩出一条61bp条带，或者同时扩出一条61bp和一条63bp条带(图2)。63bp和61bp条带的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。
实施例2分子标记鉴定玉米品种/品系的ZmMS2085基因型
1、实验材料
zmms2085、B104、昌72、Mo17、掖478、郑58、黄C、黄早四、丹340、P178、P138、综3、综31、京92、京724、掖107、8112、87-1、K12、DH351、浚单20、先玉335、京科968、川单99。
2、玉米基因组DNA的提取
采用CTAB法提取玉米基因组DNA，具体步骤如下：在苗期取3cm长的玉米叶片，在800μL抽提缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/L EDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一个1.5mL离心管中。65℃水浴30min，间或颠倒混匀。加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24:1)，颠倒混匀15min。12000r/min室温离心10min。吸上清450μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后-20℃沉淀30min。12000r/min离心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL灭菌ddH2O溶解DNA。
3、PCR扩增及检测
利用实施例1筛选得到的特异性引物组合(2085_F1，2085_R1)对本实施例所述24个玉米品种/品系的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系为：康为世纪的2×Flash PCRMasterMix(Dye)5μL，10μM的一个正向、两个反向引物各0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL；
PCR反应条件为：94℃2min；94℃20s，56℃20s，72℃30s，共35个循环，接着72℃5min，最后16℃1min。
扩增产物经6％PAGE胶电泳检测，电泳条件为：U＝2000V，I＝200mA，P＝85W，电泳1h。电泳完成后用0.1％AgNO3染色，观片灯上观察拍照。
4、结果与分析
用本发明实施例1的分子标记的引物组合扩增这24个品种/品系，发现只有zmms2085扩增出了一条63bp的带，而所有其它品种/品系都只扩增出了一条61bp的带(见图3)。这一结果表明自然条件下不存在与隐性雄性不育系2085相同变异的玉米种质，同时也印证了本发明分子标记在鉴定玉米雄性不育基因zmms2085基因型时的准确性和可靠性。
实施例3转育带有ZmMS2085基因的玉米
用zmms2085突变体与雄性育性正常的受体品种，B104，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行ZmMS2085基因和遗传背景选择，最终获得受体背景下带有纯合ZmMS2085突变基因的雄性不育系(图4)。具体实施步骤如下：
1、以受体亲本，如B104，为父本与zmms2085杂交获得F1。
2、以F1为母本与受体亲本，如B104，回交获得BC1F1。
3、种植BC1F1，使用引2085_F1：AGGCTTCACACAATTCATCCC(SEQ ID NO:1)和2085_R1：TTCTCCGTGGTACTTGCTTCGT(SEQ ID NO:2)检测ZmMS2085基因型。选择ZmMS2085杂合基因型，即同时能扩增出61bp和63bp条带的植株。
4、使用一组基因型(例如100个，或200个等)在ZmMS2085突变体和轮回亲本基因组之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。
5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如B104，回交获得BC2F1。
6、种植BC2F1，重复步骤3和步骤4，选出ZmMS2085基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC2F2。
7、种植BC2F2，重复步骤3和步骤4，选出ZmMS2085基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC2F3。BC2F3后代中分离的ZmMS2085杂合株即ZmMS2085隐性雄性不育系，BC2F3用于保存ZmMS2085隐性核雄性不育系种质资源。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种玉米雄性不育基因zmms2085的分子标记，其特征在于，所述分子标记通过核苷酸序列如SEQ ID NO:1-2所示的引物扩增得到。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述玉米雄性不育基因zmms2085为野生型B73的Zm00001eb261800基因的编码区第5外显子的第1890位碱基后插入GA两个碱基。
3.用于检测玉米雄性不育基因zmms2085的特异性引物组合，其特征在于，所述特异性引物组合含有如SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求3所述的特异性引物组合的试剂或试剂盒。
5.权利要求1所述的分子标记或权利要求3所述的特异性引物组合或权利要求4所述的试剂或试剂盒在鉴定玉米雄性不育基因zmms2085基因型中的应用。
6.权利要求1所述的分子标记或权利要求3所述的特异性引物组合或权利要求4所述的试剂或试剂盒在筛选或培育雄性不育玉米突变体中的应用。
7.权利要求1所述的分子标记或权利要求3所述的特异性引物组合或权利要求4所述的试剂或试剂盒在玉米种质资源改良中的应用。
8.权利要求1所述的分子标记或权利要求3所述的特异性引物组合或权利要求4所述的试剂或试剂盒在玉米育种中的应用。
9.检测玉米雄性育性调控基因ZmMS2085基因型的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO：1-2所示的引物组合进行PCR，对PCR扩增产物进行PAGE胶电泳，根据电泳条带确定ZmMS2085的基因型；
优选地，若扩增只产生61bp条带，则待测样本ZmMS2085的基因型为纯合野生型；若扩增只产生63bp条带，则待测样本ZmMS2085的基因型为纯合突变型。
10.一种检测玉米雄性不育基因zmms2085的方法，其特征在于，对待测样本提取基因组DNA后，利用SEQ ID NO：1-2所示的引物组合进行PCR，对PCR扩增产物大小进行分析，根据PCR产物大小推测玉米是否含有雄性不育基因zmms2085；
优选地，若PCR扩增产物为63bp，则待测样本含有雄性不育基因zmms2085。
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