CN111100869B - 一种与水稻光温敏核雄性不育性状共分离的分子标记和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种与水稻光温敏核雄性不育性状共分离的分子标记和应用，属于基因工程技术领域。本发明通过图位克隆的方法将tms4430精细定位在水稻1号染色体上，位于分子标记RM10495和RM10519之间237.39Kb的区段内，该基因与标记Indel14270，Indel14340，M3193‑6共分离。tms4430纯合突变体表现出长日高温不育，短日低温可育的光温敏感表型。tms4430的精细定位及共分离连锁标记的开发为水稻光温敏两系不育系的选育提供了新的不育基因源和分子辅助选择手段，在两系不育系选育中应用潜力巨大。

Description

一种与水稻光温敏核雄性不育性状共分离的分子标记和应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一种与水稻光温敏核雄性不育性状共分离的分子标记和应用。

背景技术

水稻是全球一半以上人口的主粮，提高水稻产量有助于帮助人类彻底摆脱饥饿问题。杂交水稻利用了水稻的杂种优势现象，使水稻的产量、抗性和适应性都有了较大提高。从上世纪60年代袁隆平先生提出利用水稻的雄性不育性生产杂交水稻开始，中国的杂交水稻经历了从三系到两系杂交稻的发展。三系杂交稻利用核质互作不育系进行杂交稻育制种，而两系杂交稻利用光温敏不育系进行杂交稻育制种。相对于三系不育系，两系不育系恢复系广、配组更为自由，大大简化了生产和繁殖过程，应用潜力巨大。

光温敏雄性不育系，其育性受到温度和光照长度的影响。按照对光温条件反应的不同，光温敏不育系可以分为四类：1)光敏不育系，在长日照下不育，短日照下可育；2)反光敏不育系，在短日照下不育，长日照下可育；3)温敏不育系，在高温下不育，低温下可育；4)反温敏不育系，在低温下不育，高温下可育。一般而言，光敏不育系的育性也受到温度的影响，而温敏不育系的育性并不受光照的影响。粳稻品种农垦58S和籼稻品种安农S-1是研究和应用最广泛的光温敏雄性不育系，目前生产上应用的光温敏不育系大部分都是这两个品种的衍生系。

为了更好地利用两系不育系，有必要分离控制光温敏雄性不育性的基因并阐明其分子作用机理。据不完全统计，目前己鉴定了20多个光温敏感型不育基因，其中，有pms3、tms5、CSA、tms9-1、Ugp1和Ugp2等6个基因已被克隆，tms-1、rpms-1和rtms-1等15个基因已完成了定位。虽然众多的水稻光温敏核不育基因被定位或克隆，但对于调控水稻光温敏核不育性状的分子基础依然知之甚少。目前生产上使用的光温敏不育系多带有tms5和pms3基因。

发明内容

本发明的目的是丰富现有技术中的光温敏核不育基因数量，提供一种含有水稻光温敏核雄性不育基因的分离的核苷酸片段，以及提供与水稻光温敏核雄性不育性状共分离的分子标记。

本发明提供的分离的核苷酸片段中含有的水稻光温敏核雄性不育基因命名为tms4430。本发明在前期研究工作中，用钴60辐射10公斤93-11种子得到M0代。辐射后的种子种植于海南省临高县试验田，成熟后分单株收种，共获得M1代材料约6500份。选种子量较多的3617个M1代材料种植成株系，每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，并收种保存。在其中4430号家系中发现一种突变体表现为雄性不育，被命名为tms4430。该突变体呈现长日高温不育，短日低温可育的光温敏雄性不育表型，该表型由突变后的TMS4430单基因控制。

本发明通过图位克隆的方法，将基因TMS4430精细定位在第1染色体短臂上的两个标记RM10495和RM10519之间237.39Kb的区段内，并且本发明还发现该片段与标记Indel14270，Indel14340，M3193-6共分离。

因此本发明提供了一个分离的核苷酸片段，所述片段在水稻1号染色体上，其为位于分子标记RM10495和RM10519之间237.39Kb的区段所对应的核苷酸片段。

所述的分离的核苷酸片段含有一个水稻光温敏核雄性育性调控基因TMS4430。

一种水稻光温敏核雄性不育基因tms4430，该基因对应的野生型基因TMS4430定位在水稻1号染色体上，位于分子标记RM10495和RM10519之间237.39Kb的区段内。

本发明提供了含有所述分离的核苷酸片段或所述水稻光温敏核雄性不育基因tms4430的生物材料，所示生物材料为表达盒、表达载体、宿主细胞。

本发明提供了与所述分离的核苷酸片段或水稻基因TMS4430共分离的分子标记，其为Indel14270，Indel14340，M3193-6。本领域技术人员能够理解分子标记Indel14270，Indel14340，M3193-6与所述水稻光温敏核雄性不育基因tms4430共分离，以及基于本发明的贡献，了解分子标记Indel14270，Indel14340，M3193-6与水稻光温敏核雄性不育性状共分离。

在Indel14270序列覆盖的范围内，93-11和明恢63基因组序列存在98个核苷酸TATCGAATCATTGATTTTCAGTCTGACATCACTGAGCATCTAAATCCTATCGACTCTTTTGGATTTCATAGCCAAACCGTGACGCTTGCCGTTGGGGC的插入缺失。

所述共分离标记Indel14270由如SEQ ID No.1所示正向引物和如SEQ ID No.2所示反向引物扩增得到。共分离标记Indel14270的引物在以93-11或tms4430突变体基因组DNA为模板时能扩增出一条305bp的条带，在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条207bp的条带。

本发明还提供了与TMS4430基因共分离的分子标记，其为Indel14340，本领域技术人员能够理解分子标记Indel14340所述水稻光温敏核雄性不育基因tms4430共分离。

本发明发现在Indel14340序列覆盖的范围内，93-11和明恢63基因组序列存在一个7个碱基AAGAAAC的插入缺失差异。所述共分离标记Indel14340可由如SEQ ID No.3所示正向引物和SEQ ID No.4所示反向引物共同扩增得到。扩增Indel14340的引物在以93-11或tms4430突变体基因组DNA为模板时能扩增出一条132bp的条带，在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条125bp的条带。

本发明还提供了与TMS4430基因共分离的分子标记，其为M3193-6，本领域技术人员能够理解分子标记M3193-6所述水稻光温敏核雄性不育基因tms4430共分离。

本发明发现在M3193-6序列覆盖的范围内，93-11和明恢63基因组序列存在一个A/T的SNP差异。该共分离标记M3193-6的序列由如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示正向引物和如SEQ ID No.7所示反向引物扩增得到。M3193-6的引物在以93-11或tms4430突变体基因组DNA为模板时能扩增出一条79bp的条带，在以明恢63基因组DNA为模板时能扩增出一条84bp的条带。

基于本发明的发现，本发明提供了用于检测所述水稻光温敏核雄性不育基因tms4430的分子标记，其为以下任一分子标记：Indel14270、Indel14340和/或M3193-6。

本发明提供了与水稻光温敏核不育性状相关的分子标记组合，含有分子标记：Indel14270，Indel14340和标记M3193-6。

所述Indel14270由SEQ ID NO.1-2所示引物扩增得到；所述Indel14340由SEQ IDNO.3-4所示引物扩增得到；所述M3193-6由SEQ ID NO.5-7所示引物扩增得到。

本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒含有以下任一或多个引物组：

引物组1：SEQ ID NO.1-2所示引物、引物组2：SEQ ID NO.3-4所示引物、引物组3：SEQ ID NO.5-7所示引物。

本发明进一步提供了上述分离的核苷酸片段、水稻光温敏核雄性不育基因tms4430、或含有该基因的生物材料、或上述分子标记Indel14270、M3193-6和/或Indel14340、或上述试剂盒在检测水稻光温敏核雄性不育基因tms4430、或该基因的基因型中的应用。

本发明提供了上述分离的核苷酸片段、水稻光温敏核雄性不育基因tms4430、或含有该基因的生物材料、或上述分子标记Indel14270、Indel14340和/或M3193-6、或上述试剂盒在筛选或检测具有光温敏雄性不育表型水稻中的应用。

本发明提供了上述分离的核苷酸片段、水稻光温敏核雄性不育基因tms4430、或含有该基因的生物材料、或上述分子标记Indel14270、Indel14340和/或M3193-6、或上述试剂盒在制备转基因植物、或作物改良育种、制种中的应用。

本发明提供的上述应用中，具体操作时，当使用Indel14270标记引物进行扩增时，如果只出现305bp的条带，说明被检测材料是tms4430纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现207bp的条带，说明被检测材料是TMS4430纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现305bp和207bp的条带，说明被检测材料是tms4430杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；

当使用Indel14340标记引物进行扩增时，如果只出现132bp的条带，说明被检测材料是tms4430纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现125bp的条带，说明被检测材料是TMS4430纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现132bp和125bp的条带，说明被检测材料是tms4430杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；

当使用M3193-6标记引物进行扩增时，如果只出现79bp的条带，说明被检测材料是tms4430纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现84bp的条带，说明被检测材料是TMS4430纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现79bp和84bp的条带，说明被检测材料是tms4430杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型。

本发明还提供了所述tms4430基因、与tms4430共分离的分子标记在筛选水稻光温敏不育系中的应用。在tms4430突变体与其它水稻品种或材料的杂交、回交或自交后代中，当使用Indel14270、Indel14340或M3193-6标记引物进行扩增时，如果只出现305bp、132bp或79bp的条带，说明被检测材料是tms4430纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现207bp、125bp或84bp的条带，说明被检测材料是TMS3193纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现305bp和207bp，或132bp和125bp，或79bp和84bp的条带，说明被检测材料是tms4430杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型。

本发明将一个新的水稻光温敏核雄性不育基因tms4430定位在一个237.39Kb的染色体片段内，并与分子标记Indel14270、Indel14340、M3193-6共分离。tms4430的鉴定为两系不育系的选育提供了新的基因资源，Indel14270、Indel14340和M3193-6等标记的开发可以高效准确的对光温敏雄性不育表型的水稻进行筛选，从而提高以tms4430为不育基因的两系不育系的选育效率。

附图说明

图1的A显示4430家系中可育植株的花粉碘-碘化钾溶液染色结果；图1的B显示海南临高早造长日高温条件下tms4430突变体的花粉碘-碘化钾溶液染色结果；图1的C显示海南陵水冬季短日低温条件下tms4430突变体的花粉碘-碘化钾溶液染色结果。

图2的A显示TMS4430基因在染色体上的位置；图2的B显示TMS4430基因的初步定位结果；图2的C显示TMS4430基因精细定位的结果及共分离标记的位置。

图3是用共分离标记Indel14270检测tms4430和明恢63的F3群体中不育株的基因型。泳道1、2分别为tms4430、明恢63；30个样本为tms4430与明恢63的F3分离群体不育单株。

图4是用共分离标记Indel14340检测tms4430和明恢63的F3群体中不育株的基因型。泳道1、2分别为tms4430、明恢63；30个样本为tms4430与明恢63的F3分离群体不育单株。

图5是用共分离标记M3193-6检测tms4430和明恢63的F3群体中不育株的基因型。泳道1、2分别为tms4430、明恢63；28个样本为tms4430与明恢63的F3分离群体不育单株。

图6是用标记Indel14270检测不同品种和这些品种与tms4430的F1杂交种的基因型。泳道1-12分别为亲本tms4430、野香B、9311、明恢63、中花11、GD-7S、隆科638S、宜香B、特B、博II B、H28B、tms4430，泳道13-21为F1杂交种tms4430/野香B、tms4430/明恢63、tms4430/中花11、tms4430/GD-7S、tms4430/隆科638S、tms4430/宜香B、tms4430/特B、tms4430/博II B、tms4430/H28B。

图7是用标记Indel14340检测不同品种和这些品种与tms4430的F1杂交种的基因型。泳道1-12分别为亲本tms4430、野香B、9311、明恢63、中花11、GD-7S、隆科638S、宜香B、特B、博II B、H28B、tms4430，泳道13-21为F1杂交种tms4430/野香B、tms4430/明恢63、tms4430/中花11、tms4430/GD-7S、tms4430/隆科638S、tms4430/宜香B、tms4430/特B、tms4430/博II B、tms4430/H28B。

图8是用标记M3193-6检测不同品种和这些品种与tms4430的F1杂交种的基因型。泳道1-12分别为亲本tms4430、野香B、9311、明恢63、中花11、GD-7S、隆科638S、宜香B、特B、博II B、H28B、tms4430，泳道13-21为F1杂交种tms4430/野香B、tms4430/明恢63、tms4430/中花11、tms4430/GD-7S、tms4430/隆科638S、tms4430/宜香B、tms4430/特B、tms4430/博IIB、tms4430/H28B。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1水稻光温敏核雄性不育突变体tms4430的表型和遗传分析

1)tms4430突变体的筛选

2013年6月用钴60辐射10公斤93-11种子得到M0代。辐射后的种子种植于海南省临高县试验田，成熟后分单株收种，共获得M1代材料约6500份。2014年春，选种子量较多的3617个M1代材料种植成株系，每个株系种50个单株。分别在分蘖期、孕穗期、抽穗期、开花期、灌浆期筛选株型、穗型、育性、产量等各种类型突变体，并收种保存。在其中4430号家系中发现一种突变体表现为雄性不育，被命名为tms4430。

2)tms4430突变体的表型分析

在临高正季栽培条件下，用碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I₂，w/w)对4430家系不同植株的花粉进行染色分析。如图1的A所示，可育植株的花粉粒绝大部分大而圆，并且被染成蓝黑色。而tms4430突变体的花粉粒小而皱缩，并且不能被染色，如图1的B。此外，可育植株套袋自交后正常结实，而tms4430突变体套袋自交后不结实。而以水稻品种93-11为父本给tms4430突变体授粉则可以结实。这些结果表明该tms4430突变体在长日高温条件下表现出雄性不育表型。将tms4430突变体的稻兜在2015年冬季种植于海南省陵水县提蒙镇，安排稻蔸在1-2月抽穗(经查询当时平均温度为17-24℃)。对抽穗后的花粉粒进行碘-碘化钾溶液(0.6％KI，0.3％I₂，w/w)染色，结果表明部分花粉粒大而饱满，并被染成蓝黑色(图1的C)，说明tms4430突变体的雄性育性在短日低温条件下发生了转育，是一个光温敏雄性不育突变体。

3)tms4430突变体的遗传分析

在长日高温条件下种植tms4430的M4代分离群体46株，其中24株表现半不育，8株表现可育，14株表现雄性不育，半不育与可育与不育株分离比符合2:1:1(χ²＝0.54，P>0.05)。用tms4430突变体与93-11回交，在回交后代一个93株的F2分离群体中，46株半不育，22株育性正常，25株不育，半不育与可育与不育株分离比也符合2:1:1(χ²＝0.13，P>0.05)。上述结果表明tms4430的雄性不育性状受由一对隐性单基因控制。

实施例2光温敏雄性不育基因TMS4430的初步定位

使用极端性状混合池分析法(bulked segregant analysis)和隐性群体分析法(recessive-class analysis)对TMS4430基因进行定位。以明恢63为父本与tms4430突变体杂交构建了一个F2群体，分离出了169个不育株。利用301对均匀分布于12条染色体上的SSR标记筛选93-11与明恢63之间具有多态性的标记，筛选得到64对具有多态性的SSR标记，多态性较低，表明明恢63与93-11在基因组序列上差异较小。分别构建所述F2群体的可育株和不育株的混合基因池，利用所述64对多态性标记对所述可育基因池与不育基因池进行分析。结果表明1号染色体上的SSR标记RM243和RM023与tms4430的突变表型存在连锁关系。进一步利用上述连锁标记逐个分析明恢63和tms4430的F2群体中的不育株的基因型，最终确定目标基因初步定位于SSR标记RM243和RM023之间，由此将TMS4430粗定位于1号染色体上(图2的A)，通过在SSR标记RM243和RM023之间和外测继续筛选多态性标记，得到RM10495、Indel14340、RM10513、RM10515、RM10526、RM10544。TMS4430基因与RM10495、RM243、Indel14340、RM10513、RM10515、RM10526、RM10544标记之间的交换单株分别为1个，1个，0个，0个，0个，1个，3个(图2的B)。

实施例3水稻光温敏雄性不育基因TMS4430的精细定位

在上述粗定位结果的基础上，使用隐性群体分析法(recessive-class analysis)进行精细定位。利用连锁标记挑选F2群体中的tms4430杂合单株发展了一个F3群体，包含3827个单株，其中分离出不育株952株。同时，在标记RM10495和RM10544之间进一步开发了3个多态性标记。其中，用于检测分子标记Indel14270的引物如SEQ ID NO.1-2所示；用于检测分子标记Indel14340的引物如SEQ ID NO.3-4所示；用于检测M3193-6的引物如SEQ IDNO.5-7所示。

利用这些标记逐个检测F3群体中分离出不育株的基因型，发现在Indel14270标记不育株都只扩出了305bp的条带(图3)；在Indel14340标记处也只扩出了132bp的条带(图4)；而M3193-6标记处也只扩出了79bp的条带(图5)。在标记RM10495处能扩增出14个单株包含双亲带型的基因型；在标记RM10519处能扩增出2个单株包含双亲带型的基因型，而在2者之前的标记只能扩增出4430亲本的带型，这些结果说明TMS4430基因定位在标记RM10495和RM10519之间237.39Kb的染色体片段内，并且与标记Indel14270，Indel14340和M3193-6等3个标记共分离(图2的C)。

实施例4 Indel14270、Indel14340和M3193-6在不同品种中的多态性

为了验证Indel14270、Indel14340和M3193-6三个标记在指示tms4430突变体光温敏雄性不育表型上的特异性，我们分析了在多个品种中三个标记的多态性。这些品种包括两系不育系GD-7S、隆科638S，三系保持系野香B、宜香B、特B、博II B、H28B，恢复系9311、明恢63，常规品种中花11。tms4430与这些品种的杂种F1均没有光温敏不育表型。图6显示，Indel14270除了在tms4430和9311中扩增出305bp条带外，在其它亲本中只扩增出了207bp条带，在tms4430与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了305bp和207bp条带，说明Indel14270可以在不同品种中特异性标记tms4430的光温敏雄性不育表型。图7显示，Indel14340除了在tms4430和9311中扩增出132bp条带外，在其它亲本中只扩增出了125bp条带，在tms4430与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了132bp和125bp条带，说明Indel14270可以在不同品种中特异性标记tms4430的光温敏雄性不育表型。图8显示，M3193-6除了在tms4430和9311中扩增出79bp条带外，在其它亲本中只扩增出了84bp条带，在tms4430与其它亲本的F1杂种中同时扩增出了79bp和84bp条带，说明M3193-6可以在不同品种中特异性标记tms4430的光温敏雄性不育表型。检测结果显示，其他类型的核不育，或其他雄性可育植株，它们的检测结果扩增条带要么是只出现207bp，或同时出现305bp和207bp；或只出现125bp，或同时出现132和125bp条带，或只出现79bp，或同时出现79和84bp条带。

实施例5利用tms4430基因转育新的光温敏不育系

用tms4430突变体与育性正常的受体，如中花11和博IIB，进行杂交、回交和自交，并在此过程中用分子标记进行tms4430基因和遗传背景选择，最终获得中花11和博IIB背景下带有纯合tms4430突变基因的隐性核不育系。具体实施步骤如下：

1、以受体亲本，如中花11和博IIB，为父本与母本tms4430杂交获得F1。

2、以F1为母本与受体亲本，如中花11和博IIB，回交获得BC1F1。

3、种植BC1F1，分别使用引物序列如SEQ ID No.1-2、或SEQ ID No.3-4、或SEQ IDNo.5-7的引物对检测tms4430基因型，选择tms4430杂合基因型，即PCR扩增产物的条带同时出现305bp和207bp条带，或同时出现132bp和125bp条带，或同时出现79bp和84bp条带。

4、使用一组基因型(例如200个)在tms4430突变体和轮回亲本之间存在多态性，且分布均匀的分子标记(包括但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。

5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如中花11和博IIB，回交获得BC2F1。

6、种植BC2F1，重复步骤3和步骤4，选出tms4430基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC2F2。

7、种植BC2F2，重复步骤3和步骤4，选出tms4430基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC2F3。BC2F3后代中分离的tms4430纯合株即tms4430基因的光温敏不育系。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 一种与水稻光温敏核雄性不育性状共分离的分子标记和应用

<130> KHP191117063.9

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgatttctt ggcattt 17

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aggtggcgga cgacagt 17

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtttctgaac tgcctagtg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggacggttc aaacatagt 19

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aaaaattgcg ctgtagaacg atcaa 25

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttgcgctgta gaacgattat 20

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcacgccaat aaatcct 17

Claims (3)

1.一种分子标记的以下任一所述的应用：

（1）在检测水稻光温敏核雄性不育基因tms4430、或该基因的基因型中的应用；

（2）筛选或检测具有光温敏核雄性不育表型水稻中的应用；

（3）在鉴定水稻光温敏雄性核不育性状中的应用；

（4）在制备光温敏核雄性不育转基因水稻中的应用；

（5）在光温敏核雄性不育水稻制种中的应用；

所述分子标记为与水稻光温敏核雄性不育基因tms4430共分离的Indel14270，Indel14340或M3193-6。

2.一种引物组的以下任一所述的应用：

（1）在检测水稻光温敏核雄性不育基因tms4430、或该基因的基因型中的应用；

（2）筛选或检测具有光温敏核雄性不育表型水稻中的应用；

（3）在鉴定水稻光温敏雄性核不育性状中的应用；

（4）在制备光温敏核雄性不育转基因水稻中的应用；

（5）在光温敏核雄性不育水稻制种中的应用；

所述引物组含有以下任一或多个引物组：

引物组1：SEQ ID NO.1-2所示引物、引物组2：SEQ ID NO.3-4所示引物、引物组3：SEQID NO.5-7所示引物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，

当使用引物组1对待测水稻模板进行扩增时，如果只出现305bp的条带，说明待测水稻材料是tms4430纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现207bp的条带，说明待测水稻材料是TMS4430纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现207bp和305bp的条带，说明待测水稻材料是tms4430杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；

当使用引物组2对待测水稻模板进行扩增时，如果只出现132bp的条带，说明待测水稻材料是tms4430纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现125bp的条带，说明待测水稻材料是TMS4430纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现132bp和125bp的条带，说明待测水稻材料是tms4430杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；

当使用引物组3对待测水稻模板进行扩增时，如果只出现79bp的条带，说明待测水稻材料是tms4430纯合基因型，具有光温敏雄性不育表型；如果只出现84bp的条带，说明待测水稻材料是TMS4430纯合基因型，不具有光温敏雄性不育表型；如果同时出现79bp和84bp的条带，说明待测水稻材料是tms4430杂合基因型，不具有光温敏雄性不育表型。

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