CN116926226A

CN116926226A - 与水稻雌性不育基因fs7相关的DNA分子标记及应用

Info

Publication number: CN116926226A
Application number: CN202210369946.XA
Authority: CN
Inventors: 李京琳; 李新鹏; 龙湍; 董叶红; 曾翔; 吴永忠; 黄培劲
Original assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Current assignee: Hainan Bolian Rice Gene Technology Co ltd
Priority date: 2022-04-08
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2023-10-24

Abstract

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及与水稻雌性不育基因fs7相关的DNA分子标记及应用。该DNA分子标记位于水稻第7号染色体第1287726位碱基到第1328904位碱基之间，所述DNA分子标记的多态性为缺失序列。本发明开发的DNA分子标记与水稻隐性核雌性不育表型共分离，且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉。利用该标记可完成对水稻雌性不育基因fs7的基因分型，预测水稻是否雌性不育。

Description

与水稻雌性不育基因fs7相关的DNA分子标记及应用

技术领域

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及与水稻雌性不育基因fs7相关的DNA分子标记及应用。

背景技术

杂交水稻是父母本杂交后获得的子一代，其产量往往比常规稻亲本提高15％以上，抗性和适应性也远胜于亲本。因此，应用和推广杂交水稻是提高水稻产量的一个重要途径。

传统的杂交稻技术是先将母本培育成雄性不育系，再与育性正常的常规稻或具有特定恢复能力的父本间隔种植于田间，在盛花期辅助人工授粉，使母本捕获父本的花粉而产生杂交种。由于父本依然具有自交结实能力，因此在收获时必须先去除父本，才能确保用机械收获的杂交种不含父本的种子。这不仅增加了人工成本，而且无法实现全机械化生产。雌性不育是指雌性器官失去生育能力而雄性育性正常，可产生有活力花粉的现象。利用雌性不育改造杂交种的父本，使父本雌性不育化并与雄性不育系配合，可以免除杂交制种中去除父本的工序，实现机械化生产。由于无需考虑去除父本，因此可以将其与母本混合播种，进一步减少制种工序。此外，混合播种改变了原有“三系法”和“两系法”制种中隔行播种父、母本的种植模式，使父母本的相对距离变得更短，有利于自然受精结实，提高杂交种的制种产量，这极有可能是未来杂交稻技术的一大趋势。目前，在水稻中已经克隆的雌性不育基因包括FST、LOG、OsAPC6、PTB1、FMS1、FMS2。

DNA分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组遗传差异的特异DNA片段。对于基因组中核苷酸序列已知的小片段插入缺失类型的遗传差异一般可使用特异引物PCR标记进行检测，例如STS(sequnce-tagged site)标记，引物扩增受阻突变体系PCR标记，CAPS(Clea ved Am plif ied Polymorphism Seq uences)标记，d CAPS(Derived Clea vedAmplified Polymorphic Sequences)标记等。

发明内容

水稻材料1895是海南波莲水稻基因科技有限公司于2013年6月在湖南省农业科学院用钴60辐射籼稻材料9311后，经多世代筛选而获得的一个由单基因(fs7)控制的雌性器官不能接受正常花粉而受精，雄性器官正常的突变体材料。该雌性不育系的育性恢复基因广泛存在于水稻种质资源中，也可以通过转野生型基因恢复雌性育性，具有重要的应用价值。

FS7是海南波莲水稻基因科技有限公司克隆的雌性不育新基因，该突变所产生的隐性核雌性不育类型的雌性不育系的自交结实率低于0.1％，且育性稳定，只受核编码的单基因调控，不受光温环境的影响。由于雌性器官包藏在母体组织内，难以通过表型观察鉴定。

鉴于此，本发明开发了一种针对水稻雌性不育新基因fs7的DNA分子标记，该DNA分子标记与水稻隐性核雌性不育表型共分离，且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉。利用该标记可完成对水稻雌性不育基因fs7的基因分型，预测水稻是否雌性不育。

本发明的第一目的是提供一种与水稻雌性不育相关的DNA分子标记，所述DNA分子标记位于水稻第7号染色体第1287726位碱基到第1328904位碱基之间，所述DNA分子标记的多态性为缺失序列。

本发明开发的DNA分子标记与水稻隐性核雌性不育表型共分离，且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉。利用该标记可完成对水稻雌性不育基因fs7的基因分型，预测水稻是否雌性不育。

作为一种优选的实施方案，所述DNA分子标记通过序列如SEQ ID NO.1-3所示的特异性引物扩增得到。

本发明的第二目的是提供扩增上述DNA分子标记的引物。

作为一种优选的实施方案，引物序列如SEQ ID NO.1-3所示：

SEQ ID NO:1：5′-CTAATCAGCTCGTTCGCAGGT-3′；

SEQ ID NO:2：5′-ACCACACACCAAACTATCTCAAC-3′；

SEQ ID NO:3：5′-AGCCTGGTAGAAACTCAAACCC-3′。

在上述引物中，SEQ ID NO:2位于缺失片段内。

本发明的第三目的是提供一种试剂或试剂盒，其包括上述引物。

优选地，所述试剂或试剂盒还包括用于PCR扩增的其他试剂，包括但不限于PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、ddH₂O等。

本发明的第四目的是提供上述DNA分子标记、上述引物、以及上述试剂或试剂盒在鉴定水稻雌性不育基因fs7基因型中的应用。

本发明的第五目的是提供上述DNA分子标记、上述引物、以及上述试剂或试剂盒在筛选或培育水稻雌性不育突变体中的应用。

本发明的第六目的是提供上述DNA分子标记、上述引物、以及上述试剂或试剂盒在水稻育种或水稻种质资源改良中的应用。

作为一种优选的实施方案，上述应用包括如下步骤：使用如SEQ ID NO:1～3所示的引物对待测样本的基因组DNA进行PCR。

作为一种优选的实施方案，上述应用中的PCR的条件为：

PCR反应体系为：2×Flash PCR MasterMix(Dye)5μL，10μM的如SEQ ID NO.1-3所示的引物各0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH₂O至10μL。

PCR反应条件为：94℃ 2min；94℃ 20s，56℃ 20s，72℃ 30s，共35个循环；接着72℃ 5min，最后16℃1min。

作为一种优选的实施方案，上述应用还包括：采用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物长度进行判断，琼脂糖凝胶电泳的条件为：1％琼脂糖胶，5V/cm电场下电泳30min，在凝胶成像系统中记录电泳图像。

作为一种优选的实施方案，上述应用还包括：

若只能扩增出213bp产物，则水稻为雌性不育性状。

作为一种优选的实施方案，上述应用还包括：

若只能扩增出213bp产物，则水稻为纯合突变基因型fs7；若只能扩增出557bp产物，则水稻为纯合野生基因型FS7；若同时扩增出213bp和557bp产物，则水稻为杂合基因型。

其中，213bp产物的参考序列如SEQ ID NO：4所示，557bp产物的参考序列如SEQ IDNO：5所示。本领域技术人员应当理解，由于水稻品种的差异，设计引物时预测的PCR产物序列只能作为参考序列，而从不同品种中扩增出来的产物的序列可能和参考序列完全一致，也可能与参考序列有部分碱基差异，但这种差异通常不会影响标记的使用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明开发的DNA分子标记与水稻隐性核雌性不育表型共分离，且操作简便、分型快速、使用灵活、费用低廉。利用该标记可完成对水稻雌性不育基因fs7的基因分型，预测水稻是否雌性不育。而且能够提高性状选择效率，满足大规模DNA分子标记辅助选择的需求。

附图说明

图1是实施例1的DNA分子标记的引物设计示意图。

图2是实施例1的DNA分子标记的共分离验证的电泳图。

图3是实施例2的琼脂糖凝胶电泳图。图中：泳道1-24分别为1895、桂恢297、明恢63、桂99、中恢1286、IR7、绿银占、IR36、桂农占、华占、中香黄占、农晶丝苗、合莉丝苗、湘早籼、五丰B、特B、长粒香、H28B、美香占2号、临旱1号、南粳46、南粳505、华粳9号、02428。PCR产物大小标记在胶图右侧。

图4是实施例3杂交转育的技术路线图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中的所有技术和科学术语，如无特殊说明，均为本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。除非有相反指明，本发明所使用或提及的技术均为本领域普通技术人员公认的标准技术。所述试验材料，如无特别注明，均为本发明领域通用的试验材料。下述实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

在下述实施例中，是通过琼脂糖胶胶电泳对PCR扩增产物长度进行判断，琼脂糖胶电泳条件为：1％琼脂糖胶，5V/cm电场下电泳30min，在凝胶成像系统中记录电泳图像。

实施例1水稻雌性不育基因fs7的引物设计及扩增片段分析

1、引物设计

参考野生型9311和突变型fs7基因组序列的差异设计了能够鉴别隐性核雄性不育表型和正常育性表型的三引物组合：1895_F1位于缺失位点右边，与缺失位点相距110个碱基；1895_R2位于缺失位点左边，与缺失位点相距103个碱基；1895_R1位于缺失片段上，与缺失片段右边界相距447个碱基。具体DNA分子标记的引物设计示意图如图1所示。

1895_F1：CTAATCAGCTCGTTCGCAGGT(SEQ ID NO:1)，

1895_R1：ACCACACACCAAACTATCTCAAC(SEQ ID NO:2)，

1895_R2：AGCCTGGTAGAAACTCAAACCC(SEQ ID NO:3)。

突变型fs7在7号染色体突变位点处的序列如SEQ ID NO：6所示。

在引物设计过程中，由于缺失片段左端附近的序列为重复序列，反向引物1895_R1能且只能设计在缺失片段的右边(如图1所示)，并与1895_F1组成一对扩增组合；若1895_R1设计在缺失片段的左边并与1895_R2组成一对扩增组合，则1895_R1和1895_R2组合会因在其它重复区段扩增出同样的产物而无法进行基因分型。

2、扩增片段分析

在正常情况下，引物1895_F1和1895_R2的位置距离非常远，无法引导PCR反应，因此只有引物1895_F1和1895_R1组成PCR反应；在fs7突变体中，7号染色体缺失一个41179碱基的DNA片段，使得引物1895_F1和1895_R2的位置距离足够靠近而能引导PCR反应，该片段的缺失也使得1895_R1失去结合位点，因此只有引物1895_F1和1895_R2组成PCR反应。用上述引物组合对水稻雌性不育基因fs7的分离群体进行扩增，雌性不育材料只能扩出一条213bp的条带(1895_F1和1895_R2组成的PCR反应)；表型正常的材料能扩出一条557bp条带(1895_F1和1895_R1组成的PCR反应)，或者同时扩出一条213bp和一条557bp条带(杂合植株同时存在两对引物组成的PCR反应)。图2为本实施例的DNA分子标记的共分离验证电泳图。

其中，213bp和557bp条带的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

实施例2水稻品种/品系的FS7基因型的鉴定

1、实验材料

1895、桂恢297、明恢63、桂99、中恢1286、IR7、绿银占、IR36、桂农占、华占、中香黄占、农晶丝苗、合莉丝苗、湘早籼、五丰B、特B、长粒香、H28B、美香占2号、临旱1号、南粳46、南粳505、华粳9号、02428

2、水稻基因组DNA的提取

采用CTAB法提取水稻基因组DNA，具体步骤如下：在苗期取3cm长的水稻叶片，在800μL抽提缓冲液[1.5％(w/v)CTAB，1.05mol/L NaCl，75mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，15mmol/L EDTA(pH 8.0)]中磨碎，收集到一个1.5mL离心管中。65℃水浴30min，间或颠倒混匀。加入800μL氯仿∶异戊醇(体积比24:1)，颠倒混匀15min。12000r/min室温离心10min。吸上清450μL，转移到一个新的1.5mL离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后-20℃沉淀30min。12000r/min离心15min。倒掉95％乙醇，用75％乙醇洗沉淀。倒掉75％乙醇，干燥后加100μL灭菌ddH2O溶解DNA。

3、PCR扩增及检测

利用实施例1的特异性引物组合(1895_F1，1895_R1，1895_R2)对本实施例所述24个水稻品种/品系的DNA进行PCR扩增，PCR的反应体系为：康为世纪的2×Flash PCRMasterMix(Dye)5μL，10μM的一个正向、两个反向引物各0.5μL，模板DNA 50ng，补ddH2O至10μL；

PCR反应条件为：94℃2min；94℃20s，56℃20s，72℃30s，共35个循环，接着72℃5min，最后16℃1min。

扩增产物经1％琼脂糖胶电泳检测，电泳条件为：5V/cm电场下电泳30min，电泳完成后在凝胶成像系统中记录电泳图像。

4、结果与分析

用实施例1的DNA分子标记的引物组合扩增这24个品种/品系，发现只有1895扩增出了一条213bp的带，而所有其它品种/品系都只扩增出了一条557bp的带，如图3所示。这一结果表明自然条件下不存在与隐性雌性不育系1895相同变异的水稻种质，同时也印证了本发明DNA分子标记在鉴定水稻雌性不育基因fs7基因型时的准确性和可靠性。

实施例3转育带有FS7基因的恢复系

用fs7突变体与雌性育性正常的受体品种，如华占进行杂交、回交和自交，并在此过程中用DNA分子标记进行FS7基因和遗传背景选择，最终获得受体背景下带有纯合FS7突变基因的雌性不育系，图4为技术路线图，具体实施步骤如下：

1、以受体亲本，如华占为母本与fs7杂交获得F₁。

2、以F₁为母本与受体亲本，如华占，回交获得BC₁F₁。

3、种植BC₁F₁，使用引物1895_F、1895_R1和1895_R2，检测FS7基因型。选择FS7杂合基因型，即同时能扩增出213bp和557bp条带的植株。

4、使用一组基因型(例如100个，或200个等)在FS7突变体和轮回亲本基因组之间存在多态性，且分布均匀的DNA分子标记(可以是但不限于SSR、SNP、INDEL、EST、RFLP、AFLP、RAPD、SCAR等类型标记)，对步骤3中选出的单株进行遗传背景鉴定，选取与轮回亲本基因型相似度高(如大于88％相似度，或2％中选率等)的植株。

5、用步骤4中选出的植株与受体亲本，如华占，回交获得BC₂F₁。

6、种植BC₂F₁，重复步骤3和步骤4，选出FS7基因型杂合，遗传背景回复率高(如大于98％，或2％中选率等)的植株，收自交种BC₂F₂。

7、种植BC₂F₂，重复步骤3和步骤4，选出FS7基因型杂合，遗传背景纯合率最高的植株，收自交种BC₂F₃。BC₂F₃后代中分离的FS7杂合株即FS7隐性雌性不育系，BC₂F₃用于保存FS7隐性核雌性不育系种质资源。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司

<120> 与水稻雌性不育基因fs7相关的DNA分子标记及应用

<130> KHP221112681.4

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctaatcagct cgttcgcagg t 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accacacacc aaactatctc aac 23

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agcctggtag aaactcaaac cc 22

<210> 4

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctaatcagct cgttcgcagg ttgaacctga aacatcacca tgatccgatg aacatgctgt 60

tcatggctgg atggatcaag ctaaaagaga atggaagata gtaaacacag gtttcttctc 120

ggaatcatta attcgtgcgt gttatcagtc agactttcgg ttttggactt cagaagttca 180

gactttcaga gttgagatag tttggtgtgt ggt 213

<210> 5

<211> 557

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctaatcagct cgttcgcagg ttgaacctga aacatcacca tgatccgatg aacatgctgt 60

tcatggctgg atggatcaag ctaaaagaga atggaagata gtaaacacag gaaatgattt 120

cacctttagc attgggctct cgagcgagag attgacagga gcaggatgat caggatcagg 180

gcccagtgct ttctccagtg cgccgcgcac cacctgctga tccttgaggt gactctccag 240

ctgcagaatc tgcatcagaa aaaaattcag taaaaaaatt aagatggaga ttaaccaaat 300

gtccttgcaa agacttgact taggatttgg ttttttcaga gagataagta caggcaggtc 360

aacattggaa gtcctggagt gaactgttct tgatgtgagt acaacaacca ataataatgg 420

ataggttcaa tgaagaacag taaatttttt tcttgtcctt gcctcttttc tcaaggagtt 480

ttgtgcctca ctcctggatg gctgaattcc cttcttggtt tcactcttca gatgagggtt 540

tgagtttcta ccaggct 557

<210> 6

<211> 465

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atcgcgtcgc cgcctctcct gcctggagcc gccgccgccg ccgccttcgc cttgggcgtc 60

tcctccagaa gctgcgagca ccgcgagctc accgacagcc tcgccgcatc tgaacacgcc 120

actgtcgctg cttgctgctg ctgctgatca aatgctttcc tgtacagtgt caggagatac 180

tgctccaggt gcttgatctc tagctccaat gtcgcgacct ccctaatcag ctcgttcgca 240

ggttgaacct gaaacatcac catgatccga tgaacatgct gttcatggct ggatggatca 300

agctaaaaga gaatggaaga tagtaaacac aggtttcttc tcggaatcat taattcgtgc 360

gtgttatcag tcagactttc ggttttggac ttcagaagtt cagactttca gagttgagat 420

agtttggtgt gtggtttttt tttttttttt cccgggtttg ccgaa 465

Claims

1.一种与水稻雌性不育基因fs7相关的DNA分子标记，其特征在于，所述DNA分子标记位于水稻第7号染色体第1287726位碱基到第1328904位碱基之间，所述DNA分子标记的多态性为缺失序列。

2.根据权利要求1所述的DNA分子标记，其特征在于，其通过序列如SEQ ID NO.1-3所示的特异性引物扩增得到。

3.扩增权利要求1或2所述的DNA分子标记的引物。

4.根据权利要求3所述的引物，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.1-3所示。

5.一种试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求3或4所述的引物。

6.权利要求1或2所述的DNA分子标记、权利要求3或4所述的引物、权利要求5所述的试剂或试剂盒在以下任一方面的应用：

(1)鉴定水稻雌性不育基因fs7基因型；

(2)筛选或培育水稻雌性不育突变体。

7.权利要求1或2所述的DNA分子标记、权利要求3或4所述的引物、权利要求5所述的试剂或试剂盒在水稻育种或水稻种质资源改良中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：使用如SEQ ID NO:1～3所示的引物对待测样本的基因组DNA进行PCR。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，若只能扩增出213bp产物，则水稻为雌性不育性状。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，若只能扩增出213bp产物，则水稻为纯合突变基因型fs7；若只能扩增出557bp产物，则水稻为纯合野生基因型FS7；若同时扩增出213bp和557bp产物，则水稻为杂合基因型。