CN108794610B - 玉米杂交不亲和相关蛋白ZmGa1S及其编码基因与应用 - Google Patents

玉米杂交不亲和相关蛋白ZmGa1S及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与玉米单向杂交不亲和现象相关蛋白ZmGa1S及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物杂交不亲和性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的ZmGa1S基因在玉米中能够控制杂交不亲和性，即在Ga1‑S/Ga1‑S基因型玉米中将该基因纯合突变或缺失可使其能够接受ga1/ga1基因型玉米的花粉而结实。本发明为植物特别是玉米的不亲和性研究提供了新的基因资源，其可在玉米育种和制种过程中得以利用。

Description

玉米杂交不亲和相关蛋白ZmGa1S及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及一种与玉米单向杂交不亲和现象相关蛋白ZmGa1S及其编码基因与应用。
背景技术
玉米是典型的异花授粉作物，一般情况下，其自交和杂交均能正常结实。然而有一类玉米，它可以给其它类型的玉米授粉结实，而反交，即其它类型的玉米给它们授粉时，则不能结实，这种现象称之为玉米单向杂交不亲和性(unidirectional cross-incompatibility，CI)(Nelson Jr，1952)。玉米单向杂交不亲和现象发现于1902年，在当时的一个爆裂玉米和甜玉米突变体sugary(sul)的F2分离群体中观察到偏分离现象(Correns，1902)。随后人们发现，只有爆裂玉米当作父本，和普通玉米杂交才能结实；当爆裂玉米作母本时，则不能和普通玉米杂交结实，即使爆裂玉米自交完全结实(Demerec，1929)。后来人们认识到，这一现象不是由sul位点控制，而是由与其连锁的其它位点控制(Emerson，1934)。玉米单向杂交不亲和性影响了单倍体配子有性传递的过程，控制这种现象的基因最初也被称之为Gametophyte Factor，即Ga基因。早在1929年Demerec就发现，用马齿型、硬粒型或甜玉米给一些爆裂型玉米授粉时不能结实，而反交，即用爆裂型玉米给马齿型、硬粒型或甜玉米授粉则可正常结实(Demerec，1929)，研究表明，这些爆裂型玉米是Ga1-S/Ga1-S基因型。自然界中的Ga1-S/Ga1-S基因型只存在于爆裂玉米、极少数中美洲玉米及玉米的祖先大刍草中，而绝大多数马齿型和硬粒型栽培玉米都是ga1/ga1基因型(Linoet al.，2008)。虽然Ga1类的材料自发现距今已有百年历史，然而对控制其单向杂交不亲和性的基因的研究才刚刚起步，对其调控的杂交不亲和的机理更是知之甚少。
目前，已有多个Ga基因的存在被发现，分别位于玉米不同的染色体上(Kermicleand Allen，1990；Nelson，1993，1994；Kermicle and Evans，2010；Lausser et al.，2010)。由于遗传背景或修饰基因的影响，大多数Ga基因的单向杂交不亲和性都不彻底，只有Ga1(Correns，1902)、Ga2(Burnham，1936)和Tcb1(teosinte crossing barrier-1)(Kermicle，1990)三个位点具有近乎100％的单向杂交不亲和性。自然界中的Tcb1存在于玉米的祖先大刍草中，Ga2存在于大刍草和少数中美洲玉米中，Ga1则存在于大刍草和少数中美洲玉米及部分爆裂玉米中，而绝大多数马齿型和硬粒型栽培玉米都不带有Ga1、Ga2和Tcb1(Kermicle，2006)。与自交不亲和性的研究相比，玉米杂交不亲和性的研究进展极其缓慢。
根据玉米Ga1杂交不亲和性状，可将玉米材料分为Ga1-S，Ga1-M和ga1三种类型。用ga1类型的玉米花粉给Ga1-S类型的玉米雌穗授粉，其结实率为0；和Ga1-S相比，Ga1-M类型的玉米材料失去了对ga1花粉不亲和的功能，能够接受来自ga1材料的花粉而结实，
但仍具有雄配子的功能，即Ga1-M花粉给Ga1-S雌穗授粉能结实。三者的关系如表1。
表1 Ga1-S、Ga1-M和ga1三者亲和性的关系
Figure BSA0000165768310000021
注：√代表亲和；×代表不亲和
玉米是世界上最重要的粮、经、饲于一体的作物，也是我国种植面积最大和总产最高的作物。在玉米生产实践中，不同类型玉米之间的隔离是实实在在的生产需求。为防止串粉混杂，影响种子纯度，不同杂交种制种田之间需要隔离；由于花粉直感，为保持种性，甜玉米、糯玉米、高油玉米、高赖氨酸等专用玉米，必须和普通玉米进行隔离种植；有机玉米的生产，也需要没有外来花粉的污染：转基因玉米和常规玉米如何安全共处，也是全球玉米生产面临的实践问题。
Ga1具有下述特点：1.100％的单向杂交不亲和性；2.Ga1-S/Ga1-S基因型只存在于爆裂玉米和极少数中美洲玉米；3.几乎所有的栽培玉米都是ga1基因型；4.利用常规育种回交转育的方法可将Ga1-S/Ga1-S基因型从爆裂玉米回交转育到马齿和硬粒等普通玉米中去。基于Ga1-S/Ga1-S基因型的特性，可以利用其作为不同类型玉米生物学隔离的工具，特别是转基因玉米和非转基因玉米、常规玉米和专用玉米之间的生物学隔离；同时，还可用于研究玉米传粉授精过程中的基因互作和信号传导以及不亲和机理。如上所述，对Ga1的研究，既具科学理论价值又有生产应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种与玉米单向杂交不亲和现象相关蛋白ZmGa1S及其编码基因与应用。
本发明所提供的蛋白质，名称为ZmGa1S，来源于玉米属的玉米(Zea mays L.)，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物杂交不亲和性相关的由序列1衍生的蛋白质。
序列表序列1为ZmGa1S的氨基酸序列，包括398个氨基酸，在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占205个，亲水氨基酸占185个，碱性氨基酸占34个，酸性氨基酸占36个，该蛋白质的分子量为42.40KD，等电点为6.50。
为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因(命名为ZmGa1S)，所述基因具体可为如下1)-4)中任一的DNA分子：
所述基因为如下1)-4)中任一的DNA分子：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)序列表中序列3所示的DNA分子；
3)在严格条件下与1)-2)中任一限定的DNA分子杂交且编码与玉米单向杂交不亲和现象相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子；
4)与1)-3)中任一限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码与玉米单向杂交不亲和现象相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。
其中，序列2为ZmGa1S基因的cDNA序列，序列3为ZmGa1S基因在玉米基因组中的序列。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGrreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，以及转录终止序列组成。
所述转基因细胞系为转入所述基因的非繁殖材料。
所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(a)植物育种和/或制种；
(b)调控植物单向杂交不亲和性。
本发明还提供了培育转基因植物的方法。
本发明所提供培育转基因植物的方法，可为如下：
(1)抑制基因型为Ga1-S/Ga1-S受体植物中ZmGa1S蛋白的表达，得到转基因植物；所述受体植物可接受ga1/ga1基因型玉米花粉授粉而结实的性状是由于所述受体植物所述ZmGa1S蛋白功能的丧失引起的；
(2)从步骤(1)所得转基因植物中得到可接受ga1/ga1基因型玉米花粉的转基因植物。
在所述方法步骤(1)中，是通过如下实现抑制所述受体植物中所述编码基因的表达的：采用CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码ZmGa1S蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切，使所述受体植物丧失或降低表达有功能的ZmGa1S蛋白的能力。
其中，所述CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码ZmGa1S蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切时的靶标片段为所述受体植物中编码ZmGa1S蛋白的基因组DNA序列中符合5’-NX-NGG-3’或5’-CCN-NX-3’序列排列规则的片段；N表示A、G、C和T中的任一种，14≤X≤30，且X为整数(如X为20)，NX表示X个连续的脱氧核糖核苷酸。更加具体的，所述靶标片段为所述受体植物中编码ZmGa1S蛋白的基因组DNA序列中的“5’-AATGCAACAGGCGTCCACATGG-3’(即序列3的第3343-3364位)”。
在本发明中，所述植物既可为单子叶植物，也可为双子叶植物。其中，所述单子叶植物如禾本科植物，具体如玉米。
在培育可接受ga1/ga1基因型玉米花粉的转基因植物时，可将任意一种基因型为Ga1-S/Ga1-S的玉米材料作为所述受体植物，获得相应的可接受ga1/ga1基因型玉米花粉的转基因玉米。
在本发明的一个实施例中，培育可接受ga1/ga1基因型玉米花粉的转基因植物时采用的所述受体植物具体为Ga1-S/Ga1-S基因型玉米自交系B6。
本发明采用图位克隆的策略，用基因型为Ga1-S/Ga1-S的玉米自交系SDGa25与基因型为ga1/ga1的玉米自交系B73组配BC1F1群体，将控制这一性状的基因定位到玉米四号染色体8.24Mb到10.38Mb之间，以公布的B73基因组测序结果为参考物理距离约为2.14Mb，共包括15个基因。利用公共数据库中的转录组数据进行de novo拼接，得到位于Ga1-S/Ga1-S基因型材料的花丝中特异表达的基因，将此基因命名为ZmGa1S。用CRISPR-Cas9基因编辑技术将Ga1-S/Ga1-S基因型的玉米自交系B6的ZmGa1S基因敲除，可以使其接受ga1/ga1基因型玉米材料的花粉，从而结实。
本发明的ZmGa1S基因在玉米中能够控制杂交不亲和性，即在Ga1-S/Ga1-S基因型玉米材料中该基因的纯合突变或缺失能够使其接受普通玉米(ga1/ga1基因型)花粉而结实。
本发明为玉米单向杂交不亲和性的研究提供了新的基因资源，其在玉米育种制种等领域的应用中可发挥重要作用。
附图说明
图1为ZmGa1S基因的图位克隆图。
图2为定位区间15个基因在玉米自交系SDGa25和B73的花丝中的半定量PCR结果图。
图3为通过对HP301序列进行de novo拼接，得到在雌穗中特异表达基因的表达模式图。
图4为ZmGa1S基因在不同基因型玉米自交系花丝中的表达和序列差异图。其中A为荧光定量PCR结果，B为半定量PCR结果，C为ZmGa1S序列差异比较。
图5为ZmGa1S基因敲除验证图。其中A为ZmGa1S基因结构以及编辑位点；B为表型验证授粉结实实验，mut为纯合转基因突变植株。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pBUN411载体：在文献“Hui-Li Xing，Li Dong，Zhi-Ping Wang，Hai-Yan Zhang，Chun-Yan Han，Bing Liu，Xue-Chen Wang，Qi-Jun Chen.BMC plant biology.14：327-338(2014)”中公开过，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得，仅可用于重复本发明实验。该质粒可同时用于转录向导RNA和表达Cas9蛋白。
玉米自交系SDGa25、US86、USP188、USP193、B6(基因型为Ga1-S/Ga1-S)；2000，178、US85、US87、US88、US89(基因型为Ga1-M/Ga1-M)；USP190、W22、Z58、B73(基因型为ga1/ga1)为本实验室收集和保存。玉米基因组测序信息参考MaizeGDB数据库，该数据库链接如下：http：//www.maizegdb.org/。玉米自交系HP301(基因型为Ga1-S/Ga1-S)根、茎、雄穗、雌穗四个组织RNA-seq数据来源于NCBI库，链接分别如下：Zea mays ssp.mays L.Hp301seedling root RNA-Seq：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX129743；Zea maysssp.mays L.Hp301 seedling shoot RNA-Seq：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX129744；Zea mays ssp.mays L.Hp301 immature tassel RNA-Seq：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX129745；Zea mays ssp.mays L.Hp301 immature，unpollinated ear tip RNA-Seq：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/SRX129742。
实施例1、玉米单向杂交不亲和基因ZmGa1S的图位克隆
一、遗传定位群体的构建
用B73(ga1/ga1)和SDGa25(Ga1-S/Ga1-S)组配F1，用SDGa25花粉给F1授粉，获得BC1F1分离群体，将分离群体与B73相间种植，开花以前，将分离群体植株去雄，使开花时的B73花粉自由散落到分离群体的花丝上，统计分离群体中结实和不结实的比例，经卡方检验为1∶1(表2)，根据孟德尔遗传定律，该性状由单位点控制，并将BC1F1群体做为遗传定位群体。
表2 BC1F1分离群体分离比的卡方检验
Figure BSA0000165768310000061
注：X0.05 2(1)＝3.84
二、ZmGa1S基因的定位
首先，以玉米自交系SDGa25和B73的基因组DNA为模板，用玉米全基因组引物筛选在自交系SDGa25和B73之间有多态性的引物。然后，从BC1F1群体中选取结实和不结实对应的单株各10株，验证多态性引物是否与单向杂交不亲和性状连锁。筛选出连锁引物，用于对群体中192个单株基因型的测定，结合雌穗结实表型筛选出基因型与表型不符的为交换单株，并根据不同引物筛选出的交换单株个数的不同，依照减少趋势确定定位区间，由此将ZmGa1S基因定位于玉米四号染色体的引物标记M46(5.41Mb)和M68(17.29Mb)之间。在M46和M68之间继续开发多态性分子标记，并用于检测BC1F1群体的所有单株(13,000株)，最终将ZmGa1S基因定位在M13(8.24Mb)和M89(10.38Mb)之间，参考已公布的玉米自交系B73基因组测序结果，物理距离约为2.14Mb(图1)。其中，用于基因定位的分子标记引物序列如表3所示。
表3 用于基因定位的分子标记引物序列
Figure BSA0000165768310000062
Figure BSA0000165768310000071
三、ZmGa1S基因的克隆
参考玉米基因组测序信息，定位区间的2.14Mb范围内包含15个基因，分别是Zm00001d048926、Zm00001d048927、Zm00001d048928、Zm00001d048929、Zm00001d048930、Zm00001d048931、Zm00001d048932、Zm00001d048936、Zm00001d048937、Zm00001d048939、Zm00001d048941、Zm00001d048942、Zm00001d048943、Zm00001d048944、Zm00001d048945。提取Ga1-S/Ga1-S基因型自交系SDGa25和ga1/ga1基因型自交系B73的花丝RNA，反转录成cDNA，以表4中上述各基因对应的引物对进行半定量PCR检测，以引物对F2/R2扩增GAPDH基因作为内参，表达分析发现，上述15个基因在花丝中不表达或表达量很低(图2)。利用NCBI数据库中玉米自交系HP301(Ga1-S/Ga1-S)不同组织的RNAseq数据进行de novo拼接，得到一个位于定位区间，且只在雌穗中特异表达的基因，命名为ZmGa1S(图3)。提取Ga1-S/Ga1-S基因型自交系SDGa25、US86、USP188、USP193，Ga1-M/Ga1-M基因型自交系2000、178、US85、US87、US88、US89以及ga1/ga1基因型自交系USP190、W22、Z58、B73的花丝RNA，反转录成cDNA，以引物对F1/R1对ZmGa1S基因进行荧光定量PCR和半定量PCR检测，以引物对F2/R2扩增GAPDH基因作为内参，结果表明ZmGa1S基因在Ga1-S/Ga1-S基因型自交系的花丝中表达，在Ga1-M/Ga1-M基因型自交系178和US89的花丝中表达，在其余Ga1-M/Ga1-M基因型自交系和ga1/ga1型自交系花丝中不表达(图4中A和B)；对上述两份Ga1-M/Ga1-M基因型自交系178和US89的ZmGa1S基因进行测序，发现该基因序列存在碱基插入(图4中C)，从而造成移码突变，因此推测ZmGa1S即为候选基因。以玉米自交系SDGa25花丝组织的cDNA为模板，采用引物对F3/R3进行PCR扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列2，序列2即为ZmGa1S基因的cDNA序列。以玉米自交系SDGa25的基因组DNA为模板，通过引物对F4/R4扩增得到序列3，序列3即为ZmGa1S基因在玉米基因组中的序列。序列2和序列3均编码序列表中序列1所示的ZmGa1S蛋白。
表4 用于基因表达检测的引物序列
Figure BSA0000165768310000072
Figure BSA0000165768310000081
F1：5′-GCGACAGTGAATGCCTTGG-3′；
R1.：5′-TTGTTCGAATTTGACCTTAGCG-3′。
F2：5′-CTGGTTTCTACCGACTTCCTTG-3′；
R2：5′-CGGCATACACAAGCAGCAAC-3′。
F3：5′-ATGGTAGGCGGCGTGAGGAG-3′；
R3.：5′-TCAGGCGCGCGGCGGCGGCG-3′。
F4：5′-CTCATCCACCTCTTTCGTAACC-3′；
R4.：5′-GGGGTGATTTGATTTGGGTGG-3′。
实施例2、玉米单向杂交不亲和基因ZmGa1S的功能验证
一、ZmGa1S基因敲除载体的构建
本发明的发明人设计实验将Ga1-S/Ga1-S基因型玉米自交系B6的ZmGa1S基因进行编辑。具体是采用CRISPR-Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromicrepeatsassociated 9)基因编辑系统，对玉米受体植株中ZmGa1S基因的基因组序列进行定点编辑。CRISPR-Cas9技术可针对基因组上特定位点DNA进行切割，利用生物体对DNA链的修复无法每次都保证100％正确的特点，重新连接的DNA链在序列上与未被切割前会产生差异，从而使得基因序列发生变化，其编码的蛋白质也随之变化。
具体到本实验中，根据CRISPR-Cas9系统的特点，选取ZmGa1S基因的第一外显子上特定序列作为sgRNA(single guide RNA)靶点序列(图5中A)，并将其连入到pBUN411载体(除草剂抗性)，构建成为ZmGa1S基因敲除载体，并采用农杆菌介导的方法转化玉米受体B6。具体操作如下：
(1)设计靶位点
5’-AATGCAACAGGCGTCCACATGG-3’(即序列3的第3,343-3,364位)。
(2)用限制性内切酶BsaI酶切pBUN411载体，回收约12.4kb的载体骨架，命名为BUN411。
(3)根据步骤(1)设计的靶位点序列，合成如下带有粘性末端(小写字母部分)的引物：
ZmGa1SF：5’-ggcgAATGCAACAGGCGTCCACA-3’；
ZmGa1SR：5’-aaacTGTGGACGCCTGTTGCATT-3’。
(4)将ZmGa1SF和ZmIGa1SR进行退火，形成有粘性末端的双链DNA，将其和步骤(2)中的胶回收产物BUN411连接，得到重组质粒pBUN411-ZmGa1S。重组质粒pBUN411-ZmGa1S的结构描述为：将pBUN411质粒的两个限制性内切酶Bsa I的识别序列之间的片段(约1.1kb)替换为DNA片段“5’-AATGCAACAGGCGTCCACA-3”’后所得的重组质粒。
二、玉米遗传转化实验
由天津吉诺沃生物科技有限公司完成重组载体pBUN411-ZmGa1S向玉米自交系B6的遗传转化，具体的转化方法是常规的农杆菌介导的玉米幼胚的遗传转化。
三、转基因后代的功能验证
将转基因后代群体中的单株提取基因组DNA，以此为模板，以P1-F/P1-R为引物，扩增获得大小1589bp的目的产物，将产物测序，编辑位点为纯合突变的植株为转基因阳性纯合突变植株，测序序列无突变的植株为转基因阴性植株。取ga1/ga1基因型自交系的花粉给为转基因阳性纯合突变植株的花丝授粉，若结实，则该基因为目的基因。同时，以转基因阴性植株和未转基因的玉米自交系B6的植株做为对照，取ga1/ga1基因型自交系的花粉给其授粉，观察是否结实。每种实验材料的供试株数不少于60株。
P1-F：5′-ACCTGAAGATGGCGGTTACAC-3′(序列3的第2,825-2,844bp位置)；
P1-R：5′-CTCAAGCTGCTCTAGCATTCG-3′(序列3的第4,395-4,413bp位置)。
以其中一株转基因阳性纯合突变植株为例，与野生型B6相比，转基因植株在ZmGa1S基因的第一个外显子上缺失1bp，导致氨基酸移码和翻译的提前终止(图5中A)。取ga1/ga1基因型自交系B73的花粉给转基因阳性纯合突变植株(mut)的花丝授粉，可结实；而B73的花粉给对照B6的花丝授粉，不能结实(图5中B)。
以上证明，玉米ZmGa1S基因为与玉米单向杂交不亲和现象相关的基因。
综合以上各实施例的研究结果，可见：通过图位克隆和转基因功能验证，本发明克隆的ZmGa1S基因是与玉米单向杂交不亲和现象相关的基因，该基因编码的蛋白突变以后，可以接受ga1/ga1基因型材料的花粉而结实，可在玉米育种制种过程中得以利用。
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Figure ISA0000165768330000071

Claims (14)

1.蛋白质，是如下：
由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)-2)中任一的DNA分子：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)序列表中序列3所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。
6.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒。
7.含有权利要求2或3所述核酸分子的转基因细胞系。
8.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组微生物。
9.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4或5所述的重组载体或权利要求6所述的表达盒或权利要求7所述的转基因细胞系或权利要求8所述的重组微生物在如下任一中的应用：
(a)植物育种和/或制种；
(b)调控植物杂交不亲和。
10.培育转基因植物的方法，为如下：
(1)抑制基因型为Ga1-S/Ga1-S受体植物中ZmGa1S蛋白的表达，得到转基因植物；所述受体植物可接受ga1/ga1基因型玉米花粉而结实的性状是由于所述受体植物所述ZmGa1S蛋白功能的丧失引起的；所述ZmGa1S蛋白为权利要求1所述蛋白质。
(2)从步骤(1)所得转基因植物中得到可接受ga1/ga1基因型玉米花粉而结实的转基因植物。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，是通过如下实现抑制所述受体植物中所述编码基因的表达的：采用CRISPR/Cas9核酸酶对所述受体植物中编码ZmGa1S蛋白的基因组DNA序列进行特异性剪切，使所述受体植物丧失或降低表达有功能的ZmGa1S蛋白的能力。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物。
14.根据权利要求13中所述的方法，其特征在于：所述禾本科植物为玉米。
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