CN111690047A - 一个玉米细胞核雄性育性基因ipe2的克隆与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与植物雄性育性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明的IPE2基因在玉米中能够控制雄性育性。本发明为植物特别是玉米的雄性育性研究提供了新的基因资源，其在玉米制种和育种领域的应用中将发挥重要作用。

Description

一个玉米细胞核雄性育性基因IPE2的克隆与应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一个玉米细胞核雄性育性基因IPE2的克隆与应用。

背景技术

植物雄性不育广义上是指植物雄性器官发育异常最终导致成熟期雄性不育(Chen and Liu，2014)且可稳定遗传给后代，但雌性生殖系统正常发育的现象。植物雄 性不育主要表现为雄性生殖系统发育畸形、雄花萎缩消失；不能形成正常的小孢子 发生组织、小孢子发生异常；花粉粒畸形、不成熟、无活力以及花药不开裂等等。 1763年，德国的Joseph Gottlieb

教授首次发现植物雄性不育现象(Mayr， 1986)；1876年，Coleman首次引入“植物雄性不育”的概念。1908年，Bateson等 在香豌豆中发现一个隐性基因控制的细胞核雄性不育。据报道(Kaul，1988)，雄性不 育现象已在617个植物品种中发现，其中涵盖了43个科、162个属和320个种。

植物配子体(Gametophyte)整个复杂的发育过程受其自身的孢子体基因与配子体基因的协同精细调控(Boavida et al.，2005)。当植物从营养生长向生殖生长转化时，在花中由亚表皮层体细胞分化形成花原基(Ma，2005；Ma et al.，2008)，但其中仅有少数 细胞分化形成生殖细胞(Kelliher and Walbot，2011)，花药原基经过复杂的分化过程形 成孢子母细胞，孢子母细胞则需经历一次减数分裂及两次有丝分裂后才可形成小孢 子(McCormick，1993；Scott et al.，2004)。如果参与雄配子发育的任何基因发生突变， 则均可能造成植物雄性不育。

雄性不育材料已在玉米(Wan et al.，2019)、水稻(Li et al.，2007)、高粱(Stephensand Holland，1954)等多种作物的杂交制种中得到应用(Bohra et al.，2016)。其中玉米是我 国种植范围最广和用途最多以及总产量最高的作物，也是三大粮食作物中利用杂种 优势起始时间较早且最为彻底的作物。玉米为雌雄同株、异花授粉的作物，是一种 极具优势的基础研究模式植物(Schnable et al.，2012)。对植物雄性不育突变体进行研 究，有利于人们更深地理解参与雄性器官发育的相关基因的调控机理，以及更深地 理解植物世代交替的生命过程，而不育材料本身也为实际生产制种提供了宝贵的资 源。

发明内容

本发明的目的是提供一种与植物雄性育性相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白质，名称为IPE2，来源于玉米属的玉米(Zea mays L.)，是 如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加，且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。

序列表序列1为IPE2的氨基酸序列，包括393个氨基酸，在该蛋白质序列中， 碱性氨基酸占26个，酸性氨基酸占37个，该蛋白质的分子量为43KD，等电点为 5.43。

为了便于上述(a)中所示蛋白质的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸 残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得 到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中 缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分 子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述蛋白质的基因(命名 为IPE2)，所述基因具体可为如下1)-5)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)序列表中序列4所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)-3)中任一限定的DNA分子杂交且编码与植物雄性育 性相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子；

5)与1)-4)中任一限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码与植物雄 性育性相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。

其中，序列2为IPE2基因在玉米基因组中的序列；序列3为IPE2基因的cDNA 序列；序列4为IPE2基因的CDS序列。

含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本 发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍 生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含 聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸 信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时， 在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动 子，例如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、 胁迫诱导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此 外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或 转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但 必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和 起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以 来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选， 可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的 酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也 可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，所述基因，报告基因，以及转 录终止序列组成。

所述转基因细胞系为转入所述基因的非繁殖材料。

本发明还提供了培育转基因植物的方法。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微 生物在植物育种和/或制种中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了培育转基因植物的方法。

本发明所提供培育转基因植物的方法，可为如下：

(1)向基因型为ipe2/ipe2受体植物中导入IPE2蛋白的编码基因，得到表达所 述编码基因的转基因植物；所述受体植物的雄性不育性状是由于所述受体植物表达 有功能的所述IPE2蛋白的能力丧失或降低引起的；

(2)从上述步骤所得转基因植物中得到雄性可育的转基因植物；所述编码基因 可通过以上重组表达载体p3300-IPE2导入所述受体植物。

在本发明中，所述玉米雄性不育为“盛花期花药不外挂”和/或“花药内没有经 1％I₂-KI染色鉴定为有活力的花粉”。

在本发明中，所述植物既可为单子叶植物，也可为双子叶植物。其中，所述单 子叶植物如禾本科植物，具体如玉米。

本发明利用图位克隆的策略，用玉米雄性不育突变体ipe2与玉米自交系B73组 配BC₁F₁群体，将控制这一突变性状的基因定位到玉米五号染色体131.799Mb到 134.582Mb之间，以公布的B73基因组测序结果为参考物理距离约为2.78Mb，共 包括二十七个基因。其中基因号为Zm00001d015960的序列在突变体与野生型之间存 在差异，突变体有一个12bp的缺失和314bp的插入，野生型没有这一缺失和插入。 用转基因技术将IPE2基因在上述玉米雄性不育突变体中互补表达，可以恢复其雄性 育性。因此Zm00001d015960基因即目的基因，命名为IPE2。

本发明的IPE2基因在玉米中能够控制雄性育性，即该基因的纯合突变或缺失能够使玉米雄性不育，在该基因突变或缺失的材料中正常表达IPE2基因能够恢复雄性 育性。

本发明为玉米雄性育性研究提供了新的基因资源。

附图说明

图1为玉米突变体ipe2与野生型的表型对比图。其中，A、C、E、G、I为野生 型，B、D、F、H、J为ipe2突变体。A和B，植株形态；C和D，雄穗花药外挂情 况；E和F，小穗形态；G和H，花药形态；I和J，花粉1％I₂-KI染色。

图2为ipe2基因图位克隆图。

图3为IPE2在玉米突变体ipe2中插入位点示意图。

图4为IPE2基因遗传互补验证图。其中，A为IPE2遗传互补流程图；B为转 基因株系的PCR检测(泳道1为阳性对照，即转化玉米受体时用的p3300-ZmIAP1 质粒作为模板扩增所得的阳性对照，泳道2为阴性对照，3-10泳道是基因型为aaB_ 的植株，经鉴定为转基因阳性)；C为基因型为aaB_植株的花粉1％I₂-KI染色；D 为基因型为aabb植株的花粉1％I₂-KI染色；E、G、I、K为基因型为aaB_的植株 雄穗花药外挂情况；F、H、J、L为基因型为aabb的植株雄穗花药外挂情况。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米突变体ipe2为本实验室收集和保存。玉米基因组测序信息参考MaizeGDB 数据库，该数据库链接如下：http：//www.maizegdb.org/。

实施例1、玉米雄性育性基因IPE2的图位克隆

一、玉米突变体ipe2的表型

与正常植株相比，玉米突变体ipe2在植株整体形态方面没有异常(图1中A和 B)，但是其雄穗的花药不外挂(图1中C和D)，经解剖其花药内部用1％I₂-KI溶 液染色未观察到饱满成熟的花粉粒(图1中I和J)，表现为彻底的雄性不育现象。 该现象在北京和海南连续4年观察表型一致，不育特性稳定，且在大田条件下肉眼 即可区分是否为雄性不育。

二、遗传定位群体的构建

以玉米突变体ip32为母本，以玉米自交系B73为父本组配F₁，F₁田间表型均为 雄性可育。而后以玉米突变体ipe2为母本，以F₁为父本构建回交群体(BC₁F₁)，BC₁F₁群体在田间可分为雄性可育个体和雄性不育个体两种类型，且两种类型的比例经卡 方检验符合1；1(表1)。由此推测玉米突变体ipe2的表型由隐性单基因控制，并将 BC₁F₁群体作为遗传定位群体。

表1 BC₁F₁群体不同表型个体的比例统计

X_0.05 ²(1)＝3.84

三、IPE2基因的定位

首先，以玉米突变体ipe2和玉米自交系B73的基因组DNA为模板，用玉米全 基因组引物筛选在突变体和自交系之间有多态性的引物。然后，从BC₁F₁群体中选 取雄性可育单株和雄性不育单株各20株，验证多态性引物是否与雄性育性性状连锁。 筛选出连锁引物，用于对BC₁F₁群体的5792个单株测定基因型，从而结合雄性育性 表型筛选出表型与基因型不符的为交换单株，并根据不同引物筛选出的交换单株个 数的不同，依照减少趋势确定定位区间，由此将IPE2基因定位在位于五号染色体的 引物标记B1(129.236Mb)和C8(149.399Mb)之间。在B1和B11之间继续开发 多态性分子标记，并用于检测BC₁F₁群体的所有单株，最终将IPE2基因定位在C3 (131.799Mb)和B7(134.582Mb)之间，参考已公布的玉米自交系B73基因组测 序结果，物理距离约为2.78Mb(图2)。其中，用于基因定位的分子标记引物序列 如表2所示。

表2用于基因定位的分子标记引物序列

四、IPE2基因的克隆

参考玉米基因组测序信息，定位区间的2.78Mb范围内包含27个基因。以雄性 可育单株和雄性不育单株的基因组DNA为模板，扩增这27个基因并比较其序列差 异，发现只有基因Zm00001d015960在雄性可育单株和雄性不育单株之间存在DNA 序列上的差异。相对于雄性可育单株(AA)，雄性不育单株(aa)在Zm00001d015960 基因的第一个外显子上缺失12bp，3’UTR上插入314.bp(图3)。因此推测候选基 因Zm00001d015960即为要克隆的IPE2基因。

以玉米自交系B73的基因组DNA为模板，采用引物对F1/R1进行PCR扩增， 所得PCR产物的序列为序列表中序列2，序列2即为IPE2基因在玉米基因组中的序 列。提取玉米自交系B73的总RNA，反转录为cDNA，采用引物对F2/R2进行PCP 扩增，所得PCR产物的序列为序列表中序列3，序列3即为IPE2基因的cDNA序列， 其中第74-1256位为CDS。序列2和序列3均编码序列表中序列1所示的IPE2蛋白。

F1：5’-GAGCACACTGCACACCAC-3’；

R1：5’-CAGGTACAATCTCAAATGAGCTT-3’。

F2：5’-GAGCACACTGCACACCACTAC-3’；

R2：5’-CAGGTACAATCTCAAATGAGCTTTC-3’。

实施例2、玉米雄性育性基因IPE2的功能验证

一、互补载体的构建

设计针对IPE2基因的基因组序列的特异引物。具体序列为：

P1-F：5’-GATTACGAATTAGCTTGCATGCCTGCAGTCGTAAAGGA ATAGGGAGGGTG-3’；

P1-R：5’-GTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGGCGACTTT CACAAGACGATACG-3’。

其中，P1-F位于IPE2基因起始密码子ATG上游2869bp，P1-R位于IPE2基因 终止密码子下游1773bp。

以玉米自交系B73的基因组DNA为模板，采用引物对P1-F/P1-R进行PCR扩 增，进一步将目标条带胶回收测序，显示其序列如序列表中序列5所示。经测序鉴 定，构建成为互补载体p3300-IPE2。

重组表达载体p3300-ZmIAP1的结构描述：将pCAMBIA3300载体的酶切位点 Kpn I和Hind III之间的小片段替换为序列表中序列5所示的DNA片段后得到的重 组质粒。

二、玉米遗传转化实验

由天津吉诺沃生物科技有限公司完成重组表达载体p3300-IPE2向玉米自交系综31的遗传转化，具体的转化方法是常规的农杆菌介导的玉米幼胚的遗传转化。

三、转基因后代群体配制

为鉴定IPE2基因的功能，将转p3300-IPE2载体的T₀代转基因植株配制成群体。 在此，将玉米基因组上正常的IPE2基因以基因型AA表示，突变的ipe2基因以基因 型aa表示。玉米受体综31是雄性育性正常的材料，因此IPE2基因在综31中的基 因型是AA，而在玉米突变体ipe2中的基因型是aa。同时，将转基因阴性植株或非 转基因植株的基因型以bb表示，将转基因阳性植株(即含有IPE2基因的互补载体 片段已整合到玉米基因组上)以B表示，那么转基因杂合植株的基因型是Bb，转基 因纯合植株的基因型是BB。转基因后代群体的配制(图4中A)，首先以T₀代转基 因阳性植株(AABb)为父本，玉米突变体ipe2(aabb)为母本，组配F₁。F₁群体包 含两种基因型，即AaBb和Aabb。提取F₁各个单株的基因组DNA鉴定其是否为转 基因阳性(B)。选择转基因阳性植株即AaBb基因型单株进行自交，其后代共产生 四种基因型：A_B_、A_bb、aaB_、aabb。其中aaB_基因型的单株，在玉米基因组 上五号染色体定位区间内的基因型为aa(确定方法是通过在定位区间两侧的连锁的 多态性分子标记，即定位区间右端B7和定位区间左端C3，来扩增单株的基因组 DNA，得到的条带带型与综31一样，就认为这一段来自综31，得到的条带带型与 ipe2一样，就认为这一段来自ipe2。我们将IPE2基因两侧的分子标记都用来做这个 检测，两侧的分子标记都同时是ipe2材料的带型，就确定这一段基因组DNA来自 突变体ipe2，如果基因组DNA双链都是来自ipe2，那么在这一区间内的目的基因的 基因型就是aa)，由此对应的表型应为雄性不育，然而由于转基因阳性(B_)使得玉 米基因组上整合了IPE2基因，aaB_基因型的单株的表型实则应为雄性可育。其中，确定是否为转基因阳性的方法具体如下：将转基因后代群体中的单株提取基因组 DNA，以此为模板，以P2-F和P2-R为引物，扩增获得大小966bp的目的条带为转 基因阳性，无此条带为转基因阴性。同时以转化前的p3300-ZmIAP1质粒为模板进行 扩增，作为阳性对照。

P2-F：5’-TCCCTTCCAATCCAACTAAGG-3’

P2-R：5’-CTCAAGCTGCTCTAGCATTCG-3’

图4中B的泳道3、4、5、6、7、8、9、10为鉴定为转基因阳性的基因型为aaB_ 的植株，泳道1是以转化前的p3300-IPE2质粒为模板的结果，是阳性对照。其中， 植株表型是否为雄性可育，具体通过如下两种方法鉴定：1、观察盛花期雄穗的花药 是否外挂，不外挂为雄性不育，外挂为雄性可育。2、花药内部用1％I₂-KI溶液染色， 未观察到黑色圆形饱满成熟的花粉粒为雄性不育，观察到黑色圆形饱满成熟的花粉 粒为雄性可育。

最终，本发明检测的4个转化事件共63个aaB_基因型单株其表型均为雄性可育(图4中E、G、I、K显示盛花期花药饱满且外挂，花药内经1％I₂-KI染色全部花 粉均呈现黑色圆形饱满状，鉴定为有活力的花粉)，同时分离出的33个aabb基因型 单株的表型均为雄性不育(盛花期花药干瘪且不外挂，花药内没有经1％I₂-KI染色 鉴定为有活力的花粉)。由此得出，转化的IPE2基因可以互补ipe2纯合突变的雄性 育性表型。

综合以上各实施例的研究结果，可见：通过图位克隆、基因的互补实验，本发 明克隆的IPE2基因是控制玉米雄性育性的基因，其突变可导致彻底的雄性不育，且 对其他性状没有明显的负面影响，可以在玉米制种过程中得以利用。

Claims (10)

1.蛋白质，是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。

3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因为如下1)-5)中任一的DNA分子：

1)序列表中序列2所示的DNA分子；

2)序列表中序列3所示的DNA分子；

3)序列表中序列4所示的DNA分子；

4)在严格条件下与1)-3)中任一限定的DNA分子杂交且编码与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子；

5)与1)-4)中任一限定的DNA序列具有90％以上同一性，且编码与植物雄性育性相关的由序列1衍生的蛋白质的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。

6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述核酸分子或权利要求4或5所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物在植物育种和/或制种中的应用。

7.培育转基因植物的方法为如下：

本发明所提供培育转基因植物的方法，可为如下：

(1)向基因型为ipe2/ipe2受体植物中导入IPE2蛋白的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；所述受体植物的雄性不育性状是由于所述受体植物表达有功能的所述IPE2蛋白的能力丧失或降低引起的；

(2)从上述步骤所得转基因植物中得到雄性可育的转基因植物；所述编码基因可通过以上重组表达载体p3300-IPE2导入所述受体植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述编码基因是通过权利要求5中的所述重组表达载体导入所述受体植物的。

9.根据权利要求7或8所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

10.根据权利要求7-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述单子叶植物为禾本科植物；

所述禾本科植物具体为玉米。

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