CN112778407A

CN112778407A - 一种玉米幼苗黄白叶基因及其编码蛋白和应用

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Publication number: CN112778407A
Application number: CN202110140125.4A
Authority: CN
Inventors: 李川; 曹墨菊; 余涛; 胡朝勇; 王靖文; 易洪杨; 夏远燕; 袁鹏; 冯开洁
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2021-02-02
Filing date: 2021-02-02
Publication date: 2021-05-11
Anticipated expiration: 2041-02-02
Also published as: CN112778407B

Abstract

本发明公开了一种玉米幼苗黄白叶蛋白及其编码基因，该蛋白由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成，其编码基因由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。还公开了它们在培育幼苗黄白叶玉米品种、杂交种纯度鉴定或去杂保纯、以及在杂交诱导单倍体育种、作为标记性状在SPT或MCS种子生产技术上的应用等用途。本发明玉米幼苗黄白叶性状特征明显，易于识别，并能稳定遗传；其次，该性状由单隐性基因控制，可通过回交转育或转基因方法将其转育到自交系中，育种方法简单；此外，本发明玉米幼苗黄白叶性状仅在出苗后短期内显现，后期快速转绿，对玉米的正常生长发育没有影响，在玉米制种和杂交诱导单倍体育种等领域应用前景极为广泛。

Description

一种玉米幼苗黄白叶基因及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种玉米幼苗黄白叶基因，以及该基因编码的蛋白质，还涉及该基因和蛋白质的用途；本发明还涉及该基因的分子标记及其应用。

背景技术

叶色突变的发生，主要是由于突变基因直接或间接干扰叶绿素的合成及降解，进而经由多种途径改变叶色中各种色素的含量和比例，最终引起叶色变异。在玉米中主要有白化、黄化、淡绿和条纹叶等叶色突变类型，已知的绝大部分叶色突变材料在整个生育期都表现为明显的叶色突变表型，不仅影响叶片光合作用的进行，甚至可能致死，因而难以在生产上应用。目前只有少部分叶色突变基因被克隆(Sawers等.Plant Physiol，2004,136(1)：2771-2781；Sawers等.Plant Mol Biol，2006，60(1)：95-106；Shi等.PLoS One，2013，8(11)：e80107)。

玉米是最早利用杂种优势的作物之一，因杂交种在生长势、抗逆性、产量和品质等方面具有优势，玉米杂交种早已得到广泛应用。利用杂种优势需要年年制种，作为雌雄同株异花的异花授粉作物，玉米制种中面临的最大困难就是母本由于人工去雄不及时或不彻底而造成导致商品杂交种子的混杂，进而造成生产上的减产，给农民带来经济损失。而如果在苗期有可用于识别假杂种的标记性状，并根据该标记性状在苗期剔除假杂种，可有效减少或避免生产上的损失。此外，苗期叶色标记性状还可用于杂交种子纯度鉴定等。

美国先锋公司通过遗传工程开发了一种利用核不育系生产种子的技术SPT(SeedProduction Technology)。该技术的优点是可通过转基因技术生产非转基因的不育系种子，有效解决了不育系的保持问题。其技术路线是将育性恢复基因、花粉致死基因及籽粒荧光标记基因连锁在一起形成表达盒构建到转基因载体。通过转基因手段将该表达盒转入核不育突变体，由于转基因植株含有育性恢复基因，不育突变体可产生携带转基因片段和不带转基因片段的两种基因型(1：1)花粉，由于转基因表达盒同时还含有花粉致死基因，转基因植株只能产生有功能的非转基因花粉，因此自交可产生不育系和保持系种子，通过荧光筛选可将保持系种子分离出来。SPT技术实现不育系和保持系的一系两用，有效解决了细胞核雄性不育育性保持的问题，在杂交种子生产上具有广泛应用前景。但研究表明SPT表达盒仍然存在一定比例(0.002％-0.518％)的转基因花粉不致死现象。为了解决这一问题，我国研究人员开发了一种多控不育系统MCS，对SPT表达盒进行了改进，将SPT中的一个花粉致死基因增加至两个，结果表明MCS的确可有效降低转基因花粉非致死比例(0.033％-0.263％),但任然存在转基因漂流现象。因此，对玉米传统去雄制种或新型的SPT和MCS不育化制种来说，如何有效地去杂留存显得尤为重要。

发明内容

本申请人于1996年利用返回式卫星搭载川单9号玉米种子进行太空诱变，将经过太空诱变的川单9号连续自交至第8代时，在田间意外发现一株幼苗叶色突变体，该突变体出土后幼苗叶色表现为黄色甚至白色，后期叶色快速转绿，在播种25天后表现为正常绿色。进一步的研究发现，此幼苗叶色变异能稳定遗传，且对玉米的正常生长发育没有影响。发明人将该突变体命名为：eal1。遗传分析表明，该玉米幼苗黄白叶性状受单隐性核基因控制。本发明就是在此意外发现的基础上实现的。

实现本发明的技术方案如下：

本发明目的在于提供一种玉米幼苗黄白叶蛋白，所述的蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的替换、缺失或添加组成的，且与幼苗黄白叶性状相关的蛋白质。

上述(a)或(b)中所述的蛋白质可人工合成，也可以先合成其蛋白编码基因，再通过表达得到。

本发明另一目的在于提供编码上述玉米幼苗黄白叶蛋白的基因(以下亦称为：幼苗黄白叶基因或黄白叶基因等)，所述的基因是如下的DNA分子之一：

(1)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的DNA分子；

(2)与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有90％以上、或95％以上同一性，且编码与幼苗黄白叶相关的蛋白质的DNA分子；

(3)将SEQ ID No.2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基添加、替换或缺失所形成的，且编码与幼苗黄白叶发育相关的蛋白质的DNA分子。

本发明还提供了上述蛋白或基因在培育具有幼苗黄白叶特性的植物上的应用。

所述的植物是指玉米、水稻等。

本发明还提供了上述蛋白或基因在玉米杂交种子纯度鉴定或去杂保纯上的应用。

本发明还提供了上述蛋白或基因在玉米杂交诱导单倍体育种中的应用。所述的应用是指在单倍体鉴定上的应用。

本发明还提供了上述基因作为标记性状在SPT或MCS种子生产技术上的应用。

本发明还提供了含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物。

所述重组载体可以为重组表达载体，也可以为重组克隆载体。

所述重组表达载体可以用现有的植物表达载体构建，如pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3301或其它衍生植物表达载体。

利用上述基因构建重组表达载体时，在其起始密码子前可加任何一种可用类型的启动子，但必须保证整个序列的正确翻译。

所述表达盒由能够启动上述基因表达的启动子、上述基因以及转录终止序列组成。

所述转基因细胞系为含有上述基因的用于转基因遗传转化的材料。

利用上述基因培育具有幼苗黄白叶特性的玉米品种的方法，包括通过转基因方法将上述幼苗黄白叶基因转到玉米品种中。

利用上述基因鉴定玉米真假杂交种的方法，以含有上述幼苗黄白叶基因的自交系为母本，以不含上述基因的自交系为父本杂交，得杂交种；将所得杂交种在田间或室内播种，如果出土幼苗叶色为黄白色，说明所生产的杂交种为假杂种；如果所得杂交种出土幼苗为正常绿色，则为真杂交种。

利用上述基因鉴定杂交种纯度的方法，以含有上述幼苗黄白叶基因的自交系为母本，以不含上述幼苗黄白叶基因的自交系为父本杂交生产杂交种子；将所得杂交种子在室内或田间种植，统计幼苗叶片颜色为黄白色和正常绿色的植株数，用表现为正常绿色的株数除以总株数，所得百分数即为杂交种子的纯度。

所述的含有上述幼苗黄白叶基因的自交系可通过回交转育获得，也可通过转基因方法获得。

所述回交转育的非轮回亲本可以是突变体eal1或含有上述幼苗黄白叶基因的eal1的衍生材料。

所述的黄白苗突变体eal1为四川农业大学通过对川单9号的太空诱变获得，保存于四川农业大学玉米研究所。

利用上述幼苗黄白叶基因鉴定和筛选杂交诱导单倍体的方法，以含有上述幼苗黄白叶基因的材料为母本，以幼苗为正常绿色的单倍体诱导系为父本杂交，种植所得种子，出土后观测幼苗叶片颜色；表现为黄白叶的，即为单倍体植株，予以保留；表现为正常绿色的，为杂交种，予以拔除。

本发明还提供了利用上述幼苗黄白叶基因结合SPT技术或MCS技术生产玉米杂交种的方法，包括以下步骤：

(1)构建上述幼苗黄白叶基因的表达载体；

(2)将步骤(1)所得的表达载体与SPT技术或MCS技术构建的表达盒串联，通过转基因方法将串联的表达盒导入母本不育系，获得转基因保持系；

(3)以含有上述黄白叶基因的的不育系做母本，以步骤(2)所得转基因保持系做父本，杂交生产保持系和不育系种子；种植所生产的种子，出苗后叶色表现为黄白色的，为非转基因的不育种子，保留用于制种；出苗后叶色表现为正常绿色的，为带有表达盒的转基因种子，拔除即可。通过此种方法可防止转基因漂流。

本发明还提供了上述幼苗黄白叶基因的分子标记，其用于扩增该分子标记的引物为：

BeCaps1-F：5’-CACTGGTGGATCAAACAAGCAA-3’(SEQ ID No.3)，

BeCaps1-R：5’-GACTCGATCTGCCGGATTCT-3’(SEQ ID No.4)。

利用上述引物对玉米基因组进行扩增，如果所得产物大小为832bp的DNA片段，那么说明为含有纯合的黄白叶基因；如果所得扩增片段大小为835bp，说明不含有黄白叶基因，其幼苗叶片颜色表现正常为绿色。

本发明具有的优点和技术效果：(1)本发明玉米幼苗黄白叶性状特征明显，易于识别，并能稳定遗传，可作为玉米制种或玉米育种中识别筛选的标记性状；(2)本发明玉米幼苗黄白叶性状由单隐性基因控制，可通过回交转育或转基因方法将其转育到自交系中，育种方法简单；(3)本发明玉米幼苗黄白叶性状仅在出苗后短期内显现，后期快速转绿，对玉米的正常生长发育没有影响，在玉米制种和杂交诱导单倍体育种等领域应用前景极为广泛。

附图说明

图1.野生型WT与突变体eal1出苗后叶色对比照片；其中WT为野生型，eal1为叶色突变体。

图2.野生型WT与突变体eal1苗期(播种后25天)叶色对比照片；其中WT为野生型，eal1为叶色突变体。

图3.野生型WT和突变体eal1苗期第二叶叶绿体超微结构对比照片；其中1为野生型WT幼苗的叶绿体，2为突变体eal1幼苗的叶绿体，3为突变体eal1叶片转绿后同期的野生型WT的叶绿体；4为突变体eal1叶片转绿后的叶绿体。

图4.成株期(播种后70天)野生型WT和突变体eal1植株对比照片；其中WT为野生型，eal1为黄白叶突变体。

图5.突变体eal1叶色突变和野生型WT与不同自交系组配的F1果穗对比照片；其中1为Y1027×WT；2为Y1027×eal1；3为WT×Y1027；4为eal1×Y1027；5为Zi330×WT；6为Zi3307×eal1；7为WT×Zi330；8为eal1×Zi330；9为B73×WT；10为B73×eal1；11为WT×B73；12为eal1×B73。

图6.精细定位eal1位点和关键候选基因分析示意图。

图7.以BeCaps1为引物对基因组DNA进行PCR扩增，再对扩增产物用NruI酶进行酶切后突变位点基因型的电泳图谱；其中2为显性纯合ZmEAL1ZmEAL1单株；3为基因型为杂合ZmEAL1zmeal1的单株；4为基因型为隐性纯合的单株。

图8.EMS4-110eeb材料基因型鉴定电泳图谱。

图9.EMS-6S1自交群体中出现的白化幼苗照片。

图10.用杂合单株EMS-6(基因型为ZmSig2A^C/T)的花粉给突变体eal1(基因型为ZmSig2A^ΔV/ΔV)授粉后获得的F1代的黄白叶幼苗照片。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明做进一步的解释和说明，但是不对本发明保护范围构成任何限制。如无特殊说明，下述实施例中所述方法均为常规方法，所述化学试剂均为常规试剂。

实施例1本发明玉米幼苗黄白叶色突变体eal1的获得及遗传分析

(一)本发明玉米幼苗黄白叶突变体eal1的获得及表型鉴定

本申请人于1996年利用返回式卫星搭载川单9号玉米种子对其进行太空诱变，将太空诱变后的川单9号种子连续自交8代，意外获得一份幼苗叶色突变材料，该突变材料表现为出苗后叶片颜色为黄色甚至白色(以下简称：黄白叶)，后期快速转变为正常绿色，发明人将该突变体材料命名为：eal1。用来源于同一穗行正常叶色株且自交后代叶色无分离的姊妹株进行保种，并作为对照WT。

将突变体eal1在田间种植，突变体eal1出土后幼苗表现出明显的黄色甚至白色的叶色变异，后期叶色快速转绿，播种约25天后突变体eal1和相应的野生型植株(WT植株)叶色一样，表现正常的绿色(见图2)；虽然早期发育相对滞后，但最终突变体eal1植株与相应的野生型植株相比，植株形态无明显差异(见图3)。

经透射电镜观察发现，突变体eal1中叶色变异是由于叶绿体发育异常导致，突变体叶色转绿后，叶片叶绿体结构恢复正常(见图4)。

利用该突变体eal1及其野生型WT分别与自交系Y1027、Zi330和B73之间分别作为父母本进行正反杂交，共得12个F1代杂交种；种植F1代，收获果穗，对其产量水平进行评价，结果(见图5)eal1突变体和其野生型WT与不同自交系配制的F1杂交种之间具有具有相同的产量水平，说明该本发明的幼苗黄白叶突变对玉米杂交种的产量无影响，即该突变对植株的生长发育没有影响。

(二)本发明突变体eal1中叶色突变性状的遗传分析

以突变体eal1为母本，以自交系B73为父本进行杂交，获得F1；然后F1自交，获得F2群体。2016年4月，在田间种植F2群体，在播种后15天进行幼苗叶色调查，分别统计叶色为正常绿色和黄白色的单株数。

结果在所调查F2群体的464株中，其中幼苗叶色为正常绿色的有346株，幼苗叶色为黄白色的有118株，叶色正常株与突变株的比例为346:118，经卡方测验，符合3:1的孟德尔分离比(χ²＝0.03<χ² _(0.05,1)＝3.84)，说明该突变性状受一对隐性核基因控制，将该基因命名为：zmeal1。

实施例2玉米zmeal1突变基因的图位克隆

(一)玉米zmeal1基因的精细定位

将实施例1中所得的F2群体作为遗传定位群体，以CTAB法提取群体中突变单株的叶片基因组DNA用于基因型鉴定。通过搜索MaizeGDB公共数据库(http://www.maizegdb.org/)，筛选了均匀覆盖整个玉米基因组的366对SSR标记。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳分析鉴定了这些SSR标记在突变体eal1与自交系B73间的多态性。

首先利用F2群体中的96株叶色突变单株进行初定位，将突变基因定位在4号染色体短臂。通过加密的4号染色体多态性标记，将突变基因定位在多态性分子标记InDel2和InDel19之间(所用部分引物见表1)。进一步加大定位群体和开发多态性分子标记，最终将突变基因定位在4号染色体短臂InDel12和SNP61之间，物理距离174.9kb，该区间包含3个可能的蛋白编码基因(见图6)。利用NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行序列比对，发现Zm00001d049160(ZmSig2A)基因氨基酸序列与拟南芥SIG2基因氨基酸序列相似性为45％，与水稻OsSig2A基因氨基酸序列相似性为77％。拟南芥SIG2突变后，植株表现为苗期叶色黄化，后期逐渐转绿(Hu等.Plant Physiol,2015,168(3)1066-1075)。水稻OsSig2A基因突变后导致叶绿体发育异常，叶片白化(Yu等.Funct Plant Biol,2019,46(8):766-776)。基于此，本发明人重点对定位区间内ZmSig2A基因进行序列分析。

播种后10天，提取对照WT和突变体eal1苗期第2叶总RNA，所用试剂为RNAiso Plus(TaKaRa,Code No.:9109),提取步骤按试剂说明书进行。运用PrimeScript^TM1st StrandcDNA Synthesis Kit(TaKaRa,Code No.:6110A)试剂盒进行反转录合成cDNA，操作步骤按试剂说明书进行。设计引物Psig2A，以反转录合成的cDNA为模板，对突变体eal1和对照WT中的ZmSig2A基因进行扩增，所用试剂为KOD FX(TOYOBO,Code No.:KFX-101)；所述的Psig2A引物为：

Psig2A-F：5’-GCTCGACCTCCACCTCTCTTT-3’

Psig2A-R：5’-ATGAGGACCCACGTAAAATGGTA-3’。

PCR扩增程序为：94℃预变性5分钟；98℃变性10秒，59℃退火30秒，68℃延伸2分钟，循环34次；68℃延伸5分钟；12℃结束程序，对PCR产物进行测序。结果发现，突变体eal1与对照WT相比，在ZmSig2A基因编码区存在276(T>A),513(A>G),939(T>C),1101(A>G),1104(G>A),1425(T>A)7个同义SNP突变，最终导致突变体中一个缬氨酸残基(V)缺失，该突变基因的核苷酸序列见SEQ ID No：2，其编码蛋白的氨基酸序列见SEQ ID No：1。蛋白结构预测结果表明此3bp的缺失可能会导致蛋白质二级结构的明显变异。基于上述结果，将ZmSig2A确定为关键候选基因。其中eal1突变体中ZmSig2A位点等位基因用ZmSig2A^ΔV表示，对照WT中ZmSig2A位点等位基因用ZmSig2A⁺表示。

表1本发明实施例试验中所涉及的部分PCR引物

引物名称	正向引物(5’to 3’)	反向引物(5’to 3’)
			umc1288	ATCCGGACAAATTGAACTTTCATC	ATAGATTCAGTGTTGGACCGAGGA
InDel-2	TTTAGTTAATTTGGCTGTTGTTGA	ACTATTATATTTTAACAAAGGCAT
			InDel-12	TTTTTGGTGGTCGTCCCAT	ATTGCTCGAGACGATTGACC
umc2281	CAATGATTGGAGCCTAACCCCT	ATGATGATCTGCAGAGCCTAGTCC
			umc2176	CTCAAGAACACCACCAGACGAGTT	ATAGATCTTTGTCGCGTGTTCTGC
InDel-19	AAGGCTCAAAAGCATAATGACA	CATCAAGCCAACTGATAATGGG
			160SNP	CCCTTGGACCGCTTCTTCTT	TGAGGCAACTCTGGCATCA
161SNP	ACGTCACGTAGTAGTCCCCG	TTTCTTTTGCCAGATCGACCAT
			Ubi2A	TTTAGCTCTGCCTTCATACGC	GCCAGAGTTGCCTCAAAGTT
BeCaps1	CACTGGTGGATCAAACAAGCAA	GACTCGATCTGCCGGATTCT
			110eeb	CCCACCACCCAAATCCTGTT	TTCAGCTGTCTCAGCACTGG

实施例3利用特异引物和酶切方法对玉米zmeal1突变基因位点基因型鉴定试验

实施例2在基因组DNA水平验证了上述7个SNP变异和一个3bp缺失。基于上述变异信息，开发了一个ZmSig2A基因内的酶切扩增多态性序列标记BeCaps1(见表1),利用引物BeCaps1对基因组DNA进行扩增，所用试剂为KOD FX(TOYOBO,Code No.:KFX-101)；扩增程序为：94℃预变性5分钟；98℃变性10秒，59℃退火30秒，68℃延伸1分钟，循环34次；68℃延伸5分钟；12℃结束程序。将所得扩增PCR产物通过NruI酶切后进行琼脂糖凝胶电泳。

结果(见图7)基因型为显性纯合ZmEAL1ZmEAL1的单株扩增产物酶切后条带大小为“721bp”和“114bp”，基因型为杂合ZmEAL1zmeal1的单株扩增产物酶切后条带大小为“832bp”，“721bp”和“114bp”，基因型为隐性纯合的zmeal1zmeal1单株扩增产物酶切后条带大小为“832bp”，说明用本发明特异引物和NruI酶切可鉴定不同材料间ZmSig2A位点的基因型。

实施例4玉米zmeal1突变基因的功能验证

构建玉米ubiquitin1基因启动子(Pubi)启动ZmSig2A⁺基因过表达的表达载体，转入农杆菌EHA105感受态细胞，通过农杆菌介导法对玉米自交系B104胚性愈伤组织进行遗传转化，通过除草剂筛选和和以Ubi2A(见表1)为引物的PCR鉴定，获得了30个转基因阳性T0植株(见图8)。T0植株自交获得T1代果穗，分别种植OE4、OE11和OE16的自交果穗，按穗行种植，每穗种植两行28株。利用引物Ubi2A对T1代幼苗进行转基因检测，3个株系分别各挑选1株阳性株(用P表示阳性)与阴性株(用N表示阴性)，与突变体eal1杂交获得F1P和F1N果穗，继续按穗行种植，F1N果穗每个穗行选择1株自交获得3个F2果穗，分别编号F2N-1，F2N-2和F2N-3；同时，用引物Ubi2A对3个果穗F1P植株进行转基因鉴定，每个穗行选择1株转基因阳性株自交获得3个F2果穗，分别编号F2P-1，F2P-2和F2P-3。室内温室种植上述F2果穗，对苗期叶色表型进行统计。结果发现来源于阴性植株组配的F2N-1，F2N-2和F2N-3群体，叶色正常株与叶色突变株的比例分别为88:25，101:36和93:27；来源于阳性植株组配的F2P-1，F2P-2和F2P-3群体，叶色正常株与叶色突变株的比例分别为121:8，96:3和119:2。统计分析表明，阴性株组配的F2群体，突变性状符合单基因控制，而阳性株组配的F2群体，突变性状表现为多基因控制。进一步利用引物Ubi2A和BeCaps1对F2P-1，F2P-2和F2P-3三个群体进行了基因型鉴定，发现三个群体中所有表现为叶色正常的ZmSig2A^ΔV/ΔV单株都为转基因植株，所有表现叶色突变的ZmSig2A^ΔV/ΔV单株都为非转基因植株，表明ZmSig2A⁺转基因可以回复ZmSig2A^ΔV/ΔV单株叶色突变表型。

实施例5利用EMS诱变突变体库材料对本发明突变基因的等位性试验

为了进一步证明eal1突变体表型的确是由于ZmSig2A基因突变导致，发明人对来源于玉米EMS诱变突变体库MEMD(http://www.elabcaas.cn/memd/)的ZmSig2A位点突变材料EMS4-110eeb(购自齐鲁师范大学)进行了等位性测定。

首先利用突变体库提供的参考序列设计基因型鉴定引物110eeb(见表1)，对突变位点进行检验，结果发现ZmSig2A基因编码区第五外显子存在一个无义突变(C>T；Arg>StopCodon)，蛋白结构预测表明突变导致蛋白翻译提前终止，产生了结构变异的蛋白质。该材料的突变等位基因用ZmSig2^T表示，野生型WT等位基因用ZmSig2^C表示。将引物110eeb检测到的杂合突变单株EMS-6(基因型为ZmSig2A^C/T)自交，获得EMS-6S1自交群体，群体分离出叶片白化单株(见图9)，其中叶色正常单株数与叶色白化单株数的比例为93:26，符合3:1分离比(χ²＝0.61<χ² _(0.05,1)＝3.84)，说明EMS-6S1群体的叶色突变表型受一对隐性核基因控制。

用杂合单株EMS-6(基因型为ZmSig2A^C/T)的花粉给突变体eal1(基因型为ZmSig2A^ΔV/ΔV)授粉杂交，获得F1果穗；种植F1种子，结果F1群体叶色出现分离(见图10)，叶色正常株数与叶色突变株数比例为101:91，符合单一核基因控制的1:1遗传分离比(χ²＝0.51<χ² _(0.05,1)＝3.84)，这说明EMS-6杂合突变位点与eal1隐性纯合突变位点等位。

以上等位性分析结果说明，eal1突变体的叶色突变表型是由ZmSig2A基因突变导致，本发明发现的突变等位基因ZmSig2A^ΔV就是导致eal1产生突变表型产生的基因。

实施例6利用本发明玉米幼苗黄白叶突变基因zmeal1(ZmSig2A^ΔV)分子内标记开发及利用分子标记辅助eal1突变性状的回交转育试验

本发明创造了一份新的苗期叶色突变体eal1，通过遗传分析、基因定位、转基因验证以及等位性测定确定了一个新的调控叶色变异的等位基因zmeal1(ZmSig2A^ΔV)。根据该基因突变(3bp的缺失)，开发了一套基于PCR产物测序来区分植株基因型的分子标记BeCaps1(见表1)，

正向引物BeCaps1-F：5’-CACTGGTGGATCAAACAAGCAA-3’(SEQ ID No.3)，

反向引物BeCaps1-R：5’-GACTCGATCTGCCGGATTCT-3’(SEQ ID No.4)。

该引物在突变体eal1中的扩增片段为832bp，在其他测试材料中的扩增片段大小为835bp,。

不同材料的PCR扩增产物可用引物5’-GACTCGATCTGCCGGATTCT-3’进行测序，通过测序结果来鉴定材料在ZmSig2A位点的基因型。

以自交系B73为例，利用上述分子标记BeCaps1及基因分型方法，将eal1(基因型为ZmSig2A^ΔV/ΔV)突变性状通过回交转育的方式导入B73(基因型用ZmSig2A^B73/B73表示)。首先将B73与突变体eal1杂交，获得F1(ZmSig2A^B73/ΔV)种子；田间种植F1，继续与B73回交获得BC1F1果穗，回交后代植株含有两种基因型ZmSig2A^B73/ΔV和ZmSig2A^ΔV/ΔV，苗期叶色表型都为正常绿色，理论上一半单株基因型为ZmSig2A^B73/ΔV，用BeCaps1标记对回交后代植株进行基因分析，选择基因型为ZmSig2A^B73/ΔV的单株继续与B73回交获得BC2F1果穗，继续重复上述分子标记筛选以及回交转育共5代。获得含有ZmSig2A^B73/ΔV基因型的BC5F1植株后，自交获得BC5F2，选择BC5F2分离出的具有eal1突变性状的单株自交保种，获得含有幼苗黄白叶基因的B73的自交系。

实施例7利用黄白苗标记对杂交种进行纯度鉴定及田间去杂试验

按照如下方法进行：

以突变体eal1做母本，自交系B104做父本，田间小规模模拟杂交制种过程中去雄不及时、不彻底导致的生物混杂。田间按6米行长、0.6米行宽、每行14穴、每穴2株进行种植，父母本行比为1:4，共种植200行。在母本去雄阶段，每25行保留1株(0.18％)去雄不彻底母本株，收获母本行果穗，混合脱粒。在室内播种收获的2000粒杂交种，出苗共计1774粒，播种后15天观测苗期叶片表型。

结果发现有2株苗期叶片出现黄白苗表型，统计得因去雄不彻底导致的种子混杂率约为0.11％，杂交种子纯度约为99.89％。说明利用本发明幼苗黄白叶性状可用于在苗期鉴定所生产杂交种的纯度；且该性状表型黄白叶明显，容易鉴定，可将假杂种在出苗早期鉴别剔除。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 一种玉米幼苗黄白叶基因及其编码蛋白和应用

<130> 2021S1937IHCY

<141> 2021-02-01

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 538

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 1

Met Ala Cys Leu Ala Pro Gln Phe Lys Trp Ala Pro Ser Ala Ala Ala

1 5 10 15

His Met Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ser Arg Cys Ser Ala

20 25 30

Leu Arg Val His Cys Ala Val Thr Ser Ala Ala Val Val Glu Asp Arg

35 40 45

Thr Asn Gly Ser Ala Ala Gln Leu Arg Leu Ala Tyr Ala Ala Pro Ala

50 55 60

Ile Gln Arg Asn Phe Glu Ala Thr Leu Ala Ser Glu Ala Leu Leu Asn

65 70 75 80

Glu Glu Ala Val Val Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Val Ala Leu Ala

85 90 95

Arg Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gln Glu Val Val Gln Ile Val Gln Arg

100 105 110

Asn Asn His Gln Pro Val Ile Arg Pro Lys Lys Cys Val Asp Asn Tyr

115 120 125

Leu Ala Asn Glu Ile Leu Arg Thr Glu Met Arg Ser Ser Ser Pro Asp

130 135 140

Met Tyr Ala Asn Asn Pro Leu Met Glu Tyr Leu Asp Ser Tyr Gly Ile

145 150 155 160

Met Asp Ala Glu Asp Glu Leu Asp Ala Tyr Ala Gln Tyr Thr Glu Asn

165 170 175

Ile Ala Val Lys Ser Ala Arg Gln Ser Glu Arg Lys Ala Arg Arg Thr

180 185 190

Arg Ala Ala Ile Lys Ala Ser Thr Thr Leu His Ala Ser Gln Lys Val

195 200 205

Ala Leu Ser Ser Lys Lys Lys Arg Ser Lys Gly Ser Ser Ser Ser Met

210 215 220

Asn Pro Leu Gly Ser Leu Trp Lys Met Thr Gly Arg Arg Leu Leu Thr

225 230 235 240

Ala Lys Glu Glu Val Glu Phe Ser Glu Gly Ile Gln Asp Leu Leu Lys

245 250 255

Leu Glu Ala Ile Gln Ala Glu Leu Ile Glu Tyr Asn Gly Gly Gln Pro

260 265 270

Thr Phe Ser Gln Trp Ala Thr Ala Ala Gly Val Asp Glu Lys Thr Leu

275 280 285

Arg Lys Arg Leu Asn Tyr Gly Ile Tyr Cys Lys Asn Arg Met Val Thr

290 295 300

Ser Asn Val Arg Leu Val Ile Ser Ile Ala Arg Glu Phe Glu Gly Pro

305 310 315 320

Gly Met Asp Phe Tyr Asp Leu Ile Gln Glu Gly Met Gln Gly Leu Ile

325 330 335

Arg Gly Ala Glu Lys Phe Asp Ser Ser Lys Gly Phe Arg Phe Ser Thr

340 345 350

Tyr Ser His Trp Trp Ile Lys Gln Ala Met Arg Lys Ser Val Ser Glu

355 360 365

Gln Ser Gln Ile Phe Arg Leu Pro Ala His Met Val Glu Ala Ser Tyr

370 375 380

Arg Val Lys Glu Cys Thr Lys Arg Leu Arg Arg Lys Leu Arg Arg Arg

385 390 395 400

Pro Thr Asn Glu Glu Ile Ala Val Asp Thr Gly Ile Pro Ile Lys Arg

405 410 415

Val Glu Ala Ala Val Asn Leu Pro Lys Tyr Ser Val Ser Leu Asp Ser

420 425 430

Lys Ile Gly Ser Thr Asp Met Thr Tyr Gln Glu Val Thr Ala Asp Pro

435 440 445

Ser Ala Glu Thr Ala Glu Glu Met Leu Asn Arg Met Ser Met Lys Lys

450 455 460

Asp Val His Met Ala Leu Asp Thr Leu Thr Thr Arg Glu Lys Gln Val

465 470 475 480

Val Leu Arg Phe Gly Leu Glu Asp Gly Arg Ile Arg Thr Leu Gln Glu

485 490 495

Ile Gly Asn Ile Met Gly Val Ser Arg Glu Arg Ile Arg Gln Ile Glu

500 505 510

Ser Gly Ala Phe Arg Lys Leu Arg Ser Lys Lys Lys Val Lys Ala Leu

515 520 525

Lys Asp Tyr Leu Val Pro Val Gly Asn Trp

530 535

<210> 2

<211> 1614

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 2

atggcgtgcc tggcgccgca gttcaagtgg gcgccgtcgg ccgccgccca catgccttcc 60

tcgtcctcgt cctcgtccta ctccaggtgc tccgcgctcc gcgtccactg cgccgtcacc 120

tccgccgctg tcgtcgagga ccgcaccaac ggcagcgcgg cgcagctgag gctcgcttac 180

gcggctccgg cgattcagag aaactttgag gcaactctgg catcagaagc acttctaaat 240

gaagaggcgg tagtagcagc ggcagccgca gaggctgttg ctcttgccag agcagctgcc 300

gaagctgccc aagaagttgt tcagatagta caaagaaaca accatcagcc ggtaattaga 360

ccaaaaaagt gtgtggacaa ctacttggca aatgaaatcc ttcgcacaga gatgcgatcg 420

agcagtcctg acatgtatgc taataatcct ttgatggagt atctggactc ttatggtatc 480

atggatgctg aagatgaatt agatgcttat gcacagtata ctgagaacat agctgtgaaa 540

tctgctcgtc aatctgagag aaaagctagg agaactagag cagcaataaa agctagcaca 600

accctccatg cttcacaaaa ggttgcatta tcctcaaaga agaagcggtc caagggttcc 660

tcgtctagta tgaatccttt aggttcgttg tggaagatga ccggtaggag acttcttaca 720

gccaaggaag aggttgaatt ctcagaaggt attcaggatc ttttgaagct tgaggcgatc 780

caagctgagc ttatagagta caatggcggt cagccaacct tctcgcagtg ggcaacagca 840

gctggagttg atgagaaaac tttgcgcaag cgcttgaatt atggtattta ttgcaagaac 900

agaatggtaa catctaatgt gagacttgta atctctattg ccagagagtt tgaaggccct 960

ggaatggact tttatgatct tattcaggaa ggaatgcagg gccttataag gggagctgaa 1020

aaatttgatt catcaaaagg ttttaggttc tctacgtatt ctcactggtg gatcaaacaa 1080

gcaatgcgta aatctgtctc agagcaatcc caaatatttc gcttgcctgc tcacatggtt 1140

gaagcaagct accgtgtaaa ggagtgtaca aaacgacttc gccgtaagct tagaagacga 1200

cccaccaatg aagaaattgc agtggacact ggtattccaa ttaaacgagt tgaggcagca 1260

gtaaacctcc caaaatatag tgtgtccctt gatagcaaaa ttggttccac cgacatgaca 1320

tatcaggagg tcacagctga tcccagtgct gagacagctg aagagatgct caacagaatg 1380

tccatgaaga aggacgtaca catggcacta gatactctca ccactcgcga gaagcaagtt 1440

gttctgaggt ttgggctcga ggatggtcgg ataagaaccc tgcaggagat cggtaacatc 1500

atgggtgtga gcagggagag aatccggcag atcgagtctg gcgcgttccg gaaactaagg 1560

agcaagaaga aggtgaaggc tttgaaggat tatctggtgc cagtaggcaa ttgg 1614

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 3

cactggtgga tcaaacaagc aa 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Zea mays

<400> 4

gactcgatct gccggattct 20

Claims

1.一种玉米幼苗黄白叶蛋白，其特征在于所述的蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2.编码权利要求1所述黄白叶蛋白的基因，其特征在于所述的基因是如下的DNA分子之一：

(1)由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的DNA分子；

3.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在培育具有幼苗黄白叶特性的植物上的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的植物是指玉米、水稻等。

5.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在玉米杂交种子纯度鉴定或去杂保纯上的应用。

6.权利要求1所述的蛋白或权利要求2所述的基因在玉米杂交诱导单倍体育种中的应用。

7.权利要求2所述基因作为标记性状在SPT或MCS种子生产技术上的应用。

8.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达盒、转基因植物细胞系、转基因植物组织或转基因植物。

9.利用权利要求2所述基因培育具有幼苗黄白叶特性的玉米品种的方法，其特征在于包括通过转基因方法将权利要求2所述基因转到玉米品种中。

10.利用权利要求2所述基因鉴定和筛选杂交诱导单倍体的方法，其特征在于包括以含有权利要求2所述黄白叶基因的材料为母本，以幼苗为正常绿色的单倍体诱导系为父本杂交，种植所得种子，出土后观测幼苗叶片颜色；表现为黄白叶的，即为单倍体植株，予以保留；表现为正常绿色的，为杂交种，予以拔除。

11.权利要求2所述基因的分子标记，其特征在于其用于扩增该分子标记的引物为：

BeCaps1-F：5’-CACTGGTGGATCAAACAAGCAA-3’(SEQ ID No.3)，

BeCaps1-R：5’-GACTCGATCTGCCGGATTCT-3’(SEQ ID No.4)。