CN112625099A - 油菜矮杆基因bnd2及其在油菜杂交育种中的应用 - Google Patents

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CN112625099A CN202011017803.XA CN202011017803A CN112625099A CN 112625099 A CN112625099 A CN 112625099A CN 202011017803 A CN202011017803 A CN 202011017803A CN 112625099 A CN112625099 A CN 112625099A
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Abstract

本发明属于植物基因工程领域，公布了一个油菜矮杆基因BND2的克隆及其在油菜杂交育种中的应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No:1，或SEQ ID No:2所示，编码如SEQ ID No:3所示氨基酸序列。bnd2/bnd2纯合自交种可以使油菜矮化，产量减少，BND2/bnd2杂交种的株高不增加，但产量增加。因此，BND2对控制油菜杂交种株高和创制抗倒伏杂交品种具有重要的利用价值。

Description

油菜矮杆基因BND2及其在油菜杂交育种中的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及油菜矮杆基因BND2及其在杂交育种中的应用。
背景技术
我国人均年消费食用油量达到20多公斤。然而，我国食用油的自给率不足35％，为了满足消费需求，2014年我国进口油籽7000多万吨。油菜是国产植物油的第一大来源，占55％，在国家食用油供给安全战略中居核心地位。此外，随着我国农业机械化进程和世界范围内车辆柴油化趋势的加快，未来柴油的供需矛盾将更加突出。分析证明，生物柴油是矿物柴油的良好替代品，而油菜作为我国值得推广的生物柴油作物，不与主要粮食作物争地，具有非常好的发展潜力。由于我国可用耕地面积日益减少，大幅度地扩大播种面积的潜力非常有限。所以，培育出高产或高产油量的油菜品种，降低其生产成本，是油菜生产最为关键的问题之一。
对耕地极为有限的我国，为了提高油菜单位面积产量，育种家们通常利用杂交优势育种等常规育种方法，培育高产油菜品种。随着杂种优势的利用，油菜株高至少增加了20cm，品种的抗倒性变得越来越重要。倒伏的油菜不仅产量比正常油菜低10％-30％(严重的可达60％以上)，而且品质差，含油量亦比正常油菜低10％-30％。另外，倒伏也使油菜的机械化收获无法正常进行。因此，倒伏问题已经成为制约油菜产量提高和机械化生产的重要因素。
在油菜中导入矮秆基因会引起油菜产量或品质的下降，这也是限制矮秆基因在油菜育种中广泛利用的主要原因。Muangprom等通过远缘杂交和胚挽救的方法将dwf2突变体与甘蓝人工合成了甘蓝型油菜，利用多代回交的方法导入到杂交组合的亲本中(Muangprom,A.,Mauriera,I.,Osborn,T.C.(2006)Transfer of a dwarf gene fromBrassica rapa to oilseed B.napus,effects on agronomic traits,and developmentof a‘perfect’marker for selection.Mol Breed,17:101–110)。相应的自交种和杂交种用于田间试验，结果显示杂交种和自交种的株高降低，抗倒伏增强。然而包含dwf2自交种的产量低于自交种对照。Fossit等利用回交的方法将Bzh转育到其它的甘蓝型油菜品种中，植株的抗倒伏性增强(Foisset,N.,Delourme,R.,Barret,P.,Renard,M.(1995)Moleculartagging of the dwarf BREIZH(Bzh)gene in Brassica napus.Theor Appl Genet,91:756-761)。Miersch等利用Bzh基因已经育成抗倒伏甘蓝型油菜品种，但是油菜产量降低(Miersch,S.,Gertz,A.,Breuer,F.,Schierholt,A.,Becke,r H.C.(2016)Influence ofthe semi-dwarf growth type on nitrogen use efficiency in winter oilseedrape.Crop Science,56:2952-2961.)。因此，打破遗传的负相关性以及发现和创造更多的表现优异的矮源，对于提高油菜的产量和实现油菜生产机械化管理有着重大的意义。
发明内容
本发明提供一种油菜矮杆基因BND2，该基因从油菜幼苗期开始调控油菜株高的发生，具体表现为使油菜幼苗下胚轴变短，株高变矮。该基因的油菜杂交种株高不增加，产量增加，对于油菜杂交种株高的调控具有重要的理论和实际意义，可为改良杂交种提供一条快速、有效的途径，本发明在农业领域具有广阔的应用前景。
本发明所提供的油菜矮杆基因，名称为BND2，来源于油菜(Brassica napus L.)，是具有下述DNA序列的基因：
1)序列表中SEQ ID No：1所示的DNA序列；
2)序列表中的SEQ ID No：1所示序列为BND2的基因组序列，包含了2220个碱基，该基因含有7个外显子(序列1的5’端起：1-102，241-450，567-714，795-835，932-1042，1240-1848，2074-2220)和6个内含子(序列1的5’端起：103-240，451-566，715-794，836-931，1043-1239，1849-2073)。第5个内含子中有一个碱基C突变为T(第1172位点)。
上述油菜矮杆基因基因BND2的编码序列SEQ ID No：2所示，编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。
同时，本发明还提供含有矮杆基因BND2的表达载体，细胞系或宿主菌。
所述表达载体是双元农杆菌载体，或可用于植物基因枪轰击的载体。
本发明还提供所述油菜矮杆基因BND2在培育油菜杂交种中的应用：是所述基因的油菜矮杆突变体中的BND2所述基因通过杂交导入具有期望性状的油菜新的品种中，获得株高矮化的油菜品种；或者是通过基因编辑的方法将油菜中所述BND2基因进行定点突变编辑，以获得株高矮化的植物油菜品种；或者通过基因导入的方法而将所述基因导入到油菜品种中，以获得株高矮化的油菜品种。
所述的应用，所述油菜优选为甘蓝型油菜。
所述的应用，将所述基因导入油菜中是通过含有所述基因的植物表达载体导入外植体，优选地用于构建所述植物表达载体的出发载体为双元农杆菌载体，或可用于植物基因枪轰击的载体。
所述的应用，所述植物表达载体为基因编辑载体。
所述的应用，将含有所述基因的油菜品种作为父本，与具有期望农艺的油菜品种进行杂交，使用后者的株高矮化，获得株高矮化的油菜品种。
本发明还提供两种调控杂交油菜株高的方法：(1)是通过与含有矮杆基因BND2的突变体材料杂交，将所述矮杆基因BND2导入到杂交组合的亲本中，使油菜杂交种株高获得调控。(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BND2基因进行定点编辑。
本发明具有以下有益效果：
常规的油菜品种植株较高，并且随着甘蓝型油菜杂交品种的广泛推广，油菜株高平均增加了20cm以上。高杆油菜倒伏后会对油菜的生长发育影响很大，导致减产15％-30％，严重可达到60％以上。油菜倒伏问题已经成为制约油菜机械化生产和产量提高的重要因素。本发明提供了一个油菜矮杆基因BND2，该基因从油菜幼苗期开始调控油菜株高的发生，具体表现为使油菜幼苗及成年植株矮化，并且在油菜杂交种中可以使株高不增加，且不影响产量，为培育抗倒伏油菜杂交种提供了一条很好的途径，在农业领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1矮秆突变体bnd2的BSA测序初步定位结果，其中A为G’值在各染色体上的分布；B为△(SNP-index)值在各染色体上的分布；C为BND2的候选区间。
图2具有多态性InDel标记的琼脂糖胶检测结果。其中：P1：矮秆突变体亲本bnd2；P2：高秆亲本L329。
图3多态性标记ID1576、SNP1540、SNP1552、SNP1553、SNP1557。其中：P1：矮秆突变体亲本bnd2；P2：高秆亲本L329。
图4多态性标记ID1656检测F2:3群体的部分结果，其中A为ID1656在两亲本间的多态性以及F2:3群体部分矮秆家系的扩增情况；B为ID1656在两亲本间的多态性以及F2:3群体部分高秆家系的扩增情况；C为D1656在两亲本间的多态性以及F2:3群体部分矮秆家系与杂合家系的扩增情况。其中：M：DNA Marker；P1：矮秆突变体bnd2；P2：高秆亲本L329。红色箭头指示交换单株。
图5候选基因BND2的精细定位过程，其中A为BND2初步定位在ID1530和ID1656两个标记之间，数值代表交换株数目；B为BND2精细定位在SNP1562和ID1576两个标记之间，区间大小为140Kb；C为BND2在A08染色体上的物理位置，数值代表物理距离，区间内含有27个基因；标红的BnaA08g20960D为矮杆候选基因BND2；D为bnd2突变体中BnaA08g20960D基因的第5个内含子中有一个碱基突变。外显子和内含子分别用黑色框和黑色线表示。
图6矮秆突变体bnd2的表型与农艺性状，其中A-E为幼苗期bnd2表型；F-G为盛花期bnd2表型；H-J为成熟期bnd2表型与相关农艺性状；K-N为bnd2的产量相关农艺性状。其中：PH：株高；FBH：有效分枝高度；MIL：主花序长度；IL：节间距离；IN：伸长节数；SPP：单株有效角果数；SPS：每角粒数；TSW：千粒重；YPP：单株产量。*：0.01<P<0.05，具有显著性差异，**：P<0.01，具有极显著性差异，***：P<0.001。标尺＝20cm(A,F,I,J)；标尺＝5cm(C-D)
图7诱变亲本2B和突变体bnd2节间组织的石蜡切片以及薄壁细胞大小，其中A为2B与bnd2节间组织纵切；B为2B与bnd2节间组织横切；C-D为2B与bnd2的纵切薄壁细胞长度(C)和面积大小(D)；E-F.2B与bnd2的横切薄壁细胞长度(E)和面积大小(F)。*代表0.01<P<0.05，具有显著性差异，**代表P<0.01，具有极显著性差异，***代表P<0.001。标尺＝10μm
图8杂交种中bnd2对株高和籽粒产量的影响分析，其中A为成熟期bnd2、L329及其杂交F1代植株；B为株高；C为单株产量。标尺＝20cm
具体实施方式：
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述实施例中提到的实验方法如无特别说明均为常规方法。
实施例一
1.BND2基因的克隆
以油菜矮杆突变体bnd2为材料，首先构建bnd2与另一商业品种L329(湘油15号)的F2:3群体，将两亲本(bnd2与L329)以及F2:3代高秆混池(HB)、矮秆混池(SB)送公司进行BSA测序。通过分析SNP(single nucleotide polymorphism)/InDel(insertions/deletions)位点，将突变基因初步定位于A08染色体上13.77Mb-18.08Mb区间内(图1)，区间大小为4.317Mb
(表1)。
表1候选区间信息统计表
Figure BDA0002699662810000051
注：Chr：候选区间所在染色体；Start：候选区间的开始位置；End：候选区间的结束位置；Length：候选区间的长度；No.variants：候选区间内的变异总数；No.genes(transcripts)：候选区间内的基因(转录本)总数；No.genes(transcripts)with LEVs：候选区间内包含大效变异的基因(转录本)数(LEVs：large effect variants，导致蛋白质序列发生改变的变异)。
根据BSA测序结果与目标基因候选区间所包含的SNP与InDel在染色体上的位置(13.77Mb-18.08Mb)，每隔50-100kb左右选取片段差异大于10bp的InDel标记设计引物，利用亲本bnd2与L329进行InDel标记的多态性筛选，首先筛选出6对在两亲本间具有多态性的标记，分别为：ID1421，ID1470，ID1482，ID1530，ID1656，ID1667(图2，表2)。
表2筛选到的标记引物序列
Figure BDA0002699662810000052
为了进一步对候选区间进行加密，在已有标记的基础上，根据染色体位置与参考基因组序列分别设计1对InDel标记ID1576与4对SNP标记：SNP1540、SNP1552、SNP1553、SNP1557(图3，表2)。其中标记ID1576为“有”、“无”型标记。
为了筛选候选基因，将矮秆突变体bnd2与高秆材料L329杂交的F2:3群体中的157个家系按株高及叶片表型分类为纯合矮秆家系、纯合高秆家系、杂合家系，并对这三种家系进行混合取材，纯合家系混合剪取三株幼嫩叶片，杂合家系混取两株高秆与两株矮秆幼嫩叶片，置于2ml圆底离心管中，并记录编号，一共有107个纯矮家系，25个纯高家系与25个杂合家系，提取油菜基因组DNA，并利用1％琼脂糖凝胶电泳与超微量分光光度计(NanoDropOne)检测DNA质量。
首先根据染色体位置，利用筛选得到的在两亲本间具有多态性的InDel标记ID1421，ID1470，ID1482，ID1530，ID1656，ID1667对157个F2:3样品进行PCR扩增，将PCR产物经3％琼脂糖凝胶电泳跑胶并记录带型(图4)，从而进行基因型的分析。结合表型与基因型的共分离情况证实了所筛选的InDel标记与目标基因BND2连锁。根据重组理论与交换单株数目，初步利用标记ID1530、ID1656将候选区间从4.317Mb缩小到1.255Mb，在A08染色体上的物理位置为15.30Mb与16.56Mb之间(图5A)。
为了进一步将候选区间缩小，在15.76Mb处筛选到1对新的具有多态性的InDel标记，对区间内的交换单株进行基因型鉴定，序列由ID1656移到ID1576(图5B)。由于在ID1530与ID1576之间新开发的InDel标记都没有检测到多态性，因此转为开发变异位点较多、分布密度比较高的SNP标记，对两亲本进行PCR扩增、PCR产物送至湖南擎科生物公司进行测序之后，比对测序结果，鉴定到5对具有多态性的标记SNP1540、SNP1552、SNP1553、SNP1557和SNP1562(表2)。通过交换单株的表型与基因型鉴定，将目的基因BND2定位在标记SNP1562与ID1576之间。BND2候选区间在A08染色体上的物理位置为15.62Mb与15.76Mb之间，区间大小为140.0Kb(图5B)。
参考“Darmor-bzh”基因组序列，在15.62Mb-15.76Mb候选区间内有27个候选基因(图5C)。其中14个基因的功能未知(表3)。通过分析SNP位点，发现BnaA08g20960D基因上有一个SNP位点。第5个内含子存在一个碱基突变，C突变为T(图5D)。BnaA08g20960D基因编码肌醇-戊基磷酸2-激酶(Inositol 1,3,4,5,6-Pentapentaphosphate 2kinase,IPK)家族蛋白。在同科植物拟南芥中的同源基因AtIPK1具有调控植物生长的功能。atipk1突变体植株矮小，生长受到抑制。因此，推测矮杆基因BND2为BnaA08g20960D。
2.BND2基因的分子特征
通过比较甘蓝型油菜的BND2的cDNA及其基因组DNA序列，发现BND2该基因含有7个外显子(序列1的5’端起：1-102，241-450，567-714，795-835，932-1042，1240-1848，2074-2220)和6个内含子(序列1的5’端起：103-240，451-566，715-794，836-931，1043-1239，1849-2073)；其基因组全长为2220bp(SEQ ID No:1)，cDNA全长为1368bp(SEQ ID No:2)，其开放阅读框架为SEQ ID No:2自5’端第1至1368位点共有1368个碱基；该基因编码蛋白长度为455个氨基酸(SEQ ID No:3)(图5D)。
表3候选基因及功能注释
Figure BDA0002699662810000071
3.BND2基因的功能
3.1矮秆突变体bnd2的表型与农艺性状分析
为了鉴定矮秆突变体bnd2的矮化调控机理，将该突变体与诱变亲本2B种在大田，发现突变体与2B相比在幼苗期时下胚轴缩短，株型紧缩，叶片变短(图6A-E)；盛花期时植株依然矮小，且开花期相比2B显著延长(图6F-G)；成熟期时2B株高为168.2±7.61cm，bnd2株高为100.65±8.09cm，仅为诱变亲本的59.8％(图6H-J，表4)。
表4矮秆突变体bnd2的农艺性状统计
Figure BDA0002699662810000081
Figure BDA0002699662810000082
注：
Figure BDA0002699662810000083
平均值；s：标准偏差；n＝10；*：0.01<P<0.05，具有显著性差异，**：P<0.01，具有极显著性差异，***：P<0.001。
为了探究引起株高矮化的原因，对株高构成的一些农艺性状进行了统计分析。我们发现，bnd2的有效分枝高度为24.95±3.17cm，相比2B(60.81±9.68cm)降低了36cm左右，此外，主花序长度、节间距离以及伸长节数相比诱变亲本2B都显著降低或减少，因此我们推测，bnd2的矮化表型可能与其有效分枝高度、主花序长度和节间距离降低、伸长节数减少有关(图6H-J，表4)。
统计与产量相关的一些农艺性状，发现突变体的单株有效角果数与诱变亲本2B相比没有很大差别(图6K，表4)，但是每角粒数显著低于2B(图6L，表4)，且千粒重与单株产量显著低于2B(图6M-N，表4)。因此，矮杆基因BND2不仅调控株高，同时影响油菜产量相关农艺性状。
3.2 bnd2突变导致茎秆节间薄壁细胞缩短
上述农艺性状统计结果表明bnd2突变体株高矮化可能与节间距缩短有关。为了探究节间距缩短的原因，我们对诱变亲本2B与bnd2突变体的茎秆节间组织的横切面与纵切面进行石蜡切片观察。结果显示，诱变亲本2B的薄壁细胞无论是横切面还是纵切面都排列较为整齐规则，呈方形，大小基本一致；而突变体bnd2薄壁细胞排列紧密，形状不规则，大小不一(图7A-B)，横切面与纵切面的细胞面积与长度都显著减小(图7C-F)。因此，推测bnd2突变导致节间缩短主要是由于薄壁细胞长度缩短、面积减小所致。这些结果表明，矮杆基因BND2在细胞伸长生长中具有重要调控作用。
3.3矮杆基因bnd2在油菜杂交育种中的应用
由于bnd2突变体虽然株高矮，但自交产量低，不能直接应用于油菜育种。为了评价其在杂交育种中的应用价值，我们将bnd2(bnd2/bnd2)与油菜商业品种L329(“湘油15号”)(BND2/BND2)杂交，获得杂交F1代(BND2/bnd2)。F1代的株高与L329相似(图8A-B，表5)。然而，杂交F1代单株产量比双亲bnd2和L329分别高3倍和32.7％(图8C，表5)。这说明在株高方面BND2对bnd2具有半显性效应，使杂交种的株高得到控制。在产量方面，由于bnd2的效应被其他产量相关的主要基因所掩盖，因而仍然在两亲本之间产生杂种优势，表现出高产，表明在杂交种中引入bnd2可以产生不增加株高但增加籽粒产量的效果。因此，bnd2在培育抗倒伏且高产的杂交种中具有潜在的应用价值。
表5 bnd2、L329及其杂交F1代的农艺性状分析
Figure BDA0002699662810000091
注：a,b,c代表显著性差异。
实施例二
利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对BND2基因进行定点编辑。下述实施方案中提到的实验方法如无特别说明均为常规方法。
1.靶标序列设计
在BND2的gDNA序列1172位点附近先找到CCT位点，取CCT前20bp的残基作为靶序列，标记为Target。
2.CRISPR/Cas9基因编辑载体构建
以pYAO:hSpCas9质粒为模板，利用pYAO-F和NOS-R引物扩增出pYAO:hSpCas9片段。使用In-fusion克隆的方法将pYAO:hSpCas9片段连接到pCambia-bar载体的酶切位点EcoRI与Hind III之间，并额外引入了多克隆位点以便下一步U6表达盒的连接，最终形成了pYAO:hSpCas9-bar载体。以拟南芥DNA为模板，利用AtU6-26-F与AtU6-26-R.引物扩增出拟南芥ATU6-26启动子片段。以pU3-gRNA质粒为模板，利用target-F(包含能靶向BND2靶标序列Target)与scaffold-R引物扩增出target-sgRNA片段。以ATU6-26启动子片段和target-sgRNA片段为模板，利用AtU6-26-F与scaffold-R引物通过搭桥PCR扩增出AtU6-26:target-sgRNA表达盒片段。使用In-fusion克隆的方法将AtU6-26:target-sgRNA片段连接到pYAO:hSpCas9-bar载体的酶切位点SpeI与MluI之间，最终构建出用于基因敲除的CRISPR载体。
3.油菜转化
将上述构建好的CRISPR/Cas9重组载体通过电击转化转入农杆菌(Agrobacterium)株系AGL0中。然后用含有重组质粒的农杆菌侵染甘蓝型油菜品种(Zhou,Y.,Wang,H.,Gilmer,S.,Whitwill,S.,Keller,W.and Fowke,L.C.(2002)Control ofpetal and pollen development by the plant cyclindependent kinase inhibitorICK1 in transgenic Brassica plants.Planta,215,248–257.)，通过除草剂Basta抗性筛选，获得T1代转基因油菜株系。
4.基因编辑突变体的分子鉴定
对转基因株系中的靶序列进行PCR扩增和测序分析，鉴定BND2在转基因油菜中是否得到编辑，筛选出基因编辑突变体。
5.油菜株高鉴定
对确认BND2在转基因油菜中得到编辑的植株，培育成熟后，统计其株高(并与对照进行比较)，保留达到预期株高的植株，收集其种子，作为后续培育株高矮化的油菜品种。
<110>湖南大学；湖南大学深圳研究院
<120>油菜矮杆基因BND2及其在杂交育种中的应用
<160> 3
<210> 1
<211>2220
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<400> 1
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<210> 3
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<400> 3
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Claims (10)

1.油菜矮杆基因编码蛋白，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：
1）序列表中的SEQ ID No:3；
2）将序列表中SEQ ID No:3的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和／或添加且与油菜矮杆相关的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的油菜矮杆蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因具有下述核苷酸序列之一：
1）序列表中SEQ ID No:1，或SEQ ID No:2所示的核苷酸序列；
2）编码序列表中SEQ ID No:3蛋白质序列的多核苷酸。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达载体，细胞系或宿主菌。
5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于其是双元农杆菌载体，或可用于植物基因枪轰击的载体。
6.如权利要求2或3所述基因在培育油菜杂交种中的应用，其特征在于：是将权利要求2或3所述基因的油菜矮杆突变体中的所述基因通过杂交导入具有期望性状的油菜品种中，获得株高矮化的油菜品种；或者是通过基因编辑的方法将油菜中所述BND2基因进行定点突变，以获得株高矮化的油菜品种；或者通过基因导入的方法而将如权利要求2或3所述基因导入到油菜品种中，以获得株高矮化的油菜品种。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述油菜为甘蓝型油菜。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：将所述基因导入油菜中是通过含有所述基因的植物表达载体导入外植体，优选地用于构建所述植物表达载体的出发载体为双元农杆菌载体，或可用于植物基因枪轰击的载体。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物表达载体为基因编辑载体。
10.如权利要求6所述的应用，其特征在于：将含有权利要求2或3所述基因的油菜品种作为父本，与具有期望农艺性状的油菜品种进行杂交，使用后者的株高矮化，获得株高矮化的油菜品种。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114831021A (zh) * 2022-06-14 2022-08-02 江苏省农业科学院 一种适用于微型盆景的观赏油菜品种培育方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105475118A (zh) * 2015-12-01 2016-04-13 贵州省油菜研究所 新型隐性矮杆油菜的选育方法及应用
CN106613927A (zh) * 2016-12-31 2017-05-10 湖南大学 一种甘蓝型油菜矮杆材料在油菜育种中的应用
CN108239647A (zh) * 2017-11-29 2018-07-03 华中农业大学 一种控制油菜株型的基因、分子标记及应用
CN110578015A (zh) * 2019-10-14 2019-12-17 江苏省农业科学院 甘蓝型油菜高矮性状紧密连锁的snp标记及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105475118A (zh) * 2015-12-01 2016-04-13 贵州省油菜研究所 新型隐性矮杆油菜的选育方法及应用
CN106613927A (zh) * 2016-12-31 2017-05-10 湖南大学 一种甘蓝型油菜矮杆材料在油菜育种中的应用
CN108239647A (zh) * 2017-11-29 2018-07-03 华中农业大学 一种控制油菜株型的基因、分子标记及应用
CN110578015A (zh) * 2019-10-14 2019-12-17 江苏省农业科学院 甘蓝型油菜高矮性状紧密连锁的snp标记及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GENBANK: "Arabidopsis thaliana inositol-pentakisphosphate 2-kinase 1 (IPK1), mRNA", 《GENBANK DATABASE》 *
GENBANK: "Brassica napus genomic scaffold, scaffold_712, whole genome shotgun sequence", 《GENBANK DATABASE》 *
李昕等: "甘蓝型油菜 EMS 诱变矮秆突变体分析", 《生命科学研究》 *
李江华等: "《烟酰胺N-甲基转移酶（NNMT）基因多态性与心脑血管病关系的代谢组学研究》", 31 August 2017, 科学技术文献出版社 *
袁隆平等: "《耐盐碱水稻育种技术》", 30 September 2019, 山东科学技术出版社 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114831021A (zh) * 2022-06-14 2022-08-02 江苏省农业科学院 一种适用于微型盆景的观赏油菜品种培育方法
CN114831021B (zh) * 2022-06-14 2022-12-20 江苏省农业科学院 一种适用于微型盆景的观赏油菜品种培育方法

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