CN113429468B

CN113429468B - 大麦雄性不育基因msg3002及其应用

Info

Publication number: CN113429468B
Application number: CN202110074077.3A
Authority: CN
Inventors: 倪飞; 付道林; 王晓; 孙梦; 吴佳洁
Original assignee: Shandong Agricultural University
Current assignee: Shandong Agricultural University
Priority date: 2020-03-05
Filing date: 2021-01-20
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2041-01-20
Also published as: CN113429468A

Abstract

本发明公开了一种大麦雄性不育基因msg3002及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明通过选择大麦雄性不育突变体材料GSHO 3002作为母本，构建图位克隆的作图群体，筛选包含2080个F₂单株的分离群体，将msg3002基因定位在一个0.2cM的遗传区间，完成了精细遗传图谱的构建。在参考大麦物理图谱和小麦共线性物理图谱的基础上，结合RNA‑Seq数据，鉴定得到大麦雄性不育基因msg3002。本发明发现的大麦雄性不育基因msg3002可在植物杂种优势利用和杂交种制种生产中发挥重要作用。

Description

大麦雄性不育基因msg3002及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种大麦雄性不育基因msg3002及其应用。

背景技术

大麦是我国第四大粮食作物，主要用作饲料、粮食和啤酒原料，在国民经济中占有重要地位。随着人口的持续增加和生活水平的不断提高，我国的粮食需求呈刚性增长。粮食产量与作物杂交种的生产和应用密切相关。在四大粮食作物中，玉米杂交种在超高产进程中发挥重要作用，使其产量自2012年开始跃居我国第一位(中国统计年鉴，2017)；杂交水稻的广泛应用促使我国水稻产量增幅超过20％，其种植面积达到水稻总种植面积的50％以上(Yuan,2015)。然而，麦类作物杂交种尚未获得大规模的生产和利用。小麦和大麦都是严格地自花授粉作物，雄性不育性状的保持和恢复是杂交种生产的关键，发掘和鉴定优良雄性不育基因是杂交种生产的前提。因此，利用正向遗传学的方法分离大麦雄性不育基因对大麦和小麦等植物杂交制种有重要意义。

植物雄性不育(male sterility)是指雄蕊发育不正常，不能产生正常的花药、花粉或雄配子，但雌蕊发育正常，可以接受外来花粉而受精结实的现象。主要包括细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility,CMS)和细胞核雄性不育(genic male sterility,GMS)。植物雄性不育是开发杂种优势的重要工具，在作物杂交育种上应用广泛，相关的杂交制种技术分为“三系法”(three-line system)和“两系法”(two-line system)(Chen etal.,2014)。基于CMS的杂交制种技术称为“三系法”，即需要三个育种品系：CMS不育系、不育保持系和不育恢复系。与CMS相比，大多数GMS还没有用于杂交制种，主要困难在于无法有效实现GMS不育基因的保持和恢复。最近几年，以隐性雄性不育基因为基础并结合基因工程手段创制的第三代杂交技术在水稻和小麦中逐渐成熟(Chang et al.,2016；Wang et al.,2017)。该技术的前提是获得败育彻底的雄性不育基因，其优势是可以获得100％不育的隐性核不育群体，进而获得不含转基因成分的杂种F₁，是一种稳定高效、不育系和保持系集一体的新型不育杂交育种体系。不管是“三系法”、“两系法”，还是基于基因工程的第三代杂交技术，发掘和鉴定败育彻底的雄性不育基因是植物杂种优势利用的前提。

发明内容

针对上述现有技术，本发明选择大麦雄性不育突变体材料GSHO 3002作为母本，构建图位克隆的作图群体，筛选包含2,080个F₂个体的分离群体(超过4,000个交换型配子)，将该msg3002定位在一个0.2cM的遗传区间，完成了精细遗传图谱的构建。在参考大麦物理图谱和小麦共线性物理图谱的基础上，结合RNA-Seq数据，鉴定得到大麦雄性不育基因msg3002。该基因的功能缺失会造成大麦的雄性不育，由此可以产生新的雄性不育材料，在科研和农业生产中具有重要的应用价值。

本发明的第一方面，提供一种大麦雄性不育基因msg3002，所述基因msg3002为：

i)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；或

iii)与i)或ii)的核苷酸序列具有90％或90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供基因msg3002在调控植物花粉发育中的应用；所述基因msg3002为如下a)-d)中任一项所述的DNA片段；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

c)除b)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA片段；

d)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有90％或90％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.3所示的蛋白等价。

基因msg3002作为大麦雄性不育基因，该基因突变后会导致大麦雄蕊的花药中无花粉粒产生，导致雄性不育，自交不结实，但雌蕊发育正常。因此，基因msg3002可以调控植物花粉发育。

本发明的第三方面，提供携带上述基因msg3002的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在调控植物花粉发育中的应用。

本发明的第四方面，提供如下1)-3)中任一项所述的蛋白在调控植物花粉发育中的应用；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.3所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在SEQ ID NO.3所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。

本发明的第五方面，提供基因msg3002在创制植物雄性不育株系中的应用；所述基因msg3002为如下a)-d)中任一项所述的DNA片段；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

c)除b)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA片段；

d)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有90％或90％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.2所示的蛋白等价。

本发明的第六方面，提供基因msg3002在植物杂交育种或制种中的应用；所述基因msg3002为如下a)-d)中任一项所述的DNA片段；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

c)除b)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA片段；

本发明的第七方面，提供一种创制植物雄性不育株系的方法，包括在含有如下a)-d)任一项所述的多核苷酸的植物中使所述多核苷酸表达降低或不表达的步骤；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

c)除b)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA片段；

d)DNA片段，与a)或b)限定的DNA片段具有90％或90％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.3所示的蛋白等价；

或者，包括在含有由如下1)-2)中任一项所述的蛋白的植物中使所述蛋白质活性降低或丧失的步骤；

1)氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的蛋白；

2)将SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与SEQ ID NO.3所示的蛋白具有相同功能的蛋白。

优选的，使所述多核苷酸表达降低或不表达的方法包括：突变或敲除所述多核苷酸的全部或部分序列；或者构建干涉载体干扰所述多核苷酸的表达；或者使用基因沉默系统使所述多核苷酸的表达沉默。

本发明的第八方面，提供一种恢复植物雄性不育株系的花粉育性的方法，包括如下步骤：将外源基因Msg3002转入植物雄性不育株系，使得突变体恢复野生型表型。

所述外源基因Msg3002为如下a)-d)中任一项所述的DNA片段；

a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b)SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

c)除b)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA片段；

上述应用或方法中，所提及的“植物”可以为在利用该基因msg3002后表现雄性不育的所有物种。所述植物包括：自身携带基因msg3002的植物；和/或通过外源转入基因msg3002或基因msg3002突变体的植物。

优选的，所述植物具体包括但不限于：大麦、小麦、水稻和短柄草等。

本发明的有益效果：

本发明首次从大麦雄性不育突变体材料GSHO 3002中利用正向遗传学的方法分离得到大麦雄性不育基因msg3002，并通过基因表达模式检测和单倍型分析，证明了msg3002发生突变后，能够导致大麦出现雄性不育的表型。本发明发现的大麦雄性不育基因msg3002在植物的杂种优势利用和杂交种制种生产中都将具有重要作用。

附图说明

图1：大麦野生型材料Morex和雄性不育突变体GSHO 3002的花药。

图2：msg3002精细遗传图谱的构建和候选基因的鉴定；图中，A.大麦1HL染色体物理图谱；B.msg3002定位于侧翼标记SP5M12和SP5M8之间；C.msg3002定位于侧翼标记SP5M21和SP5M23之间大约0.2cM的遗传区间；D.关键区域包含4个候选基因。

图3：msg3002关键区域的共线性分析；图中，A.大麦1HL关键区域物理图谱(562.5Kb)；B.中国春1AL共线性区域物理图谱(1.22Mb)；C.中国春1BL共线性区域物理图谱(1.17Mb)；D.中国春1DL共线性区域物理图谱(505.6Kb)。

图4：msg3002候选基因的鉴定和单倍型分析；结合RNA-Seq测序、基因组注释信息及共线性分析，鉴定出来4个候选基因：MLO(A)、GDSL(B)、Calcineurin B(C)和GDI2(D)；单倍型分析表明，这些候选基因在可育和败育材料之间存在多个SNP，其中GDSL基因存在一个碱基的删除，造成了移码突变和提前终止。

图5：候选基因的表达模式分析；MLO(A)、GDSL(B)、Calcineurin B(C)和GDI2(D)。

图6：利用RT-PCR方法对GDSL基因的表达模式进行检测。

图7：小麦基因编辑表型。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性质，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，发掘和鉴定败育彻底的雄性不育基因是作物杂种优势利用的前提。本发明选用的大麦雄性不育突变体材料GSHO 3002，是天然产生的突变体材料，来自大麦遗传资源种质库(Barley Genetic Stocks Database，https://www.nordgen.org/bgs/)，为无花粉粒类型的雄性不育，自交不结实，但雌蕊发育正常，可以接受外来花粉而恢复育性(Hockett et al.,1981)。由于GSHO 3002中的雄性不育基因未被定位和命名，我们暂用msg3002代替。本研究利用该突变体材料构建了包含116个单株的F₂初步定位群体，并结合BSR-Seq技术将msg3002定位在1.9cM的遗传区间；同时，我们利用重测序技术加快分子标记开发效率，在初步定位的基础上又筛选了包含1,964个单株的F₂精细定位群体，最终将msg3002定位于一个0.2cM的遗传区间，完成了目标基因精细遗传图谱的构建。该遗传区间对应在大麦Morex参考基因组IBSC_v2(http://plants.ensembl.org/Hordeum_vulgare/Info/Index)上大约为371Kb，包含4个高可信基因：HORVU1Hr1G064440(MLO)、HORVU1Hr1G064460(GDSL)、HORVU1Hr1G064470(Calcineurin B)和HORVU1Hr1G064480(GDI2)。在这4个候选基因中，一个编码GDSL(Gly-Asp-Ser-Leu)脂酶的基因在花药中存在特异的时空表达模式；同时，与野生型材料相比，在雄性不育材料GSHO3002中该GDSL基因的第二个外显子上存在一个碱基的删除，造成了移码突变和提前终止，该基因发生突变后能够导致大麦出现雄性不育的表型。因此，该GDSL基因就是大麦雄性不育基因msg3002。基因的全长gDNA序列如SED ID NO.1所示；基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；所编码蛋白的氨基酸序列如SED ID NO.3所示。

基于上述发现的大麦雄性不育基因msg3002，本发明的保护范围还包括与上述基因同源的DNA片段，只要它们编码的蛋白与SEQ ID NO.3所示的蛋白功能等价。本文所指的“与SEQ ID NO.3所示的蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中SEQ ID NO.3所示的蛋白相同或相近。SEQ ID NO.3所示的蛋白典型的生物学功能是调控植物花粉发育。通过下调SEQ ID NO.3所示的蛋白的表达量和/或活性，可以导致植物的雄蕊发育不正常，雄蕊的花药中不产生花粉粒。

这些与基因msg3002同源的DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ ID NO.1和SEQID NO.2)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明SEQ ID NO.3所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的基因msg3002的非关键位置的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明基因msg3002的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，例如90％、92％、94％、96％、97％、98％或者99％，只要编码的蛋白与SEQ ID NO.3所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul etal.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlin andAltschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。

但是，基因msg3002关键位点的突变会导致大麦出现雄性不育的表型，本发明通过单倍体分析发现，基因msg3002在第二个外显子上存一个碱基的删除(G290*，基于野生型Morex的CDS序列)，造成了移码突变和提前终止，由此导致大麦雄性不育。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：msg3002基因的定位与克隆

1.msg3002定位群体的创制和多态性检测：

大麦材料GSHO 3002的雄性不育表型如图1。为构建msg3002图位克隆的作图群体，本研究选择了大麦测序品种Morex作为杂交父本，与败育材料GSHO 3002杂交并构建了F₂分离群体。通过对F₂分离群体以及F_2:3代株系的表型鉴定，本研究确定了败育亲本GSHO3002中的雄性不育表型由一个隐性单基因控制，即msg3002。另外，我们对不同亲本材料的旗叶进行了RNA-Seq测序和DNA重测序。RNA-Seq数据分析表明败育亲本GSHO 3002与大麦测序材料Morex和栽培品种Tamalpais之间分别存在47,390个和68,170个高可信多态性(SNP和InDel)位点。DNA重测序数据表明，亲本材料GSHO 3002与Morex之间存在22万个高可信多态性位点(测序深度大于15×)，其中包括1.78万个InDel位点。这些多态性位点为分子标记开发，并为最终构建精细遗传图谱提供了基础。

2.msg3002精细遗传图谱的构建：

利用Morex和GSHO 3002杂交组合的F₂代分离群体，完成了msg3002的初步定位和精细定位工作，最终将该基因定位于大麦1HL染色体上大约0.2cM的遗传区间(图2)。具体研究结果如下：利用包含116个F₂单株的初步定位群体，并结合BSR-Seq技术，我们首先将msg3002定位在两个侧翼标记SP5M12和SP5M8之间大约1.9cM的遗传区间(图2B)；利用包含1,964个单株的F₂精细定位群体，并结合重测序技术提高分子标记的开发效率，我们将目标基因进一步定位到侧翼标记SP5M21和SP5M14之间大约0.2c M的遗传区间(图2C)。参考大麦测序材料Morex的物理图谱，侧翼标记SP5M21和SP5M14之间的物理区间大约371Kb(图2D)。

3.候选基因的初步分析和筛选：

在获取大麦Morex参考物理图谱的基础上，我们利用RepeatMasker工具(http://www.repeatmasker.org)对该371Kb的物理图谱进行了重复序列鉴定。结果表明，大约有158.5Kb的序列(～42.6％)为已知重复序列，其中绝大多数为LTR(Long TerminalRepeats)类型的反转录转座子，另外也包含部分DNA转座子和简单重复序列。接着，我们利用RNA-Seq技术对可育和败育材料不同发育时期(从孢原细胞时期到成熟花粉粒时期，混合取样)的花药进行测序并分析，结合目标区间的基因组注释信息，在该371Kb的关键区域中一共鉴定到4个可能的候选基因：MLO、GDSL、Calcineurin B和GDI2(图2D)。其中MLO编码一种植物膜蛋白，与植物抗病反应有关；GDSL编码一种GDSL(Gly-Asp-Ser-Leu)脂酶，该类基因家族成员众多，但相关功能研究较少，可能与植物发育或抗病反应有关；Calcineurin B基因编码一个钙调磷酸酶B蛋白，参与到非生物胁迫过程中Ca²⁺的信号转导；GDI2编码一个GDP解离抑制因子，参与GDP-GTP的转换。

我们还比较了关键候选基因区域在大麦和普通小麦上的共线性关系。在基因水平上，大麦与普通小麦三个亚基因组之间的共线性关系良好(图3)。上述4个候选基因在普通小麦A、B和D基因组上一一对应，该区间上下游的基因也具有很好的共线性关系。

实施例2：msg3002基因的单倍型分析和表达模式检测

1.单倍型分析：

本发明采用DNA重测序技术分析上述4个候选基因在野生型材料Morex和突变体材料GSHO 3002之间的差异。可育和败育材料的DNA样本采用常规CTAB法提取，DNA的浓度和完整性检测分别利用Nanodrop 2000和常规琼脂糖凝胶电泳方法完成。文库插入片段大小约300bp，测序平台选用Illumina NovaSeq，测序读长为PE 150bp，测序深度不低于10×，即>50G/样本。测序并经过过滤之后获得clean data，以大麦Morex参考基因组为参考，利用序列比对软件BWA(http://bio-bwa.sourceforge.net/)进行mapping，并利用samtools v1.5(http://www.htslib.org/)提取msg3002目标区间(～371Kb)序列，然后再利用SPAdesv3.10(http://cab.spbu.ru/software/spades/)对目标区间的序列进行de novo组装后可获得所有候选基因的序列并进行单倍型分析。

通过对候选基因进行序列比对后发现：与可育亲本Morex相比，在败育材料GSHO3002中MLO的基因在编码区有6个SNPs，其中两个SNPs在最后一个外显子中造成了两个氨基酸的改变；GDSL在第二个外显子上存一个碱基的删除(G290*，基于野生型Morex的CDS序列)，造成了移码突变和提前终止；Calcineurin B和GDI2分别存在3个和2个SNPs，但均未造成氨基酸的改变(图4)。

为进一步确认GDSL基因在突变体中的单倍型信息，本发明还利用普通PCR方法对该基因进行扩增，并采用一代测序方法进行验证。GDSL基因被分为两段进行扩增，扩增引物分别为：

GDSL-F1：5’-CTG CCC CTC ACC TTT TCC TTC-3’；(SEQ ID NO.4)

GDSL-R1：5’-TCA GTT TGG TTG GAG CCC ATG TG-3'。(SEQ ID NO.5)

GDSL-F2：5’-CAG ACT GAT GTT AAT TGC AGC ATC-3’；(SEQ ID NO.6)

GDSL-R2：5’-CAT TTC ACT CTC CGA CTC GCA G-3'。(SEQ ID NO.7)

测序结果与DNA重测序分析结果一致。

2.表达模式检测：

本发明为了对候选基因进行筛选，选取了可育材料在减数分裂前后的花药进行RNA-Seq测序和基因表达定量分析。叶环距和幼穗长度可作为预测花药发育阶段的指标。对大麦花药和花粉进行卡宝品红染色表明：当叶环距为-6cm～-3cm，穗长在2cm～5cm时，幼穗的大多花药处于减数分裂时期。本发明按此标准对花药进行取样，分别选取减数分裂时期以及减数分裂前后共三个发育阶段的花药等量混合后进行RNA测序。同时，为保证样品的一致性，花药仅从幼穗中部的3-5个小花收集，获取的样品立刻置于液氮保存，每组样品取3个生物学重复，RNA提取、质检以及后续建库测序与BSR-Seq类似。结合大麦公共RNA-Seq数据(NCBI BioProject:PRJEB14349)中根(root)、茎(stem)、叶(leaf)和籽粒(grain)的表达数据以及本发明中所测的花药(anther)表达数据，我们采用salmonv0.14.1(https://combine-lab.github.io/salmon/)对不同组织中的基因表达进行了定量分析。结果表明，4个候选基因中在上述至少一个组织中表达(TPM>1)；在花药中则有两个基因(GDSL和GDI2)表达，但只有GDSL(HORVU1Hr1G064460)呈现出花药特异表达的特征(图5)。

本发明选取GDSL(HORVU1Hr1G064460)作为最有可能的候选基因，利用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)方法对GDSL基因的表达模式进行验证。检测样本为可育亲本材料Morex减数分裂前后的花药(anther)、雌蕊(pistil)、旗叶(flag leaf)、茎(stem)和根(root)。总RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen,CA,USA)方法，具体步骤参照试剂盒说明书。RNA浓度和质量分别用Nanodrop 2000和琼脂糖凝胶电泳检测，cDNA的合成使用RevertAid Frist Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒(Thermo Scientific,MA,USA)完成。由于RNA样品中可能混有DNA污染，在合成cDNA之前先用DNase I(Thermo Fisher)对RNA样品进行处理，具体操作步骤按照试剂盒说明执行。RT-PCR的检测使用2×Taq Master Mix(CWBIO,Beijing,China)试剂盒完成。

RT-PCR检测所用到的引物如下：

GDI2-F：5’-CTC AAC CTT AAT CAG CTC TGG AAG-3'；(SEQ ID NO.8)

GDI2-R：5’-ACT TAA GCC GTG CTT TGC TAT C-3'。(SEQ ID NO.9)

结果显示，GDSL基因则只在雄蕊(花药)中特异表达(图6)。

结合精细定位结果、单倍型和表达模式分析结果，GDSL基因即为msg3002，其花药特异的表达模式和提前终止最终导致了突变体GSHO 3002的雄性不育表型。

实施例3：小麦中基因编辑

1.实验方法

1.1 CRISPR/Cas9靶点设计：

利用E-crispr(http://www.e-crisp.org/E-CRISP/designcrispr.html)网站，将大麦Msg3002在小麦中的同源基因(TraesCS1A01G261300、TraesCS1B01G272100、TraesCS1D01G261300)的CDS序列输入网站，设计gRNA靶点，然后利用Ensemble plant(http://plants.ensembl.org/index.html)网站检测靶点的特异性。

1.2 Target位点：

根据小麦-1A，-1B，-1D基因组上同源基因的第二个外显子和第三个外显子区域分别设计了2个通用sgRNA，将sgRNA构建在CRISPR/Cas9(pBUE413)载体上。CRISP/Cas9的靶点序列信息如下：

Target1:CCGGCATTCTCTCCAGCAGTGGC；(SEQ ID NO.10)

Target2:CCTGCGCAATGTGTCAGGCGTGC；(SEQ ID NO.11)

1.3引物设计：

P121:AAGCACGGTCAACTTCCGTA；(SEQ ID NO.12)

P122:GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC；(SEQ ID NO.13)

Msg3002-CRISP-WheatA-SF2:GATTTCTGACCCCTTCTGTTGTAC；(SEQ ID NO.14)

Msg3002-CRISP-WheatA-SR1:ACAATGCGCAGCACACTGGTG；(SEQ ID NO.15)

Msg3002-CRISP-WheatB-SF2:CCCATGCGACATTCCTAGTTC；(SEQ ID NO.16)

Msg3002-CRISP-WheatB-SR1:AACAATGCACAGCACACTGATAATA；(SEQ ID NO.17)

Msg3002-CRISP-WheatD-SF2:GGTTTCTCCATGGATCATTGGT；(SEQ ID NO.18)

Msg3002-CRISP-WheatD-SR1:AACAATGCACAACACACTGATAATC；(SEQ ID NO.19)

P121/122为BAR基因检测引物，Msg3002-CRISP-WheatA-SF2/SR1、Msg3002-CRISP-WheatB-SF2/SR1、Msg3002-CRISP-WheatD-SF2/SR1为小麦A、B、D三个亚基因组特异引物，分别对应TraesCS1A01G261300、TraesCS1B01G272100、TraesCS1D01G261300。

1.4检测方法：

1.4.1 BAR基因PCR扩增

BAR基因PCR扩增使用的是Vazyme Green Taq Mix试剂盒，具体反应体系如下：

反应条件为：退火温度57℃，延伸时间25s。

1.4.2 Msg3002-ABD基因PCR扩增

Msg3002-ABD基因PCR扩增使用的是Vazyme Green Taq Mix试剂盒，反应体系如下：

反应条件为：退火温度60℃，延伸时间90s。

2.实验结果

以六倍体普通小麦Fielder为受体材料，利用农杆菌介导的遗传转化方法，共获得6株独立的T₀代转基因植株，共20个分蘖(表1)。BAR基因检测(检测引物为P121/122)结果表明，来自株系Msg3002-1的1个分蘖1,2和来自Msg3002-4的3个分蘖为阴性，其余16个分蘖均为阳性，转化率约为80％。利用Msg3002基因对应小麦A、B、D同源基因的特异扩增引物，Msg3002-CRISP-WheatA-SF2/SR1、Msg3002-CRISP-WheatB-SF2/SR1、Msg3002-CRISP-WheatD-SF2/SR1，对所有的转基因苗进行测序并分析靶基因的突变情况。结果表明：在T₀代转基因植株中出现了三种编辑情况：纯合编辑(+/+)、一条DNA链编辑另一条没有编辑(+/-)和未发生编辑(-/-)(表1)。其中3个阳性转基因株系(Msg3002-1、Msg3002-2和Msg3002-15)的8个分蘖在A、B、D三个亚基因组的目标基因上均发生了纯合编辑，并表现出雄性不育表型(表1)；而两个阳性转基因株系(Msg3002-3和Msg3002-7)的8个分蘖以及1个转基因株系(Msg3002-1)的1个BAR基因检测阴性分蘖(1,2)只在A、B、D三个亚基因组的目标基因上发生了部分编辑或没有编辑，其所有分蘖均为可育表型；Msg3002-3为转基因阴性株系，其3个分蘖均为发生基因编辑，表现为野生型可育表型。

表1：小麦基因编辑统计表

说明："+"代表Bar基因检测为阳性，"-"代表Bar基因检测为阴性；"+/+"代表小麦A、B或D亚基因组发生纯合编辑；"+/-"代表小麦A、B或D亚基因组只有一条DNA链发生编辑，另外一条DNA链未发生编辑；"-/-"代表小麦A、B或D亚基因组未发生基因编辑；"F"代表可育，"S"代表败育。

小麦基因编辑的部分表型如图7所示，Fieler为转化受体材料(野生型)；Msg3002-1(1,1)、Msg3002-2(2,1)和Msg3002-15(15,1)分别来自三个独立转基因阳性株系，并在A、B、D三个亚基因组均发生了纯合编辑，均表现出败育表型；Msg3002-7(7,1)为独立转基因阳性株系，但只在A和B亚基因组发生了杂合编辑(+/-)，表现出可育表型。

通过基因编辑结果与表现型比较发现，只有在A、B、D三个亚基因组均发生编辑时才会出现败育表型，只有一个或两个或没有亚基因组发生纯合编辑时仍表现出可育表型。

通过以上对转基因植株的功能验证实验，证明了Msg3002小麦同源基因MSG3002-A(TraesCS1A01G261300)、MSG3002-B(TraesCS1B01G272100)和MSG3002-D(TraesCS1D01G261300)突变后会导致小麦花药发育异常并最终导致雄性不育的表型。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 大麦雄性不育基因msg3002及其应用

<130> 2020

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3610

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgcctc tcctcgctct cctccccctc ctcctcctcc tctccgcccc acctctctcc 60

gcagccgcct cgactccccg gtccgcgccg ccgtcggcgc cccccacccc gctcgtcccc 120

gcgctcttcg tcatcggcga ctccacgtcg gacgtcggca ccaacaacta cctcggcacg 180

ctcgcccgcg ccgaccgcga gccctacggg cgggacttcg acacccaccg ccccaccgga 240

cgcttctcca acggccgcat ccccgtcgac tacctcggtg cgttgctcgc ttctccttgg 300

tttctccatg gaatcggtgc gggtgcgggc gcggttctgg tctctcgatt ttgcgcgtcc 360

tcgcagacgc ggatcgtttc ggtttaggtc tccatggctg atcatgacta ctgatgattg 420

tttgttaatt ctccttgatt tgtcccgtgt aatcttctgt cgctgctgtg gcatgaatcc 480

acaggaatat ccctagtttc tcttcccttg atttctgacc ccttcttgtt gtaccacagc 540

ggagaaactg ggacttccct tcgtgcctcc gtacctcgag cagagcatgc gcatgggcgt 600

cggcagtgtt ggcctcagca acattggcgg aatgatccaa ggcgtcaact acgcttccgc 660

ggcagccggc attctctcca gcagtggctc tgagctggtc tgttctccca cctctccccc 720

gtccccataa ctctgcatca atcttattag ttacgttacg tcttggtgct gtcgagagat 780

ctgtttgggg atgattctgc tgtcaatctg tggtttcttc acaccaaatt tgatgctaat 840

cgattggggt tcttgcgatt ttggttgcgc ttgcagggga tgcatgtctc gctgacccag 900

caggtgcagc aggttgagga tacatatgag cagttggcgc ttgctcttgg ggaggcagct 960

acagtcgact tgttcaagag gtcggtcttc tttgtgtcga tcgggagcaa cgacttcatc 1020

cactactacc tgcgcaatgt gtcaggcgtg cagatgcatt atctcccatg ggagttcaat 1080

cagctccttg ttaacgcagt gaggcaggaa atcaaggtgt gcttcttcct cagtttattc 1140

tgtgtaccgt tgcttccctc ctatgtgatt acaagtctgc tgctgctgtg cattgtcgct 1200

taaggctgta gaattgaggt tttacttgcg gagttgcacc aagcatagtc agggatctct 1260

gtaactacga attgcgtttt gaacaaaatg tacttccttg tcggataaac tagaatttta 1320

tctgggaaat taacaaaaga aagtgattaa atgaatgaag tctccctgtt ggttagcagt 1380

tctagaacat tgatgccttt gcctttggtt cacatactaa ttgttcttac tatcaaattt 1440

ggggttattt ctggtaaagt tgcacaggta atacaaatgc aaaatgtttc agattgatgt 1500

tagttgaagc attttgataa aacatgagta aaaatggttg ggtggatgtt ccggatacta 1560

caatgaggtg taatgctgtt tagttggtat ataagggtat atggatggta gccaaaactt 1620

atctccaatt tttcagcatg ccaataactc tttatcgact ctagctcatt tttctggcca 1680

acattactca tcagtgtgct gtgcattgtc tcttaaggct gtagaattgg ggttttactt 1740

gttgagttgc accacgcata gtcaggcatc tctgtaacta cgaatttcag tttgggggaa 1800

acgtacttcc atgtctagat aaactagatt ttttaatctg ggaacttaac acatgaaagt 1860

gatttaaatc agtgaagtct ccttgttggt ttccagttct agaactttaa tgccttcacc 1920

tttgctttac atactaattg ttcttactgt cgaatttggg gttatttctt gcaaaattgt 1980

acaggtacta caaatgcaaa aatgtttcag actgatgtta attgcagcat ctgataaaat 2040

atgaaataaa aatggttgga ttgatgatcc cgagtctaca gtgaggtgaa atggtgttta 2100

gtttgtatat ttttgggatg ccaatgcctc tttaccaact ctagtcattt ttattgccaa 2160

cgctgaccaa ctcatggaca agcaaaattt tggcctaact ttttggtaag gccccacatg 2220

ggctccaacc aaactgattt gaagagctaa agtagaatgt gagtaaacct ttttttcttc 2280

ttggacacac aacccaaatg tgtgtgtaat tgtatactag aagacggcgt catgatgacg 2340

caaagtacaa agcaaataca accccgaaga gcgaaaatcc taaactattg aaaacgaagc 2400

taaacaactg aaaagctgaa actgtacaag gcgctagctc acgctaccca agctacacaa 2460

cagcatactg tcttaaactc tgatatattc tgaaatgttc aggctgcatt ttttgtgtgc 2520

tgccatctgt tttgggttca agttaagtct gttgtacttt cagctgtaac tgtggaacgc 2580

cttgcatatt tttctcactc catagaactg ttcatgagcc gaccatggta caatcgtgct 2640

actcagtcca tgtgtcatgg atcatttgat tctgtatggc taatttatct ttgttaccca 2700

atcttaagca gaacatataa tgcatgatga ttgaagatgc atataccagt aaccggtagt 2760

ttgtcctatg tagaaatttt ctttgtgttc attccataat cccatttatc tgctgatgca 2820

aatcgtaatg gattgctttg gtttctttat tcttcgcaat accgtagcaa attaattgcc 2880

attttgcatc cattactgtt tagttctata tatgtggttt ttgtcagagt actccacgtt 2940

tgatgcctaa actagttgtg gtctcatgta tctactacta cgttctgaca acgatgattt 3000

atgcagaatc tgtacaatat caatgttcga aaggtcgtgc tgatgggcct tcctcctgtt 3060

ggctgtgccc ctcacttcct ttcggattac ggcagccaaa atggggaatg catcgattac 3120

atcaacaatg ttgtgatcga gtttaactat ggcctgagat acatgtccag cgagttcctc 3180

cgccagtacc ctgactctat gatcagttac tgtgatacat ttgaggggtc agttgacata 3240

ctagagaacc gtgaccgcta tggtgagcaa attgcatcat tagtactaca tttaacttga 3300

gtgccaagtc ttctcagatg tatcatttgt actacatttg ctaataagtc ttctcctttt 3360

ggtggaattg caacgcgcag gctttctgac caccaccgat gcttgctgtg ggcttggcaa 3420

gtatggcggc ctattcatat gtgttcttcc acagatggcg tgcagcgacg cgtcaagcca 3480

tgtgtggtgg gatgaattcc acccgacaga tgctgtgaac cggatcctgg cagaaaacgt 3540

gtggtccggt gagcacacca ggatgtgcta tccagtgaac ttgcaggaga tggtgaaact 3600

gaagcagtag 3610

<210> 2

<211> 1161

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcgcctc tcctcgctct cctccccctc ctcctcctcc tctccgcccc acctctctcc 60

gcagccgcct cgactccccg gtccgcgccg ccgtcggcgc cccccacccc gctcgtcccc 120

gcgctcttcg tcatcggcga ctccacgtcg gacgtcggca ccaacaacta cctcggcacg 180

ctcgcccgcg ccgaccgcga gccctacggg cgggacttcg acacccaccg ccccaccgga 240

cgcttctcca acggccgcat ccccgtcgac tacctcgcgg agaaactggg acttcccttc 300

gtgcctccgt acctcgagca gagcatgcgc atgggcgtcg gcagtgttgg cctcagcaac 360

attggcggaa tgatccaagg cgtcaactac gcttccgcgg cagccggcat tctctccagc 420

agtggctctg agctggggat gcatgtctcg ctgacccagc aggtgcagca ggttgaggat 480

acatatgagc agttggcgct tgctcttggg gaggcagcta cagtcgactt gttcaagagg 540

tcggtcttct ttgtgtcgat cgggagcaac gacttcatcc actactacct gcgcaatgtg 600

tcaggcgtgc agatgcatta tctcccatgg gagttcaatc agctccttgt taacgcagtg 660

aggcaggaaa tcaagaatct gtacaatatc aatgttcgaa aggtcgtgct gatgggcctt 720

cctcctgttg gctgtgcccc tcacttcctt tcggattacg gcagccaaaa tggggaatgc 780

atcgattaca tcaacaatgt tgtgatcgag tttaactatg gcctgagata catgtccagc 840

gagttcctcc gccagtaccc tgactctatg atcagttact gtgatacatt tgaggggtca 900

gttgacatac tagagaaccg tgaccgctat ggctttctga ccaccaccga tgcttgctgt 960

gggcttggca agtatggcgg cctattcata tgtgttcttc cacagatggc gtgcagcgac 1020

gcgtcaagcc atgtgtggtg ggatgaattc cacccgacag atgctgtgaa ccggatcctg 1080

gcagaaaacg tgtggtccgg tgagcacacc aggatgtgct atccagtgaa cttgcaggag 1140

atggtgaaac tgaagcagta g 1161

<210> 3

<211> 386

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Leu Ser Ala

1 5 10 15

Pro Pro Leu Ser Ala Ala Ala Ser Thr Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ser

20 25 30

Ala Pro Pro Thr Pro Leu Val Pro Ala Leu Phe Val Ile Gly Asp Ser

35 40 45

Thr Ser Asp Val Gly Thr Asn Asn Tyr Leu Gly Thr Leu Ala Arg Ala

50 55 60

Asp Arg Glu Pro Tyr Gly Arg Asp Phe Asp Thr His Arg Pro Thr Gly

65 70 75 80

Arg Phe Ser Asn Gly Arg Ile Pro Val Asp Tyr Leu Ala Glu Lys Leu

85 90 95

Gly Leu Pro Phe Val Pro Pro Tyr Leu Glu Gln Ser Met Arg Met Gly

100 105 110

Val Gly Ser Val Gly Leu Ser Asn Ile Gly Gly Met Ile Gln Gly Val

115 120 125

Asn Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Gly Ile Leu Ser Ser Ser Gly Ser Glu

130 135 140

Leu Gly Met His Val Ser Leu Thr Gln Gln Val Gln Gln Val Glu Asp

145 150 155 160

Thr Tyr Glu Gln Leu Ala Leu Ala Leu Gly Glu Ala Ala Thr Val Asp

165 170 175

Leu Phe Lys Arg Ser Val Phe Phe Val Ser Ile Gly Ser Asn Asp Phe

180 185 190

Ile His Tyr Tyr Leu Arg Asn Val Ser Gly Val Gln Met His Tyr Leu

195 200 205

Pro Trp Glu Phe Asn Gln Leu Leu Val Asn Ala Val Arg Gln Glu Ile

210 215 220

Lys Asn Leu Tyr Asn Ile Asn Val Arg Lys Val Val Leu Met Gly Leu

225 230 235 240

Pro Pro Val Gly Cys Ala Pro His Phe Leu Ser Asp Tyr Gly Ser Gln

245 250 255

Asn Gly Glu Cys Ile Asp Tyr Ile Asn Asn Val Val Ile Glu Phe Asn

260 265 270

Tyr Gly Leu Arg Tyr Met Ser Ser Glu Phe Leu Arg Gln Tyr Pro Asp

275 280 285

Ser Met Ile Ser Tyr Cys Asp Thr Phe Glu Gly Ser Val Asp Ile Leu

290 295 300

Glu Asn Arg Asp Arg Tyr Gly Phe Leu Thr Thr Thr Asp Ala Cys Cys

305 310 315 320

Gly Leu Gly Lys Tyr Gly Gly Leu Phe Ile Cys Val Leu Pro Gln Met

325 330 335

Ala Cys Ser Asp Ala Ser Ser His Val Trp Trp Asp Glu Phe His Pro

340 345 350

Thr Asp Ala Val Asn Arg Ile Leu Ala Glu Asn Val Trp Ser Gly Glu

355 360 365

His Thr Arg Met Cys Tyr Pro Val Asn Leu Gln Glu Met Val Lys Leu

370 375 380

Lys Gln

385

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctgcccctca ccttttcctt c 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcagtttggt tggagcccat gtg 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cagactgatg ttaattgcag catc 24

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

catttcactc tccgactcgc ag 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctcaacctta atcagctctg gaag 24

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

acttaagccg tgctttgcta tc 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ccggcattct ctccagcagt ggc 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cctgcgcaat gtgtcaggcg tgc 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

aagcacggtc aacttccgta 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaagtccagc tgccagaaac 20

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gatttctgac cccttctgtt gtac 24

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

acaatgcgca gcacactggt g 21

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cccatgcgac attcctagtt c 21

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

aacaatgcac agcacactga taata 25

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggtttctcca tggatcattg gt 22

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aacaatgcac aacacactga taatc 25

Claims

1.一种植物雄性不育基因msg3002，其特征在于，所述植物雄性不育基因msg3002为大麦msg3002基因或大麦msg3002基因在小麦中的同源基因；

所述大麦msg3002基因的序列为：

i）SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或

ii）SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；

大麦msg3002基因在小麦中的同源基因为TraesCS1A02G261300、TraesCS1B02G272100和TraesCS1D02G261300。

2.权利要求1所述的植物雄性不育基因msg3002在调控植物花粉发育中的应用；

所述植物为大麦或小麦。

3.携带权利要求1所述植物雄性不育基因msg3002的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌在调控植物花粉发育中的应用；

所述植物为大麦或小麦。

4.如下1）-2）中任一项所述的蛋白在调控植物花粉发育中的应用；

1）氨基酸序列是SEQ ID NO.3所示的蛋白；

2）在SEQ ID NO.3所示的蛋白的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；

所述植物为大麦或小麦。

5.权利要求1所述的植物雄性不育基因msg3002在创制植物雄性不育株系中的应用；

所述植物为大麦或小麦。

6.权利要求1所述的植物雄性不育基因msg3002在植物杂交育种或制种中的应用；

所述植物为大麦或小麦。

7.一种创制植物雄性不育株系的方法，其特征在于，包括在含有如下a)-d)任一项所述的多核苷酸的植物中使所述多核苷酸表达降低或不表达的步骤；

a）SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b）SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

c）除b)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA片段；

d) TraesCS1A02G261300、TraesCS1B02G272100和TraesCS1D02G261300；

或者，包括在含有SEQ ID NO.3所述的蛋白的植物中使所述蛋白质活性降低或丧失的步骤；

所述植物为大麦或小麦。

8.根据权利要求7所述的创制植物雄性不育株系的方法，其特征在于，使所述多核苷酸表达降低或不表达的方法包括：突变或敲除所述多核苷酸的全部或部分序列；或者构建干涉载体干扰所述多核苷酸的表达；或者使用基因沉默系统使所述多核苷酸的表达沉默。

9.一种恢复大麦雄性不育株系的花粉育性的方法，其特征在于，包括如下步骤：将外源基因Msg3002转入大麦雄性不育株系，使得突变体恢复野生型表型；

所述外源基因Msg3002为如下a)-c)中任一项所述的DNA片段；

a）SEQ ID NO.1所示的DNA片段；

b）SEQ ID NO.2所示的DNA片段；

c）除b)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA片段；

所述大麦雄性不育系由基因Msg3002突变造成。