CN116286901A - 一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其应用 - Google Patents

一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的应用，所述MsGDSL酯酶/脂肪酶基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述的应用是：通过抑制MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的表达从而获得紫花苜蓿雄性不育株系并用其生产种子；本发明还提供一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，通过构建过表达载体，利用遗传转化手段转化上述育成的紫花苜蓿雄性不育株系，使其恢复育性及野生型表型；本发明创制的紫花苜蓿雄性不育株系以及提供的恢复该雄性不育株系育性的方法，在杂交紫花苜蓿构建和农业生产上具有十分重要的应用。

Description

一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其应用
技术领域
本发明涉及一种生物工程技术领域的紫花苜蓿株系创制方法，尤其涉及一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其应用。
背景技术
紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是发展草畜产业首选的牧草资源，在世界范围内广泛种植。作为典型的雌雄同花异花授粉植物，具有自交不亲和性，需采用杂交的方式进行制种。因有着明显的杂种优势，在实际应用中利用这种优势制种主要分为人工去雄杂交制种和利用核质互作雄性不育系杂交制种两条途径，后者不仅可以减少去雄用工，降低制种成本且被证明能有效培育优质苜蓿杂交品种。随着各国对优质牧草需求量的与日俱增，早日全面揭示紫花苜蓿雄性不育的机理，最大发挥其杂种优势效应是重要任务。
雄性不育对植物本身是不利于繁衍的性状，但却是在自然界中进化出的生存方式之一，利用这一性状进行重要遗传改良是目前关于紫花苜蓿育种工作的研究热点。在高等植物中，花粉发育是一个复杂的过程,其间涉及到大量基因的表达和调控。花粉作为雄配子体，包含与雌配子体结合完成受精过程的全部遗传信息,在开花植物的有性生殖过程中发挥着重要的作用，花粉发育期间的任一过程受阻都可能导致植物花粉败育，表现雄性不育性。紫花苜蓿雄性不育的发生有时空特异性，发掘和阐明其雄性不育相关基因的复杂调控网络通路，为生产实践中能更好地利用紫花苜蓿雄性不育系和杂种优势培育优质杂交种扩大紫花苜蓿产业提供理论依据。
紫花苜蓿在育种方面的研究虽一直在进行，但杂交种选育过程中优质雄性不育系与配套保持系材料筛选困难，同时作为四倍体植物，基因组相对复杂、生长周期较长等因素，也限制了其杂交、杂种优势利用在育性遗传基础和遗传模式等相关研究的进度。
发明内容
本发明的目的是针对目前技术上的缺陷和不足，提供一种MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的应用及恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，利用MsGDSL酯酶/脂肪酶基因及其蛋白参与调控紫花苜蓿花粉败育的特点，以及利用转基因技术控制紫花苜蓿雄性生殖发育，通过抑制该蛋白产生新的紫花苜蓿雄性不育株系，通过过表达该蛋白恢复紫花苜蓿的雄性不育性。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一方面，本申请提供了一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因，所述MsGDSL酯酶/脂肪酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
另一方面，本申请还提供了一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的应用，所述的应用是：通过抑制MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的表达从而获得紫花苜蓿雄性不育株系，并用所述紫花苜蓿雄性不育株系来生产种子。
最后，本申请还提供了一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，通过构建过表达载体，利用遗传转化手段转化上述紫花苜蓿雄性不育株系，能够使其恢复育性及野生型表型。
优选的，所述方法包括如下步骤：
将MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建的农杆菌转入所述紫花苜蓿雄性不育系，培育，即得；其中MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建载体中含有编码如如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
优选的，具体包括以下步骤：
(a)提供携带表达MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建载体的农杆菌LBA4404；
在MsGDSL酯酶/脂肪酶基因全长两端添加XbaI和SacI酶切位点，设计特异性引物MsGDSL酯酶/脂肪酶-F-pBI/MsGDSL酯酶/脂肪酶-R-pBI，用高保真酶进行PCR扩增；
MsGDSLF酯酶/脂肪酶-pBI：5’-gctctagaatgaattccatgaggttaattcatgtactttggt-3’和
MsGDSL酯酶/脂肪酶-R-pBI：5’-cgagctcttataaacatgccttcccaattggaactact-3’
对pBI-121表达载体使用同样的双酶进行37℃酶切3h后，将目的片段与去除GUS后的线性长载体相连接，转入大肠杆菌感受态细胞于LB/Kan固体培养基上培养，挑取单克隆用载体引物M13-F/R进行PCR检测并测序；
M13-F：5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’和
M13-R：5’-cacacaggaaacagctatgac-3’
将菌液在LB/Kan液体培养液中扩繁，测序正确后，成功构建pBI121-MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体，将所得pBI121-MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体倒入农杆菌；
(b)将紫花苜蓿不育系细胞或组织与步骤(a)中农杆菌感受态细胞接触，从而使编码如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转入到紫花苜蓿不育系细胞，并且整合到紫花苜蓿不育系细胞的染色体上；
(c)选择转入所述核苷酸的紫花苜蓿细胞或组织，再生，获得紫花苜蓿植株。
本发明的有益效果：
本发明首次从豆科植物的花药中克隆全新基因，即紫花苜蓿MsGDSL酯酶/脂肪酶基因，通过控制紫花苜蓿GDSL酯酶/脂肪酶基因及其编码蛋白获得紫花苜蓿雄性生殖发育的变异株，实现控制紫花苜蓿花粉育性；本发明创制的紫花苜蓿雄性不育株系在营养期与来源亲本的产量及品质性状无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，得到花粉败育植株，同时发明恢复该雄性不育株系育性的操作方式，在杂交紫花苜蓿构建和农业生产上具有十分重要的应用。
附图说明
图1为本发明提供的实施例1中pRNAi-MsGDSL酯酶/脂肪酶干扰表达载体构建示意图；
图2为本发明提供的实施例2中pBI121-MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体构建示意图；
图3为本发明提供的不育系形态学观察示意图；
图4为本发明提供的恢复育性植株表征镜像图。
具体实施方式
下面结合实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验步骤，通常按照常规条件。
所述的MsGDSL酯酶/脂肪酶基因如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
实施例1、紫花苜蓿雄性不育株系创制方法
1.1紫花苜蓿育性控制的MsGDSL酯酶/脂肪酶基因克隆
利用野生型紫花苜蓿公农1号材料，根据MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的全长序列设计特异性引物MsGDSL酯酶/脂肪酶-F/R，依次进行提取花药总RNA,合成cDNA及PCR扩增MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的cDNA全长。
MsGDSL酯酶/脂肪酶-F：5’-gctctagaatgaattccatgaggttaattcatgtac-3’和
MsGDSL酯酶/脂肪酶-R：5’-cgagctcttataaacatgccttcccaattgg-3’
经测序鉴定cDNA序列全长1095bp，包括364个氨基酸。该基因经BLAST比对，其隶属于GDSL酯酶/脂肪酶家族。
1.2通过RNAi手段降低紫花苜蓿中MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的表达水平
为抑制MsGDSL酯酶/脂肪酶基因表达，构建pRNAi-MsGDSL酯酶/脂肪酶干扰表达载体并转化野生型紫花苜蓿，以期调控育性，获得紫花苜蓿雄性不育株系，重组载体构建图谱如图1所示，该载体包含如SEQ ID NO.3(正向片段)和SEQ ID NO.4(反向片段)所示的核苷酸序列。
基于同源重组技术，在序列中选取长500bp的保守片段，设计特异性引物MsGDSL酯酶/脂肪酶-RNAi-F/R，采用高保真酶进行PCR扩增。
MsGDSL酯酶/脂肪酶-RNAi-F：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttatgtgtgtaccctgcaatttataactttgg-3’和
MsGDSL酯酶/脂肪酶-RNAi-R：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggttcccaaaatttcaggaaatgacctttgaact-3’
经BP重组及LR反应构建RNAi表达载体，于LB/Spe抗性平板上挑取单菌落，过夜摇菌后用引物RNAi-F/R进行PCR鉴定及测序验证。
RNAi-F：5’-actgacgtaagggatgacgcac-3’和
RNAi-R：5’-gatttgtagagagagactggt-3’
测序正确后将pRNAi-MsGDSL酯酶/脂肪酶重组载体质粒转化农杆菌感受态细胞LBA4404，重悬菌体匀涂布到YEP/Spe固体培养基(含20mg/Lrif)上，28℃倒置培养48h。挑取单菌落至对应的液体培养基中扩繁菌液，次日吸取100μL菌液，以1/50的比例取菌液转移到YEP液体培养基(不含任何抗生素)中扩繁活化，4000xg离心10min收集菌体，用MS液体培养基(4.43g/LMS+30g/L蔗糖)重悬菌体，调节菌液OD600值达0.6-0.8，此时即可用于紫花苜蓿的遗传转化。
选取长势良好的野生型紫花苜蓿无菌苗，将叶片剪成四边均有伤口的1cm2小块作外植体，于农杆菌重悬液中振荡侵染15min，无残留菌液后按照叶片上表面朝下的方式9片/皿排布于MS固体培养基(MS5194.43g/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.8g/L)上，28℃暗处共培养3d。
共培养后的外植体用无菌水(含500mg/LCef)冲洗后，转移至MS1培养基(MS+2,4-D2mg/L+KT0.25mg/L+Kan25mg/L+TCC500mg/L)诱导长出愈伤组织，待其长至1cm及以上时剪下，接种到MS2培养基(MS+KT1.5mg/L+Kan25mg/L+TCC500mg/L)上进一步分化培养，约30d后转至MS3培养基(1/2MS+Kan25mg/L+TCC500mg/L)中诱导生根，长出大量不定根后进行炼苗、移栽至试验田培养。
对移栽成活的再生苗进行分子检测，提取叶片的基因组DNA进行PCR阳性鉴定，RT-PCR分析阳性苗中MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的表达水平，综合选取有效RNA干扰植株。
1.3MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿花粉发育异常
如图3所示，雄性不育系表型与野生型紫花苜蓿表型相比，抑制MsGDSL酯酶/脂肪酶基因表达后的阳性植株的花粉粒呈干瘪状，数量少、体型小且有缺失(B，C)；采用碘-碘化钾染色测定法后进行镜检，镜检结果表明花粉在四分体后期的绒毡层细胞异常导致小孢子发育缺陷，进而表现释放花粉粒数量少或不能正常释放花粉粒(A)，导致紫花苜蓿花粉败育，创制新的紫花苜蓿雄性不育株系。
1.4上述创制的雄性不育系在紫花苜蓿制种中的用途
将MsGDSL酯酶/脂肪酶不育系作为父本与三系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到F1代。在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将该植株与原不育亲本对应的保持系杂交。再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交筛选后获得新的雄性不育不育系，适宜作为杂交组合中的母本。
实施例2、恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法
2.1通过过表达MsGDSL酯酶/脂肪酶基因恢复新雄性不育系的育性
为恢复新雄性不育系的育性，构建pBI121-MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体并转入上述创制的新紫花苜蓿雄性不育系，以期恢复育性，重组载体构建图谱如图2所示，该载体包含如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，具体的，所述载体包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在MsGDSL酯酶/脂肪酶基因全长两端添加XbaI和SacI酶切位点，设计特异性引物MsGDSL酯酶/脂肪酶-F-pBI/MsGDSL酯酶/脂肪酶-R-pBI，用高保真酶进行PCR扩增。
MsGDSL酯酶/脂肪酶-F-pBI：5’-gctctagaatgaattccatgaggttaattcatgtactttggt-3’和
MsGDSL酯酶/脂肪酶-R-pBI：5’cgagctcttataaacatgccttcccaattggaactact-3’
对pBI-121表达载体使用同样的双酶进行37℃酶切3h后，将上述目的片段与去除GUS后的线性长载体相连接，转入大肠杆菌感受态细胞于LB/Kan固体培养基上培养，挑取单克隆用载体引物M13-F/R进行PCR检测并测序。
M13-F：5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’和
M13-R：5’-cacacaggaaacagctatgac-3’
将菌液在LB/Kan液体培养液中扩繁，测序正确后，利用农杆菌介导的紫花苜蓿遗传转化体系将成功构建的pBI121-MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体导入上述创制的新雄性不育系植株，通过共培养、筛选、分化及诱导生根等培养过程，进行阳性鉴定及花粉育性观察，如图4所示，由雄性不育系转化得到的恢复植株镜像图内小孢子数远多于所述不育系，且在花期采用I2-KI溶液染色进行育性测定，紫花苜蓿新雄性不育株系的花粉由之前的黄褐色变为蓝色，即恢复了新雄性不育系的育性，同时与野生型紫花苜蓿表型基本无异。

Claims (5)

1.一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因，其特征在于，所述MsGDSL酯酶/脂肪酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种雄性不育MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的应用，其特征在于，所述的应用是：通过抑制MsGDSL酯酶/脂肪酶基因的表达从而获得紫花苜蓿雄性不育株系，并用所述紫花苜蓿雄性不育株系来生产种子。
3.一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，其特征在于，通过构建过表达载体，利用遗传转化手段转化权利要求2中的紫花苜蓿雄性不育株系，能够使其恢复育性及野生型表型。
4.根据权利要求3所述的一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
将MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建的农杆菌转入所述紫花苜蓿雄性不育系，培育，即得；其中MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建载体中含有编码如如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
5.根据权利要求4所述的一种恢复MsGDSL酯酶/脂肪酶基因缺失导致紫花苜蓿雄性不育的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(a)提供携带表达MsGDSL酯酶/脂肪酶互补构建载体的农杆菌LBA4404；
在MsGDSL酯酶/脂肪酶基因全长两端添加XbaI和SacI酶切位点，设计特异性引物MsGDSL酯酶/脂肪酶-F-pBI/MsGDSL酯酶/脂肪酶-R-pBI，用高保真酶进行PCR扩增；
MsGDSLF酯酶/脂肪酶-pBI：5’-gctctagaatgaattccatgaggttaattcatgtactttggt-3’和
MsGDSL酯酶/脂肪酶-R-pBI：5’-cgagctcttataaacatgccttcccaattggaactact-3’
对pBI-121表达载体使用同样的双酶进行37℃酶切3h后，将目的片段与去除GUS后的线性长载体相连接，转入大肠杆菌感受态细胞于LB/Kan固体培养基上培养，挑取单克隆用载体引物M13-F/R进行PCR检测并测序；
M13-F：5’-cgccagggttttcccagtcacgac-3’和
M13-R：5’-cacacaggaaacagctatgac-3’
将菌液在LB/Kan液体培养液中扩繁，测序正确后，成功构建pBI121-MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体，将所得pBI121-MsGDSL酯酶/脂肪酶过表达载体倒入农杆菌；
(b)将紫花苜蓿不育系细胞或组织与步骤(a)中农杆菌感受态细胞接触，从而使编码如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列转入到紫花苜蓿不育系细胞，并且整合到紫花苜蓿不育系细胞的染色体上；
(c)选择转入所述核苷酸的紫花苜蓿细胞或组织，再生，获得紫花苜蓿植株。
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