CN113817754B - 水稻短粒基因shg1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程领域,具体涉及一种控制水稻籽粒发育基因SHG1的分离克隆、功能验证,及其在水稻在生产实践中的应用。本发明公开了一种水稻短粒基因SHG1,所述基因SHG1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述。本发明还同时公开了水稻短粒基因SHG1的用途:减小水稻籽粒大小(粒长减小、粒宽不变),适当减小水稻籽粒大小,可以使灌浆更饱满,产量和品质相平衡。

Description

水稻短粒基因SHG1及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域,具体涉及一种控制水稻籽粒发育基因SHG1的分离克隆、功能验证,及其在水稻在生产实践中的应用。
背景技术
水稻是人类重要的粮食作物,主要分布于亚洲、欧洲南部、美洲及非洲等地,养活了世界三分之一以上的人口。随着人口逐年增加,可用耕地面积减少,自然灾害频发,土地流转与非粮化趋势加剧,粮食安全成为困扰许多国家的重大问题,保持粮食的稳产和高产成了农作物育种的首要目标。据预测到2050年世界粮食产量必须增加70%才能满足日益增长的人口对粮食的需求。
千粒重是决定产量的三要素之一,而粒形是决定千粒重的重要农艺性状。其中,反映粒形的指标主要包括粒长、粒宽、粒厚和长宽比。这些指标不但与水稻产量息息相关,同时也影响水稻的外观品质,决定其最终的商品价值。迄今为止,已有多个控制粒形的基因被克隆,它们主要参与细胞增殖与扩展、植物激素、泛素化、灌浆和小RNA等分子机制的调控,为提高水稻产量和改良稻米品质奠定了重要的基础。
水稻粒长、粒宽、粒厚和长宽比都是由多基因控制的数量性状,其多数相关的数量性状位点(QTL)主要是通过影响颖壳细胞的分裂来调控粒形。GS3位于第3染色体着丝粒附近,是影响粒长和粒重的主效QTL(Fan et al.,2006)。GS3编码一个含有3个结构域的跨膜蛋白,其中OSR结构域是影响粒长的必要元件,而VWFC结构域对OSR结构域有抑制作用(Maoet al.,2010)。GS3功能丧失后,导致籽粒变长、变窄及粒重增加;GS3超表达之后,籽粒变小、植株矮化、生长发育受到抑制,表明GS3是粒长的负调控因子。与长粒品种相比,长粒品种中该基因在第二个外显子发生了一个无义突变,造成蛋白质翻译提前终止。水稻品种基因组关联分析表明位于GS3第二个外显子的这个无义突变是造成水稻自然群体中粒长差异的重要原因(Fan et al.,2009)。GW2位于第2染色体,是粒宽和粒重的主效QTL,编码一个具有E3泛素连接酶活性的RING蛋白,通过将其底物锚定到蛋白酶体进行降解,从而负调节细胞的分裂。GW2主要是通过颖壳细胞数目增多使颖壳变大,同时也提高了水稻灌浆速率,从而改变籽粒的大小及产量(Song et al.,2007)。GW2基因除了影响了籽粒的发育,也调控了整个植株的发育。因此,与GS3基因一样,同属于多效性基因。GS5基因位于第5染色体上,编码一个丝氨酸羧肽酶,正向调控水稻粒宽和粒重(Li et al.,2011)。GS5基因通过影响细胞的数目和大小影响籽粒的宽度,其表达量的升高会促进颖壳细胞分裂,从而增加粒宽,反之则反。研究表明,宽粒和窄粒品种都编码完整的GS5蛋白,因此造成粒宽差异的原因可能是该基因表达量高低的差异。
除了上述这些影响粒形和产量的重要基因或者QTL之外,还有很多其他间接影响水稻粒形和粒重的多效基因。DEP1编码一个G蛋白,能够增强茎端分生组织的活力,促进细胞分裂,提高穗密度和增加每穗粒数,进而极大的提高产量。DEP1等位突变还造成紧凑、直立、小穗表型,同时也引起籽粒变短(Huang et al.,2009)。FUWA编码一个NHL结构域的蛋白,主要在根分生组织、茎尖分生组织以及花序中表达(Chen et al.2015)。当FUWA突变后,植株变矮,分蘖数减少,茎秆变粗,穗变短但直立紧密,枝梗和穗粒数减少,籽粒变宽、变厚、变短,胚乳重量增加、灌浆速率增快,千粒重增加。DSG1编码一个丝裂原活化蛋白激酶,主要在根、茎、叶以及穗中表达。dsg1突变体植株明显矮化,节间缩短,叶片直立,花药和籽粒变小,粒长、粒宽及千粒重均显著降低(Liu et al.2015)。
水稻(Oryza sativa)是全球近一半人口赖以生存的基本食粮,在我国甚至亚洲有很大的种植面积,本发明克隆的控制短粒基因SHG1及其编码的蛋白在提高水稻产量中具有重要的生产应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水稻短粒基因SHG1及其在水稻育种中的应用。
为了解决上述技术问题,本发明提供一种水稻短粒基因SHG1,基因SHG1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明还同时提供了如上述水稻短粒基因SHG1编码的蛋白质,该蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还同时提供了含有上述基因的重组载体和转化体。
本发明还同时提供了水稻短粒突变体基因SHG1的用途:减小(适当减小)水稻籽粒大小,可以使灌浆更饱满,产量和品质相平衡。
作为本发明的水稻短粒基因SHG1的用途的改进:禾本科植物为水稻,适当减小水稻籽粒的大小(粒长减小、粒宽不变),可以使灌浆更饱满,产量和品质相平衡。
本发明还同时提供了一种调控禾本科植物籽粒发育的方法:包括用上述的基因SHG1转化禾本科植物(例如水稻)细胞,再将转化后的禾本科植物细胞培育成植株,所述植株的籽粒变小(籽粒的粒长变小)、千粒重降低。
本发明还同时提供了含有上述基因的质粒,以及含有所述基因或所述载体的工程菌或宿主细胞。
所述工程菌和宿主细胞可理解为本领域技术人员在转基因过程中所使用的工程菌或宿主细胞。但随着科技发展,所述工程菌和宿主细胞的选择也许会发生变化,或在非转基因目的的应用领域,也同样涉及载体和工程菌的利用,但只要含有本发明所述基因或本发明所述的载体,均在本发明的保护范围之内。
进一步地,本发明还提供了一种宿主细胞,该宿主细胞含有基因序列,该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
本发明的另一个目的在于提供上述基因用于转基因改良作物的用途。
转基因水稻的制备为本领域常规技术手段,本发明不另作限定,利用本发明所述基因进行水稻转基因的技术方案均在本发明的保护范围之内。
实现本发明的具体技术步骤如下:
一、突变体SHG1的分离和遗传分析:
本发明的水稻大粒突变体shg1来自籼稻品种双科早(SKZ)的EMS突变体库(图1)。通过与野生型的正反交实验,证明该突变体受隐性单基因控制。
二、SHG1与野生型小穗的比较
在成熟期观察shg1的籽粒。shg1突变体粒长显著减小、粒宽不变,千粒重显著降低(图1)。
三、SHG1基因的图位克隆
为了分离SHG1基因,本发明首先构建了一个定位群体,由shg1与粳稻品种日本晴(NIP)杂交组配成F2定位群体,再通过图位克隆的方法,利用多种分子标记对SHG1位点进行初步定位,将其初步定位在第7染色体上,并介于R5与R23标记之间。通过对这两个标记之间的序列进行分析,发展新的多态性标记将SHG1基因精细定位到标记R12与R19之间约10kb的区域内,通过测序比对分析发现与双科早(SKZ)相比,shg1突变体的LOC_Os07g04670基因的DNA序列发生碱基替换,导致氨基酸突变(图2)。Blast分析发现SHG1基因(LOC_Os07g04670)与前人报道的G1是等位基因。shg1突变位点与前人报道的G1等位基因的突变位点不一致,shg1中的突变体DNA序列发生碱基替换,导致氨基酸突变。SHG1基因主要在穗中表达,与其表型一致(图3)。
本发明的水稻短粒突变体shg1与g1突变体表型差异明显。具体为:而g1突变体的主要特征花发育缺陷,导致护颖伸长,而现有的shg1突变体主要表现为籽粒变小,千粒重降低。因此,通过SHG1基因的克隆和深入的功能解读,深入阐明了水稻籽粒调控的遗传机制及其作用机理。因而,本发明对水稻的产量的进一步提高及分子设计育种提供了重要的理论意义。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1是双科早(SKZ)和SHG1突变体的籽粒表型比较;
图1中:
A为SKZ和SHG1突变体籽粒的长度比较;
B为SKZ和SHG1突变体籽粒的宽度比较;
C为SKZ和SHG1突变体籽粒的长度统计数据;
D为SKZ和SHG1突变体籽粒的宽度统计数据;
E为SKZ和SHG1突变体籽粒的千粒重统计数据;
图2是基因定位与功能互补实验转基因水稻的表型;
图2中:
A为SHG1基因的定位;
B为SHG1基因编码肉桂醇脱氢酶,其突变导致蛋白翻译提前终止;
C为遗传互补实验;wt代表野生型植株的籽粒,SHG1代表突变体植株的籽粒,COM代表互补植株的籽粒。
图3是SHG1基因的表达;
0.5cm代表0.5cm长的穗,0.5~2cm代表0.5~2cm长的穗,2~5cm代表2~5cm长的穗,Root代表根,Culm代表茎,Leaf代表叶。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1:
1、水稻材料
水稻(Oryza sativa L.)突变体shg1(short grain 1),原始野生型材料为籼稻品种双科早(SKZ)(图1)。shg1突变体是来自EMS诱变体库。
2、分析和定位群体
通过shg1突变体与粳稻品种日本晴(NIP)的正反交实验,表明该突变体受隐性单核基因控制。shg1突变体和NIP进行杂交,F1代自交,并从F2群体中挑选出857株同时具有小粒表型的个体作为定位群体。在抽穗期每株取1克左右的叶片,用来提取总DNA。
表1、突变体shg1的遗传分析
Figure BDA0003270124810000051
3、DNA提取
在抽穗期每株取1克左右的叶片,用来提取总DNA。具体步骤如下:
①、称取1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状,然后加入600μl的CTAB溶液(2%(m/V)CTAB,100mmol/L Tris-Cl,20mmol/L EDTA,1.4mol/L NaCl;pH8.0)配制的DNA提取缓冲液,65℃水浴40分钟。再加600μl的氯仿:异戊醇(24:1的体积比),并混匀。10,000rpm离心5分钟,将上清液转移到新的离心管中。
②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3~1倍体积预冷(至4℃)的乙醇,轻轻混匀至DNA沉淀。12,000rpm离心10分钟,倒出上清液。
③、再用75%(体积浓度)的乙醇500μl洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。
④、将上述洗涤后的DNA晾干并溶于500μl纯水中。
⑤、用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。完整合适的DNA用于PCR扩增,不完整的DNA则重新提取,直至获得完整的DNA。
实施例2:
1、SHG1基因的初步定位
从shg1突变体与NIP杂交组合的F2群体随机选取94个隐性个体,组成的小群体进行多态性分析,根据本实验室均匀分布于12条染色体上的引物,按照已知的反应条件进行PCR扩增进行连锁分析。PCR扩增条件如下:PCR反应总体系为10μl:其中100ng/μl水稻基因组DNA 1μl,10×PCR Buffer 1μl,,2mM dNTP 1μl,10uM引物2μl,5U/μl rTaq0.05μl,ddH2O4.95μl。PCR扩增条件具体为:94℃预变性5分钟;94℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸30秒,35个循环,经4%琼脂糖凝胶电泳分离和Gelred核酸染料染色,检测PCR产物的多态性,将SHG1基因初步定位在第7号染色体上R5与R23标记之间(图2)。
2、SHG1基因的精细定位
利用由shg1与NIP杂交组配成F2定位群体剩余的隐性个体,在初定位的基础上继续设计分子标记,最终将SHG1基因精确定位在标记R12与R19之间约10kb的区域内。通过测序比对分析发现与SKZ相比,shg1突变体的LOC_Os07g04670基因的DNA序列发生碱基替换,导致氨基酸突变(图2)。Blast分析发现SHG1基因(LOC_Os07g04670)与前人报道的G1是等位基因。shg1突变位点与前人报道的G1等位基因的突变位点不一致,shg1中的突变体DNA序列发生碱基替换,导致氨基酸突变。引物序列如表2所示:
表2、SHG1基因的定位标记序列
标记名称 前引物(5’-3’) 后引物(5’-3’) 片段大小
R5 TGTCCTTAGCATGGAAGACC GTTGTTGATCATCTGGTACG 119bp
R23 GTAGGTGATATATTGATCC GTTCAAATTTTAACTAGCC 140bp
R12 GATCTGCCTCTGCATGCATG GTCCATCACATCACGACGCGAG 676bp
R19 GGTAACACCATGAGGTTTTCGTC CAGATTTAGTACCGCACCTCACTAC 746bp
3、基因预测和比较分析:
根据精细定位的结果,在10kb kb范围内根据Rice Genome Annotation Projecthttp://rice.plantbiology.msu.edu/)的预测,发现在此区间内只有1个候选基因。通过设计测序引物,采用PCR方法分别从shg1突变体和野生型SKZ基因组中扩增候选基因进行测序分析。shg1突变体的LOC_Os07g04670基因的DNA序列发生碱基替换,导致氨基酸突变。Blast分析发现SHG1基因(LOC_Os07g04670)与前人报道的G1是等位基因。SHG1突变位点与前人报道的G1等位基因的突变位点不一致,SHG1中的突变体DNA序列发生碱基替换,导致氨基酸突变。
将这些结果分别重复验证3次,都得到相同结果,证明了其准确性。根据基因注释信息(NCBI),预测此SHG1基因编码了一个DUF640结构域蛋白。
PCR反应体系为:100ng/μl水稻基因组DNA 2μl,
Figure BDA0003270124810000061
GXL Buffer 10μl,2.5mM dNTP 4μl,10μM引物4μl,/>
Figure BDA0003270124810000062
GXL DNA Polymerase 4μl,ddH2O 26μl,总体系为50μl。PCR扩增条件具体为:94℃预变性2分钟;98℃变性10秒,60℃退火15秒,68℃延伸70秒,30个循环,经1%的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收转入大肠杆菌后挑选阳性单克隆测序。SHG1基因测序引物如下:SHG1CX-1F:CTACTACCACCTTGGTTGGCTC和SHG1CX-1R:GATGCAGACACATCACACATGTAGC。
水稻短粒基因SHG1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;SEQ ID NO:4末尾设有终止子*。
原始野生型材料籼稻品种双科早(SKZ)的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示,SKZ所编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所述。SEQ ID NO:3末尾设有终止子*。
实施例3、植物转化:
利用同源重组和PCR技术扩增SKZ SHG1的DNA序列(含SEQ ID NO:1)。电泳后回收纯化DNA片段,再将回收纯化的片段大小正确的产物连接到酶切后的载体上进行大肠杆菌转化,挑选阳性单克隆测序。获得正确转化载体pCA1301-SHG1,通过电击的方法转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株系LBA4404中转化水稻突变体SHG1愈伤组织。利用突变体种子诱导的愈伤组织,经过诱导培养基培养3周后,挑选生长旺盛愈伤用作转化的受体。用含有重组质粒载体的LBA4404菌株侵染水稻愈伤,在黑暗和25℃条件下共培养3天后,在含有300mg/LG418的筛选培养基上培养。筛选抗性愈伤在含有250mg/L G418预分化培养基上培养10天左右。将预分化的愈伤转至分化培养基上在光照和25℃条件下培养。二个月左右获得到抗性转基因植株,再将其移植到大田中继续生长。在成熟期对植株进行籽粒表型鉴定和观察,发现shg1籽粒大小恢复正常(图2C),具体数据如下表3。表明本发明获得了使shg1突变体恢复正常表型的转基因水稻(图2C)。
表3
粒长 粒宽 千粒重
wt 8.32±0.19 2.01±0.12 19.85±0.51
shg1突变体 6.19±0.22 2.05±0.11 16.87±0.39
抗性转基因植株 8.25±0.26 2.00±0.12 20.01±0.55
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然,本发明不限于以上实施例,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国水稻研究所
<120> 水稻短粒基因SHG1及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 831
<212> DNA
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 1
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<213> 水稻(Oryza sativa L.)
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1 5 10 15
Pro Ala Glu Leu Arg Pro Ser Arg Tyr Glu Ser Gln Lys Arg Arg Asp
20 25 30
Trp Gln Thr Phe Thr Gln Tyr Leu Ala Ala His Arg Pro Pro Leu Glu
35 40 45
Leu Arg Arg Cys Ser Gly Ala His Val Leu Glu Phe Leu Arg Tyr Leu
50 55 60
Asp Arg Phe Gly Lys Thr Arg Val His Glu Pro Pro Cys Pro Ser Tyr
65 70 75 80
Gly Gly Arg Ser Pro Ser Ala Ala Gly Pro Val Ala Ala Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Cys Gln Cys Pro Leu Arg Gln Ala Trp Gly Ser Leu Asp Ala Leu
100 105 110
Val Gly Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Asp Glu Arg His Gly Arg Ala Gly
115 120 125
Glu Pro Asp Ala Val Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Thr Asp Ser Thr
130 135 140
Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala Ala Asn Pro Phe Ala Ala Arg Ala Val
145 150 155 160
Arg Leu Tyr Leu Arg Asp Val Arg Asp Ala Gln Ala Met Ala Arg Gly
165 170 175
Ile Ser Tyr His Lys Lys Lys Lys Arg Arg Gly Gly Asn Met Asn Gly
180 185 190
Ala Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ala Arg Ala Gly Val Asn Asp Gly
195 200 205
Asp Ala Thr Ala Pro Pro Val Ala Val Thr Pro Gly Leu Pro Leu Pro
210 215 220
Pro Leu Pro Pro Cys Leu Asn Gly Val Pro Phe Glu Tyr Cys Asp Phe
225 230 235 240
Gly Ser Val Leu Gly Gly Ala His Gly Ala His Gly Gly His Gly Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Val Tyr Leu Pro Phe Leu Tyr
260 265 270
Asn Thr Phe Ser
275
<210> 4
<211> 276
<212> PRT
<213> 水稻(Oryza sativa L.)
<400> 4
Met Ser Ser Ser Ser Ala Ala Ala Leu Gly Ser Asp Asp Gly Cys Ser
1 5 10 15
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Cys Gln Cys Pro Leu Arg Gln Ala Trp Gly Ser Leu Asp Ala Leu
100 105 110
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115 120 125
Glu Pro Asp Ala Val Ala Gly Ala Gly Ala Val Ala Thr Asp Ser Thr
130 135 140
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145 150 155 160
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Gly Ser Val Leu Gly Gly Ala His Gly Ala His Gly Gly His Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Phe Tyr Gly Ala Gly Val Tyr Leu Pro Phe Leu Tyr
260 265 270
Asn Thr Phe Ser
275

Claims (4)

1.水稻短粒基因SHG1在减小水稻籽粒中的应用,其特征在于:所述水稻短粒基因SHG1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示,水稻短粒基因SHG1编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQID NO:4所示。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:减小水稻籽粒为水稻的粒长减小、粒宽不变。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于:使水稻灌浆更饱满,产量和品质相平衡。
4.一种调控禾本科植物籽粒发育的方法,其特征在于:包括用SEQ ID NO:2所示的基因SHG1转化禾本科植物细胞,再将转化后的禾本科植物细胞培育成植株,所述植株的籽粒变小,千粒重降低;所述禾本科植物为水稻。
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