DE69835144T2

DE69835144T2 - Verfahren zur herstellung von hybridem saatgut mittels bedingter weiblicher sterilität

Info

Publication number: DE69835144T2
Application number: DE69835144T
Authority: DE
Inventors: Marie Stacy Chapel Hill HARPER; Dean Lyle Chesterfield CROSSLAND; Erica Pittsboro PASCAL
Original assignee: Syngenta Participations AG
Current assignee: Syngenta Participations AG
Priority date: 1997-03-03
Filing date: 1998-02-27
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2018-02-28
Also published as: EP0972058A1; HUP0002390A3; AU725706B2; DE69835144D1; CN1249782A; EP0972058B1; HUP0002390A2; TR199902113T2; CA2281862C; UA73070C2; CA2281862A1; ES2263200T3; BR9808824A; AU6341098A; KR20000075938A; IL131505A0; PL336800A1; MX9908098A; WO1998039462A1; ATE332385T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Hybridsaatgut in Pflanzen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Hybridsaatgutherstellung unter Verwendung, als ein Elter des Hybrids, einer Pflanze, die mit einem chimären Gen transformiert ist, das bei Expression in den weiblichen Fortpflanzungsstrukturen ein Protein liefert, das die Umwandlung eines exogen eingesetzten Protoxins zu einem Toxin katalysiert, wodurch die Bestäubung unwirksam gemacht wird. Auch eingeschlossen in der Erfindung sind die Verwendung der konditional weiblich-sterilen Pflanzen in Kombination mit konditional männlich-sterilen Pflanzen zur wirksameren Herstellung von Hybridsaatgut, chimäre Gene, die nützlich für die Erfindung sind, transgene Pflanzen, die die chimären Gene umfassen, und neue Promotoren, die nützlich zur Expression in den weiblichen Fortpflanzungsstrukturen einer Pflanze sind.
Hintergrund der Erfindung
Heterosis in Nutzpflanzen hat beträchtliche Aufmerksamkeit wegen ihrer deutlichen Wirkung auf die Ertragsverbesserung gewonnen. Die erhöhte Produktivität beim Kreuzen unterschiedlicher Stämme von Mais wurde zuerst im späten 19. Jahrhundert bemerkt und wurde dann gemäß systematischen genetischen Verfahren entwickelt. Das gewöhnliche Verfahren zum Züchten von Hybridmais besteht in der Einrichtung vieler Inzuchtlinien, der Durchführung von Artenkreuzungen und der Bestimmung, welche Hybride produktiver in einer gegebenen Lokalität sind.
Der Erfolg von Hybridmais motivierte Pflanzenzüchter zur Untersuchung der Existenz und Stärke der Hybridvitalität (Heterosis) in vielen anderen Arten mit wirtschaftlicher Bedeutung. Allgemein weisen Hybride erhöhte Erträge im Vergleich mit Nicht-Hybridsorten auf. Hybride sind gewöhnlich effizienter in der Verwendung von Wachstumsfaktoren und ergeben einen größeren Ertrag pro Einheit für die Wachstumsfaktoren wie Wasser und Düngemittel. Unter Streß sind Hybride allgemein den Muttersorten überlegen mit einer stabileren Leistung über ein weites Spektrum von Umgebungen. Bei Hybriden gibt es eine Gleichförmigkeit von Produkt und Reife, die häufig die Ernte erleichtert und den Wert des Produkts auf dem Markt erhöht. Die Hybride kann auch Eigenschaften kombinieren, die schwierig oder unmöglich auf anderen Wegen zu kombinieren sind. Dies gilt besonders für viele interspezifische und intergenerische Hybride. Die allgemeine Schlußfolgerung aus der Forschung besteht darin, daß Hybridvitalität, ein übliches Phänomen in Pflanzen, von ausreichender Stärke ist, um eine kommerzielle Ausnutzung zu garantieren, falls geeignete Techniken entwickelt werden können.
Hybridvitalität wurde als ein weit verbreitetes Phänomen in Pflanzen und Tieren seit vielen Jahren erkannt. Kommerzielle Hybride werden jetzt umfassend in vielen Anbauten verwendet, einschließlich Mais, Sorghum, Zuckerrübe und Sonnenblume. Andere Anbauten mit großer Anbaufläche wie Weizen, Gerste und Reis werden noch primär als Inzuchtsorten kultiviert. Forschung wird für diese und andere Anbauten durchgeführt, die die weit verbreitete Verwendung von kommerziellen Hybriden in der Zukunft erlauben mag, aber der primäre beschränkende Faktor in der Entwicklung neuer Hybridanbauten ist das Fehlen von wirtschaftlichen Hybridsaatgut-Herstellungsverfahren in diesen Anbauten.
Herkömmlich wird die Hybridsaatgutproduktion im großen Maßstab durch das Pflanzen separater Reihen oder Blöcke von weiblichen Elternlinien und der männlichen Elternlinien zu ihrer Bestäubung erreicht. Nur das an den weiblichen Elternreihen erzeugte Saatgut wird geerntet. Zur Sicherstellung, daß dieses Saatgut Hybridsaatgut ist, das nicht mit geselbstetem Saatgut verunreinigt ist, müssen Bestäubungskontrollverfahren bei den weiblichen Elternpflanzen implementiert werden um sicherzustellen, daß an ihnen gebildete Samen aus der Kreuzbestäubung und nicht aus der Selbstbestäubung resultieren. Bekannte Bestäubungskontrollmechanismen sind allgemein mechanisch, chemisch oder genetisch.
Die Eliminierung von fruchtbaren Pollen aus dem weiblichen Elter kann durch Emaskulation von Hand bei einigen Arten wie Mais, einer einhäusigen Art, erreicht werden. Eine solche Eliminierung von fruchtbarem Pollen wird durch Herausziehen oder Abschneiden des männlichen Blütenstands (Quaste) aus Pflanzen in der weiblichen Elternpopulation erreicht. Dieses einfache Verfahren verhindert die Selbstbestäubung durch mechanisches Entfernen der Quaste aus weiblichen Pflanzen, bevor der Pollen verbreitet wird, um Selbstung zu verhindern. Jedoch haben die meisten Hauptanbaupflanzen von Interesse funktionelle männliche und weibliche Organe innerhalb der gleichen Blüte, was die Emaskulation unpraktisch macht. Selbst wenn sie prak tisch ist, ist diese Form der Hybridsaatgutproduktion äußerst arbeitsintensiv und daher kostspielig. Zur Eliminierung des mühseligen Entquastens, das zur Verhinderung der Selbstbestäubung in Hybridkreuzungen notwendig ist, wurden in manchen Arten genetische Faktoren verwendet, die männliche Sterilität erzeugen.
Männliche Sterilität in der weiblichen Pflanze kann durch Kerngene oder durch ein cytoplasmatisch-genetisches System kontrolliert werden. Die genetische männliche Sterilität wird durch Kerngene kontrolliert, in denen die Allele für Sterilität allgemein rezessiv gegenüber den Allelen für Fruchtbarkeit sind. Genetische männliche Sterilität tritt in vielen Arten auf. Gewöhnlich wird sie durch ein einzelnes rezessives Gen kontrolliert, das homozygot sein muß, um männliche Sterilität zu verursachen. Züchter, die genetische männliche Sterilität für die Hybridsaatgutproduktion verwenden, entwickeln gewöhnlich eine phänotypisch gleichförmige weibliche Linie, die in 50 % männlich-sterile und 50 % männlich-fruchtbare Individuen aufspaltet. Saatgut für diese Linien wird isoliert verstärkt durch Ernten von Saatgut aus Pflanzen, die homozygot für das männliche Sterilitätsgen sind und durch Pflanzen bestäubt werden, die heterozygot für das männliche Sterilitätsgen und deshalb männlich-fruchtbar sind. Zur Herstellung von kommerziellem Hybridsaatgut mit genetischer männlicher Sterilität müssen die 50 % männlich-fruchtbaren weiblichen Pflanzen vom Feld entfernt werden, sobald ihre Fruchtbarkeit identifiziert werden kann. Die mit dem Entfernen von fruchtbaren Pflanzen aus weiblichen Pflanzen verbundene Arbeit hat die Verwendung von genetischer männlicher Sterilität in der Herstellung von Hybridsaatgut stark eingeschränkt. Es gibt mehrere Probleme, die mit diesem System zur Herstellung von kommerziellem Hybridsaatgut verbunden sind. Zuerst ist es nicht möglich, fruchtbare Pflanzen von den gewünschten männlich-sterilen Pflanzen in der weiblichen Population zu eliminieren. Genetische männlich-sterile Pflanzen müssen durch Paaren mit männlichfruchtbaren Individuen aufrechterhalten werden. Die Hälfte der F₁-Pflanzen aus einer solchen Kreuzung wäre steril, aber die verbleibenden Pflanzen wären fruchtbar. Somit können die unerwünschten männlich-fruchtbaren Pflanzen in der weiblichen Population Pollen verbreiten und die Wirksamkeit des gewünschten männlich Elters reduzieren.
Die erfolgreiche Verwendung von cytoplasmatischer männlicher Sterilität für die kommerzielle Hybridsaatgutherstellung erfordert ein stabiles männlich-steriles Cytoplasma, eine angemessene Pollenquelle und ein wirksames System, um den Pollen aus dem männlichen Elter auf die männlich sterile weibliche Pflanze zu übertragen. Auch erfordert das cytoplasmatisch-genetische System der männlichen Sterilität drei Linien zur Herstellung einer einzelnen gekreuzten Hybride: die A-Linie (männlich-steril), die B-Linie (männlich-fruchtbarer Aufrechterhalter) und die R-Linie (männlichfruchtbar mit Restorergenen). Mit cytoplasmatisch-genetischer männlicher Sterilität erzeugte Dreiwegekreuzungen beinhalteten die Aufrechterhaltung und Produktion von vier Linien, einer A- und B-Linie einer Inzuchtlinie und männlich-fruchtbaren Inzuchtlinien der zwei anderen.
Außerdem zeigte die Südliche Maisfäule ("Southern Maize Blight"), die durch Helminthosporium maydis, Rasse T verursacht wird, die ernsthaft alle Maishybriden mit cytoplasmatischem männlich-sterilem T-Cytoplasma angriff, die Anfälligkeit einer Hybridsaatgut-Herstellungsindustrie auf Basis einer einzelnen Quelle für männlich-steriles Cytoplasma. Für Hybridmais sind die meisten Saatguthersteller zur händischen oder mechanischen Emaskulation und Windbestäubung zurückgekehrt.
Hybridsaatgut kann auch durch die Verwendung von Chemikalien hergestellt werden, die die lebensfähige Pollenbildung blockieren oder abtöten. Diese als Gametozide bezeichneten Chemikalien werden verwendet, um eine vorübergehende männliche Sterilität zu verleihen. Jedoch beschränken die Kosten und Verfügbarkeit der Chemikalien und die Verläßlichkeit der Anwendungen die Produktion von Hybridsaatgut durch die Verwendung von Gametoziden.
Molekulare Verfahren für die Hybridsaatgutherstellung wurden ebenfalls beschrieben. Solche Verfahren transformieren Pflanzen mit Konstrukten, die Antisense-DNA und andere Gene enthalten, die die Produktion von fruchtbarem Pollen in Pflanzen kontrollieren können. Solche regenerierten Pflanzen sind funktionell männlich-steril und werden zur Herstellung von Hybridsaatgut durch Kreuzung mit Pollen aus männlich-fruchtbaren Pflanzen verwendet. Die primären Mängel dieser Ansätze rühren aus der Tatsache her, daß das genetisch manipulierte männliche Sterilitätsgen, ob es Antisense oder RNAse ist, nur in einem heterozygoten Zustand aufrechterhalten werden kann. Sie sind grundsätzlich die gleichen wie natürliche genetische männlich-sterile Pflanzen, indem sie durch Kreuzung mit isogenen männlich-fruchtbaren Linien aufrechterhalten werden müssen. Dies ist höchst problematisch auf dem Hybridkreuzungsgebiet, wo die Anbaufläche groß und der Ertrag kritisch ist. Das heterozygote weibliche Elter, von dem nur 50 % männlich-steril sein werden, muß in Reihen neben dem männlichen Elter als Pollendonor gepflanzt und die 50 % fruchtbaren weiblichen Eltern entfernt werden. Dies wird in gentechnisch manipulierten genetischen männlich-sterilen Pflanzen leichter gemacht, weil ein Herbizidresistenzgen mit dem männlichen Sterilitätsgen verbunden werden kann und Herbizidbesprühung verwendet werden kann, um die fruchtbaren Pflanzen zu entfernen, aber es bedeutet dennoch, daß die weiblichen Elternreihen in doppelter Dichte gepflanzt werden müssen, um den gleichen Ertrag pro Fläche unseres Systems zu erhalten. Dies wird einen gewissen Ertragsverlust aufgrund von Konkurrenz verursachen. Die Herbizidbesprühung bedeutet ebenfalls einen Ertragsverlust, weil die resistenten Pflanzen niemals 100 % immun gegenüber dem Herbizid sind, und die Kosten für das Versprühen der Chemikalie sind beträchtlich.
Ein Mangel dieser herkömmlichen Hybridsaatgut-Herstellungssysteme ist die Notwendigkeit, separate Reihen oder Blöcke der männlichen und weiblichen Elternlinien zu pflanzen. Der physikalische Abstand zwischen den männlichen Pollendonor- und weiblichen Pollenempfängerpflanzen führt zu einer weniger effizienten Pollenübertragung, einem schlechten Saatgutansatz auf dem weiblichen Elter, zur Notwendigkeit, mehr Produktionsland für Pollendonorpflanzen zur Verfügung zu stellen, und zu weniger Ertrag an Hybridsaatgut pro Einheitsfläche Acker. Dieser Mangel ist besonders akut bei Anbauarten wie Weizen, die geringe Mengen von Pollen freisetzen und bei denen der Pollen nicht effektiv durch den Wind weitergetragen wird. Herkömmliche Hybridsaatgut-Herstellungsverfahren haben bei Einsatz für Weizen erfordert, daß ein Drittel bis zwei Drittel der Erzeugungsfläche den männlichen Pollendonorpflanzen zur Verfügung gestellt werden (Johnson und Schmidt, Adv. Agronomy 20:199–233 (1968); Wilson, Plant Breeding Reviews 303–309 (1989)). Das Ergebnis besteht darin, daß die Kosten der Hybridweizensaatgut-Herstellung zu hoch sind, um eine Industrie zu halten, trotz der Verfügbarkeit von Hybridsaatgut-Herstellungstechniken und der erwiesenen Heterosis.
Zum Erreichen eines wirtschaftlicheren Hybridsaatgut-Herstellungssystems für Weizen und andere Anbauten ist es notwendig, die männlichen und weiblichen Elternpflanzen enger aneinander zu führen, um einen effizienteren Pollentransfer zu bewirken. Anstelle der separaten Blöcke oder Reihen, so daß Saatgut aus nur den weiblichen Elternpflanzen geerntet werden kann, müssen die männlichen und weiblichen Elternpflanzen in den gleichen Reihen zwischengepflanzt werden, was bedeutet, daß die Pflanzen Zentimeter anstelle von Metern entfernt sind. Da es unpraktisch wäre, Saatgut aus nur den weiblichen Eltern zu ernten, wenn sie so nah beabstandet sind, um Eltern herzustellen, ist es notwendig, die Bildung von lebens fähigem Saatgut auf den männlichen Elternpflanzen zu verhindern, zusätzlich zur Verhinderung der Bildung von lebensfähigem Pollen auf den weiblichen Elternpflanzen.
Ein Verfahren zur Verhinderung der Bildung von lebensfähigem Saatgut ist die Verwendung von weiblich-sterilen Pflanzen. Natürlich vorkommende weibliche Sterilität wurde in mehreren Anbauten berichtet (Honma und Phatak, Journal of Heredity 55:143–145 (1964); Sniezdo und Winiarczyk, Protoplasma 187:31–38 (1995); Justus und Meyer, Journal of Heredity 54:167–168 (1963); Hanna und Powell, Journal of Heredity 65:247–249 (1974); Brown und Bingham, Crop Science 24:1207–1208 (1984)), aber es gibt Probleme bei der Aufrechterhaltung dieser Linien, und sie werden nicht kommerziell verwendet. Ein Verfahren zur Konstruktion eines dominanten weiblichen Sterilitätsgens wurde beschrieben ( EP 412 006 A1 (1990); Goldman et al., EMBO Journal 13:2976–2984 (1994)), aber erneut ist die Aufrechterhaltung einer dieses Gen enthaltenden weiblich-sterilen Linie aufgrund der Unfähigkeit problematisch, eine für das weibliche Sterilitätsgen homozygote Linie zu erzeugen. Ein Verfahren zur Aufrechterhaltung und Verwendung dieses weiblichen Sterilitätsgens in der Hybridsaatgutherstellung wurde beschrieben ( EP 402 270 (1990)). Jedoch erfordert es die Einführung eines weiblichen Sterilitätsgens, eines Restorergens eines ersten männlichen Sterilitätsgens, eines zweiten Sterilitätsgens und zweier Herbizidresistenzgene in einer komplexen Reihe von aufeinanderfolgenden Transformationen, um die weiblich-sterile männliche Elternlinie zu erzeugen, und es erfordert die Einführung des ersten männlichen Sterilitätsgens, eines Restorergens des weiblichen Sterilitätsgens und eines Herbizidresistenzgens in einer komplexen Reihe von aufeinanderfolgenden Transformationen, um die männlichsterile weibliche Elternlinie zu erzeugen. Eine Herbizidbehandlung ist erforderlich, um die richtigen Genotypen in jeder Runde der Linienvermehrung zu selektieren, und zur Herstellung des Hybridsaatguts muß das Erzeugungsfeld mit einem der Herbizide behandelt werden, um unerwünschte Genotypen abzutöten, die ein Ergebnis des Verfahrens sind. Obwohl das obige System den wirtschaftlichen Vorteil des Zwischenpflanzens der männlichen und weiblichen Linien liefern könnte, ist es zu komplex für die kommerzielle Anwendung.
Entsprechend besteht ein Bedarf an einem einfachen wirtschaftlichen Verfahren für die Hybridsaatgutherstellung.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Hybridsaatgutherstellung bereit, das das Herstellen einer konditional weiblich-sterilen Pflanze, die einen weiblich-bevorzugten Promotor umfaßt, der funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verbunden ist, die ein Enzym codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert, worin der weiblichbevorzugte Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Promotor, der aus dem pSH64-Klon mit der Eingangsnummer NRRL B-21920 isolierbar ist, einem Promotor, der aus dem pCIB10302-Klon mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz isolierbar ist, und einem Promotor besteht, der aus dem X2-1-Klon isolierbar ist, der die Nukleotide 1-1093 von SEQ ID NO: 14 umfaßt; das Zwischenpflanzen der konditional weiblich-sterilen Pflanze mit einer männlich-sterilen Pflanze; das Induzieren von weiblicher Sterilität durch Anwenden des Protoxins auf die konditional weiblich-sterile Pflanze und das Herstellen von Hybridsaatgut umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Pflanze entweder normal selbstbestäubt oder normal fremdbestäubt. In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist die Pflanze aus der Gruppe ausgewählt, die aus Mais, Weizen und Gerste besteht. Auch bereitgestellt durch die Erfindung werden Hybridsamen, die durch das Verfahren hergestellt werden.
Die Erfindung stellt ferner eine Expressionskassette bereit, die einen weiblich-bevorzugten Promotor umfaßt, der aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Promotor, der aus dem pSH64-Klon mit der Eingangsnummer NRRL B-21920 isolierbar ist, einem Promotor, der aus dem pCIB10302-Klon mit der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz isolierbar ist, und einem Promotor besteht, der aus dem X2-1-Klon isolierbar ist, der die Nukleotide 1-1093 von SEQ ID NO: 14 umfaßt, funktionsfähig verbunden mit einer codierenden Sequenz, die ein Enzym codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert. Eine bevorzugte Ausführungsform umfaßt einen weiblichbevorzugten Promotor, der funktionsfähig mit der codierenden Sequenz des argE-Gens verbunden ist. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform umfaßt den weiblich-bevorzugten Promotor aus entweder dem PSH64-Klon oder dem pCIB10302-Klon, funktionsfähig verbunden mit der argE-codierenden Sequenz. Zusätzliche Ausführungsformen der codierenden Sequenzen, die nützlich in der Erfindung sind, sind diejenigen, die aus dem P450_su1-Monoxygenase-Gen und dem pehA-Gen erhalten werden.
Auch bereitgestellt durch die Erfindung werden Pflanzen, die eine Expressionskassette der Erfindung umfassen, die den weiblich-bevorzugten Promotor umfassen, der funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verbunden ist, die ein Enzym codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert, und Samen solcher Pflanzen.
Auch hier beschrieben wird die Verwendung eines Protoxins in einem Verfahren zur Induzierung von weiblicher Fruchtbarkeit in einer Pflanze, die einen weiblich-bevorzugten Promotor umfaßt, der funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verbunden ist, die ein Enzym codiert, die die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert, und zur Induzierung von weiblicher Sterilität durch Ausbringen des Protoxins auf die Pflanze.
Auch hier beschrieben wird die Verwendung der codierenden Sequenz aus dem argE-Gen in einem Verfahren zur Herstellung von Hybridsaatgut, worin die argE-codierende Sequenz funktionsfähig mit einem weiblich-bevorzugten Promotor verbunden ist, der bei Expression die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert, um dadurch weibliche Sterilität zu induzieren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Definitionen und Nomenklatur
Der Begriff "weibliche Fortpflanzungsstruktur" wie hier verwendet bezeichnet diejenigen Teile einer Pflanze, die das Fruchtblatt oder Gynoeceum bilden (ein in Bezug auf das Gynoeceum verwendeter alter etablierter Begriff ist "Stempel"). Das Fruchtblatt einer Blüte einer Pflanze schließt ohne Beschränkung eine Narbe, einen Griffel, einen Fruchtknoten und Zellen oder Gewebe ein, die die Narbe, den Griffel und den Fruchtknoten umfassen. Ein "weiblich-bevorzugter" Promotor wie hier verwendet bezeichnet einen Promotor mit Transkriptionsaktivität nur in oder gewöhnlich in einer oder mehreren der Zellen oder Gewebe einer weiblichen Fortpflanzungsstruktur einer Pflanze.
"Expressionskassette" wie hier verwendet bezeichnet eine DNA-Sequenz, die die Expression eines Gens in Pflanzenzellen ausrichten kann, umfassend einen Promotor, der funktionsfähig mit einer Aminosäure-codierenden Region verbunden ist, die funktionsfähig mit einer Terminationsregion verbunden ist. Das Gen kann chimär sein, was bedeutet, daß wenigstens eine Komponente des Gens heterolog in Bezug auf wenigstens eine andere Komponente des Gens ist. Das Gen kann auch ein natürlich vorkommendes sein, das aber in rekombinanter Form erhalten wurde, die nützlich für die genetische Transformation einer Pflanze ist.
"Protoxin" wie hier verwendet bezeichnet eine Chemikalie mit minimaler Phytotoxizität, die durch die Wirkung eines Enzyms aktiviert werden kann, um ein Reaktionsprodukt zu erzeugen, das toxisch für Pflanzenzellen ist oder Pflanzenzellfunktionen in einer Weise stört, um das normale Wachstum, die normale Entwicklung oder die normale Stoffwechselaktivität zu verzögern, zu unterdrücken oder zu verhindern. Das toxische Reaktionsprodukt wird hier als "Toxin" bezeichnet. In der Erfindung wird das Protoxin exogen auf die Pflanze ausgebracht, was durch jedes Mittel erreicht werden kann, das die Blattabsorption, Wurzelabsorption, den direkten Kontakt mit den gezielten Pflanzenteilen oder die systemische Bewegung von einem der Teil der Pflanze auf einen anderen erleichtert.
"Weibliche Fruchtbarkeit" wie hier verwendet bedeutet, daß die weiblichen Fortpflanzungsstrukturen einer Pflanze die lebensfähige Saatgutbildung bei Bestäubung mit funktionellem oder lebensfähigem Pollen unterstützen können. "Weibliche Sterilität" wie hier verwendet bedeutet, daß die weiblichen Fortpflanzungsstrukturen einer Pflanze die lebensfähige Saatgutbildung bei Bestäubung mit funktionellem oder lebensfähigem Pollen nicht unterstützen können. "Konditionale weibliche Sterilität" wie hier verwendet bedeutet, daß weibliche Sterilität bei der exogenen Ausbringung eines Protoxins erzeugt wird, das anschließend durch ein Enzym zur Erzeugung eines toxischen Reaktionsprodukts aktiviert wird. "Männliche Sterilität" wie hier verwendet bedeutet, daß die männlichen Fortpflanzungsstrukturen einer Pflanze unfähig zur Erzeugung von lebensfähigem oder funktionellem Pollen sind.
Kontrolle der weiblichen Fruchtbarkeit in Pflanzen
Einer der vorteilhaften Aspekte der vorliegenden Erfindung ist ihre Verwendung in der Kontrolle der lebensfähigen Saatgutbildung in Pflanzen unter Feldbedingungen durch Kontrolle der weiblichen Fruchtbarkeit. Die Fruchtbarkeit der weiblichen Pflanze kann durch Erhalt einer transgenen Pflanze kontrolliert werden, die eine chimäre oder rekombinante Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Enzym codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert, das bei Expression unter der Kontrolle eines weiblich-bevorzugten Promotors die weiblichen Fortpflanzungsstrukturen unfähig zur fruchtbaren Saatgutbildung bei exogener Ausbringung des Protoxins machen wird. Die transgenen Pflanzen werden als konditional für weibliche Sterilität bezeichnet, weil das Erscheinen von weiblicher Sterilität durch die Gegenwart des Protoxins bedingt ist. Die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin in den weiblichen Fortpflanzungsstrukturen könnte die lebensfähige Saatgutbildung durch mehrere Mechanismen verhindern, abhängig davon, wann und in welchen Zellen oder Geweben der weiblichbevorzugte Promotor aktiv ist. Diese schließen ohne Beschränkung ein: 1) Störung der normalen Stempelentwicklung, so daß der Stempel nicht mehr kompetent ist, um eine Befruchtung zu erlauben, 2) Inhibierung des Pollenschlauchwachstums durch das umgewandelte Toxin, 3) Störung der Entwicklung von lebensfähigen Gameten und 4) Störung der Saatgutentwicklung nach Bestäubung.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Protoxin exogen auf transgene Pflanzen unter Feldbedingungen ausgebracht, und die Umwandlung des Protoxins zum Toxin erfolgt in der weiblichen Fortpflanzungsstruktur. Die lebensfähige Saatgutbildung wird durch die Wirkung des Toxins in der weiblichen Fortpflanzungsstruktur verhindert.
Codierende Sequenzen und in der Erfindung nützliche Protoxine
Nützliche codierende Sequenzen für die Erfindung schließen ohne Beschränkung jede Sequenz ein, die ein Protein codiert, das ein Protoxin zu einem Toxin umwandeln kann. Diese codierenden Sequenzen können entweder homologen oder heterologen Ursprungs sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die codierende Sequenz aus dem argE-Gen funktionsfähig mit einem weiblich-bevorzugten Promotor verbunden. Die Expression dieses chimären Gens in einer transgenen Pflanze führt zu konditionaler weiblicher Sterilität in Gegenwart des Protoxins N-Acetylphosphinothricin (N-Acetyl-PPT). Das Genprodukt des argE-Gens ist die N-Acetyl-L-ornithindeacetylase von E. coli, die eine breite Spezifität für die Hydrolyse von Substraten des Typs R₁-CO-NH-CH((CH₂)-R₂)-COOH hat. Als Ergebnis dieser Aktivität katalysiert das argE-Genprodukt die Umwandlung des Protoxins Acetylphosphinothricin zum Toxin Phosphinothricin (PPT) (Kiste et al., The Plant Journal 9:809–818 (1996)).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die codierende Sequenz aus dem Gen für die P450_su1-Monoxygenase, CPY105A1, funktionsfähig mit einem weiblich-bevorzugten Promotor verbunden. Diese Expression führt zu konditionaler weiblicher Sterilität in Gegenwart eines Sulfonamid-Protoxins. Die P450_su1-Monoxygenase aus Streptomyces griseolus vermittelt bei Ausrichtung auf den Chloroplasten die N-Dealkylierung der Sulfonylharnstoffverbindung R7402 (2-Methylethyl-2,2-dihydro-N-[(4,6-dimethoxypyrimidin-2-yl)aminocarbonyl]-1,2-benzoisothiazol-7-sulfonamid-1,1-dioxid) und wandelt sie zu einem Toxin um (O'Keefe et al., Plant Physiology 105:473–482 (1994)).
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die codierende Sequenz des pehA-Gens funktionsfähig mit einem weiblich-bevorzugten Promotor verbunden, und diese Expression führt zu konditional weiblicher Sterilität in Gegenwart des Protoxins, Glycerylglyphosat. Das Genprodukt des Burkholderia caryophili PG2982 pehA-Gens ist eine Phosphonatmonoesterhydrolase, die die Umwandlung des Protoxins Glycerylglyphosat zum Toxin Glyphosat katalysiert (Dotson et al., Plant Journal 10:383–392 (1996)).
Jede codierende Sequenz, die ein Enzym codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert, kann in der Erfindung verwendet werden, vorausgesetzt sie ist funktionsfähig mit einem weiblich-bevorzugten Promotor der Erfindung verbunden.
In der Erfindung nützliche Promotoren
Zur Durchführung der Erfindung ist es wünschenswert, daß die obigen Nukleotidsequenzen, die ein Enzym codieren, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert, funktionsfähig mit einer 5'-regulatorischen Sequenz verbunden sind, die ihre Expression in einer Weise ausrichtet, die bevorzugt für die weiblichen Fortpflanzungsstrukturen einer Pflanze ist. Diese Spezifität der Expression stellt sicher, daß die Wirkung des exprimierten Enzyms nur in denjenigen Geweben oder Zellen ausgeübt werden wird, die notwendig für die Bildung von lebensfähigen Samen sind, und nicht nachteilig für die Pflanze über ihre Wirkung auf die Fruchtbarkeit sein wird.
Weiblich-bevorzugte Gene, die nützlich für spezifische Pflanzenarten sind, können durch Isolieren neuer Transkripte, die in weiblichen Geweben exprimiert werden, unter Verwendung von Techniken kloniert werden, die den Fachleuten bekannt sind. Dies beinhaltet das Isolieren von RNA aus weiblichen Geweben wie Maisseide oder Weizenstempeln und das differentielle Durchmustern durch Techniken wie Differential-Display, PCR-Select-cDNA-Subtraktion und subtraktive cDNA-Bibliothekskonstruktion zur Isolierung von cDNA-Klonen, die bevorzugt in den weiblichen Geweben und nicht in anderen Teilen der Pflanze wie Blatt, Wurzel oder Quaste exprimiert werden. Die Gewebespezifität dieser klonierten cDNAs kann durch Northern-Analyse bestätigt werden. Die Promotorsequenzen für weiblich-bevorzugte Klone kann dann durch Verwendung der isolierten neuen cDNAs als Sonden für die genomische Bibliotheksdurchmusterung erhalten werden. Genomische Klone können isoliert werden, die 5'- und 3'-regulatorische Sequenzen enthalten, die für die Expression in weiblichem Gewebe benötigt werden. Diese Sequenzen können zur Konstruktion von Expressionskassetten zur Expression von chimären Genen in weiblich-bevorzugter Weise verwendet werden. Siehe zum Beispiel die hier beschriebenen Beispiele.
Andere, in der Erfindung nützliche regulatorische Elemente
Die 5'-regulatorische Region der Expressionskassette kann auch andere verstärkende Sequenzen einschließen. Es wurde festgestellt, daß zahlreiche Sequenzen die Genexpression in transgenen Pflanzen steigern. Zum Beispiel ist bekannt, daß eine Anzahl von nicht-translatierten Leitsequenzen, die aus Viren stammen, die Expression steigern. Spezifisch wurde gezeigt, daß Leitsequenzen aus dem Tabakmosaikvirus (TMV, die "W-Sequenz"), dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) und dem Luzernemosaikvirus (AMV) wirksam in der Steigerung der Expression sind (z.B. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15:8693–8711 (1987); Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15:65–79 (1990)). Andere fachbekannte Leitsequenzen schließen ohne Beschränkung ein:
Picornavirus-Leitsequenzen, z.B. die EMCV-Leitsequenz (Enzephalomyocarditis 5'-nichtcodierende Region) (O. Elroy-Stein, T.R. Fuerst und B. Moss, PNAS USA 86:6126–6130 (1989));
Potyvirus-Leitsequenzen, z.B. TEV-Leitsequenz (Tabakätzvirus) (Allison et al., (1986)); MDMV-Leitsequenz (Maiszwergmosaikvirus) (Virology 154:9–20);
Leitsequenz des Bindungsprotein (BiP) der schweren Kette von humanem Immunglobulin (D.G. Maccjak und P. Sarnow, Nature 353:90–94 (1991));
untranslatierte Leitsequenz aus der Hüllprotein-mRNA von Luzernemosaikvirus (AMV-RNA 4) (S.A. Jobling und L. Gehrke, Nature 325:622–625 (1987));
Tabakmosaikvirus-Leitsequenz (TMV) (D.R. Gallie et al., Molecular Biology of RNA, S. 237–256 (1989)) und
chlorotische Maisscheckungsvirus-Leitsequenz (MCMV) (S.A. Lommel et al., Virology 81:382–385 (1991)). Siehe auch Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965–968 (1987).
Es wurde gezeigt, daß verschiedene Intronsequenzen die Expression bei Addition zur 5'-regulatorischen Region steigern, insbesondere in einkeimblättrigen Zellen. Zum Beispiel wurde festgestellt, daß die Introns des Mais-Adhl-Gens signifikant in die Expression des Gens vom Wildtyp unter seinem zugehörigen Promotor bei Einführung in Maiszellen steigern (Callis et al., Genes Develop. 12:1183–1200 (1987)).
Zusätzlich zu Promotoren sind auch eine Vielzahl von 3'-Transkriptionsterminatoren verfügbar zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Transkriptionsterminatoren sind verantwortlich für die Termination der Transkription und korrekte mRNA-Polyadenylierung. Geeignete Transkriptionsterminatoren und diejenigen, die dafür bekannt sind, in Pflanzen zu funk tionieren, schließen den CaMV 35S-Terminator, den tm1-Terminator, den Nopalinsynthase-Terminator, den rbcS E9-Terminator aus der Erbse und andere fachbekannte ein. Diese können in sowohl einkeimblättrigen als auch zweikeimblättrigen Pflanzen verwendet werden.
Pflanzentransformation
Die Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung können in die Pflanzenzelle in einer Anzahl von fachlich anerkannten Weisen eingeführt werden. Die Fachleute werden einsehen, daß die Wahl des Verfahrens vom Pflanzentyp, d.h. einkeimblättrig oder zweikeimblättrig, abhängen kann, auf den für die Transformation abgezielt wird. Geeignete Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen schließen ohne Beschränkung die Mikroinjektion (Crossway et al., Bio Techniques 4:320–334 (1986)), die Elektroporation (Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602–5606 (1986)), die Agrobacterium-vermittelte Transformation (Hinchee et al., Biotechnology 6:915–921 (1988)), den direkten Gentransfer (Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717–2722 (1984)) und die ballistische Partikelbeschleunigung unter Verwendung von Vorrichtungen ein, die erhältlich sind von Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin, und BioRad, Hercules, California (siehe z.B. Sanford et al., US-PS 4,945,050 und McCabe et al., Biotechnology 6:923–926 (1988)). Siehe auch Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421–477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27–37 (1987) (Zwiebel); Christou et al., Plant Physiol. 87:671–674 (1988) (Sojabohne); McCabe et al., Bio/Technology 6:923–926 (1988) Sojabohne; Datta et al., Bio/Technology 8:736–740 (1990) (Reis); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4305–4309 (1988) (Mais); Klein et al., Bio/Technology 6:559–563 (1988) (Mais); Klein et al., Plant Physiol. 91:440–444 (1988) (Mais); Fromm et al., Bio/Technology 8:833–839 (1990) (Mais) und Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603–618 (1990) (Mais); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526–8530 (1990) (Tabakchloroplasten); Koziel et al., Biotechnology 11:194–200 (1993) (Mais); Shimamoto et al., Nature 338:274–277 (1989) (Reis); Christou et al., Biotechnology 9:957–962 (1991) (Reis); EP 0 332 581 ; Horn et al. (Knauelgras und andere Pooideae); Vasil et al., Biotechnology 11:1153–1558 (1993) (Weizen); Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077–184 (1993) (Weizen); Wan und Lemaux, Plant Physiol. 104:37–48 (1994) (Gerste).
Ein anderer besonders bevorzugter Satz von Ausführungsformen für die Einführung der Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung in Mais durch Mikroprojektilbombardierung wird in US-Patentanmeldung Nr. 08/008,374 beschrieben, die hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt wird. Eine zusätzliche bevorzugte Ausführungsform ist das Protoplastentransformationsverfahren für Mais, wie es in EP 0 292 435 sowie in US-PS 5,350,689 offenbart wird. Ein anderer besonders bevorzugter Satz von Ausführungsformen für die Einführung der Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung in Weizen durch Mikroprojektilbombardierung kann in US-PS 5,610,042 gefunden werden.
Die Transformation von Pflanzen kann mit einem einzelnen DNA-Molekül oder mehrfachen DNA-Molekülen (d.h. Co-Transformation) ausgeführt werden, und diese beiden Techniken sind geeignet zur Verwendung mit den Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung. Zahlreiche Transformationsvektoren sind für die Pflanzentransformation verfügbar, und die Expressionskassetten dieser Erfindung können in Verbindung mit jedem solchen Vektor verwendet werden. Die Auswahl des Vektors wird von der bevorzugten Transformationstechnik und der Zielart zur Transformation abhängen.
Viele Vektoren sind für die Transformation unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens erhältlich. Diese tragen typischerweise wenigstens eine T-DNA-Randsequenz und schließen Vektoren wie pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. (1984)) ein. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Expressionskassetten der vorliegenden Erfindung in einen der binären Vektoren pCIB200 und pCIB2001 zur Verwendung mit Agrobacterium inseriert werden. Diese Vektorkassetten für die Agrobacterium-vermittelte Transformation wurden in der folgenden Weise konstruiert. pTJS75kan wurde durch NarI-Verdau von pTJS75 geschaffen (Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164:446–455 (1985)), was das Ausschneiden des Tetracyclinresistenzgens erlaubte, gefolgt von Insertion eines AccI-Fragments aus pUC4K, das ein NPTII trägt (Messing & Vierra, Gene 19:259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184–187 (1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266–276 (1990)). XhoI-Linker wurden an das EcoRV-Fragment von pCIB7 ligiert, das die linken und echten T-DNA-Ränder, ein pflanzenselektierbares nos/nptII-chimäres Gen und den pUC-Polylinker enthält (Rothstein et al., Gene 53:153–161 (1987)), und das XhoI-verdaute Fragment wurde in SalI-verdautes pTJS75kan kloniert, um pCIB200 zu erzeugen (siehe auch EP 0 332 104 , Beispiel 19). pCIB200 enthält die folgenden besonderen Polylinker-Restriktionsorte: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI und SalI. Das Plasmid pCIB2001 ist ein Derivat von pCIB200, das durch die Insertion zusätzlicher Restriktionsorte in den Polylinker erzeugt wurde. Besondere Restriktionsorte im Polylinker von pCIB2001 sind EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HapI und StuI. pCIB2001 weist zusätzlich dazu, daß es diese besonderen Restriktionsorte enthält, auch eine pflanzliche und bakterielle Kanamycinselektion, linke und rechte T-DNA-Ränder für die Agrobacterium-vermittelte Transformation, die aus RK2 stammende trfA-Funktion zur Mobilisierung zwischen E. coli und anderen Wirten und die OriT- und OriV-Funktionen auch aus RK2 auf. Der pCIB2001-Polylinker ist geeignet zur Klonierung von pflanzlichen Expressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten.
Ein zusätzlicher Vektor, der zur Agrobacterium-vermittelten Transformation nützlich ist, ist der binäre Vektor pCIB10, der ein Gen, das Kanamycinresistenz zur Selektion in Pflanzen codiert, rechte und linke T-DNA-Randsequenzen enthält und Sequenzen aus dem Plasmid pRK252 für einen weiten Wirtebereich beinhaltet, was seine Replikation sowohl in E. coli als auch in Agrobacterium erlaubt. Seine Konstruktion wird von Rothstein et al. beschrieben, Gene 53:153–161 (1987). Verschiedene Derivate von pCIB10 wurden konstruiert, die das Gen für Hygromycin B-Phosphotransferase beinhalten, beschrieben von Gritz et al., Gene 25:179–188 (1983). Diese Derivate ermöglichen die Selektion von transgenen Pflanzenzellen auf Hygromycin allein (pCIB743) oder Hygromycin und Kanamycin (pCIB715, pCIB717).
Verfahren, die eine Form des direkten Gentransfer oder des Agrobacterium-vermittelten Transfer verwenden, werden gewöhnlich, aber nicht notwendigerweise, mit einem selektierbaren Marker unternommen, der Resistenz gegen ein Antibiotikum (z.B. Kanamycin, Hygromycin oder Methotrexat) oder ein Herbizid (z.B. Phosphinothricin) liefern kann. Die Wahl des selektierbaren Markers für die Pflanzentransformation ist jedoch nicht kritisch für die Erfindung, es sei denn die Expression dieser Resistenz und ihre biochemische Aktivität wechselwirken mit der Wahl der Umwandlung von Protoxin zu Toxin, die zur Verwendung in der Erzeugung von konditionaler Fruchtbarkeit gewählt wurde.
Für bestimmte Pflanzenarten können unterschiedliche Antibiotika- oder Herbizidselektionsmarker bevorzugt sein. Selektionsmarker, die routinemäßig in der Transformation verwendet werden, schließen das nptII-Gen ein, das Resistenz gegen Kanamycin und verwandte Antibiotika verleiht (Messing & Vierra, Gene 19:259–268 (1982); Bevan et al., Nature 304:184–187 (1983)), das bar-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Phosphinothricin verleiht (White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625–631 (1990)), das hph-Gen, das Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin verleiht (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4:2929–2931), das dhfr-Gen, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht (Bourouis et al., EMBO J. 2:1099–1104 (1983)) und das Mannosephosphatisomerasegen, das eine Selektion auf Mannose als Kohlenstoffquelle erlaubt ( EP 530 129 , WO 94/20627).
Ein solcher Vektor, der nützlich für direkte Gentransfertechniken in Kombination mit Selektion durch das Herbizid Basta (oder Phosphinothricin) ist, ist pCIB3064. Dieser Vektor beruht auf dem Plasmid pCIB246, das den CaMV 35S-Promotor in funktionsfähiger Fusion mit dem GUS-Gen aus E. coli und den CaMV 35S-Transkriptionsterminator umfaßt, und wird in WO 93/07278 beschrieben, hier durch Verweis eingeführt. Ein Gen, das für die Verleihung von Resistenz gegen Phosphinothricin nützlich ist, ist das bar-Gen aus Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al., EMBO J. 6:2519–2523 (1987)). Dieser Vektor ist geeignet zur Klonierung von Pflanzenexpressionskassetten, die ihre eigenen regulatorischen Signale enthalten. Es sollte jedoch festgestellt werden, daß die Verwendung von bar als selektierbarer Marker mit der Funktion der vorliegenden Erfindung wechselwirken kann, falls es auch in weiblichen Fortpflanzungsstrukturen exprimierbar ist. Dieses Problem kann durch die Verwendung von Promotoren ausgeräumt werden, die die Expression in den Zell- oder Gewebekulturen kontrollieren, die für die Transformation verwendet werden, aber nicht zur bar-Genexpression in den weiblichen Fortpflanzungsstrukturen führen.
Ein weiterer Transformationsvektor ist der Vektor pGL2 (Shimamoto et al., Nature 338:274–276 (1989)), der das Hygromycinphosphotransferase-Gen (hpt) aus Streptomyces enthält, funktionsfähig verbunden mit den 35S-Promotor- und 35S-Terminatorsequenzen.
Ein zusätzlicher Transformationsvektor ist pSOG35, der das E. coli-Gen für Dihydrofolatreduktase (DHFR) als selektierbaren Marker verwendet, der Resistenz gegen Methotrexat verleiht. PCT wurde zur Amplifizierung des 35S-Promotors (800 bp), von Intron 6 aus dem Mais-Adh1-Gen (550 bp) und von 18 bp der GUS-untranslatierten Leitsequenz aus pSOG10 verwendet. Ein 250 bp-Fragment, das das Dihydrofolatreduktasetyp II-Gen aus E. coli codiert, wurde auch durch PCR amplifiziert, und diese zwei PCR-Fragmente wurden mit einem SacI-PstI-Fragment aus pBI221 (Clonetech) zusammengesetzt, das das pUC19-Vektorgerüst und den Nopalinsynthase-Terminator umfaßte. Der Zusammenbau dieser Fragmente erzeugte pSOG19, das den 35S-Promotor in Fusion mit der Intron 6-Sequenz, der GUS-Leitsequenz, dem DHFR-Gen und dem Nopalinsynthase-Terminator enthält. Austausch der GUS-Leitsequenz in pSOG19 gegen die Leitsequenz aus dem chlorotischen Maisscheckungsvirus (MCMV) erzeugte den Vektor pSOG35. pSOG19 und pSOG35 tragen das aus pUC stammende Gen für Ampicillinresistenz und haben HindIII-, SphI-, PstI- und EcoRI-Orte, die zur Klonierung von Fremdsequenzen verfügbar sind.
Herstellung von Hybridsaatgut unter Verwendung von konditional weiblicher Sterilität
Zur Herstellung von Hybridsaatgut, das nicht mit Saatgut verunreinigt ist, das durch Selbstbestäubung erzeugt ist, müssen Bestäubungskontrollverfahren implementiert werden, um die Selbstbestäubung des weiblichen Elters zu verhindern und die Kreuzbestäubung durch das männliche Elter sicherzustellen. Dies wird gewöhnlich durch mechanische Verfahren, genetische männliche Sterilität oder chemische Hybridisierungsmittel (CHAs) erreicht. Zum Beispiel ist die derzeitige Praxis bei Mais das mechanische "Entquasten" des weiblichen (oder Samen-) Elters, was ein zeitaufwendiges und arbeitsintensives Verfahren ist. Bei Weizen ist die Kontrolle der Fruchtbarkeit durch mechanische Mittel unpraktisch auf der Saatgutherstellungsebene, und genetische Quellen für männliche Sterilität sind nicht kommerziell etabliert. Verfahren zur Hybridsaatgutherstellung auf Basis von allein Bestäubungskontrolle erfordern, daß Blöcke von männlichen Elternpflanzen physikalisch getrennt von Blöcken von weiblichen Elternpflanzen sind, da die männlichen Elternpflanzen Saatgut aus Selbstbestäubung erzeugen werden. Die Verwendung der vorliegenden Erfindung in der Herstellung von Hybridsaatgut bietet die Vorteile von Verlässlichkeit, einfacher Anwendung und, besonders wichtig, wird das Zwischenpflanzen von männlichen und weiblichen Elternpflanzen erlauben, was zu einem effizienteren Pollentransfer, der Notwendigkeit für weniger männliche Elternpflanzen und einer wirtschaftlicheren Hybridsaatgutproduktion führen wird.
Zur Herstellung von Hybridsaatgut unter Verwendung der Erfindung ist eine transgene Elternpflanze erforderlich, die ein Enzym exprimiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin in einer weiblich-bevorzugten Weise katalysiert. Der Erhalt von transgenen Pflanzen, die diesen Genotyp besitzen, wird oben beschrieben. Die transgenen Pflanzen, die die chimären oder rekombinanten Gene der vorliegenden Erfindung enthalten, können unter Verwendung normaler Pflanzenzüchtungsmethodiken homozygot hergestellt und unbeschränkt aufrechterhalten werden.
Auch erforderlich für die Herstellung von Hybridsaatgut gemäß der Erfindung ist eine Elternpflanze, die männlich steril ist. Männliche Sterilität ist das Versagen oder die Unfähigkeit zur Erzeugung von lebensfähigem oder funktionellem Pollen. Männliche Sterilität kann auch aus Störungen resultieren, die zur Nichtbildung von Pollen oder zum Fehlen von funktioneller Fähigkeit im Pollen bei seiner Bildung führen. Deshalb wird Pollen entweder nicht gebildet oder ist, falls gebildet, entweder nicht lebensfähig oder unfähig zur effektiven Befruchtung unter normalen Bedingungen.
Viele Quellen für männliche Sterilität zur Verwendung in der Hybridsaatgutproduktion sind bekannt (Kaul, Male Sterility in Higher Plants, Springer-Verlag (1988)). Natürlich vorkommende cytoplasmatische männliche Sterilitätsgene und ihre Verwendung wurden beschrieben für Mais (Levings, Science 250:942–947 (1990)), Weizen (Toriyama et al., Jpn. J. Breed. 43:517–524 (1993)), Tabak (Gerstel et al., Genetics 89:157–169 (1978)), Roggen (Steinborn et al., Theor. Appl. Genet. 85:822–824 (1993)), Sonnenblume (Crouzillat et al., Plant Mol. Biol. 16:415–426 (1991)), Sojabohne (Davis, US-PS 4,763,441 (1988)), Brassica (Grelon et al., Mol. Gen. Genet. 243:540–547 (1994)), Karotte (Kitagawa et al., Sex. Plant Reprod. 7:41–50 (1994)), Sorghum (Chen et al., Plant Mol. Biol. 28:799–809 (1995)), Reis (Kadowaki et al., Mol. Gen. Genet. 224:10–16 (1990)) und Gerste (Kaul und Singh, Cytobios 66:71–85 (1991)).
Die Konstruktion von chimären oder rekombinanten männlichen Sterilitätsgenen ist auch bekannt. Es wurde gezeigt, daß ein Gen, das eine β-1,3-Glucanase bei Expression aus einem Promotor codiert, der nur in den Tapetumzellen des Staubbeutels aktiv ist, männliche Sterilität in transgenen Pflanzen verursacht (Worrall et al., Plant Cell 4:759–771 (1992)). Es wurde bezeigt, daß ein Gen, das ein uneditiertes mitochondriales atp9-Gen aus Weizen codiert, männliche Sterilität bei Expression aus dem konstitutiven CaMV 35S-Promotor in transgenen Pflanzen verursacht (Hernould et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2370–2374 (1993)). Es wurde gezeigt, daß ein Gen, das ein RNAse-Enzym codiert, männliche Sterilität bei Expression aus einem Promotor verursacht, der nur in den Tapetumzellen des Staubbeutels in transgenen Pflanzen aktiv ist (DeBlock et al., Planta 189:218–225 (1993); EP 344 029 ; Mariani et al., Nature 347:737–741 (1990)). Es wurde gezeigt, daß die Expression einer Antisense-RNA, die komplementär zu einem Gen ist, das kritisch für die Pollenbildung ist, männliche Sterilität in transgenen Pflanzen verursacht ( EP 513 884 ).
Zusätzlich gibt es viele andere männlich-spezifische Promotoren, die allgemein fachbekannt sind und in der Konstruktion von chimären männlichen Sterilitätsgenen verwendet werden könnten. Diese schließen Promotorsequenzen zur Expression in Pollen, dem Tapetum oder anderen Strukturen im Staubbeutel ein. Beispiele für männlich-spezifische Promotoren schließen ohne Beschränkung den LAT52-Promotor (Twell et al., Dev. 109:705–13 (1989)), den A127-Promotor aus Tomate (Dotson et al., Plant J. 10:383–392 (1996)), den Zmg-Promotor aus Mais (Hamilton et al., Sex. Plant Reprod. 2:208–212 (1989)), den CDPK-Promotor aus Mais (Guerro et al., Mol. Gen Genet. 224:161–168 (1990)) und die Staubbeutel-spezifischen ant32- und ant43D-Promotoren ein, die in US-PS 5,477,002 offenbart werden, hier durch Verweis in seiner Gesamtheit eingeführt. Zusätzlich können Promotorsequenzen für Staubbeutel-spezifische cDNAs durch Isolieren der entsprechenden genomischen DNA-Sequenzen und Definieren der Promotor-regulatorischen Regionen kloniert werden, zum Beispiel durch Isolieren von Promotorsequenzen für das Orchideen-Pollenschlauch-spezifische P450 (Nadeau et al., Plant Cell 8:213–239 (1996)) und das Bcpl von Arabidopsis (Xu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:2106–2110 (1995)). In ähnlicher Weise können neue Gene, die männlich-spezifisch sind, durch eine Vielzahl von Techniken wie Differential-Display, PCR-Select-cDNA-Subtraktion und differentielle cDNA-Bibliotheksdurchmusterung isoliert werden. Nach Identifizierung können entsprechende genomische Sequenzen isoliert werden, die Promotorregionen charakterisiert werden und diese Sequenzen dann als Promotorregionen zur Konstruktion von Expressionskassetten verwendet werden, die in einer männlichspezifischen Weise exprimiert werden.
Die obigen künstlichen männlichen Sterilitätsgene haben den Nachteil, daß ihre Wirkung unkonditional und dominant ist. Sobald die transgene Pflanze geschaffen wird, ist sie immer männlich-steril, was die Aufrechterhaltung von Pflanzenlinien schwierig macht und es unmöglich macht, eine homozygote, wahre Züchtungspflanzenlinie zu schaffen.
Eine weitere Kategorie von männlichen Sterilitätsgenen wurde beschrieben, in denen der männlich-sterile Phänotyp konditional ist. In dieser Kategorie wird die männliche Fruchtbarkeit nur nach Ausbringung eines chemischen Protoxins gestört. In einem Beispiel für konditionale männliche Sterilität wurde ein Gen beschrieben, das eine N-Acetyl-L-ornithindeacetylase codiert, die die Umwandlung des Protoxins N-Acetyl-L-phosphinothricin zum herbiziden Toxin L-Phosphinothricin katalysiert (Kriete et al., Plant Journal 9:809–818 (1996); EP 531 716 A2 (1992)). Transgene Pflanzen, die dieses Gen in den Tapetumzellen des Staubbeutels exprimieren, wurden männlich-steril nur bei Behandlung mit dem N-Acetyl-L-phosphinothricin-Protoxin gemacht. In einem anderen Beispiel für konditionale männliche Sterilität wurde ein Gen beschrieben, das ein bakterielles Cytochrom P450 codiert, das die Umwandlung eines Sulfonylharnstoff-Protoxins R7402 zu einem herbiziden Toxin katalysiert (WO 91/03561; O'Keefe et al., Plant Physiology 105:473–483 (1994)). Transgene Pflanzen, die dieses Gen in den Tapetumzellen des Staubbeutels exprimieren, wurden männlich-steril nur bei Behandlung mit dem R7402-Protoxin gemacht. In einem anderen Beispiel für konditionale männliche Sterilität wurde ein Gen beschrieben, das eine Phosphonatmonoesterhydrolase codiert, die die Umwandlung des Protoxins Glycerylglyphosat zum herbiziden Toxin Glyphosat katalysiert (Dotson et al., Plant J. 10:383–293 (1996)). Transgene Pflanzen, die dieses Gen in den Tapetumzellen des Staubbeutels exprimieren, wurden männlich-steril nur bei Behandlung mit dem Glycerylglyphosat-Protoxin gemacht.
Jede der oben beschriebenen oder fachbekannten Quellen für männliche Sterilität könnte in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Dies schließt jedes natürlich vorkommende männlich-sterile genetische System oder die Transformation eines chimären oder rekombinanten Gens in die weibliche Elternlinie von Interesse ein.
Wie hier beschrieben wird die lebensfähige Saatgutbildung in der konditional weiblich-sterilen Pflanze (männlichen Elternpflanze) als Ergebnis der Umwandlung des Protoxins zum Toxin in den weiblichen Fortpflanzungsstrukturen verhindert, und die Pollenproduktion wird in der männlichsterilen Pflanze (weiblichen Elternpflanze) verhindert. Zum Erhalt von Hybridsaatgut wird homozygotes Saatgut aus dem männlichen Elter und dem weiblichen Elter in einem Produktionsfeld zwischengepflanzt, um somit den effizienten Pollentransfer zu erlauben. In einem Beispiel der Verwendung der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Hybridsaatgut ist das weibliche Elter männlich-steril durch ein beliebiges Mittel, und das männliche Elter wird manipuliert, um weiblich-steril in Gegenwart eines geeigneten exogen ausgebrachten Protoxins zu sein. Nach Ausbringung des Protoxins zum geeigneten Zeitpunkt während der Pflanzenentwicklung wird die einzige lebensfähige Saatgutproduktion ein Ergebnis des Pollens des männlichen Elters (weiblich-steril) sein, der die Samenanlagen des weiblichen Elters (männlich-steril) befruchtet. Im bevorzugten Modus der Verwendung der vorliegenden Erfindung wird das weibliche Elter manipuliert, so daß es bei Ausbringung eines Protoxins männlich-steril ist, wohingegen das männliche Elter manipuliert wird, so daß es in Gegenwart des gleichen Protoxins weiblich-steril ist. Zur Herstellung von Hybridsaatgut werden die zwei Elternlinien zwischengepflanzt, und nach Ausbringung des Protoxins zum geeigneten Zeitpunkt während der Pflanzenentwicklung wird nur Hybridsaatgut erhalten. Durch diese Mittel kann jedes gewünschte Hybridsaatgut hergestellt werden.
Zur Herstellung von Hybridweizensaatgut wird das männliche Elter manipuliert, so daß es weiblich-steril in Gegenwart eines geeigneten exogen ausgebrachten Protoxins ist, und das weibliche Elter wird manipuliert, so daß es männlich-steril in Gegenwart des gleichen Protoxins ist. Beide transgenen Elternlinien werden homozygot gemacht und das Saatgut durch Standardpraktiken der Industrie vermehrt. Für die Hybridsaatgutproduktion wird homozygotes Saatgut aus den manipulierten männlichen und weiblichen Elternlinien in einem Verhältnis von männlichen zu weiblichen Pflanzen zwischengepflanzt, das bestimmt wird, um eine effiziente Bestäubung sicherzustellen. Zu einem geeigneten Zeitpunkt während der Pflanzenentwicklung wird das Protoxin auf das Produktionsfeld ausgebracht. Nach der Samenreifung wird das gesamte Produktionsfeld geerntet, wobei nur Hybridsaatgut erhalten wird.
Beispiele
Die folgenden Beispiele beschreiben weiter die Materialien und Methoden, die in der Durchführung der Erfindung verwendet werden, und die anschließenden Ergebnisse.
Beispiel 1: Tabakpflanzen, die konditional für weibliche Sterilität sind
Plasmid pSH58 wurde konstruiert, das den ΔS13-Promotor enthält (–339 bis –79 des SLG₁₃-Promotors, fusioniert an –46 bis +8 des CaMV 35S-Promotors, Dzelkalns et al., Plant Cell 5:855–863 (1993), und an ein argE-Gen (SEQ ID NO: 3) im korrekten Translationsleseraster. Der ΔS13-Promotor ist ein weiblich bevorzugter Promotor.
Das argE-Gen wurde aus genomischer E. coli-DNA durch PCR-Reaktionen mit dem Primer 5'-TATCTAGACCAGAGGTGTGTCAACAAATGAA-3' (SEQ ID NO: 5) und dem Primer 5'-CGTCTAGATTGCGGCACTGGAGTTTC-3' (SEQ ID NO: 6) erhalten. Das resultierende Fragment wurde in pGEM-TA (Stratagene) kloniert, und die korrekte Sequenz wurde besättigt. Unter Verwendung einer Reihe von PCR- und Subklonierungsschritten wurden eine pflanzliche Translationskonsensus-Sequenz und ein BamHI-Ort stromaufwärts des argE-Translationsstartorts unter Verwendung der PCR-Primer 5'-CGCGGATCCTAAACAATGAAAAACAAATTACCGCC-3' (SEQ ID NO: 7) und GCGCCTAGGCGCTTAATGCCAGCAAAAATCC-3' (SEQ ID NO: 8) plaziert. Dieses Produkt wurde dann stromabwärts des ΔS13-Promotors in Plasmid pSH15 (ΔS13-Promotor in Bluescript sk) fusioniert und der nos-Transkriptionsterminator 3' zum β-Glucuronidase-(GUS)-Gen addiert. Diese ΔS13-argE-nos- Kasssette wurde dann als ein EcoRI-Fragment in pCIB200 ligiert, das T-DNA-Ränder und einen funktionalen pflanzenselektierbaren Marker, Kanamycinresistenz, enthielt. Dieses Plasmid wurde als pSH58 bezeichnet.
Plasmid pFA100 wird in einer ähnlichen Weise zu pSH58 oben konstruiert, außer daß das argE-Gen (SEQ ID NO: 3) das GUS-Gen in StigI-Gus (Goldman et al., EMBO J. 13:2976–2984 (1994)) im korrekten Translationsleseraster unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme ersetzt. Die StigI-argE-Fusion wird dann in einen Vektor wie pCIB200 ligiert, der T-DNA-Ränder, 3'-Terminationssequenzen und einen funktionellen pflanzenselektierbaren Marker wie Kanamycinresistenz enthält. Der StigI-Promotor ist ein weiblich-bevorzugter Promotor.
Tabakblattscheiben werden wie in Horsch et al. beschrieben, Science 227:1229–1231 (1985), mit pSH58 transformiert. Die Gegenwart der integrierten Transgene wird durch PCR bestätigt. Northern-Analyse von RNA, die aus weiblichem Gewebe hergestellt ist, wird zur Bestätigung der gewebespezifischen Expression des argE-Gens in den transgenen Pflanzen verwendet. Diese Pflanzen sind selbstfertil und haben den Phänotyp konditionaler weiblicher Sterilität. T1-Saatgut wird nach Selbstbestäubung gesammelt. Das weiblich konditionale Transgen in pFA100 wird auch in Tabak unter Verwendung ähnlicher Verfahren eingeführt.
Beispiel 2: Tabakpflanzen die konditional für männliche Sterilität sind
Plasmid pSH60 wurde mit dem TA29-Promotor (Kriete et al., Plant J. 9:809–818 (1996)), fusioniert an das argE-Gen, konstruiert. Der TA29-Promotor wurde aus Tabak durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-AACTGCAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3' (SEQ ID NO: 9) und 5'-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAAAAC-3' (SEQ ID NO: 10) kloniert. Durch eine Reihe von Subklonierungsschritten wurde das TA29-Fragment stromaufwärts von argE fusioniert, das die pflanzliche Konsensus-Translationssequenz wie in Beispiel 1 beschrieben enthält, und ein nos-Transkriptionsterminator 3' zum argE-Gen addiert. Die TA29-argE-nos-Kassette wurde zwischen T-DNA-Ränder in das Plasmid pSGCGF1 kloniert, das auch den pflanzenselektierbaren Marker Hygromycin enthält. Das resultierende Plasmid wurde als pSH60 bezeichnet.
Tabakblattscheiben wurden wie in Horsch et al. beschrieben, Science 227:1229–1231 (1985), mit pSH60 transformiert. Die Gegenwart der integrierten Transgene wird durch PCR bestätigt. Northern-Analyse von RNA, die aus weiblichem Gewebe hergestellt ist, wird zur Besättigung der gewebespezifi schen Expression des argE-Gens in den transgenen Pflanzen verwendet. Diese Pflanzen sind selbstfertil und haben den Phänotyp konditionaler männlicher Sterilität. T1-Saatgut wird nach Selbstbestäubung gesammelt.
Tabakblattscheiben werden auch mit pGK73 transformiert, das eine Expressionskassette des argE-Gens unter der Kontrolle des TA29-Promotors enthält (Kriete et al., Plant J. 9:809–818 (1996)), wie in Horsch et al. beschrieben, Science 227:1229–1231 (1985). Die Gegenwart der integrierten Transgene wird durch PCR bestätigt. Northern-Analyse von RNA, die aus Staubbeuteln hergestellt ist, wird zur Bestätigung der gewebespezifischen Expression des argE-Gens in den transgenen Pflanzen verwendet. Diese Pflanzen sind selbstfertil und haben den Phänotyp konditionaler männlicher Sterilität. Saatgut der T₁-Generation wird nach Selbstbestäubung gesammelt.
Beispiel 3: Chemische Behandlung von transformierten Tabakpflanzen verleiht gewebespezifische Sterilität
Saatgut der T₁-Generation aus sowohl konditional weiblich-sterilen Pflanzen (transformiert mit pFA100) als auch konditional männlich-sterilen Pflanzen (transformiert mit pGK73) wird im Boden eingepflanzt. Sobald Pflänzchen zu einer ausreichenden Größe herangewachsen sind, wird Blattgewebe durch PCR auf Gegenwart des argE-Transgens analysiert. PCR-positive Pflanzen werden in das Gewächshaus überführt. Diese Pflanzen sind vollständig fruchtbar in Abwesenheit von exogen eingesetztem Protoxin. Eine Untergruppe der konditional weiblich-sterilen Pflanzen und eine Untergruppe der konditional männlich-sterilen Pflanzen werden mit dem Protoxin Acetyl-PPT während der Wachstumsstadien behandelt. Als Ergebnis der bevorzugten Umwandlung von Protoxin zu Toxin werden die behandelten konditional männlich-sterilen Pflanzen männlich-steril, und die konditional weiblichsterilen Pflanzen werden weiblich-steril. Die unbehandelten Pflanzen bleiben vollständig fruchtbar. Pollen aus den behandelten weiblich-sterilen Pflanzen wird gesammelt und zur Bestäubung der Stempel von behandelten männlich-sterilen Pflanzen verwendet, die die weiblichen Elternpflanzen sind. Befruchtung erfolgt, und Hybridsaatgut wird auf den männlich-sterilen Pflanzen erzeugt.
Beispiel 4: Erhalt von DNA-Klonen von neuen Genen, die bevorzugt in weiblicher Fortpflanzungsstruktur von Mais exprimiert werden
Ein seidenspezifisches cDNA-Fragment wurde zuerst unter Verwendung des PCR-Select-cDNA-Subtraktionskits von Clontech (Clontech Kat. # K1804-01) identifiziert. PolyA-mRNA wurde aus sich entwickelnder Maisseide, ganzer Quaste, Blatt und Wurzelgeweben der Mais-Inzuchtlinie CG00526 unter Befol gung von Verfahren isoliert, die im Poly(A) Quick mRNA Isolation Kit (Stratagene Kat. # 200348) umrissen werden. cDNAs wurden aus polyA-mRNA von jedem Gewebe synthetisiert und in die "Tester-cDNA", die in diesem Fall durch Seiden-cDNAs dargestellt wird, und die "Treiber-cDNA" unterteilt, die aus gleichen Mengen von Quasten-, Blatt- und Wurzel-cDNAs zusammengesetzt ist. Die cDNA-Subtraktion und PCR-Amplifikation wurden wie im Anwenderhandbuch beschrieben durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden in einen TA-Klonierungsvektor, pCRII (Invitrogen Kat. # K2000-01), subkloniert. Jeder Subklon wurde auf Gewebespezifität in Northern-Blots mit 5 μg Gesamt-mRNA aus Maisseide, Quaste, Blatt und Wurzelgewebe durchmustert. Klon B200i mit einer Länge von 145 bp zeigte eine seidenspezifische Expression. Das B200i-seidenspezifische cDNA-Fragment wurde zur Durchmusterung einer sich entwickelnden Seiden-cDNA-Bibliothek verwendet. Die Seiden-cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von polyA-mRNA konstruiert, die aus Seiden isoliert wurde, die aus Kolben mit einer Länge von 18 cm entnommen wurden, unter Befolgen der Verfahren, die ausführlich dargestellt werden im Zap cDNA Gigapack II Gold Cloning Kit von Stratagene (Stratagene Kat. # 200402). Klone, die mit der B200i-Sonde hybridisieren, wurden zur Sequenzanalyse selektiert. Ein Klon mit einer Größe von 772 bp enthielt die B200i-Sondensequenz. Dieser Klon, B200i4-2, wurde als Sonde in Northern-Blots verwendet, die 1 μg polyA-mRNA aus Maisseide, Quaste, Blatt und Wurzelgewebe enthielten. Die Expression wurde nur in Seide detektiert. Die Sequenz des cDNA-Klons B200i4-2 ist in SEQ ID NO: 1 dargestellt.
Zur Isolierung der entsprechenden genomischen Region wurde die B200i4-2-cDNA als Sonde zur Durchmusterung einer genomischen Bibliothek von Mo17-Mais (Stratagene) verwendet. Lambda-Klone wurden isoliert, die stark mit der B200i4-2-Sonde hybridisierten. Southern-Analyse und Restriktionskartierung wurden zur Identifizierung genomischer Fragmente verwendet, die die jeweilige cDNA-Sequenz mit 5'- und 3'-Regionen enthielt. Ein BamHI-Fragment von circa 6,5 Kb wurde aus einem der positiven Lambda-Klone isoliert und in Bluescript SK+ (Stratagene) subkloniert und als pSH64 bezeichnet.
Der genomische B200i4-2-Klon, pSH64, der die 5'- und 3'-regulatorischen Regionen enthielt, wurde durch Sequenzanalyse analysiert. Computerisierte Abtastung wurde auch zur Identifizierung mutmaßlicher Promotorelemente verwendet. Die Sequenz der 5'- und 3'-regulatorischen Region des weiblich-bevorzugten Gens, das im genomischen Klon pSH64 enthalten war, ist in SEQ ID NO: 11 dargestellt. Der pSH64-Klon wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 27. Februar 1998 beim Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA hinterlegt und der Eingangsnummer NRRL B-21920 zugewiesen.
Ein chimäres Gen, das in einer bevorzugten Weise in weiblichen Fortpflanzungsstrukturen exprimiert wird, wird die folgt konstruiert. Die 431 bp 5'-regulatorische Region von B200i wurde aus pSH64 durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-AAAACTGCAGGAATTCACTGCTGAGGGAGCGA-3' (SEQ ID NO: 12) und 5'-GCGGGATCCTTCTTGCTGTAGTCCTCGACCACG-3' (SEQ ID NO: 13) amplifiziert und als PStI-BamHI-Fragment in pSOG10 kloniert, das an die nos-Terminationssequenzen fusioniertes GUS enthält. Die B200i-Gus-nos-Kassette wurde dann als EcoRI-Fragment in mit EcoRI verdautes pSH64 subkloniert, was effektiv GUS-nos stromabwärts der B200i-regulatorischen Region voller Länge plazierte (Nukleotide 1-3790 von SEQ ID NO: 11). Dieses Plasmid wurde als pSH70 bezeichnet.
Die B200i-regulatorische Region aus pSH70 wie oben beschrieben wurde als BglII-BamHI-Fragment in BS-KS (Stratagene) kloniert, und die 3'-regulatorische Region von B200i aus pSH64 wurde stromabwärts als EcoRV-Fragment addiert (Nukleotide 4427-6397 aus SEQ ID NO: 11). Dieses Plasmid wurde als pSH73 bezeichnet. Plasmid pSH74 wurde durch einen partiellen BamHI-Verdau von pSH73 und durch Ligieren in ein DNA-Fragment konstruiert, das argE (aus Beispiel 1) am BamHI-Ort enthielt, wodurch effektiv argE zwischen die 5'- und 3'-regulatorischen Regionen von B200i plaziert wurde.
Beispiel 5: Erhalt von cDNA-Klonen von neuen Genen, die bevorzugt in der weiblichen Fortpflanzungsstruktur von Weizen exprimiert werden
Ein stempelspezifisches cDNA-Fragment wurde aus UC703-Weizen unter Verwendung des mRNA-Differential-Display-Verfahrens von Genhunter (Genhunter Kat. # M502) wie im Protokoll des Kits beschrieben isoliert. Die zur Identifizierung des stempelspezifischen cDNA-Fragments verwendeten Primer waren AP-18 und T₁₂ CA. Das Fragment wurde in einen pGEM-TA-Klonierungsvektor (Promega Kat. # A362A) subkloniert und als P26 bezeichnet. Der P26-Klon wurde als Sonde an Northern-Blots verwendet, die 5 μm Voll-mRNA aus Weizenstempel, Staubbeutel, Blatt und Wurzelgewebe enthielten, und die Gewebespezifität wurde bestätigt. Eine Weizenstempel-cDNA-Bibliothek wurde unter Verwendung von Stempeln konstruiert, die aus UC703-Weizen isoliert wurden, unter Befolgen der im Zap cDNA Gigapack II Gold Cloning Kit von Stratagene (Stratagene Kat. # 200402) umrissenen Verfahren. Klone, die mit der P26-Sonde hybridisierten, wurden zur Sequenzanalyse selektiert. Ein Klon, P26-A4, hatte eine Länge von 881 bp und enthielt die P26-Sequenz mit 203 bp. Northern-Blots, die 5 μm Voll-mRNA aus vier Entwicklungsstadien der Stempel enthielten, A) Fahnenblattscheide ("boot"), B) aufgegangen, C) reif und D) befruchtet, sowie Staubbeutel, Blatt und Wurzel wurden mit der 881 bp P26-A4-Sonde hybridisiert. Eine vorherrschende Stempelexpression wurde im Stempel detektiert, wobei eine sehr geringfügige Expression in der Wurzel detektiert wurde.
Ein zweites stempelspezifisches cDNA-Fragment wurde auch aus UC703-Weizen unter Verwendung von Verfahren isoliert, die ähnlich den obigen waren. Dieses Fragment wurde in einen pGEM-TA-Klonierungsvektor (Promega Kat. # A362A) subkloniert und als P19 bezeichnet. Der P19-Klon wurde als Sonde in Northern-Blots verwendet, die 5 μg Voll-mRNA aus Weizenstempel, Staubbeutel, Blatt und Wurzelgewebe enthielten, und die Gewebespezifität wurde bestätigt. Eine Weizenstempel-cDNA-Bibliothek wurde wie oben beschrieben konstruiert. Klone, die mit der P19-Sonde hybridisierten, wurden zur Sequenzanalyse selektiert. Ein Klon, P19-QA, hatte eine Länge von 649 bp und enthielt die P19-Sequenz. Northern-Blots, die 5 μg Voll-mRNA aus vier Entwicklungsstadien der Stempel enthielten, A) Fahnenblattscheide, B) aufgegangen, C) reif und D) befruchtet, sowie Staubbeutel, Blatt und Wurzel wurden mit der 649 bp P19-QA-Sonde hybridisiert. Expression wurde als für den Stempel bevorzugt nachgewiesen.
Beispiel 6: Erhalt genomischer Klone von neuen Genen, die bevorzugt in weiblichen Fortpflanzungsstrukturen von Weizen exprimiert werden, und Identifizieren der Pramotorregion
Zur Isolierung der entsprechenden genomischen Region wurde die P26-A4-cDNA als Sonde zur Durchmusterung einer maßgeschneiderten genomischen Bibliothek aus UC703-Weizen verwendet, die aus 2 Wochen alten Sämlingen hergestellt wurde. Die Bibliothek wurde durch partiellen MboI-Verdau von vollständiger genomischer DNA und anschließende Ligation der Fraktion mit 8-22 kb Größe mit BamHI-verdauter Lambda-EMBL3-DNA (Clontech Kat. # CS1013j) konstruiert. Lambda-Klone wurden isoliert, die stark mit der P26-A4-Sonde hybridisierten. Southern-Analyse und Restriktionskartierung wurden zur Identifizierung genomischer Fragmente verwendet, die die jeweilige cDNA-Sequenz mit 5'- und 3'-Regionen enthielt. Ein 5,5 kb XbaI-Fragment wurde aus einem der positiven Lambda-Klone isoliert und in Bluescript SK+ (Stratagene) subkloniert. Dies wurde als pCIB10302 bezeichnet.
Der genomische P26-A4-Klon, pCIB10302, der 5'-regulatorische Regionen enthält, wurde durch Sequenzanalyse analysiert. Computerisierte Abtastung wird auch zur Identifizierung mutmaßlicher Promotorelemente verwendet. Ferner werden die 5'-Regionen durch Endonukleaserestriktionsenzyme kartiert, und der Transkriptionsstartort wird durch RACE PCR und RNAse-Schutzverfahren bestimmt. Die Sequenz der 5'-regulatorischen Region des weiblich-bevorzugten Gens, das im genomischen Klon P26-A4 enthalten ist, wird in SEQ ID NO: 2 dargestellt.
Zur Isolierung der entsprechenden genomischen Region wurde die P19-cDNA als Sonde zur Durchmusterung einer maßgeschneiderten genomischen Bibliothek aus UC703-Weizen verwendet, die aus 2 Wochen alten Sämlingen wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt wurde. Lambda-Klone wurden isoliert, die stark mit der P19-Sonde hybridisierten. Southern-Analyse und Restriktionskartierung wurden zur Identifizierung genomischer Fragmente verwendet, die die jeweilige cDNA-Sequenz mit 5'- und 3'-Regionen enthält. Ein XhoI-Fragment mit ~8 Kb wurde aus einem der positiven Lambda-Klone isoliert und in Bluescript SK+ (Stratagene) subkloniert, bezeichnet als X2-1.
Der genomische P19-Klon, der die 5'- und 3'-regulatorischen Regionen enthält, wurde durch Sequenzanalyse analysiert. Computerisierte Abtastung wurde auch zur Identifizierung mutmaßlicher Promotorelemente verwendet. Ferner wurden die 5'- und 3'-Regionen durch Endonukleaserestriktionsenzyme kartiert. Die Sequenz der 5'-regulatorischen Region des weiblich-bevorzugten Gens, das im genomischen Klon X2-1 enthalten ist, ist in SEQ ID NO: 14 dargestellt.
Beispiel 7: Konstruktion chimärer Gene, die in einer bevorzugten weise in weiblichen Fortpflanzungsstrukturen exprimiert werden
Plasmid pFA200 wurde durch operatives Verbinden der folgenden Komponenten unter Verwendung von fachbekannten Standardverfahren konstruiert: 1) Die P26-regulatorischen Regionen wie oben beschrieben (Nukleotide 1-3987), 2) ein DNA-Fragment, das das argE-Gen enthält, konstruiert mit geeigneten Restriktionsorten zur Fusion des ATG des offenen Leserasters von argE im Raster mit dem Translationsstartort (ATG bei Nukleotid 3987) des P26-Fragments, wodurch die regulatorische stromaufwärts gelegene Region von P26 mit argE fusioniert wird, und 3) ein Vektor, der 3'-Terminationssequenzen enthält, die funktionell in Pflanzen sind. Die Expression von argE unter der Kontrolle des P26-Promotors wird das argE-Genprodukt bevorzugt in der weiblichen Fortpflanzungsstruktur der Pflanze exprimieren.
Die P19 5'-regulatorischen Regionen (Nukleotide 1-1093 von SEQ ID NO: 14), geschnitten mit PstI, einem gerade stromaufwärts der P19-Sequenzen im X2-1-Plasmid gefundenen Restriktionsenzymort, und NcoI (Nukleotid 1088 aus SEQ ID NO: 14) am ATG von P19, wurden an pSOG15 ligiert, das mit PstI und NcoI geschnitten war (pSOG15 enthält das GUS-Gen und den nos-Terminator mit einem PstI-Ort 5' zum GUS-Gen und NcoI am ATG des GUS-Gens). Dieses Plasmid wurde als pXB1 bezeichnet.
Plasmid p19arg wird durch funktionsfähiges Verbindungen unter Verwendung fachbekannter Standardverfahren der folgenden Komponenten konstruiert: 1) Die P19-regulatorischen Regionen wie oben beschrieben, 2) ein DNA-Fragment, das das argE-Gen enthält, das mit geeigneten Restriktionsorten zur Fusion des ATG des offenen Leserasters von argE im Raster mit dem Translationsstartort (ATG bei 1090 von SEQ ID NO: 14) des P19-Fragments manipuliert ist, wodurch die stromaufwärts gelegene regulatorische Region von P19 mit argE fusioniert wird, und 3) ein Vektor, der 3'-Terminationssequenzen enthält, die in Pflanzen funktionell sind. Expression von argE unter der Kontrolle des P19-Promotors wird das argE-Genprodukt vorzugsweise in der weiblichen Fortpflanzungsstruktur der Pflanze exprimieren.
Transiente Expression von Genen in weiblichen Fortpflanzungsstrukturen wurde durch Übertragung auf intakte Gewebe bestimmt. Weizenblütengewebe (Stempel und Staubbeutel) wurde auf Murashige-Skoog-Medium ausplattiert, das 15 % Maltose enthielt. DNA von pXB1 oder pSH70 wurde auf Goldpartikel in Mikrometergröße unter Verwendung von Standardverfahren ausgefällt. Zwei Zielplatten mit 20 Stempeln und Staubbeuteln pro Ziel wurden 2- oder 3-mal mit der Dupont Biolistics^® Heliumvorrichtung unter Verwendung eines Berstdrucks von 1.100 psi beschossen. Die Platten wurden mit einem Gitter mit 80 mesh zwischen dem Trägerstand und dem Ziel beschossen. Die Ziele wurden für 16 Stunden bei 26°C nach der Bombardierung in die Dunkelheit gestellt, bevor die Gewebe auf GUS-Entwicklungsmischung (100 mg X-gluc in 200 ml 0,05 M Natriumphosphat pH 7) für 2 bis 24 Stunden bei 37°C überführt wurden. Die GUS-Gene in pXB1 und pSH70 erzeugten GUS-Aktivität in den Stempeln. Transiente Transformationsassays von pSH70 in Maisseidengewebe zeigten Expression von GUS in den weiblichen Geweben.
Beispiel 8: Transformation von Weizen mit einem chimären Gen, das ein Protein codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin in einer weiblich-bevorzugten weise katalysiert
Unreife Embryos (0,75–1,0 mm Länge) des Genotyps UC703 werden auf Murashiga-Skoog-Medium ausplattiert, das 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthält. Nach circa 4 Stunden werden die Embryos mit der Seite der Embryoachse nach unten auf Platten ausplattiert, die Murashige-Skoog-Medium mit 15 % Maltose, 3 % Saccharose und 3 mg/l 2,4-D enthalten, beschichtet mit einem auf Filterpapier gestützten Block aus Agarose, der die gleichen Komponenten enthält. Man läßt die Embryos für 2–3 Stunden vor der Bombardierung plasmolysieren.
DNA von pFA200 und pSOG35 wird auf Goldpartikel von Mikrometergröße unter Verwendung von Standardverfahren ausgefällt. Vier Zielplatten mit 20 Embryos pro Ziel werden zweimal mit der DuPont Biolistics^® Heliumvorrichtung unter Verwendung eines Berstdrucks von 1.100 psi beschossen. Die Platten werden mit einem Gitter mit 80 mesh zwischen dem Trägerstand und dem Ziel beschossen. Die Ziele werden für 24 Stunden bei 26°C nach der Bombardierung in die Dunkelheit gestellt, bevor die Blöcke mit den Embryos auf Platten gelegt werden, die Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthalten. Die individuellen Embryos werden aus den Blöcken entfernt und direkt auf frisches Medium der gleichen Zusammensetzung nach weiteren 48 Stunden plaziert.
Circa 6 Wochen nach der Genübertragung wird das ansprechende Gewebe auf Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose mit 0,2 mg/l Methotrexat für einen Zeitraum von 3 Wochen plaziert. Das Gewebe wird dann auf ein Regenerationsmedium plaziert, das aus Murashige-Skoog-Medium mit 1 mg/l Zeatinribosid und 1 mg/l Methotrexat zusammengesetzt ist. Nach 2 Wochen werden regenerierende Pflänzchen in als "GA7s" bezeichnete sterile Behälter mit halbkonzentrierten Murashige-Skoog-Salzen, 2 % Saccharose, 1 mg/l NAA und entweder 4 oder 8 mg/l Methotrexat plaziert.
In einem weiteren Beispiel werden unreife Embryos (0,75–1,0 mm Länge) des Genotyps UC703 wie oben beschrieben verarbeitet, außer daß Murashige-Skoog-Medium verwendet wird, das 2 mg/l 2,4-D enthält. Nach circa 4 Stunden werden die Embryos mit der Seite der Embryoachse nach unten auf Platten ausplattiert, die Murashige-Skoog-Medium mit 15 % Maltose, 3 % Saccharose und 2 mg/l 2,4-D enthalten, überschichtet mit einem auf Filterpapier gestützten Block aus Agarose, der die gleichen Komponenten enthält. Man läßt die Embryos für 2–3 Stunden vor der Bombardierung plasmolysieren.
DNA von pFA200, pSH74 oder p19arg, neben pUbi-Hyg, das den Mais-Ubiquitinpromotor funktionsfähig verbunden mit dem Hygromycinphosphotransferase-Gen enthält, wird auf Goldpartikel von Mikrometergröße unter Verwendung von Standardverfahren ausgefällt. Vier Zielplatten mit 20 Embryos pro Ziel werden zweimal mit der Dupont Biolistics^® Heliumvorrich tung unter Verwendung eines Berstdrucks von 1.100 psi beschossen. Die Platten werden mit einem Gitter mit 80 mesh zwischen dem Trägerstand und dem Ziel beschossen. Die Ziele werden für 24 Stunden bei 26°C nach der Bombardierung in die Dunkelheit plaziert, bevor die Blöcke mit den Embryos auf Platten gelegt werden, die Murashige-Skoog-Medium mit 2 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose enthalten.
Circa 3 Wochen nach der Genübertragung wird das ansprechende Gewebe auf Murashige-Skoog-Medium mit 3 mg/l 2,4-D und 3 % Saccharose plaziert. Das Gewebe wird dann auf ein Regenerationsmedium plaziert, das aus Murashige-Skoog-Medium, 3 % Saccharose, 5 mg/l GA3, 1 mg/l NAA und 20 mg/l Hygromycin zusammengesetzt ist. Nach 2 Wochen werden regenerierende Gewebe auf Medium überführt, das aus Murashige-Skoog-Medium mit 3 % Saccharose und 20 mg/l Hygromycin zusammengesetzt ist. Nach 2 Wochen werden die regenerierenden Pflänzchen in als "GA7s" bezeichnete sterile Behälter mit halbkonzentrierten Murashige-Skoog-Salzen, 2 % Saccharose, 1 mg/l NAA und 20 mg/l Hygromycin plaziert.
DNA wird aus Blattgewebe von Pflanzen extrahiert, die aus der Transformation stammen, und PCR wird auf Gegenwart der dhfr oder hyg selektierbaren Markergene und des argE-Gens durchgeführt. Die PCR-positiven Pflanzen werden zur Vermehrung in das Gewächshaus überführt. Während der Blütestadien werden Stempel aus jeder transgenen Pflanze gesammelt und RNA aus diesem Gewebe hergestellt. Expression von argE wird durch Northern-Analyse bestätigt. Die Pflanzen werden selbstbestäubt, und Saatgut wird gesammelt.
Beispiel 9: Konstruktion von chimären Genen, die in einer bevorzugten Weise in männlichen Fortpflanzungsstrukturen exprimiert werden
Plasmid pGK73 wird als Ausgangspunkt verwendet. Die TA29-argE-3'-Terminationssequenzen werden als Kassette aus dem Agrobacterium-Transformationsvektor entfernt und in pBluescript KS+ unter Verwendung geeigneter Restriktionsenzyme ligiert. Das resultierende Plasmid wird als pMA200 bezeichnet.
Der staubbeutelspezifische Promotor B6 wurde aus Plasmid pSGBNE1 konstruiert, das einen 3 kb genomischen Klon enthält, subkloniert als EcoRI-NheI-Fragment aus pSGB6g1 (siehe US-PS 5,470,359 ). Ein 1558 bp ApaII/XbaI-Fragment wurde abgestumpft in Bluescript (KS) am SmaI-Ort kloniert. Eine Translationsfusion mit dem argE-Gen wurde wi zuvor in Beispiel 2 beschrieben konstruiert. Das resultierende Plasmid wird als pSH68 bezeichnet.
Der pollenspezifische Promotor Zmg, ein 1 kb HindIII-PpuMI-Fragment von Zmg13 (Hamilton et al., Sexual Plant Reproduction, 2:208–212 (1989)), wurde aus pCIB391 in Bluescript als ein HindIII-SmaI-Fragment kloniert. Die nos-Transkriptionsterminationsregion wurde als BamHI-XbaI-Fragment addiert. Die codierende Sequenz für argE als BamHI-Fragment (aus Beispiel 1) wurde dann am BamHI-Ort ligiert, wodurch effektiv argE zwischen den Zmg-Promotor und die nos-Terminationssequenzen plaziert wurde. Dieses Plasmid wird als Zmgarg bezeichnet.
Beispiel 10: Transformation von Weizen mit einem chimären Gen das in einer männlich-bevorzugten Weise exprimiert
Die Plasmide pUbi-Hyg, das den Mais-Ubiquitinpromotor funktionsfähig verbunden mit dem Hygromycinphosphotransferase-Gen enthält, und pMA200 oder pSH68 oder pZmgarg werden als rekombinante Sequenzen zur Transformation von unreifen Weizenembryos wie in Beispiel 8 beschrieben verwendet. Pflanzen werden regeneriert, und PCR wird zur Bestätigung der Gegenwart des argE-Transgens verwendet. Transgene Pflanzen werden in das Gewächshaus überführt. Während der Blütestadien werden Staubbeutel gesammelt und RNA aus diesem Gewebe hergestellt, und die argE-Expression wird durch Northern-Analyse bestätigt. Die Pflanzen werden selbstbefruchtet, und Saatgut wird gesammelt.
Beispiel 11: Transformation von Mais mit einem chimären Gen, das ein Protein codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin in einer weiblich-bevorzugten Weise katalysiert
Typ I-Kallus wird aus unreifen zygotischen Embryos des Genotyps 0000526 unter Verwendung von Standardkulturtechniken erhalten. Zur Genübertragung werden circa 300 mg des Typ I-Kallus durch Zerkleinern mit einer Skalpellklinge unter 3-maligem Spülen mit Standardkulturmedium, das 18 % Saccharose enthält, hergestellt und unmittelbar auf halbfestes Kulturmedium plaziert, das wiederum 18 % Saccharose enthält. Nach circa 4 Stunden wird das Gewebe unter Verwendung der PDS-1000/He Biolistic-Vorrichtung von BioRad bombardiert. Eines der folgenden Plasmide: pFA200, pSH74 oder p19arg, neben pSOG35, wird auf 1 μm Goldpartikel unter Verwendung des Standardprotokolls von BioRad ausgefällt. Circa 16 Stunden nach der Genübertragung wird der Kallus auf Standardkulturmedium überführt, das 2 % Saccharose und 2 mg/l Methotrexat enthält. Der Kallus wird zur Selektion für 8 Wochen subkultiviert, worauf überlebender und wachsender Kallus auf Standardregenerationsmedium zur Herstellung von Pflanzen überführt wird. Pflanzen werden erhalten und mit Ereignisnummern versehen. Pflanzen aus jedem Ereignis werden durch PCR auf Gegenwart des argE-Gens getestet, und PCR-positive Pflanzen werden in das Gewächshaus überführt. Während der Blüte werden Kolben gesammelt, RNA aus diesen Kolben hergestellt und die Expression von argE durch Northern-Analyse bestätigt.
Alternativ werden die transgenen Maispflanzen durch Mikroprojektilbombardierung von unreifen Embryos erhalten. Kolben des Genotyps CG00526 werden selbstbestäubt, und unreife zygotische Embryos werden circa 10 Tage später erhalten. Circa 840 unreife zygotische Embryos werden auf 14 unterschiedliche Zielplatten aufgeteilt, die ein Medium enthalten, das die Bildung von embryogenem Kallus induzieren und stützen kann. Die unreifen zygotischen Embryos werden unmittelbar auf das gleiche Medium übertragen, das jedoch 12 % Saccharose enthält. Nach 5 Stunden werden die unreifen zygotischen Embryos mit entweder pFA200 oder pSH74 oder p19arg neben pSOG35 unter Verwendung der PDS-1000/He-Vorrichtung von BioRad bombardiert. Die Plasmide werden auf 1 μm Goldpartikel im wesentlichen gemäß dem von BioRad veröffentlichten Verfahren wie oben beschrieben ausgefällt. Die Partikel werden unter Verwendung eines Berstdrucks von 1.550 psi Helium übertragen. Jede Zielplatte wird zweimal mit der Zubereitung aus Plasmid und Goldpartikeln beschossen. Das Selektionsmittel, Methotrexat, wird mit 2 mg/l am Tag der Genübertragung eingesetzt und nach circa einem Monat erhöht. Der so erhaltene embryogene Kallus wird in Gegenwart des Selektionsmittels Methotrexat regeneriert. Pflanzen werden erhalten und mit Ereignisnummern versehen. Pflanzen aus jedem Ereignis wurden durch PCR auf Gegenwart des argE-Gens getestet, und PCR-positive Pflanzen werden in das Gewächshaus überführt. Während der Blüte werden Kolben gesammelt, RNA aus diesem Gewebe hergestellt und die Expression von argE durch Northern-Analyse bestätigt.
Beispiel 12: Transformation von Mais mit einem chimären Gen, das ein Protein codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin in einer männlich-bevorzugten spezifischen Weise katalysiert
Plasmide pMA200 oder pSH68 oder pZmgarg und pSOG35 werden als rekombinante Sequenzen zur Transformation von unreifen Maisembryos wie in Beispiel 11 beschrieben verwendet. Pflanzen werden regeneriert, und PCR wird zur Bestätigung der Gegenwart des argE-Transgens verwendet. Transgene Pflanzen werden in das Gewächshaus überführt. Während der Blütestadien werden Quasten gesammelt, RNA aus diesem Gewebe hergestellt und die argE-Expression durch Northern-Analyse bestätigt. Pflanzen werden selbstbestäubt und Saatgut wird gesammelt.
Beispiel 13: Transformation von Gerste, die ein Protein codiert, das die Umwaadlung eines Protoxins zu einem Toxin in einer weiblich-bevorzugten weise katalysiert
Gerstenähren (Sorte Golden Promise) mit unreifen Embryos einer Größe von circa 1,5 bis 2,5 mm werden geerntet, in 15 % (V/V) Bleiche (5,25 % Natriumhypochlorit) für 10 Minuten oberflächensterilisiert und fünfmal mit sterilem Wasser gespült. Unreife Embryos werden aus jungen Karyopsen seziert und longitudinal zweigeteilt. Sie werden auf ein Kallus-Induktionsmedium (Wan und Lemaux, Plant Physiology 104:37–48 (1994)) ausplattiert, das basische Murashige-Skoog-Salze enthält, ergänzt mit 30 g/l Maltose, 1 mg/l Thiamin-HCl, 0,25 g/l Myoinosit, 1 g/l Kaseinhydrolysat, 0,69 g/l Prolin, 2,5 mg/l Dicamba, und verfestigt mit 3,5 g/l Phytagel^® (Sigma).
Zur Embryobombardierung werden die Embryos mit der Scutellumseite nach oben für 1–3 Tage bei 24–28°C in der Dunkelheit inkubiert. Am Tag der Transformation werden die Embryos in die Mitte einer Petrischale (100 × 15 mm) zur Bildung eines Rings gesetzt. DNA aus den Plasmiden pFA200 oder pSH74 oder p19arg neben pUbi-Hyg wird auf Goldpartikel mit 0,6 oder 1,0 μm (BioRad) unter Befolgen des Handbuchs von Dupont Biolistic Particle Delivery Systems ausgefällt. Jede Embryoplatte wird einmal mit einer DuPont PDS-1000-Heliumkanone unter Verwendung eines Berstdrucks von 1.100 psi beschossen. Nach der Bombardierung werden die Embryos auf frisches Kallus-Induktionsmedium mit der Scutellumseite nach unten übertragen. Drei bis sieben Tage nach der Bombardierung werden die Embryos auf ein Selektionsmedium (Kallus-Induktionsmedium plus 10 mg/l Hygromycin) für circa 14 Tage übertragen. Der abgeleitete Kallus wird in kleinere Stücke zerbrochen und separat aufbewahrt. In anschließenden Subkulturen wird Kallus auf ein frisches Selektionsmedium mit 20 mg/l Hygromycin circa alle 21 bis 28 Tage überführt. Nach 2–3 Subkulturen wird der überlebende Kallus auf ein FHG-Medium (Hunter, Doktorarbeit, Wye College, University of London, Ashford, Kent, 1988), ergänzt mit 1–3 mg/l 6-Benzylaminopurin und 10–20 mg/l Hygromycin, zur Pflanzenregeneration überführt. Die Pflanzen werden bei 23–25°C unter Fluoreszenzlicht regeneriert. Die aufgegangenen grünen Schößlinge/Pflänzchen werden auf ein hormonfreies Medium auf Basis von basischen Murashige-Skoog-Salzen in einer Petrischale mit 25 × 100 mm überführt. Die Pflanzen werden auf einen Magenta GA7-Behälter zur weiteren Entwicklung überführt, wenn sie eine Größe von 2–3 cm erreichen.
Zur Kallusbombardierung werden die Embryos mit der Scutellumseite nach unten in der Dunkelheit bei 24–28°C für wenigstens 10 Tage inkubiert. Am Tag der Transformation wird embryogener Kallus aus den kultivierten Embryos in kleine Stücke zerschnitten und in die Mitte einer Petrischale plaziert. DNA-Übertragung und die anschließenden Pflanzenregenerationsschritte sind identisch zu den in der Embryobombardierung beschriebenen.
Die Pflanzen werden durch PCR auf Gegenwart des Transgens getestet, und diejenigen, die positiv sind, werden in das Gewächshaus überführt. Während der Blütestadien werden Stempel gesammelt und RNA aus diesem Gewebe hergestellt. Die Expression von argE wird durch Northern-Analyse bestätigt. Die Pflanzen sind selbstfertil, und Saatgut wird geerntet.
Beispiel 14: Transformation von Gerste mit einem chimären Gen, das ein Protein codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin in einer männlich-bevorzugten Weise katalysiert
Plasmide pMA200 oder pSH68 oder pZmgarg und pUbi-Hyg werden als rekombinante Sequenzen zur Transformation von unreifen Gerstenembryos und Kallus wie in Beispiel 13 beschrieben verwendet. Pflanzen werden regeneriert, und PCR wird zur Bestätigung der Gegenwart des argE-Transgens verwendet. Transgene Pflanzen werden in das Gewächshaus überführt. Während der Blütestadien werden Staubbeutel gesammelt und RNA aus diesem Gewebe hergestellt, und argE-Expression wird durch Northern-Analyse bestätigt. Pflanzen werden selbstbestäubt, und Saatgut wird gesammelt.
Beispiel 15: Chemische Behandlung von transformierten Pflanzen verleiht konditionale Sterilität
Saatgut aus der T₁-Generation von Pflanzen, die mit pFA200 oder pSH74 oder p19arg transformiert sind (was konditional weibliche Sterilität verleiht), und von Pflanzen, die mit pMA200 oder pSH68 oder pZmgarg transformiert sind (was konditional männliche Sterilität verleiht), werden im Boden ausgepflanzt. Sobald Pflänzchen zu einer ausreichenden Größe gewachsen sind, wird Blattgewebe durch PCR auf Gegenwart des argE-Transgens analysiert. PCR-positive Pflanzen werden in das Gewächshaus überführt. Diese Pflanzen sind vollständig fruchtbar. Eine Untergruppe der Pflanzen, die pFA200 oder pSH74 oder p19arg enthalten, und eine Untergruppe, die pMA200 oder pSH68 oder pZgmarg enthalten, werden mit dem Protoxin Acetyl-PPT während der Wachstumsstadien behandelt. Die Pflanzen, die mit pMA200 oder pSH68 oder pZmgarg transformiert sind (Homozygote sind für das Pollenpromotorkonstrukt Zmgarg erforderlich), sind als Ergebnis der Umwandlung des Acetyl-PPT zu PPT in den männlichen Fortpflanzungsstrukturen männlichsteril. Die mit pFA200 oder pSH74 oder p19arg transformierten Pflanzen sind als Ergebnis der Umwandlung des Acetyl-PPT zu PPT in den weiblichen Fort pflanzungsstrukturen weiblich-steril. Die unbehandelten Pflanzen, die mit pFA200 oder pSH74 oder p19arg und pMA200 oder pSH68 oder pZmgarg transformiert sind, sind vollständig fruchtbar.
Beispiel 16: Herstellung von Weizenhybridsaatgut unter Verwendung von transgenen Pflanzen, die ein Protoxin zu einem Toxin in weiblichen Fortpflanzungsstrukturen umwandeln
Transgene Weizenpflanzen aus den Beispielen 8 und 10, die mit pFA200 oder pSH74 oder p19arg (was konditional weibliche Sterilität verleiht) und pMA200 oder pSH68 oder pZmgarg (was konditional männliche Sterilität verleiht) transformiert wurden, werden als Pflanzenlinien gezüchtet, die homozygot für jedes der Transgene sind, und das Saatgut wird durch Standardpraktiken vermehrt. Homozygotes Saatgut aus Pflanzen, die pFA200 oder pSH74 oder p19arg enthalten, und aus Pflanzen, die pMA200 oder pSH68 oder pZmgarg enthalten, werden in einem Verhältnis von männlichen zu weiblichen Eltern, das ausreichend zur Sicherstellung eines effizienten Pollentransfer ist, zwischengepflanzt. Zu einem geeigneten Zeitpunkt während der Pflanzenentwicklung wird das Protoxin Acetyl-PPT auf das Feld ausgebracht. Nach der Saatgutreifung wird das gesamte Produktionsfeld abgeerntet, was nur Hybridsaatgut liefert. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Hybridsaatgutherstellung, umfassend: (a) Herstellen einer konditional weiblich-sterilen Pflanze, die einen weiblich-bevorzugten Promotor umfaßt, der funktionsfähig mit einer codierenden Sequenz verbunden ist, die ein Enzym codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert, worin der weiblich-bevorzugte Promotor aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Promotor, der aus dem pSH64-Klon mit der Eingangsnummer NRRL B-21920 isolierbar ist, einem Promotor, der die in SEQ ID NO:2 dargestellte Sequenz umfaßt, und einem Promotor, der Nukleotide 1-1093 von SEQ ID NO:14 umfaßt, besteht; (b) Zwischenpflanzen der konditional weiblich-sterilen Pflanze mit einer männlich-sterilen Pflanze; (c) Induzieren von weiblicher Sterilität durch Anwenden des Protoxins auf die konditional weiblich-sterile Pflanze; und (d) Herstellen von Hybridsaatgut.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Pflanze eine normal selbstbestäubte Pflanze ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Pflanze eine normal fremdbestäubte Pflanze ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die normal selbstbestäubte Pflanze Weizen ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die normal selbstbestäubte Pflanze Gerste ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, worin die normal fremdbestäubte Pflanze Mais ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der weiblich-bevorzugte Promotor ein aus dem pSH64-Klon mit der Eingangsnummer NRRL B-21920 isolierbarer Promotor ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der weiblich-bevorzugte Promotor ein Promotor ist, der die in SEQ ID NO:2 dargestellte Sequenz umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der weiblich-bevorzugte Promotor ein Promotor ist, der Nukleotide 1-1093 von SEQ ID NO:14 umfaßt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die codierende Sequenz, die ein Enzym codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert, aus einem Gen erhalten wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem argE-Gen, dem P450_su1-Monoxygenase-Gen und dem pehA-Gen besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 10, worin die codierende Sequenz aus dem argE-Gen erhalten wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin das Protoxin Acetylphosphinothricin ist.
Hybridsaatgut, das durch das Verfahren von Anspruch 1 hergestellt ist und noch den weiblich-bevorzugten Promotor umfaßt, der mit einer codierenden Sequenz funktionsfähig verbunden ist, die ein Enzym codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert.
Expressionskassette, die einen weiblich-bevorzugten Promotor umfaßt, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einem Promotor, der aus dem pSH64-Klon mit der Eingangsnummer NRRL B-21920 isolierbar ist, einem Promotor, der die in SEQ ID NO:2 dargestellte Sequenz umfaßt, und einem Promotor, der Nukleotide 1-1093 von SEQ ID NO:14 umfaßt, besteht, funktionsfähig verbunden mit einer codierenden Sequenz, die ein Enzym codiert, das die Umwandlung eines Protoxins zu einem Toxin katalysiert.
Expressionskassette gemäß Anspruch 14, worin die codierende Sequenz aus einem Gen erhalten wird, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus dem argE-Gen, dem P450su1-Monoxygenase-Gen und dem pehA-Gen besteht.
Expressionskassette gemäß Anspruch 15, worin die codierende Sequenz aus dem argE-Gen erhalten wird.
Expressionskassette gemäß Anspruch 14, worin die codierende Sequenz aus dem P450su1-Monoxygenase-Gen erhalten wird.
Expressionskassette gemäß Anspruch 14, worin die codierende Sequenz aus dem pehA-Gen erhalten wird.
Expressionskassette gemäß Anspruch 14, worin der weiblichbevorzugte Promotor aus dem pSH64-Klon mit der Eingangsnummer NRRL B-21920 isolierbar ist und die codierende Sequenz von Interesse aus dem argE-Gen erhalten wird.
Expressionskassette gemäß Anspruch 14, worin der weiblichbevorzugte Promotor die in SEQ ID NO:2 dargestellte Sequenz umfaßt und die codierende Sequenz von Interesse aus dem argE-Gen erhalten wird.
Expressionskassette gemäß Anspruch 14, worin der weiblichbevorzugte Promotor Nukleotide 1-1093 von SEQ ID NO:14 umfaßt und die codierende Sequenz von Interesse aus dem argE-Gen erhalten wird.
Weiblich-bevorzugter Promotor, der aus dem genomischen pSH64-Klon mit der Eingangsnummer NRRL B-21920 isolierbar ist.
Weiblich-bevorzugter Promotor gemäß Anspruch 22, worin der Promotor Nukleotide 1-1390 von SEQ ID NO:11 umfaßt.
Weiblich-bevorzugter Promotor, der die in SEQ ID NO:2 dargestellte Sequenz umfaßt.
Weiblich-bevorzugter Promotor, der Nukleotide 1-1093 von SEQ ID NO:14 umfaßt.
Pflanze, die die Expressionskassette gemäß Anspruch 14 umfaßt.
Pflanze, die die Expressionskassette gemäß Anspruch 16 umfaßt.
Pflanze, die die Expressionskassette gemäß Anspruch 19 umfaßt.
Pflanze, die die Expressionskassette gemäß Anspruch 20 umfaßt.
Pflanze, die die Expressionskassette gemäß Anspruch 21 umfaßt.
Saatgut der Pflanze gemäß Anspruch 26, das noch die Expressionskassette gemäß Anspruch 14 umfaßt.
Saatgut der Pflanze gemäß Anspruch 27, das noch die Expressionskassette gemäß Anspruch 16 umfaßt.
Saatgut der Pflanze gemäß Anspruch 28, das noch die Expressionskassette gemäß Anspruch 19 umfaßt.
Saatgut der Pflanze gemäß Anspruch 29, das noch die Expressionskassette gemäß Anspruch 20 umfaßt.
Saatgut der Pflanze gemäß Anspruch 30, das noch die Expressionskassette gemäß Anspruch 21 umfaßt.