ES2263200T3 - Metodo para la produccion de semillas hibridas utilizando la esterilidad condicional femenina. - Google Patents
Metodo para la produccion de semillas hibridas utilizando la esterilidad condicional femenina.Info
- Publication number
- ES2263200T3 ES2263200T3 ES98907657T ES98907657T ES2263200T3 ES 2263200 T3 ES2263200 T3 ES 2263200T3 ES 98907657 T ES98907657 T ES 98907657T ES 98907657 T ES98907657 T ES 98907657T ES 2263200 T3 ES2263200 T3 ES 2263200T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- female
- plant
- promoter
- gene
- baselineskip
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 50
- 230000036512 infertility Effects 0.000 title description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 74
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 37
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 37
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 34
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 220
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 112
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 44
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 44
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 42
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 42
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 32
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 31
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 claims description 25
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 9
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 9
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 abstract description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 15
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 12
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 35
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 35
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 35
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 29
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 29
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 27
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 15
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 15
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 15
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 14
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 14
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 14
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 13
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 12
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 12
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 12
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 12
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 11
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 11
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 10
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 10
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 102400000233 M-alpha Human genes 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 7
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 7
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 7
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 7
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 7
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 6
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 6
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 6
- 241000370685 Arge Species 0.000 description 5
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 5
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 5
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 5
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 5
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 5
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 5
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 5
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 4
- 230000037039 plant physiology Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- ZEEBBLHXZHVTJG-UHFFFAOYSA-N 2-[[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]methylamino]acetic acid Chemical compound OCC(O)COP(O)(=O)CNCC(O)=O ZEEBBLHXZHVTJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 3
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 3
- 241000710118 Maize chlorotic mottle virus Species 0.000 description 3
- VZVQOWUYAAWBCP-LURJTMIESA-N N-acetyl-L-phosphinothricin Chemical compound CC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCP(C)(O)=O VZVQOWUYAAWBCP-LURJTMIESA-N 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 3
- 101150103518 bar gene Proteins 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 3
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 3
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 208000003643 Callosities Diseases 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 101100288095 Klebsiella pneumoniae neo gene Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 2
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 2
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 2
- JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N N(2)-acetyl-L-ornithine Chemical compound CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC[NH3+] JRLGPAXAGHMNOL-LURJTMIESA-N 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 241000723792 Tobacco etch virus Species 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 2
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 description 2
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 108010026239 phosphonate monoester hydrolase Proteins 0.000 description 2
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoic acid;azane Chemical compound [NH4+].CP(O)(=O)CCC(N)C([O-])=O ZBMRKNMTMPPMMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOSWTRUMMSCNCW-HNNGNKQASA-N 9-ribosyl-trans-zeatin Chemical compound C1=NC=2C(NC\C=C(CO)/C)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O GOSWTRUMMSCNCW-HNNGNKQASA-N 0.000 description 1
- 101150012482 ARG gene Proteins 0.000 description 1
- 101150021974 Adh1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 108700001528 Arabidopsis BCP1 Proteins 0.000 description 1
- 241000228438 Bipolaris maydis Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 101100297345 Caenorhabditis elegans pgl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 101000737786 Daucus carota Calcium-dependent protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150105088 Dele1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- 241001057636 Dracaena deremensis Species 0.000 description 1
- 241000710188 Encephalomyocarditis virus Species 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 229920002148 Gellan gum Polymers 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 101000737787 Glycine max Calcium-dependent protein kinase SK5 Proteins 0.000 description 1
- 101000899240 Homo sapiens Endoplasmic reticulum chaperone BiP Proteins 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000723994 Maize dwarf mosaic virus Species 0.000 description 1
- 101000763602 Manilkara zapota Thaumatin-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000763586 Manilkara zapota Thaumatin-like protein 1a Proteins 0.000 description 1
- 108091022912 Mannose-6-Phosphate Isomerase Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000966653 Musa acuminata Glucan endo-1,3-beta-glucosidase Proteins 0.000 description 1
- 101500006448 Mycobacterium bovis (strain ATCC BAA-935 / AF2122/97) Endonuclease PI-MboI Proteins 0.000 description 1
- 125000003047 N-acetyl group Chemical group 0.000 description 1
- NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N N-benzyladenine Chemical compound N=1C=NC=2NC=NC=2C=1NCC1=CC=CC=C1 NWBJYWHLCVSVIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100271432 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) atp-9 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100324954 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) oli gene Proteins 0.000 description 1
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241001582367 Polia Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241001330029 Pooideae Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 1
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 description 1
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 101100020617 Solanum lycopersicum LAT52 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187435 Streptomyces griseolus Species 0.000 description 1
- 241000187391 Streptomyces hygroscopicus Species 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M acetylcholine chloride Chemical compound [Cl-].CC(=O)OCC[N+](C)(C)C JUGOREOARAHOCO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007844 bleaching agent Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000006900 dealkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010056535 dihydrofolate reductase type II Proteins 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- IIPNDONTVPDUFZ-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-methyl-1-oxido-3,4-dihydropyrrol-1-ium-2-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C1(C)CCC=[N+]1[O-] IIPNDONTVPDUFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000010200 gynoecium development Effects 0.000 description 1
- 101150029559 hph gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 230000010191 monoecy Effects 0.000 description 1
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008117 seed development Effects 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- -1 sulfonyl urea compound Chemical class 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- GOSWTRUMMSCNCW-UHFFFAOYSA-N trans-zeatin riboside Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(O)C1O GOSWTRUMMSCNCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 101150003560 trfA gene Proteins 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8233—Female-specific, e.g. pistil, ovule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/829—Female sterility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Botany (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Seeds, Soups, And Other Foods (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Abstract
La invención suministra un procedimiento para la producción de semillas híbridas que comprende la producción de una planta estéril hembra condicional que comprende un promotor preferencial para la hembra operablemente unido a una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina, el trasplante de la planta estéril hembra condicional con una planta estéril macho, aplicando la protoxina a la planta estéril hembra condicional y la producción de una semilla híbrida. Se evita la formación se semillas viables en la planta estéril hembra condicional como resultado de la conversión de la protoxina en la toxina en las estructuras reproductoras hembras y se evita la producción de polen en la planta estéril macho, permitiendo de esta forma el trasplante de los dos padres del cruce híbrido para suministrar una transferencia de polen más eficiente. También se suministran casetes de expresión útiles en la invención, plantas transformadas con la casete de expresión y nuevos promotores preferenciales para las hembras.
Description
Método para la producción de semillas híbridas
utilizando la esterilidad condicional femenina.
La presente invención se refiere a la producción
de semillas híbridas en plantas. En particular, la invención se
refiere a un método de producción de semillas híbridas que usa como
un progenitor del híbrido una planta transformada con un gen
quimérico que, cuando se expresa en la estructura reproductora
femenina, produce una proteína que cataliza la conversión de una
protoxina aplicada exógenamente en una toxina, haciendo así ineficaz
la fertilización. También se incluye en la invención el uso de las
plantas femeninas-estériles condicionales en
combinación con plantas androestériles
(masculinas-estériles) condicionales para producir
más eficientemente semillas híbridas, genes quiméricos útiles para
la invención, plantas transgénicas que comprenden los genes
quiméricos, y nuevos promotores útiles para la expresión en las
estructuras reproductoras femeninas de una planta.
La heterosis en plantas de cultivo ha recibido
una considerable atención a causa de su marcado efecto en la mejora
del rendimiento. La mayor productividad al cruzar diferentes cepas
de maíz se observó por primera vez a finales del siglo XIX y
después se desarrolló siguiendo procedimientos genéticos
sistemáticos. El método habitual para criar maíz híbrido es
establecer muchas líneas puras, hacer cruces y determinar qué
híbridos son más productores en una localidad dada.
El éxito del maíz híbrido hizo que los criadores
de plantas explorasen la existencia y la magnitud del vigor híbrido
en otras muchas especies de interés económico. En general, los
híbridos mostraron mayores rendimientos en comparación con las
variedades no híbridas. Los híbridos son normalmente más eficientes
en el uso de factores de crecimiento y dan un mayor rendimiento por
unidad para factores de crecimiento tales como agua y fertilizante.
Bajo condiciones adversas, los híbridos son generalmente superiores
a los cultivos parentales o progenitores, con un comportamiento más
estable en una gama amplia de ambientes. Con los híbridos, hay
uniformidad en el producto y madurez que frecuentemente facilita la
recolección y hace aumentar el valor del producto en el mercado. El
híbrido puede combinar también caracteres que son difíciles o
imposibles de combinar de otra forma. Esto es particularmente
cierto para muchos híbridos interespecíficos e intergenéricos. La
conclusión general de la investigación es que el vigor híbrido, un
fenómeno común en las plantas, es de magnitud suficiente para
garantizar la explotación comercial si pueden desarrollarse las
técnicas apropiadas.
El vigor híbrido ha sido reconocido como un
fenómeno generalizado en plantas y animales durante muchos años.
Los híbridos comerciales se usan ahora con profusión en muchos
cultivos, incluyendo maíz, sorgo, caña de azúcar y girasol. Otros
cultivos en grandes superficies, como el trigo, la cebada y el
arroz, se desarrollan aún principalmente como variedades puras. Se
están llevando a cabo investigaciones en estos y otros cultivos que
permitan el uso extendido de híbridos comerciales en el futuro, pero
el principal factor limitante en el desarrollo de nuevos cultivos
híbridos es la carencia de métodos para la producción económica de
semillas de híbridos en estos cultivos.
Tradicionalmente, la producción de semillas de
híbridos en gran escala se lleva a cabo plantando filas o bloques
separados de líneas parentales femeninas y las líneas parentales
masculinas para polinizarlas. Solamente se recolecta la semilla
producida en las filas parentales femeninas. Para asegurarse de que
esta semilla es una semilla híbrida no contaminada con semilla
autofecundada, han de establecerse métodos de control de la
polinización en las plantas parentales femeninas para asegurar que
las semillas formadas de ellas es el resultado de la polinización
cruzada y no de la autopolinización. Los mecanismos de control de la
polinización conocidos son generalmente mecánicos, químicos o
genéticos.
La eliminación del polen fértil del progenitor
femenino puede realizarse por emasculación manual en algunas
especies tales como el maíz, una especie monoica. Tal eliminación de
polen fértil se consigue arrancando o cortando la inflorescencia
masculina (borla) de las plantas de la población parental femenina.
Este simple procedimiento previene la
auto-fertilización desborlando mecánicamente las
plantas femeninas antes de desprender el polen para evitar la
autofecundación. Sin embargo, la mayoría de las plantas de cultivo
de interés tienen órganos masculinos y femeninos funcionales dentro
de la misma flor, que hacen impracticable la emasculación. Incluso
cuando es practicable, esta forma de producción de semillas híbridas
es extremadamente laboriosa y por tanto costosa. Para eliminar la
laboriosa operación de eliminación de la inflorescencia masculina
(desborlamiento) que es necesaria para prevenir la
autofertilización en cruces de híbridos, en algunas se han usado
especies factores genéticos que producen esterilidad masculina.
La esterilidad masculina (androesterilidad) en
el progenitor femenino puede ser controlada por genes nucleares o
por un sistema citoplásmico-genético. La esterilidad
masculina genética se controla por genes nucleares en los que los
alelos para la esterilidad son generalmente recesivos respecto a los
alelos para la fertilidad. La esterilidad masculina genética se
presenta en muchas especies. Normalmente, es controlada por un único
gen recesivo que debe ser homocigótico para producir esterilidad
masculina. Los criadores que usan la esterilidad masculina genética
para la producción de semillas de híbridos desarrollan normalmente
una línea femenina fenotípicamente uniforme que segrega 50% de
individuos estériles masculinos (androestériles) y 50% de fértiles
masculinos (androfértiles). La semilla para estas líneas aumenta en
el aislamiento recolectando la semilla de plantas homocigóticas
para el gen de esterilidad masculina que son polinizadas por plantas
heterocigóticas para el gen de esterilidad masculina, y por tanto
androfértiles. Para producir una semilla híbrida comercial con
esterilidad masculina genética, el 50% de las plantas femeninas
androfértiles han de ser arrancadas del terreno tan pronto como
pueda identificarse su fertilidad. El trabajo asociado con esta
operación de separación de las plantas fértiles de las plantas
femeninas ha restringido en gran medida el uso de la esterilidad
masculina genética en la producción de semillas híbridas. Hay
diversos problemas asociados con este sistema para producir semillas
híbridas comerciales. En primer lugar, no es posible eliminar
plantas fértiles de las plantas masculinas-estériles
deseadas en la población femenina. Las plantas androestériles
genéticas han de mantenerse emparejándolas con individuos
androfértiles. La mitad de las plantas F_{l} de tal cruce serían
estériles, pero las demás plantas serían fértiles. Así, las plantas
androfértiles no deseadas en la población femenina pueden diseminar
polen y reducir la eficacia del progenitor masculino deseado.
El éxito del uso de la esterilidad masculina
citoplásmica para la producción comercial de semillas híbridas
requiere un citoplasma androestéril estable, una fuente adecuada de
polen y un sistema efectivo para conseguir el polen del progenitor
masculino para la hembra femenina-estéril. También,
el sistema citoplásmico-genético de esterilidad
masculina requiere tres líneas para producir un único híbrido
cruzado: la línea A (androestéril), la línea B (mantenedor
androfértil) y la línea R (androfértil con genes restauradores). Los
cruces de tres vía producidos con esterilidad masculina
citoplásmica-genética implicaron el mantenimiento y
la producción de cuatro líneas, una línea A y B de un endógamo, y
endógamos androfértiles de las otras dos.
Además, el tizón sureño del maíz causado por
Helminthosporium maydis, Raza T, que atacaba gravemente a
todos los híbridos de maíz con citoplasma T androestéril
citoplásmico, demostró la vulnerabilidad de una industria de
producción de semillas híbridas basada en una única fuente de
citoplasma androestéril. Para el maíz híbrido, la mayor parte de
los productores de semillas han vuelto a la emasculación manual o
mecánica y a la polinización anemófila (realizada por el
viento).
También pueden producirse semillas híbridas
mediante el uso de productos químicos que bloquean o matan la
formación de polen viable. Estos productos químicos, llamados
gameticidas, se usan para conferir una androesterilidad
transitoria. Sin embargo, el coste y la disponibilidad de los
productos químicos, y la fiabilidad de las aplicaciones, limitan la
producción de semillas híbridas mediante el uso de gameticidas.
También se han descrito métodos moleculares para
la producción de semillas híbridas. Tales métodos transforman
plantas con construcciones que contienen DNA antisentido y otros
genes que son capaces de controlar la producción de polen fértil en
las plantas. Tales plantas regeneradas son funcionalmente
androestériles y se usan para la producción de semillas híbridas
por cruce con polen de plantas androfértiles. Las principales
deficiencias de estos planteamientos surgen del hecho de que el gen
de la esterilidad masculina construido por ingeniería genética,
tanto si es un antisentido o RNAsa, puede mantenerse solamente en
estado heterocigótico. Son fundamentalmente igual que
androestériles genéticos naturales por cuanto han de mantenerse por
cruce con líneas androfértiles isogénicas. Esto es lo más
problemático en el terreno del cruce de híbridos en el que la
superficie es grande y el rendimiento es crítico. El progenitor
hembra heterocigótico, del que solamente un 50% será androestéril,
ha de ser plantado en filas próximas al progenitor masculino donante
de polen y han de eliminarse el 50% de los progenitores femeninos
fértiles. Esto se hace más fácil en estériles masculinos genéticos
construidos por ingeniería genética porque puede unirse un gen de
resistencia a un herbicida al gen de la esterilidad masculina, y
puede usarse la pulverización del herbicida para eliminar las
plantas fértiles, pero aún supone que las filas de progenitor
femenino han de ser plantadas a doble densidad con el fin de
conseguir el mismo rendimiento por unidad de superficie de este
sistema. Esto producirá alguna pérdida de rendimiento debida a la
competencia. La pulverización de herbicida también supone una
pérdida de rendimiento ya que las plantas resistentes nunca son
inmunes en un 100% al herbicida, y los costes de pulverización del
producto químico son considerables.
Un inconveniente de estos sistemas de producción
de semillas híbridas tradicionales es la necesidad de plantar filas
o bloques separados de las líneas parentales masculina y femenina.
La distancia física entre las plantas donantes de polen masculino y
receptoras de polen femenino tiene por resultado una transferencia
de polen menos eficiente, deficiente construcción determinada de la
semilla en el parental femenino, la necesidad de dedicar más
terreno de producción a las plantas donantes de polen, y menos
rendimiento de semillas híbridas por unidad de superficie del
terreno. Este inconveniente es especialmente agudo en especies de
cultivo tales como el trigo que liberan pequeñas cantidades de
polen, y el polen no es transportado eficazmente por el viento. Los
métodos tradicionales de producción de semillas híbridas, cuando se
aplican al trigo, han precisado dedicar de un tercio a dos tercios
del terreno de producción a plantas donantes de polen masculinas
(Johnson y Schmidt, Adv. Agronomy 20: 199-233
(1968); Wilson, Plant Breeding Reviews 303-309
(1989)). El resultado es que el coste de producción de semillas
híbridas de trigo es demasiado elevado para mantener una industria a
pesar de la disponibilidad de técnicas de producción de semillas
híbridas y la heterosis probada.
Para conseguir un sistema de producción de
semillas híbridas más económico para trigo y otros cultivos, es
necesario acercar las plantas parentales masculinas y femeninas para
efectuar una transferencia del polen más eficiente. En vez de estar
en bloques separados de filas de forma que pueden recolectarse las
semillas de solamente las plantas parentales femeninas, las plantas
parentales masculinas y femeninas necesitan ser interplantadas en
las mismas filas, lo que significa que las plantas están separadas
por unos centímetros en vez de estarlo por unos metros. Dado que
sería impracticable recolectar semillas de solamente los
progenitores femeninos cuando están tan estrechamente espaciadas
para hacer progenitores, es necesario prevenir la formación de
semillas viables en las plantas parentales masculinas además de
prevenir la formación de polen viable en las plantas parentales
femeninas.
Un método para prevenir la formación de semillas
viables es el uso de plantas femeninas-estériles. La
esterilidad femenina de origen natural ha sido descrita en varios
cultivos (Honma y Phatak, Journal of Heredity 55:
143-145 (1964); Sniezdo y Winiarczyk, Protoplasma
187: 31-38 (1995); Justus y Meyer, Journal of
Heredity 54: 167-168 (1963); Hanna y Powell,
Journal of Heredity 65: 247-249 (1974); Brown y
Bingham, Crop Science 24: 1207-1208 (1984)), pero
hay problemas para mantener estas líneas y no se usan
comercialmente. Se ha descrito un método para construir un gen
dominante de esterilidad femenina (EP 412.006 A1 (1990); Goldman
et al., EMBO Journal 13: 2976-2984 (1994)),
pero también aquí el mantenimiento de una línea
femenina-estéril que contenga este gen es
problemático debido a la incapacidad para crear una línea
homocigótica para el gen de la esterilidad femenina. Se ha descrito
un método de mantenimiento y uso en la producción de semillas
híbridas de este gen de esterilidad femenina (EP 402.270 (1990)).
Sin embargo, requiere la introducción de un gen de esterilidad
femenina, un gen restaurador de un primer gen de esterilidad
masculina, un segundo gen de esterilidad masculina y dos genes de
resistencia a un herbicida en una compleja serie de transformaciones
secuenciales para crear la línea parental masculina
estéril-femenina, y requiere la introducción del
primer gen de esterilidad masculina, un gen restaurador del gen de
esterilidad femenina y un gen de resistencia a un herbicida en una
serie compleja de transformaciones secuenciales para crear la línea
parental femenina androestéril. El tratamiento con herbicida se
necesita para seleccionar los genotipos correctos en cada ronda de
multiplicación de la línea, y para producir la semilla híbrida el
terreno de producción necesita ser tratado con uno de los herbicidas
para eliminar genotipos indeseables que son el resultado del
procedimiento. Aunque el anterior sistema podría proporcionar la
ventaja económica de interplantar las líneas masculina y femenina,
es demasiado complicado para tener utilidad comercial.
En consecuencia, existe una necesidad de un
método simple y económico para la producción de semillas
híbridas.
La presente invención proporciona un método para
la producción de semillas híbridas, que comprende producir una
planta femenina-estéril condicional que comprende un
promotor femenino-preferencial unido operativamente
a una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza
la conversión de una protoxina en una toxina, en donde dicho
promotor femenino-preferencial se elige entre el
grupo que consiste en un promotor aislable del clon pSH64, que
tiene el número de entrada NRRL 8-21920, un promotor
aislable del clon pCIB 10302 que tiene la secuencia expuesta en SEC
ID Nº: 2, y un promotor aislable del clon X2-1, que
comprende los nucleótidos 1-1093 de la SEC ID Nº:
14, interplantar la planta femenina-estéril
condicional con una planta androestéril, inducir la esterilidad
femenina aplicando la protoxina a la planta
femenina-estéril condicional, y producir las
semillas híbridas. En una realización de la invención preferida, la
planta es normalmente auto-polinizada o bien es
normalmente sometida a polinización cruzada. En realizaciones
preferidas de un modo particular, la planta se elige entre el grupo
consistente en maíz, trigo y cebada. También se proporcionan por
medio de la presente invención semillas híbridas producidas por
el
método.
método.
La invención proporciona además una casete de
expresión que comprende un promotor
femenino-preferencial elegido entre el grupo que
consiste en un promotor aislable del clon pSH64, que tiene el número
de entrada NRRL 8-21920, un promotor aislable del
clon pCIB 10302 que tiene la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 2, y
un promotor aislable del clon X2-1, que comprende
los nucleótidos 1-1093 de la SEC ID Nº: 14, unida
operativamente a una secuencia de codificación que codifica una
enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina.
Una realización preferida comprende un promotor
femenino-preferencial unido operativamente a la
secuencia de codificación del gen argE. Una realización
particularmente preferida comprende el promotor
femenino-preferencial del clon PSA64 o bien del
clon PCIB1032 unido operativamente a la secuencia codificadora de
argE. Otras realizaciones de secuencias codificadoras útiles
en la invención son las obtenidas del gen de la monoxigenasa
P450_{sul}, y el
gen pehA.
gen pehA.
También se proporcionan por medio de la
invención plantas que comprenden una casete de expresión de la
invención que comprende el promotor
femenino-preferencial unido operativamente a una
secuencia codificadora que codifica una enzima que cataliza la
conversión de una protoxina en una toxina, y semillas de tales
plantas.
También se describe en el presente texto el uso
de una protoxina en un método para inducir fertilidad femenina en
una planta, que comprende un promotor
femenino-preferencial unido operativamente a una
secuencia codificadora que codifica una enzima que cataliza la
conversión de una protoxina en una toxina, e inducir esterilidad
femenina aplicando la protoxina a la planta.
También se describe en el presente texto el uso
de la secuencia codificadora del gen argE en un método para
producir semillas híbridas en el que la secuencia codificadora de
argE esta unida operativamente a un promotor
femenino-preferencial que, cuando se expresa,
cataliza la conversión de una protoxina en una toxina, induciendo
así esterilidad femenina.
\newpage
La expresión "estructura reproductora
femenina", como se usa en el presente texto, significa aquellas
partes de una planta que componen el carpelo, o gineceo (un término
establecido de antiguo, usado en relación con el gineceo es
"pistilo"). El carpelo de una flor de una planta incluye, pero
sin limitarse a ellos, estigma, estilo, ovario y células o tejidos
que comprenden el estigma, estilo y ovario. Un promotor
"femenino-preferencial", como se usa en el
presente texto, significa un promotor que tiene actividad
transcripcional solamente o principalmente en una o más de las
células o tejidos de una estructura reproductora femenina de una
planta.
"Casete de expresión", como se usa en el
presente texto, significa una secuencia de DNA capaz de dirigir la
expresión de un gen en células vegetales, que comprende un promotor
unido operativamente a una región codificadora de aminoácidos que
está unida operativamente a una región de terminación. El gen puede
ser quimérico, lo que significa que al menos un componente del gen
es heterólogo con respecto a, al menos, otro componente del gen. El
gen puede ser también de origen natural, pero que ha sido obtenido
de una forma recombinante útil para la transformación genética de
una planta.
"Protoxina", como se usa en el presente
texto, significa una sustancia química con una fitotoxicidad mínima
que puede ser activada por la acción de una enzima para producir un
producto de reacción que es tóxico para las células de la planta o
que interrumpe las funciones de las células de la planta de manera
suficiente para retrasar, suprimir o prevenir el crecimiento, el
desarrollo o la actividad metabólica normales. El producto de
reacción tóxico se denomina en el presente texto como "toxina".
En la invención, la protoxina se aplica de forma exógena a la
planta, lo que puede realizarse por cualquier medio que facilite la
absorción foliar, la absorción por la raíz, el contacto directo con
las partes de la planta señaladas o el movimiento sistémico de una
a otra parte de la planta.
"Fertilidad femenina", como se usa en el
presente texto, significa que las estructuras reproductoras
femeninas de una planta son capaces de soportar la formación de
semilla viable cuando se polinizan con polen funcional o viable.
"Esterilidad femenina", como se usa en el presente texto,
significa que las estructuras reproductoras femeninas de una planta
no son capaces de soportar la formación de semilla viable cuando se
polinizan con polen funcional o viable. "Esterilidad femenina
condicional", como se usa en el presente texto, significa que se
produce esterilidad femenina cuando se realiza la aplicación exógena
de una protoxina que es posteriormente activada por una enzima para
dar lugar a un producto de reacción tóxico. "Esterilidad
masculina" (androesterilidad), como se usa en el presente texto,
significa que las estructuras reproductoras masculinas de una planta
son incapaces de producir polen viable o funcional.
Uno de los aspectos ventajosos de la presente
invención es su uso en el control de la formación de semillas
viables en plantas bajo condiciones de campo, controlando la
fertilidad femenina. La fertilidad de la hembra puede controlarse
obteniendo una planta transgénica que comprende una secuencia de
nucleótidos quimérica o recombinante que codifica una enzima que
cataliza la conversión de una protoxina en una toxina, que cuando
se expresa bajo el control de un promotor
femenino-preferencial proporcionará las estructuras
reproductoras femeninas incapaces de la formación de semillas
viables al tener lugar la aplicación exógena de la protoxina. Se
dice que las plantas transgénicas son condicionales para la
esterilidad femenina porque la aparición de esterilidad femenina
está condicionada por la presencia de la protoxina. La conversión de
una protoxina en una toxina en las estructuras reproductoras
femeninas podría evitar la formación de semillas viables por medio
de varios mecanismos, dependiendo de cuándo y en qué células o
tejidos está activo el promotor
femenino-preferencial. Esto incluye, pero sin
limitarse a ello: 1) interrupción en el desarrollo normal del
pistilo de forma que el pistilo deja de ser competente para
permitir la fertilización, 2) inhibición del crecimiento del tubo
polínico por la toxina convertida, 3) interrupción del desarrollo
de gametos viables, y 4) interrupción del desarrollo de la semilla
después de la fertilización.
En una realización de la presente invención, se
aplica exogénicamente una protoxina a plantas transgénicas bajo
condiciones de campo, y la conversión de la protoxina en toxina
tiene lugar en la estructura reproductora femenina. La formación de
semilla viable se evita por la acción de la toxina en la estructura
reproductora femenina.
Las secuencias de codificación útiles para la
invención incluyen, pero sin limitarse a ellas, cualquier secuencia
que codifique una proteína capaz de convertir una protoxina en una
toxina. Estas secuencias de codificación pueden ser de origen
homólogo o heterólogo.
En una realización preferida, la secuencia de
codificación del gen argE está unida operativamente a un
promotor femenino-preferencial. La expresión de este
gen quimérico en una planta transgénica tiene por resultado
esterilidad femenina condicional en presencia de la protoxina
N-acetil fosfinotricina (N-acetil
PPT). El producto génico del gen argE es la
N-acetil-L-ornitina
desacetilasa de E. coli, que tiene una amplia especificidad
para la hidrólisis de sustratos del tipo
R_{1}-CO-NH-CH((CH_{2})-R_{2})-COOH.
Como resultado de esta actividad, el producto génico de argE
cataliza la conversión de la protoxina
acetil-fosfinotricina en la toxina fosfinotricina
(PPT) (Kiete et al., The Plant Journal 9:
809-818 (1996)).
En otra realización preferida, la secuencia de
codificación procedente del gen para la monooxigenasa P450_{sul},
CPY105A1, está unida operativamente a un promotor
femenino-preferencial. Esta expresión tiene por
resultado esterilidad femenina condicional en presencia de una
protoxina de sulfonamida. La monooxigenasa P450_{sul} de
Streptomyces griseolus, cuando se dirige al cloroplasto,
media la N-desalquilación del compuesto de sulfonil
urea R7402
(2-metiletil-2,2-dihidro-N-[(4,6-dimetoxipirimidin-2-il)aminocarbonil]-1,2-benzoiaotiazol-7-sulfonamida-1,1-dióxido,
y lo convierte en una toxina (O'Keefe et al., Plant
Physiology 105: 473-482 (1994)).
En otra realización preferida, la secuencia de
codificación del gen pehA está unida operativamente a un
promotor femenino-preferencial, y esta expresión
tiene por resultado esterilidad femenina condicional en presencia
de la protoxina, gliceril glifosato. El producto génico del gen
pehA de Burkholderia caryophili PG2982 es una
fosfonato monoéster hidrolasa que cataliza la conversión de la
protoxina gliceril glifosato en la toxina glifosato (Dotson et
al., Plant Journal 10: 383-392 (1996)).
Cualquier secuencia codificadora que codifique
una enzima que catalice la conversión de una protoxina en una
toxina puede ser usada en la presente invención, siempre y cuando
esté operativamente unida a un promotor
femenino-preferencial de la presente invención.
Para poner en práctica la presente invención, es
deseable que las anteriores secuencias de nucleótidos que codifican
una enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina
estén operativamente unidas a una secuencia reguladora 5' que
dirige su expresión de una manera que es preferencial para las
estructuras reproductoras femeninas de una planta. La especificidad
de la expresión asegura que el efecto de la enzima expresada se
ejerza solamente en aquellos tejidos o células que son necesarios
para la formación de semillas viables y no sean perjudiciales para
la planta más allá de su influencia sobre la fertilidad.
Los genes
femenino-preferenciales útiles para especies
vegetales específicas pueden ser clonados aislando nuevos
materiales de transcripción expresados en tejidos femeninos, usando
técnicas conocidas por los expertos en este campo. Esto implica
aislar el RNA de tejidos femeninos tales como el estigma del maíz o
los pistilos del trigo, y cribar diferencialmente por técnicas
tales como display diferencial, sustracción de cDNA elegido por PCR
o hibridación sustractiva, y construcción de una genoteca
sustractiva de cDNA para aislar clones de cDNA que son
preferencialmente expresados en los tejidos femeninos y no en otras
partes de la planta tales como hojas, raíz o inflorescencia
masculina. La especificidad para el tejido de estos cDNAs clonados
puede confirmarse mediante análisis Northern. Las secuencias
promotoras para clones femenino-preferenciales
pueden obtenerse entonces usando los nuevos cDNAs aislados como
sondas para el cribado de la genoteca. Pueden aislarse clones
genómicos que contienen secuencias reguladoras 5' y 3' que se
necesitan para la expresión en tejido femenino. Estas secuencias
pueden usarse para construir casetes de expresión para la expresión
de genes quiméricos de una manera
femenina-preferencial. Véanse, por ejemplo, los
ejemplos descritos en el presente texto.
La región reguladora 5' de la casete de
expresión puede incluir también otras secuencias potenciadoras. Se
han encontrado numerosas secuencias que potencian la expresión de un
gen en plantas transgénicas. Por ejemplo, se sabe que varias
secuencias guía no traducidas derivadas de virus potencian la
expresión. Específicamente, se ha demostrado que secuencias guía
procedentes del virus del mosaico del tabaco (TMV, la secuencia
"W"), el virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) y virus
del mosaico de la alfalfa (AMV) son eficaces para potenciar la
expresión (p. ej. Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15:
8693-8711 (1987); Skuzeski et al., Plant
Molec. Biol. 15: 65-79 (1990). Otras guías
conocidas en la técnica incluyen, pero sin limitarse a ellas:
Guías de picornavirus, por ejemplo guía EMCV
(región no codificadora 5' de la encefalomiocarditis)
(Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R., y Moss, B. PNAS
USA 86: 6126-6130 (1989));
Guías de potivirus, por ejemplo guía de TEV
(Tobacco Etch Virus) (Allison et al. (1986); guía de MDMV
(virus del mosaico enano del maíz); Virology, 154:
9-20);
Guía de la proteína de unión de la cadena pesada
de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak, D. G., y Sarnow, P.,
Nature, 353: 90-94 (1991);
Guía no traducida del mRNA de la proteína de la
envoltura del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4),
(Jobling, S. A., y Gehrke, L., Nature, 325:
622-625 (1987);
Guía del virus del mosaico del tabaco (TMV),
(Gallie, D. R. et al., Molecular Biology of RNA,
páginas 237-256 (1989); y
Guía del virus del moteado clorótico del maíz
(MCMV) (Lommel, S. A. et al., Virology, 81:
382-385 (1991). Véase también
Della-Cioppa et al., Plant Physiology,
84: 965-968 (1987).
\newpage
Se ha demostrado que varias secuencias de
intrones potencian la expresión cuando se añaden a la región
reguladora 5', en particular en células monocotiledóneas. Por
ejemplo, se ha encontrado que los intrones del gen AdhI del
maíz potencian de forma significativa la expresión del gen del tipo
silvestre bajo su promotor cognado cuando se introducen en células
de maíz (Callis et al., Genes Develop. 1:
1183-1200 (1987)).
Además de los promotores, también se dispone de
una variedad de terminadores transcripcionales 3' para su uso en la
presente invención. Los terminadores transcripcionales son
responsables de la terminación de la transcripción y la correcta
poliadenilación del mRNA. Terminadores transcripcionales apropiados
son aquellos que se sabe que actúan en plantas e incluyen el
terminador CaMV 35S, el terminador tml, el terminador de la
nopalina sintetasa, el terminador rbcS E9 del guisante y
otros conocidos en la técnica. Estos pueden usarse tanto en
monocotiledóneas como en dicotiledóneas.
Las casetes de expresión de la presente
invención pueden ser introducidas en la célula vegetal de varias
maneras conocidas en la técnica. Los expertos en la técnica
apreciarán que la elección del método podría depender del tipo de
planta, es decir monocotiledóneas o dicotiledóneas, señalada para la
transformación. Los métodos adecuados para transformar células
vegetales incluyen, pero sin limitarse a ellos, microinyección
(Crossway et al., BioTechniques 4:
320-334 (1986)), electroporación (Riggs et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:
5602-5606 (1986), transformación mediada por
Agrobacterium (Hinchee et al., Biotechnology 6:
915-921 (1988)), transferencia de genes directa
(Paszkowski et al., EMBO J. 3:
2717-2722 (1984)), y aceleración de partículas
balísticas usando dispositivos disponibles de Agracetus, Inc.,
Madison, Wisconsin y BioRad, Hercules, California (véanse, por
ejemplo, Sanford et al., patente de EE.UU. nº 4.945.050 y
McCabe et al., Biotechnology 6:
923-926 (1988)). Véanse también Weissinger et
al., Annual Rev. Genet. 22: 421-477
(1988); Sanford et al., Particulate Science and
Technology 5: 27-37 (1987) (cebolla); Christou
et al., Plant Physiol. 87: 671-674
(1988) (soja); McCabe et al., Bio/Ttechnology 6:
923-926 (1988)) (soja); Datta et al.,
Bio/Technology 8: 736-740 (1990) (arroz);
Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:
4305-4309 (1988) (maíz), Klein et al.,
Bio/Technology 6: 559-563 (1988) (maíz);
Klein et al., Plant Physiol. 91:
440-444 (1988) (maíz); Fromm et al.,
Bio/Technology 8: 833-839 (1990) (maíz); y
Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:
603-618 (1990) (maíz); Svab et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526-8530 (1990)
(cloroplasto del tabaco); Koziel et al., Biotechnology
11: 194-200 (1993) (maíz); Shimamoto et al.,
Nature 338: 274-277 (1989) (arroz); Christou
et al., Biotechnology 9: 957-962
(1991) (arroz); solicitud de patente europea EP 0 332 581, Horn
et al. (dáctilo aglomerado y otras Pooideae); Vasil
et al., Biotechnology 11: 1553-1558
(1993) (trigo); Weeks et al., Plant Physiol. 102:
1077-1084 (1993) (trigo); Wan y Lemaux, Plant
Physiol. 104: 37-48 (1994) (cebada).
Un conjunto de realizaciones particularmente
preferidas para la introducción de las casetes de expresión de la
presente invención en el maíz mediante bombardeo de microproyectiles
se describe en el documento U.S. nº de serie 08/008.374,
incorporado al presente texto como referencia en su totalidad. Una
realización adicional preferida es el método de transformación del
protoplasto para el maíz, como se describe en la solicitud de
patente europea EP 0 292 435, así como en la patente de EE.UU. nº
5.350.689. Un conjunto de realizaciones particularmente preferidas
para la introducción de las casetes de expresión de la presente
invención en el trigo mediante bombardeo con microproyectiles,
puede encontrarse en la patente de EE.UU. nº 5.610.042.
La transformación de plantas puede realizarse
con una única molécula de DNA o con múltiples moléculas de DNA (es
decir, co-transformación), y ambas técnicas son
adecuadas para ser usadas con las casetes de expresión de la
presente invención. Se dispone de numerosos vectores de
transformación para la transformación de plantas, y las casetes de
expresión de esta invención pueden usarse junto con cualquiera de
estos vectores. La selección del vector dependerá de la técnica de
transformación preferida y la especie objetivo de la
transformación.
Se dispone de muchos vectores para la
transformación usando Agrobacterium tumefaciens. Estos llevan
típicamente al menos una secuencia extrema del
T-DNA e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan,
Nucl. Acids Res. (1984)). En una realización preferida, las
casetes de expresión de la presente invención pueden ser insertadas
en el vector binario pCIB200 o bien en el pCIB2001 para su uso con
Agrobacterium. Estas casetes vector para la transformación
mediada por Agrobacterium fueron construidas de la manera
siguiente. Se creó pTJS75kan mediante digestión con NarI de
pTJS75 (Schmidhauser y Helinski, J. Bacteriol. 164:
446-455 (1985)) que permite la escisión del gen de
la resistencia a la tetraciclina, seguida por la digestión de un
fragmento AccI de pUC4K que lleva un NPTII (Messing y
Vierra, Gene 19: 259-268 (1982); Bevan et
al., Nature 304: 184-187 (1983); McBride
et al., Plant Molecular Biology 14:
266-276 (1990)). Se ligaron enlazadores XhoI
al fragmento EcoRV de pCIB7 que contiene los extremos de
T-DNA izquierdo y derecho, un gen quimérico
nos/nptII seleccionable vegetal y el polienlazador pUC
(Rothstein et al., Gene 53: 153-161
(1987)), y el fragmento digerido con XhoI fue clonado en
pTJS75kan digerido con SalI para crear pCIB200 (véase
también el documento EP 0 332 104, ejemplo 19). El pCIB200 contiene
los siguientes sitios de restricción de polienlazador únicos:
EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI y SalI. El plásmido
pCIB2001 es un derivado de pCIB200 que fue creado mediante la
inserción en el polienlazador de sitios de restricción adicionales.
Sitios de restricción únicos en el polienlazador de pCIB2001 son
EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI,
HpaI y StuI. El pCIB2001, además de contener estos sitios
de restricción únicos, tiene también selección por kanamicina
vegetal y bacteriana, extremos de T-DNA izquierdo y
derecho para la transformación mediada por Agrobacterium, la
función trfA derivada de RK2 para la movilización entre E.
coli y otros hospedadores, y las funciones OriT y
OriV también de RK2. El polienlazador pCIB2001 es adecuado
para la clonación de casetes de expresión en plantas, que contienen
sus propias señales reguladoras.
Un vector adicional útil para la transformación
mediada por Agrobacterium es el vector binario pCIB10, que
contiene un gen que codifica la resistencia a la kanamicina para la
selección en plantas, secuencias del extremo derecho e izquierdo de
T-DNA e incorpora secuencias procedentes del
plásmido de amplia gama de hospedadores pRK252 que le permiten la
replicación tanto en E. coli como en Agrobacterium. Su
construcción se describe en Rohstein et al., Gene 53:
153-161 (1987). Se han construido varios derivados
de pCIB10 que incorporan el gen para higromicina B
fosfonotransferasa descrito por Gritz et al., Gene 25:
179-188 (1983). Estos derivados permiten la
selección de células de plantas transgénicas en solamente
higromicina (pCIB743) o en higromicina y kanamicina (pCIB715,
pCIB717).
Se han emprendido métodos que usan una forma de
transferencia génica directa o bien transferencia mediada por
Agrobacterium normalmente, pero no necesariamente, con un
marcador seleccionable que puede proporcionar resistencia a un
antibiótico (p. ej. kanamicina, higromicina o metotrexato) o un
herbicida (p. ej. fosfinotricina). Sin embargo, la elección del
marcador seleccionable para la transformación de la planta no es
crítica para la invención, a menos que la expresión de esta
resistencia y su actividad bioquímica interfiera con la elección de
la conversión de protoxina en toxina elegida para ser usada en la
creación de fertilidad condicional.
Para ciertas especies vegetales, pueden
preferirse diferentes marcadores de selección de antibióticos o
herbicidas. Los marcadores de selección usados rutinariamente en la
transformación incluyen el gen nptII que confiere
resistencia a la kanamicina y antibióticos relacionados con ella
(Messing y Vierra, Gene 19: 259-268 (1982);
Bevan et al., Nature 304: 184-187
(1983)), el gen bar que confiere resistencia al herbicida
fosfinotricina (White et al., Nucl. Acids Res. 18:
1062 (1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:
625-631 (1990)), el gen hph que confiere
resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger y Diggelmann,
Mol. Cell Biol. 4: 2929-2931), el gen
dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Bourouis et
al., EMPO J. 2: 1099-1104 (1983)), el
gen de la manosa fosfato isomerasa, que permite la selección en
manosa como fuente de carbono (EP 530 129, WO 94/20627).
Uno de tales vectores útiles para las técnicas
de transferencia directa de genes en combinación con la selección
mediante el herbicida Basta (o fosfinotricina) es pCIB3064. Este
vector está basado en el plásmido pCIB246, que comprende el
promotor CaMV 35S en fusión operativa con el gen GUS de E.
coli y el terminador transcripcional CaMV 35S, y se describe en
la solicitud publicada PCT WO 93/07278, incorporada al presente
texto como referencia. Un gen útil para conferir resistencia a la
fosfinotricina es el gen bar procedente de Streptomyces
hygroscopicus (Thompson et al., EMBO J. 6:
2519-2523 (1987)). Este vector es adecuado para la
clonación de casetes de expresión en plantas, que contienen sus
propias señales reguladoras. Sin embargo, debe observarse que el uso
de bar como marcador seleccionable puede interferir con la
operación de la presente invención si también puede expresarse en
estructuras reproductoras femeninas. Este problema puede
solucionarse mediante el uso de promotores que controlan la
expresión en los cultivos de células o tejidos usados para
transformación, pero no tienen por resultado la expresión del gen
bar en estructuras reproductoras femeninas.
Otro vector de transformación es el vector pGL2
(Shimamoto et al., Nature 338, 274-276
(1989)) que contiene el gen de la higromicina fosfotransferasa
(hpt) de Streptomyces ligado operativamente al promotor 35S
y secuencias terminadoras de 35S.
Un vector de transformación adicional es pSOG35,
que utiliza el gen de E. coli de dihidrofolato reductasa
(DHFR) como marcador seleccionable que confiere resistencia al
metotrexato. Se utilizó PCR para amplificar el promotor 35S
(\sim800 pb), intrón 6 procedente del gen Adh1 del maíz (\sim550
pb), y 18 pb de la secuencia guía no traducida de GUS procedente de
pSOG10. Un fragmento de 250 pb que codifica el gen de dihidrofolato
reductasa tipo II de E. coli fue también amplificado
mediante PCR y estos dos fragmentos de la PCR fueron ensamblados
con un fragmento SacI-PstI procedente de
pBI221 (Clonetech) que comprendía el esqueleto del vector de pUC19
y el terminador de la nopalina sintetasa. El ensamblaje de estos
fragmentos generó pSOG19 que contiene el promotor 35S en fusión con
la secuencia del intrón 6, la guía GUS, el gen de DHFR y el
terminador de nopalina sintetasa. El reemplazo de la guía GUS en
pSOG19 con la secuencia guía del virus del moteado clorótico del
maíz (MCMV) generó el vector pSOG35. pSOG19 y pSOG35 llevan el gen
derivado de pUC para la resistencia a la ampicilina y tienen sitios
HindIII, SphI, PstI y EcoRI disponibles para la
clonación de secuencias extrañas.
Para producir semillas híbridas no contaminadas
con semillas producidas por auto-polinización, han
de establecerse métodos de control de la polinización para impedir
la autopolinización del progenitor femenino y asegurar la
polinización cruzada por el progenitor masculino. Este se realiza
normalmente por métodos mecánicos, androesterilidad genética o
agentes de hibridación química (CHAs). Por ejemplo, en el maíz, la
práctica corriente es la eliminación mecánica de la inflorescencia
del progenitor femenino (o semilla), que es un procedimiento que
requiere mucho tiempo y trabajo. En el trigo, el control de la
fertilidad por medios mecánicos no es práctico a escala de
producción de semillas, y no están comercialmente establecidas
fuentes genéticas de esterilidad masculina. Los métodos de
producción de semillas híbridas basados solamente en el control de
la polinización requieren que los bloques de plantas parentales
masculinas estén separados físicamente de los bloques de plantas
parentales femeninas, ya que las plantas parentales masculinas
producirán semillas de la autopolinización. El uso de la presente
invención en la producción de semillas híbridas ofrece las ventajas
de la fiabilidad y la facilidad de uso y, lo más importante,
permitirá interplantar plantas parentales masculinas y femeninas,
con el resultado de una transferencia de polen más eficiente, la
necesidad de menos plantas parentales masculinas y una producción
más económica de semillas híbridas.
Para producir semillas híbridas usando la
presente invención, se requiere una planta parental transgénica que
exprese una enzima que catalice la conversión de una protoxina en
una toxina de manera femenina-preferencial. La
obtención de plantas transgénicas que poseen este genotipo se
describió anteriormente. Las plantas transgénicas que contienen los
genes quiméricos o recombinantes de la presente invención pueden
hacerse homocigóticas y mantenerse indefinidamente usando métodos
normales para la cría de plantas.
Para la producción de semillas híbridas de
acuerdo con la presente invención se requiere también una planta
parental que sea androestéril. La esterilidad masculina es el
fracaso o incapacidad para producir polen viable o funcional. La
esterilidad masculina puede resultar de interrupciones que conducen
a la no formación de polen o a la carencia de capacidad funcional
en el polen cuando se ha formado. Por consiguiente, o no se forma el
polen o, si se forma, éste es no viable o bien es incapaz de
realizar una fertilización efectiva bajo condiciones normales.
Se conocen muchas fuentes de esterilidad
masculina para ser usadas en la producción de semillas híbridas
(Kaul, Male Sterility in Higher Plants, Springer Verlag (1988)).
Los genes de la esterilidad masculina citoplásmica de origen
natural y su uso han sido descritos para el maíz (Levings, Science
250: 942-947 (1990), trigo (Toriyama et al.,
Jpn. J. Breed. 43: 517-524 (1993)), tabaco (Gerstel
et al., Genetics 89: 157-169 (1978)), centeno
(Steinborn et al., Theor. Appl. Genet. 85:
822-824 (1993)), girasol (Crouzillat et al.,
Plant Mol. Biol. 16: 415-426 (1991)), soja (Davis,
patente de EE.UU. nº 4.763.441 (1988)), Brassica (Grelon
et al., Mol. Gen. Genet. 243: 540-547
(1994)), zanahoria (Kitagawa et al., Sex. Plant Reprod. 7:
41-50 (1994)), sorgo (Chen et al., Plant
Mol. Biol. 28: 799-809 (1995)), arroz (Kadowaki
et al., Mol. Gen. Genet. 224: 10-16 (1990))
y cebada (Kaul y Singh, Cytobios 66: 71-85
(1991)).
También es conocida la construcción de genes de
esterilidad masculina quiméricos o recombinantes. Se ha demostrado
que un gen que codifica una
\beta-1,3-glucanasa, cuando se
expresa a partir de un promotor activo solamente en las células del
tapete de la antera, produce esterilidad masculina en plantas
transgénicas (Worrall et al., Plant Cell 4:
759-771 (1992)). Se ha demostrado que un gen que
codifica un gen mitocondrial atp9 no editado del trigo
produce esterilidad masculina cuando se expresa a partir del
promotor CaMV 35S constitutivo en plantas transgénicas (Hernould
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:
2370-2374 (1993)). Se ha demostrado que un gen que
codifica una enzima RNAsa produce esterilidad masculina cuando se
expresa a partir de un promotor activo solamente en células del
tapete de la antera en plantas transgénicas (DeBlock et al.,
Planta 189: 218-225 (1993); EP 344.029; Mariani
et al., Nature 347: 737-741 (1990)). Se ha
demostrado que la expresión de un RNA antisentido complementario a
un gen crítico para la formación de polen produce esterilidad
masculina en plantas transgénicas (EP 513.884).
Adicionalmente, hay otros muchos promotores
androespecíficos que son bien conocidos en la técnica y que podrían
ser utilizados en la construcción de genes quiméricos de esterilidad
masculina. Estos incluyen secuencias promotoras para la expresión
en el polen, el tapete u otras estructuras en la antera. Los
ejemplos de promotores androespecíficos incluyen, pero sin
limitarse a ellos, el promotor LAT52 (Twell et al.,
Dev. 109: 705-13 (1989)), el promotor A127
del tomate (Dotson et al., Plant J. 10,
383-392 (1996)), el promotor Zmg del maíz (Hamilton
et al., Sex. Plant Reprod. 2: 208-212
(1989)), el promotor CDPK del maíz (Guerro et al., Mol.
Gen Genet. 224: 161-168 (1990)), los promotores
ant32 y ant43D específicos de la antera descritos en la patente de
EE.UU. nº 5.477.002, que se incorpora al presente texto como
referencia en su totalidad. Adicionalmente, pueden clonarse
secuencias promotoras para cDNAs específicos de la antera aislando
las correspondientes secuencias de DNA genómico y definiendo las
regiones reguladoras del promotor, por ejemplo aislando secuencias
promotoras para p450 específico del tubo polínico de la orquídea
(Nadeau et al., Plant Cell 8: 213-239
(1996)) y el Bcp1 de Arabidopsis (Xu et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. 92: 2106-2110 (1995)). Del mismo
modo, genes nuevos que son androespecíficos pueden ser aislados por
diversas técnicas tales como display diferencial,
hibridación sustractiva y escrutinio diferencial de genoteca de
cDNA. Una vez identificados, pueden aislarse las correspondientes
secuencias genómicas y caracterizarse las regiones promotoras, y
estas secuencias se usan entonces como regiones promotoras para
construir casetes de expresión expresadas de una forma
androespecífica.
Los anteriores genes artificiales de esterilidad
masculina tienen el inconveniente de que su acción es incondicional
y dominante. Una vez creada la planta transgénica, es siempre
androestéril, haciendo que el mantenimiento de las líneas de
plantas sea difícil, y haciendo imposible crear una verdadera línea
homocigótica de plantas de cría.
Se ha descrito otra categoría de genes de
esterilidad masculina en la que el fenotipo de la esterilidad
masculina es condicional. En esta categoría, la fertilidad
masculina se interrumpe solamente después de la aplicación de una
protoxina química. En un ejemplo de esterilidad masculina
condicional, se ha descrito un gen que codifica una
N-acetil-L-ornitina
desacetilasa que cataliza la conversión de la protoxina
N-acetil-L-fosfinotricina
en la toxina herbicida L-fosfinotricina (Kriete
et al., Plant Journal 9: 809-818 (1996); EP
531.716 A2 (1992)). Las plantas transgénicas que expresan este gen
en las células tapetales de la antera se hicieron androestériles
solamente cuando se las trató con la protoxina
N-acetil-L-fosfinotricina.
En otro ejemplo de esterilidad masculina condicional, se ha
descrito un gen que codifica un citocromo bacteriano P450 que
cataliza la conversión de una protoxina R7402 de sulfonilurea en
una toxina herbicida (WO 91/03561; O'Keefe et al., Plant
Physiology 105: 473-482 (1994)). Las plantas
transgénicas que expresan este gen en las células tapetales de la
antera se hicieron androestériles solamente cuando se las trató con
la protoxina R7402. En otro ejemplo de esterilidad masculina
condicional, se ha descrito un gen que codifica una fosfonato
monoéster hidrolasa que cataliza la conversión de la protoxina
gliceril glifosato en la toxina herbicida glifosato (Dotson, et
al., Plant J. 10: 383-392 (96)). Las
plantas transgénicas que expresan este gen en las células tapetales
de la antera se hicieron androestériles solamente cuando fueron
tratadas con la protoxina glicerol
glifosato.
glifosato.
Cualquiera de las fuentes de esterilidad
masculina descritas anteriormente o conocidas en la técnica podría
emplearse en la presente invención. Esto incluye cualquier sistema
genético androestéril de origen natural o transformando un gen
quimérico o recombinante en la línea parental femenina de
interés.
Como se describe en el presente texto, la
formación de semillas viables se evita en la planta con esterilidad
femenina condicional (planta parental masculina) como resultado de
la conversión de la protoxina en la toxina en las estructuras
reproductoras femeninas, y la producción de polen se evita en la
planta androestéril (planta parental femenina). Para obtener
semillas híbridas, la semilla homocigótica del progenitor masculino
y el progenitor femenino son interplantadas en un campo de
producción, permitiendo así la eficiente transferencia de polen. En
un ejemplo de uso de la presente invención para producir semillas
híbridas, el progenitor femenino es androestéril por cualquier
medio y el progenitor masculino se modifica por ingeniería genética
para sea femenina-estéril en presencia de una
apropiada protoxina aplicada exógenamente. Después de la aplicación
de la protoxina en el momento apropiado durante el desarrollo de la
planta, la única producción de semillas viables será el resultado
del polen del progenitor masculino
(femenino-estéril) que fertiliza los óvulos del
progenitor femenino (androestéril). En el modo preferido de usar la
presente invención, el progenitor femenino es modificado por
ingeniería genética para ser androestéril al aplicarle una
protoxina, mientras que el progenitor masculino se modifica por
ingeniería genética para que sea femenina-estéril en
presencia de la misma protoxina. Para producir semillas híbridas,
las dos líneas parentales son interplantadas, y después de la
aplicación de la protoxina en el momento adecuado durante el
desarrollo de la planta solamente se obtienen semillas híbridas.
Por estos medios puede producirse cualquier semilla híbrida que se
desee.
Para producir semillas híbridas de trigo, el
progenitor masculino se modifica por ingeniería genética para que
tenga esterilidad femenina en presencia de una protoxina apropiada
aplicada exógenamente y el progenitor femenino se modifica por
ingeniería genética para que sea androestéril en presencia de la
misma protoxina. Ambas líneas parentales transgénicas se hacen
homocigóticas y la semilla se multiplica mediante prácticas
estándar de la industria. Para la producción de semillas híbridas,
la semilla homocigótica de las líneas parentales masculina y
femeninas modificadas por ingeniería genética son interplantadas a
una determinada relación de masculinas a femeninas para asegurar
una eficiente polinización. En un momento apropiado durante el
desarrollo de la planta, la protoxina se aplica al campo de
producción. Después de la maduración de la semilla, se recolecta el
campo de producción entero, dando sólo semillas híbridas.
Los ejemplos que siguen describen con más
detalle los materiales y métodos usados para llevar a cabo la
invención, y los resultados consiguientes.
Se construyó el plásmido pSH58, que contiene el
promotor \DeltaS13 (-339 a -79 del promotor SLG_{13} fusionado
con -46 a +8 del promotor CaMV 35S, Dzelkalns et al.,
Plant Cell 5: 855-863 (1993)) y se fusionó
con el gen argE (SEC ID Nº: 3) en el marco de lectura
traduccional correcto. El promotor \DeltaS13 es un promotor
femenino-preferencial.
El gen argE se obtuvo del DNA genómico de
E. coli mediante reacciones PCR con cebador
5'-TATCTAGAC
CAGAGGTGTGTCAACAAATGAA-3' (SEC ID Nº: 5) y cebador 5'-CGTCTAGATTGCGGCACTGGAGTTTC-3' (SEC ID Nº: 6). El fragmento resultante fue clonado en pGEM-TA (Stratagene) y se confirmó la secuencia correcta. Usando una serie de etapas de PCR y subclonación, se puso una secuencia de consenso traduccional en plantas y un sitio BamHI secuencia arriba del sitio de inicio de la traducción de argE usando cebadores de PCR, 5' CGCGGATCC
TAAACAATGAAAAACAAATTACCGCC-3' (SEC ID Nº: 7) y GCGCCTAGGGCTTAATGCCAGCAAAAATCC-3'
(SEC ID Nº: 8). Este producto se fusionó después secuencia abajo del promotor \DeltaS13 en el plásmido pSH13 (promotor \DeltaS13 en sk bluescript) y el terminador transcripcional nos se añadió 3' al gen de \beta-glucuronidasa (GUS). Esta casete \DeltaS13-argE-nos se ligó después como fragmento EcoRI en pCIB200 que contiene extremos de T-DNA y un marcador seleccionable vegetal funcional, resistencia a la kanamicina. Este plásmido se designó como pSH58.
CAGAGGTGTGTCAACAAATGAA-3' (SEC ID Nº: 5) y cebador 5'-CGTCTAGATTGCGGCACTGGAGTTTC-3' (SEC ID Nº: 6). El fragmento resultante fue clonado en pGEM-TA (Stratagene) y se confirmó la secuencia correcta. Usando una serie de etapas de PCR y subclonación, se puso una secuencia de consenso traduccional en plantas y un sitio BamHI secuencia arriba del sitio de inicio de la traducción de argE usando cebadores de PCR, 5' CGCGGATCC
TAAACAATGAAAAACAAATTACCGCC-3' (SEC ID Nº: 7) y GCGCCTAGGGCTTAATGCCAGCAAAAATCC-3'
(SEC ID Nº: 8). Este producto se fusionó después secuencia abajo del promotor \DeltaS13 en el plásmido pSH13 (promotor \DeltaS13 en sk bluescript) y el terminador transcripcional nos se añadió 3' al gen de \beta-glucuronidasa (GUS). Esta casete \DeltaS13-argE-nos se ligó después como fragmento EcoRI en pCIB200 que contiene extremos de T-DNA y un marcador seleccionable vegetal funcional, resistencia a la kanamicina. Este plásmido se designó como pSH58.
El plásmido pFA100 se construye de una manera
similar a pSH58, que se vio antes, excepto que el gen argE
(SEC ID Nº: 3) reemplaza al gen GUS en Stig1-GUS
(Goldman et al., EMBO J. 13: 2976-2984
(1994)) en el marco de lectura traduccional correcto usando las
enzimas de restricción apropiadas. La fusión STIG1-argE se
liga después en un vector tal como pCIB200 que contiene extremos de
T-DNA, secuencias de terminación 3' y un marcador
seleccionable vegetal funcional tal como la resistencia a la
kanamicina. El promotor Stig1 es un promotor
femenino-preferencial.
Discos de hojas de tabaco se transforman como se
describe en Horsch et al., Science 227:
1229-1231 (1985) con pSH58. La presencia de los
transgenes integrados se confirma mediante PCR. El análisis Northern
del RNA hecho a partir de tejido femenino se usa para confirmar la
expresión específica del tejido del gen argE en las plantas
transgénicas. Estas plantas son autofecundantes y tienen el fenotipo
de la esterilidad femenina condicional. La semilla T1 se recoge
después de la autopolinización. El transgén condicional femenino en
pFA100 se introduce también en el tabaco usando procedimientos
similares.
El plásmido pSH60 se construyó con el promotor
TA29 (Kriete et al., Plant J. 9:
809-818 (1996)) fusionado con el gen argE.
El promotor TA29 fue clonado a partir del tabaco mediante PCR usando
los cebadores
5'-AACTG
CAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3' (SEC ID Nº: 9) y 5'-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAA
AAC-3' (SEC ID Nº: 10). Mediante una serie de pasos de subclonación, el fragmento TA29 fue fusionado secuencia arriba de argE que contiene la secuencia de traducción de consenso vegetal, como se describe en el Ejemplo 1, y un terminador transcripcional nos añadido 3' al gen argE. La casete TA29-argE-nos fue clonada entre extremos de
T-DNA en el plásmido pSGCGF1 que contiene también el marcador seleccionable vegetal higromicina. El plásmido resultante se designó pSH60.
CAGCTTTTTGGTTAGCGAATGC-3' (SEC ID Nº: 9) y 5'-CAGACTAGTTTTAGCTAATTTCTTTAAGTAAA
AAC-3' (SEC ID Nº: 10). Mediante una serie de pasos de subclonación, el fragmento TA29 fue fusionado secuencia arriba de argE que contiene la secuencia de traducción de consenso vegetal, como se describe en el Ejemplo 1, y un terminador transcripcional nos añadido 3' al gen argE. La casete TA29-argE-nos fue clonada entre extremos de
T-DNA en el plásmido pSGCGF1 que contiene también el marcador seleccionable vegetal higromicina. El plásmido resultante se designó pSH60.
Discos de hojas de tabaco se transformaron como
se describe en Horsch et al., Science 227:
1229-1231 (1985) con pSH60. La presencia de los
transgenes integrados se confirma mediante PCR. El análisis Northern
del RNA hecho a partir de tejido femenino se usa para confirmar la
expresión específica del tejido del gen argE en las plantas
transgénicas. Estas plantas son autofecundantes y tienen el fenotipo
de la esterilidad masculina condicional. La semilla T1 se recoge
después de la autopolinización.
Discos de hojas de tabaco se transforman también
con pGK73, que contiene una casete de expresión del gen argE
bajo el control del promotor TA29 (Kriete et al., Plant
J. 9: 809-818 (1996)) como se describe en Horsch
et al., Science 227: 1229-1231
(1985). La presencia de los transgenes integrados se confirma
mediante PCR. El análisis Northern del RNA hecho a partir de
anteras se usa para confirmar la expresión específica del tejido
del gen argE en las plantas transgénicas. Estas plantas son
autofecundantes y tienen el fenotipo de la esterilidad masculina
condicional. La semilla de la generación T_{1} se recoge después
de la autopolinización.
Las semillas de la generación T_{1} de plantas
tanto femeninas-estériles condicionales
(transformadas con pFA100) como plantas androestériles
condicionales (transformadas con pGK73) se plantan en el terreno.
Una vez que las plántulas han crecido hasta un tamaño suficiente,
el tejido foliar se analiza mediante PCR en relación con la
presencia del transgén argE. Las plantas positivas para la
PCR se transfieren al invernadero. Estas plantas son totalmente
fértiles en ausencia de protoxina aplicada exógenamente. Un
subconjunto de las plantas femeninas-estériles
condicionales y un subconjunto de las plantas androestériles
condicionales son tratados con la protoxina
acetil-PPT durante las etapas de crecimiento. Como
resultado de la conversión preferencial de la protoxina en toxina,
las plantas androestériles condicionales tratadas se hacen
androestériles y las plantas femeninas-estériles
condicionales tratadas se hacen femeninas-estériles.
Las plantas no tratadas permanecen completamente fértiles. El polen
de las plantas femeninas-estériles tratadas se
recoge y se usa para polinizar los pistilos de plantas
androestériles tratadas, que son las plantas parentales femeninas.
La fertilización tiene lugar y se produce la semilla híbrida en la
planta androestéril.
Un fragmento de cDNA específico del estigma fue
primeramente identificado usando el kit de substracción de
cDNA PCR-Select de Clontech (nº de catálogo
Chlontech K 1804-1). PoliA mRNA fue aislado del
estigma de maíz en desarrollo, inflorescencia completa, tejidos
foliar y de la raíz de la línea pura de maíz CG00526 (Stratagene,
nº de cat. 200348). Los cDNAs fueron sintetizados a partir de poliA
mRNA de cada tejido y divididos en "cDNA tester", en este caso
representado por los cDNAs del estigma, y "cDNA driver"
compuesto por iguales cantidades de cDNAs de inflorescencia
masculina, hoja y raíz. La sustracción de cDNA y la amplificación
por PCR se llevaron a cabo como se describe en el manual del
usuario. Los productos de la PCR fueron subclonados en un vector de
clonación TA, pCRII (Invitrogen, nº de cat.
K2000-1). Cada subclón fue escrutado en relación
con la especificidad del tejido en transferencias Northern con 5
\mug de mRNA total del tejido del estigma, inflorescencia
masculina, hoja y raíz del maíz. El clon B200i, de 145 pb de
longitud, mostró expresión específica para el estigma. El fragmento
de cDNA específico del estigma de B200i fue usado para escrutar una
genoteca de cDNA de estigma en desarrollo. La genoteca de cDNA del
estigma fue construida usando poliA mRNA aislado de estigmas
tomados de espigas de 18 cm de largo, siguiendo los procedimientos
detallados en el kit Zap cDNA Gigapack II Gold Cloning de
Stratagene (nº de cat. 200402 de Stratagene). Los clones que se
hibridan con la sonda B200i fueron elegidos para el análisis de la
secuencia. Un clon, de 772 pb de tamaño, contenía la secuencia de
la sonda B200i. Este clon, B200i4-2, se usó como
sonda en transferencias Northern que contienen 1 \mug de poliA
mRNA de tejido de estigma, inflorescencia masculina, hoja y raíz del
maíz. La expresión se detectó solamente en el estigma. La secuencia
del clon de cDNA B200i4-2 se expone en la SEC ID Nº:
1.
Con el fin de aislar la correspondiente región
genómica, el cDNA de B200i4-2 se usó como sonda para
escrutar una genoteca de maíz Mo17 (Stratagene). Se aislaron clones
lambda que se hibridaban intensamente con la sonda
B200i4-2. Se usó análisis Southern y cartografiado
de restricción para identificar los fragmentos genómicos que
contienen la secuencia respectiva de cDNA con las regiones 5' y 3'.
Se aisló un fragmento Bam HI de \sim6,5 Kb de uno de los clones
lambda positivos y se subclonó en Bluescript SK+ (Stratagene), y se
le designó pSH64.
El clon B200i4-2 genómico,
pSH64, que contiene las regiones reguladoras 5' y 3', fue analizado
mediante análisis de secuencia. También se usó barrido
informatizado para identificar los elementos promotores putativos.
La secuencia de la región reguladora 5' y 3' del gen
femenino-preferencial contenido en el clon genómico
pSH64 se expone en la SEC ID Nº: 11. El clon pSH64 fue depositado
bajo los términos del Tratado de Budapest el 27 de febrero de 1998
en el Agricultural Research Service, Patent Culture Collection
(NRRL), Northern Regional Research Center, 1815 North University
Street, Peoria, Illinois 61604, EE.UU., y se le asignó el número de
entrada NRRL B-21920.
Se construye un gen quimérico que se expresa de
manera preferencial en estructuras reproductoras femeninas de la
forma siguiente. La región reguladora 5' de 431 pb de B200i fue
amplificada a partir de pSH64 mediante PCR usando los cebadores
5'-AAAACTGCAGGAATTCACTGCTGAGGGAGCGA-3'
(SEC ID Nº: 12) y
5'-GCGGGATCCTTCTTGCTGTAGTCCTCGACCACG-3'
(SEC ID Nº: 13), y clonada como fragmento
PstI-BamHI en pSOG10 que contiene GUS fusionado con
las secuencias de terminación de nos. La casete
B200i-GUS-nos fue después subclonada
como fragmento EcoRI en pSH64 digerido con EcoRI, poniendo
efectivamente GUS-nos secuencia abajo de la región
reguladora B200i de longitud completa (nucleótidos
1-3790 de SEC ID No: 11). Este plásmido fue
designado pSH70.
La región reguladora B200i de pSH70, como se
describió anteriormente, fue clonada como fragmento
BglII-BamHI en BS-KS (Stratagene) y
la región reguladora 3' de B200i procedente de pSH64 se añadió
secuencia abajo como fragmento EcoRV (nucleótidos
4427-6397 de SEC ID Nº: 11). Este plásmido fue
designado pSH73. El plásmido pSH74 fue construido mediante una
digestión parcial con BamHI de pSH73 y ligando en un fragmento de
DNA que contiene argE (del Ejemplo 1) en el sitio BamHI,
poniendo efectivamente argE entre las regiones reguladoras 5' y 3'
de B200i.
Un fragmento de cDNA específico del pistilo fue
aislado de trigo UC703 usando el método de display
diferencial de mRNA de Genhunter (nº de act. de Genhunter M502)
como se describe en el protocolo del kit. Los cebadores
usados para identificar el fragmento de cDNA específico del pistilo
fueron AP-18 y T_{12}CA. El fragmento fue
subclonado en un vector de clonación pGEM-TA (nº de
cat. de Promega A362A) y se llamó P26. El clon P26 fue usado como
sonda en transferencias Northern que contienen 5 \mug de mRNA
total del tejido del pistilo, antera, hoja y raíz del trigo, y se
confirmó la especificidad del tejido. Se construyó una genoteca de
cDNA del pistilo de trigo usando pistilos aislados del trigo UC703
siguiendo los procedimientos indicados en el kit Zap cDNA
GigaPack II Gold Cloning de Stratagene (nº de cat. de Stratagene
200402). Los clones que se hibridan con la sonda P26 fueron
seleccionados para análisis de secuencia. Un clon,
P26-A4, era de 881 pb de longitud y contenía la
secuencia de P26 de 203 pb. Las transferencias Northern que
contenían 5 \mug de mRNA total de cuatro etapas de desarrollo de
los pistilos, A) inicio, B) brote, C) maduro, D) fertilizado, así
como de antera, hoja y raíz, fueron hibridadas con la sonda
P26-A4 de 881 pb. La expresión predominante del
pistilo fue detectada en el pistilo, con mucho menos expresión
detectada en la raíz.
Un segundo fragmento de cDNA específico del
pistilo fue también aislado del trigo UC703 usando procedimientos
similares a los anteriores. Este fragmento fue subclonado en un
vector de clonación pGEM-TA (nº de cat. Promega
A362A) y se le llamó P19. El clon P19 fue usado como sonda en
transferencias Northern que contienen 5 \mug de mRNA total del
tejido de pistilo, antera, hoja y raíz del trigo y se confirmó la
especificidad por el tejido. Se construyó una genoteca de cDNA del
pistilo del trigo como se describió antes. Los clones que se
hibridan con la sonda P19 fueron seleccionados para análisis de la
secuencia. Un clon, el P19-QA, tenía una longitud
de 649 pb y contenía la secuencia P19. Las transferencias Northern
que contenían 5 \mug de mRNA total de cuatro etapas de desarrollo
de los pistilos, A) inicio, B) brote, C) maduro, D) fertilizado, así
como antera, hoja y raíz, fueron hibridadas con la sonda 649
P19-QA. Se demostró que la expresión era
preferencial para el pistilo.
Para aislar la correspondiente región genómica,
se usó el cDNA de P26-A4 como sonda para cribar una
genoteca genómica custom de trigo UC703 preparada a partir
de plántulas de 2 semanas de edad. La genoteca se construyó
mediante digestión parcial con MboI del DNA genómico total y la
subsiguiente ligación de la fracción de 8-22 kb de
tamaño con DNA de lambda EMBL3 digerido con BamHI (nº de cat.
Clontech CS1013j). Se aislaron los clones de lambda que se
hibridaban fuertemente con la sonda P26-A4. Se usó
análisis Southern y cartografiado de restricción para identificar
fragmentos genómicos que contienen la respectiva secuencia de DNA
con regiones 5' y 3'. Se aisló un fragmento XbaI de 5,5 kb de uno
de los clones lambda positivos y fue subclonado en Bluescript SK+
(Stratagene). Este se designó pCIB10302.
El clon de P26-A4 genómico,
pCIB10302, que contiene las regiones reguladoras 5' fue analizado
por análisis de secuencia. También se usa barrido por ordenador
para identificar elementos promotores putativos. Además, las
regiones 5' se cartografían mediante enzimas endonucleasas de
restricción y el sitio de inicio de la transcripción se determina
mediante RACE PCR y métodos de protección de RNAsa. La secuencia de
la región reguladora 5' del gen
femenino-preferencial contenido en el clon genómico
P26-A4 se expone en la SEC ID No: 2.
Para aislar la correspondiente región genómica,
se usó el cDNA de P19 como sonda para cribar una genoteca genómica
de trigo UC703 "custom" preparada a partir de plántulas de 2
semanas de edad como se describe en el Ejemplo 6. Se aislaron
clones lambda que se hibridaban intensamente con la sonda P19. Se
usó análisis Southern y cartografiado de restricción para
identificar fragmentos genómicos que contienen la secuencia
respectiva de cDNA con las regiones 5' y 3'. Se aisló un fragmento
XhoI de \sim8 Kb de uno de los clones lambda positivos y se
subclonó en Bluescript SK+ (Stratagene), y se le designó
X2-1.
El clon P19 genómico que contiene las regiones
reguladoras 5' y 3', fue analizado mediante análisis de secuencia.
También se usó barrido informatizado para identificar los elementos
promotores putativos. Además, las regiones 5' y 3' fueron
cartografiadas mediante enzimas de restricción de endonucleasa. La
secuencia de la región reguladora 5' del gen
femenino-preferencial contenido en el clon genómico
X2 se expone en la SEC ID Nº: 14.
Se construyó el plásmido pFA200 enlazando
operativamente, empleando métodos estándar conocidos en la técnica,
los siguientes componentes: 1) las regiones reguladoras de P26, como
se describen anteriormente (nts 1-3987), 2) un
fragmento de DNA que contiene el gen argE construido por
ingeniería genética con los sitios de restricción apropiados para
fusionarse con el ATG del marco de lectura abierto de argE en
marco con el sitio de inicio de la traducción (ATG a nt 3987) del
fragmento P26, fusionando así la región reguladora secuencia arriba
de P26 con argE y 3) un vector que contiene secuencias de
terminación 3' que son funcionales en plantas. La expresión de
argE bajo el control del promotor P26 expresará el producto
génico de argE preferencialmente en la estructura
reproductora femenina de la planta.
Las regiones reguladoras 5' de P19 (nucleótidos
1-1093 de la SEC ID No: 14), corte con PstI, un
sitio de una enzima de restricción que se encuentra justo secuencia
arriba de las secuencias P19 en el plásmido X2-1, y
NcoI (nucleótido 1088 de SEC ID No: 14) en el ATG de P19, se ligaron
al corte pSOG15 con PstI y NcoI (pSOG15 contiene el gen GUS y el
terminador nos con un sitio PstI 5' respecto del gen GUS y NcoI en
el ATG del gen GUS). Este plásmido se designó pXB1.
Se construyó el plásmido p19arg enlazando
operativamente, empleando métodos estándar conocidos en la técnica,
los siguientes componentes: 1) las regiones reguladoras de P19, como
se describen anteriormente, 2) un fragmento de DNA que contiene el
gen argE construido por ingeniería genética con los sitios de
restricción apropiados para fusionarse con el ATG del marco de
lectura abierto de argE en marco con el sitio de inicio de la
traducción (ATG en1090 de la SEC ID No: 14) del fragmento P19,
fusionando así la región reguladora secuencia arriba de P19 con
argE y 3) un vector que contiene secuencias de terminación 3'
que son funcionales en plantas. La expresión de argE bajo el
control del promotor P19 expresará el producto génico de argE
preferencialmente en la estructura reproductora femenina de la
planta.
La expresión transitoria de genes en estructuras
reproductoras femeninas se determinó por suministro a tejidos
intactos. Tejido floral del trigo (pistilos y anteras) se puso en
placa en medio de Murashige y Skoog que contiene 15% de maltosa. El
DNA de pXB1 o pSH70 fue precipitado sobre partículas de oro de
tamaño micrométrico usando procedimientos estándar. Se disparó
sobre dos placas diana con 20 pistilos y anteras por diana 2 o 3
veces con el dispositivo de helio DuPont Biolistcs® usando una
presión de descarga de 75 atmósferas. Las placas son disparadas con
un tamiz de malla 80 puesto entre la plataforma portadora y la
diana. Las dianas se pusieron en la oscuridad a 26C durante 16
horas después del bombardeo antes de que los tejidos fueran
transferidos a mezcla de desarrollo de GUS (100 mg de
X-gluc en 200 ml de fosfato sódico 0,05M pH 7)
durante 2 a 24 horas a 37ºC. Los genes GUS en pXB1 y pSH70
produjeron actividad de GUS en los pistilos. Ensayos de
transformación transitoria de pSH70 en tejido de estigma de maíz
demostraron la expresión de GUS en los tejidos femeninos.
Embriones inmaduros (de 0,75 a 1,0 mm de
longitud) de genotipo UC703 se ponen en placa en medio de Murashige
y Skoog que contiene 3 mg/l de 2,4-D y 3% de
sacarosa. Después de aproximadamente 4 horas los embriones se ponen
en placa con el lado del eje del embrión hacia abajo, en placas que
contienen medio de Murashige y Skoog con 15% de maltosa, 3% de
sacarosa y 3 mg/ml de 2,4-D cubierto con una lámina
(slab), soportada con un papel de filtro, de agarosa que
contiene los mismos componentes. Se dejan plasmolizar los embriones
durante 2-3 horas antes del bombardeo.
Se precipita DNA de pFA200 y pSOG35 sobre
partículas de oro de tamaño micrométrico usando procedimientos
estándar. Se dispara sobre cuatro placas diana con 20 embriones por
placa dos veces con el dispositivo de helio DuPont Biolistics®
usando una presión de descarga de 75 atmósferas. Las placas son
disparadas con un tamiz de malla 80 puesto entre la plataforma
portadora y la diana. Las dianas se ponen en la oscuridad a 26C
durante 24 horas después del bombardeo antes de que las láminas con
los embriones se pusieran sobre placas que contienen medio de
Murashige y Skoog con 3 mg/ml de 2,4-D y 3% de
sacarosa. Los embriones individuales se retiran de las láminas y se
ponen directamente en medio fresco de la misma composición después
de otras 48 horas.
Aproximadamente 6 semanas después del suministro
del gen, el tejido respondedor se pone en medio de Murashige y
Skoog con 3 mg/L de 2,4-D y 3% de sacarosa con 0,2
mg/L de metotrexato durante un periodo de 3 semanas. Después se
pone el tejido en un medio de regeneración que comprende medio de
Murashige y Skoog con 1 mg/L de ribósido de zeatina y 1 mg/L de
metotrexato. Al cabo de 2 semanas, las plántulas en regeneración se
ponen en recipientes estériles llamados "GA7s" con sales de
Murashige y Skoog de fuerza media, 2% de sacarosa, 1 mg/L de NAA y
4 o bien 8 mg/ml de metotrexato.
En otro ejemplo, embriones inmaduros (de 0,75 -
1,0 mm de longitud) del genotipo UC703 se procesan como se
describió anteriormente, excepto que se usa medio de Murashige y
Skoog que contiene 2 mg/l de 2,4-D. Después de
aproximadamente 4 horas, los embriones se ponen en placa con el lado
del eje del embrión hacia abajo, en placas que contienen medio de
Murashige y Skoog con 15% de maltosa, 3% de sacarosa y 2 mg/ml de
2,4-D cubiertas con una lámina (slab) de
agarosa, soportada con un papel de filtro, que contiene los mismos
componentes. Se dejan plasmolizar los embriones durante
2-3 horas antes del bombardeo.
El DNA de pFA200, pSH74 o p19arg, junto con
pUbi-Hyg que contiene el promotor de ubiquitina del
maíz unido operativamente al gen de la higromicina
fosfotransferasa, se precipita sobre partículas de oro de tamaño
micrométrico usando procedimientos estándar. Se dispara sobre
cuatro placas diana con 20 embriones por placa dos veces con el
dispositivo de helio DuPont Biolistcs® usando una presión de
descarga de 75 atmósferas. Las placas son disparadas con un tamiz
de malla 80 puesto entre la plataforma portadora y la diana. Las
dianas se ponen en la oscuridad a 26C durante 24 horas después del
bombardeo antes de que las láminas con los embriones se pusieran
sobre placas que contienen medio de Murashige y Skoog con2 mg/ml de
2,4-D y 3% de sacarosa.
Aproximadamente 3 semanas después del
suministro del gen, el tejido respondedor se pone en medio de
Murashige y Skoog con 3 mg/ml de 2,4-D y 3% de
sacarosa. Después se pone el tejido en un medio de regeneración que
comprende medio de Murashige y Skoog con 3% de sacarosa, 5 mg/L de
GA3, 1 mg/L de NAA y 20 mg/L de higromicina. Al cabo de 2 semanas,
el tejido en regeneración se transfiere en medio que comprende medio
de Murashige y Skoog con 3% de sacarosa y 20 mg/L de higromicina.
Al cabo de 2 semanas las plántulas en regeneración se ponen en
recipientes estériles llamados "GA7s" con sales de Murashige y
Skoog de fuerza media, 2% de sacarosa, 1 mg/L de NAA y 4 y 20 mg/L
de higromicina.
Se extrae el DNA del tejido foliar de las
plantas derivadas de la transformación y se realiza la PCR para ver
la presencia de los genes marcadores seleccionables dhfr o
hyg y el gen argE. Las plantas positivas para la PCR
se envían al invernadero para su propagación. Durante las etapas de
floración, se recogen los pistilos de cada planta transgénica y se
hace el RNA a partir de este tejido. La expresión de argE se
confirma por análisis Northern. Las plantas se autofertilizan y se
recogen las semillas.
El plásmido pGK73 se usa como punto de partida.
Las secuencias de terminación TA29-argE-3' se
retiran como una casete del vector de transformación de
Agrobacterium y se ligan en pBluescript KS+ usando las
enzimas de restricción apropiadas. El plásmido resultante se
denomina pMA200.
El promotor específico de la antera, B6, se
construyó a partir del plásmido, pSGBNE1, que contiene un clon
genómico de 3 kb subclonado como fragmento
EcoRI-NheI de pSGB6g1 (véase la patente de EE.UU. nº
5.470.359). Un fragmento ApaI/XbaI de 1558 pb fue clonado
blunt en Bluescript (KS) en el sitio SmaI. Se construyó una
fusión traduccional con el gen argE como se describió
anteriormente en el Ejemplo 2. El plásmido resultante se denomina
pSH68.
El promotor específico del polen Zmg, un
fragmento HindIII-PpuMI de 1 kb de Zmg13 (Hamilton
et al., Sexual Plant Reproduction 2, 208-212
(1989)) fue clonado a partir de pCIB391 en bluescript como fragmento
HindIII-SmaI. La región de terminación de la
transcripción nos fue añadida como fragmento
amHI-XbaI. La secuencia de codificación para
argE como fragmento BamHI (del Ejemplo 1) fue después ligada
en el sitio BamHI, poniendo efectivamente argE entre el
promotor de Zg y las secuencias de terminación nos. Este plásmido se
denomina Zmgarg.
Los plásmidos pUbi-Hyg, que
contienen el promotor de ubicuitina del maíz unido operativamente al
gen de la higromicina fosfotransferasa, y pMA200 o pSH68 o pZmgarg
se usan como secuencias recombinantes para la transformación de
embriones inmaduros de trigo como se describe en el Ejemplo 8. Las
plantas son regeneradas y se usa PCR para confirmar la presencia
del transgen argE. las plantas transgénicas se transfieren al
invernadero. Durante las etapas de floración, se recogen las
anteras y se hace RNA a partir de este tejido, y se confirma la
expresión de argE por análisis Northern. Las plantas se
auto-fertilizan y se recogen las semillas.
Se obtiene callo de Tipo I a partir de embriones
cigóticos inmaduros de genotipo CG00526 usando técnicas de cultivo
estándar. Para el suministro de genes, se preparan aproximadamente
300 mg del callo de Tipo I desmenuzando con una hoja de bisturí,
aclarando 3 veces con medio de cultivo estándar que contiene 18% de
sacarosa, y se ponen inmediatamente en un medio de cultivo
semisólido que también contiene 18% de sacarosa. Al cabo de unas 4
horas, el tejido es bombardeado usando el dispositivo
PDS-1000/He Biolistic de BioRad. Uno de los
plásmidos pFA200, pSH74 o p19arg, junto con pSOG35, es precipitado
en partículas de oro de 1 \mum usando el protocolo estándar de
BioRad. Aproximadamente 16 horas después del suministro del gen el
callo se transfiere a medio de cultivo estándar que contiene 2% de
sacarosa y 2 mg/L de metotrexato. El callo se subcultiva en
selección durante 8 semanas, después de lo cual los callos
supervivientes y en crecimiento se transfieren a medio de
regeneración estándar para la producción de plantas. Se obtienen las
plantas y se les dan números de evento. Las plantas de cada evento
se analizan por PCR para observar la presencia del gen argE y
las plantas positivos para la PCR de transfieren al invernadero.
Durante la floración, se colectan las espigas, se hace RNA de este
tejido y se confirma la expresión de argE por análisis
Northern.
Alternativamente, las plantas de maíz
transgénico se obtienen por bombardeo con microproyectiles de
embriones inmaduros. Las espigas del genotipo CG00526 se
autopolinizan y se obtienen embriones cigóticos inmaduros
aproximadamente 10 días más tarde. Aproximadamente ochocientos
cuarenta embriones cigóticos inmaduros se dividen entre 14 placas
diana diferentes que contienen un medio capaz de inducir y soportar
la formación de callo embriogénico. Los embriones cigóticos
inmaduros se transfieren inmediatamente al mismo medio, pero
conteniendo 12% de sacarosa. Al cabo de 5 horas, los embriones
cigóticos inmaduros se bombardean con, pFA200, con pSH74 o con
p19arg, junto con pSOG35, usando el dispositivo
PDS-1000/He de BioRad. Los plásmidos se precipitan
en partículas de oro de 1 \mum de acuerdo con el procedimiento
publicado de BioRad, como se describió antes. Las partículas se
suministran usando una presión de descarga de 105 atmósferas de
helio. Se dispara dos veces sobre cada placa diana con el plásmido
y el preparado de partículas de oro. El agente de selección,
metotrexato, se aplica a razón de 2 mg/L el día del suministro del
gen y se aumenta hasta después de aproximadamente un mes. El callo
embriogénico así obtenido se regenera en presencia del agente de
selección metotrexato. Se obtienen las plantas y se les dan números
de evento. Las plantas de cada evento fueron ensayadas mediante PCR
para observar la presencia del gen argE y las plantas
positivas para la PCR se transfieren al invernadero. Durante la
floración, se recogen las espigas, se hace el RMA a partir de este
tejido y se confirma la expresión de argE por análisis
Northern.
Los plásmidos pMA200 o pSH68 o pZmgarg y pSOG35
se usan como secuencias recombinantes para la transformación de
embriones inmaduros de maíz como se describe en el ejemplo 11. Las
plantas se regeneran y se usa PCR para confirmar la presencia del
transgén argE. Las plantas transgénicas se transfieren al
invernadero. Durante las etapas de floración, se recolectan las
espigas macho, se prepara el RNA a partir de este tejido y la
expresión de argE se confirma por análisis Northern. Las
plantas se auto-fertilizan y se recolecta la
semilla.
Se cosechan espigas de cebada (cv Golden
Promise) con embriones inmaduros de aproximadamente 1,5 a 2,5 mm de
tamaño, se esterilizan en superficie en lejía (hipoclorito sódico al
5,25%) al 15% (v/v) durante 10 minutos, y se aclaran cinco veces
con agua estéril. Los embriones inmaduros se disecan de las
cariopsis jóvenes y se bisecan longitudinalmente. Se ponen en placa
en un medio de inducción de callo (Wan y Lemaux, Plant Physiology
104: 37-48 (1994)) que contiene sales básicas de
Murashige y Skoog suplementadas con 30 g/L de maltosa, 1 mg/L de
tiamina-HCl, 0,25 g/L de
mio-inositol, 1 g/L de hidrolizado de caseína, 0,69
g/L de prolina, 2,5 mg/L de dicamba, y se solidifican mediante 3,5
g/L de Phytagel® (Sigma).
Para el bombardeo de los embriones, estos son
incubados con el lado del escutello hacia arriba en la oscuridad a
24-28ºC, durante 1 a 3 días. El día de la
transformación, los embriones se ponen en el centro de una placa
petri (100 x 15 mm) formando un anillo. El DNA de los plásmidos
pFA200 o pSH74 o p19arg, junto con pUbi-hyg, se
precipita sobre partículas de oro de 0,6 o 1,0 \mum (BioRad)
siguiendo el manual de DuPont Biolistic Particle Delivery Systems.
Se dispara una vez sobra cada placa de embriones con una pistola de
helio DuPont PDS-1000 a una presión de descarga de
75 atmósferas. Después del bombardeo, los embriones se transfieren a
un medio fresco de inducción de callo con el lado del escutelo
hacia abajo. De tres a siete días después del bombardeo, los
embriones se transfieren a un medio para selección (medio de
inducción de callo más 10 mg/l de higromicina) durante
aproximadamente 14 días. El callo derivado se rompe en trozos más
pequeños y se mantiene separado. En posteriores subcultivos, el
callo se transfiere a un medio fresco de selección con 20 mg/l de
higromicina aproximadamente cada 21 a 28 días. Después de
2-3 subcultivos, el callo superviviente se
transfiere a un medio FHG (Hunter, Ph. D. Thesis, Wye College,
Universidad de Londres, Ashford, Kent, 1988) suplementado con
1-3 mg/L de
6-bencil-aminopurina y
10-20 mg/l de higromicina para la regeneración de la
planta. Las plantas se regeneran a 23-25ºC bajo
luces fluorescentes. Los brotes verdes/plántulas emegidos se
transfieren a un medio libre de hormonas basado en sales básicas de
Murashige y Skogg en una placa Petri de 25 mm x 100 mm. Las plantas
se transfieren a un recipiente Magenta GA7 para posterior desarrollo
cuando alcanzan un tamaño de 2 a 3 cm.
Para el bombardeo del callo, los embriones se
incuban con el lado dele scutelo haca abajo en la oscuridad a
24-28ºC durante al menos 10 días. El día de la
transformación, los callos embriogánicos procedentes de los
embriones cultivados se cortan en tozos pequeños y se ponen en el
centro de una placa petri. El suministro de DNA y las subsiguientes
etapas de regeneración de las plantas son idénticas a las descritas
en el bombardeo de los embriones.
Se analizan las plantas mediante PCR para
observar la presencia del transgén, y las que son positivas se pasan
al invernadero. Durante las etapas de floración, se recogen los
pistilos y se prepara el RNA a partir de este tejido. La expresión
de argE se confirma mediante análisis Northern. Las plantas
se autofertilizan y se recogen las semillas.
Los plásmidos pMA200 o pSH68 o pZmgarg y
pUbi-Hyg se usan como secuencias recombinantes para
la transformación de embriones inmaduros de cebada y callos como se
describe en el Ejemplo 13. Las plantas se regeneran y se usa PCR
para confirmar la presencia del transgén argE. Las plantas
transgénicas se transfieren al invernadero. Durante las etapas de
floración, se recolectan las anteras y se prepara el RNA a partir de
este tejido y la expresión de argE se confirma por análisis
Northern. Las plantas se auto-fertilizan y se
recolecta la semilla.
Las semillas de la generación T_{1} de plantas
transformadas con pFA200 o pSH74 o p19arg (que confieren
esterilidad femenina condicional) y plantas transformadas con pMA200
o pSH68 o pZmgarg (que confieren esterilidad masculina condicional)
se plantan en tierra. Una vez que las plántulas han crecido a un
tamaño suficiente, se analiza el tejido foliar mediante PCR para
observar la presencia del transgén argE. Las plantas
positivas para la PCR se pasan al invernadero. Estas plantas son
enteramente fértiles. Un subconjunto de plantas que contiene pFA200
o pSH74 o p19arg y un subconjunto que contiene pMA 200 o pSH68 o
pZmarg se tratan con la protoxina acetil-PPT
durante las etapas de crecimiento. Las plantas transformadas con
pMA200 o pSH68 o pZmarg (se necesitan homocigotos para la
construcción de promotor de polen pZmgarg) son androestériles como
resultado de la conversión del acetil-PPT en PPT en
las estructuras reproductoras masculinas. Las plantas transformadas
con pFA200 o pSH74 o p19arg son femeninas-estériles
como resultado de la conversión del acetil-ppT en
PPT en las estructuras reproductoras femeninas. Las plantas no
tratadas transformadas con pFA200 o pSH74 o p19arg y pMA200 o pSH68
o pZmarg son entramente fértiles.
Plantas de trigo transgénico de los Ejemplos 8 y
10 fueron transformadas con pFA200 o pSH74 o p19arg (que confieren
esterilidad femenina condicional) y pMA 200 o pSH68 o pZmgarg (que
confieren esterilidad masculina condicional) se crían como líneas
de plantas homocigóticas para cada uno de los transgenes y la
semilla se multiplica mediante prácticas estándar. Las semillas
homocigóticas de plantas que contienen pFA200 o pSH74 o p19arg y
plantas que contienen pMA 200 o pSH68 o pZmgarg son interplantadas a
una relación de progenitores masculinos a femeninos suficiente para
asegurar una eficiente transferencia de polen. En un momento
apropiada durante el desarrollo de las plantas, se aplica al campo
la protoxina acetil-PPT. después de la maduración
de las semillas, se cosecha la producción entera del campo, dando
solamente semillas híbridas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Crossland, Lyle D
\hskip3,9cmHarper, Stacy M
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TITULO DE LA INVENCIÓN: Método de producción de semillas híbridas usando esterilidad femenina condicional.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NUMERO DE SECUENCIAS: 14
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Novartis Corporation - Patent and Trademark Dept.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 12257
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Research Triangle PArk
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NCNY
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CP: 22057
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disco blando
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, versión 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: US TBA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 27-FEB-1998
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NUMERO DE SOLICITUD: US (prov)
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Pace, Gary M
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NUMERO DE REGISTRO: 40.403
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/Nº DE EXPEDIENTE: CGC 1915/Reg
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELEFONO: 919-541-8582
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 919-541-8689
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 772 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: /desc = "secuencia de cDNA para transcrito femenino-preferencial designado B200i4-2"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 4126 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácidos nucleicos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: TATA_signal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 3864
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 3912
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /función = "sitio de inicio de la transcripción"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 3983
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /función = "sitio ATG usado para fusiones traduccionales"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2070 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: no
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 211 ... 1362
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /producto = "N-acetilornitinasa"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 384 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: desc/ = "cebador para argE"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTATCTAGACC AGAGGTGTGT CAACAAATGA A
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: desc/ = "cebador para argE"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTCTAGATT GCGGCACTGG AGTTTC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: desc/ = "cebador para argE"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCGGATCCT AAACAATGAA AAACAAATTA CCGCC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: desc/ = "cebador para argE"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGCCTAGGC GCTTAATGCC AGCAAAAATC C
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: desc/ = "cebador para TA29"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACTGCAGCT TTTTGGTTAG CGAATGC
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: desc/ = "cebador para TA29"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCAGACTAGTT TTAGCTAATT TCTTTAAGTA AAAAC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6596 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1 ... 3790
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /función= "Región reguladora 5' de B200i4-2"
\hskip6.5cm/evidencia= EXPERIMENTAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_signal
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 4427 ... 6397
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /función= "Región reguladora 3' para B200i4-2"
\hskip6.5cm/evidencia= EXPERIMENTAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 3789 ... 3791
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /función= "Inicio de la traducción ATG"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 4402 ... 4404
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /función= "Parada de la traducción"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No:11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: desc/ = "cebador para B200i"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAAACTGCAG GAATTCACTG CTGAGGGAGC GA
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESCRIPCIÓN: desc/ = "cebador para B200i"
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCGGGATCCT TCTTGCTGTA GTCCTCGACC ACG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID No: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1093 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1090 ... 1092
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /función= "Inicio de la traducción ATG"
\hskip6.5cm/evidencia= EXPERIMENTAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERISTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1 ... 1093
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: experimental
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACION: /función= "Región reguladora 5' de P19"
\hskip6.5cm/evidencia= EXPERIMENTAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID No: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (35)
1. Un método para la producción de semillas
híbridas que comprende:
- (a)
- producir una planta femenina-estéril condicional que comprende un promotor femenino-preferencial unido operativamente a una secuencia de codificación que codifica una enzima que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina, en donde dicho promotor femenino-preferencial se elige entre el grupo que consiste en un promotor aislable del clon pSH64 que tiene el número de entrada NRRL B-21920, un promotor que comprende la secuencia expuesta en SEC ID No: 2, y un promotor que comprende los nucleótidos 1 a 1093 de SEC ID No: 14
- (b)
- interplantar la planta femenina-estéril condicional con una planta androestéril;
- (c)
- inducir esterilidad femenina aplicando la protoxina a la planta femenina-estéril condicional; y
- (d)
- producir semillas híbridas.
2. El método según la reivindicación 1ª, en el
que dicha planta es una planta normalmente
auto-polinizada.
3. El método según la reivindicación 1ª, en el
que dicha planta es una planta normalmente polinizada cruzada.
4. El método según la reivindicación 2ª, en el
que dicha planta normalmente auto-polinizada es
trigo.
5. El método según la reivindicación 2ª, en el
que dicha planta normalmente auto-polinizada es
cebada.
6. El método según la reivindicación 3ª, en el
que dicha planta normalmente polinizada cruzada es maíz.
7. El método según la reivindicación 1ª, en el
que dicho promotor femenino-preferencial es un
promotor aislable del clon pSH64 que tiene el número de entrada NRRL
B-21920.
8. El método según la reivindicación 1ª, en el
que dicho promotor femenino-preferencial es un
promotor que comprende la secuencia expuesta en SEC ID No: 2.
9. El método según la reivindicación 1ª, en el
que dicho promotor femenino-preferencial es un
promotor que comprende los nucleótidos 1 a 1093 de SEC ID No:
14.
10. El método según la reivindicación 1ª, en el
que dicha secuencia codificadora que codifica una enzima que
cataliza la conversión de una protoxina en una toxina se obtiene a
partir de un gen elegido entre el grupo consistente en el gen
argE, el gen de la monoxigenasa P450_{sul} y el gen
pehA.
11. El método según la reivindicación 10ª, en el
que dicha secuencia codificadora se obtiene del gen argE.
12. El método según la reivindicación 1ª, en el
que dicha protoxina es acetil-fosfinotricina.
13. Las semillas híbridas producidas por el
método según la reivindicación 1ª, que comprenden el promotor
femenino-preferencial unido operativamente a una
secuencia codificadora que codifica una enzima que cataliza la
conversión de una protoxina en una toxina.
14. Una casete de expresión que comprende un
promotor femenino-preferencial, elegido entre el
grupo consistente en un promotor aislable del clon pSH64 que tiene
el número de entrada NRRL B-21920, un promotor que
comprende la secuencia expuesta en SEC ID No: 2, y un promotor que
comprende los nucleótidos 1 a 1093 de la SEC ID No: 14, unido
operativamente a una secuencia codificadora que codifica una enzima
que cataliza la conversión de una protoxina en una toxina.
15. La casete de expresión según la
reivindicación 14ª, en la que dicha secuencia codificadora se
obtiene a partir de un gen elegido entre el grupo consistente en el
gen argE, el gen de la monoxigenasa P450_{sul} y el gen
pehA.
16. La casete de expresión según la
reivindicación 15ª, en la que la secuencia codificadora se obtiene a
partir del gen argE.
17. La casete de expresión según la
reivindicación 14ª, en la que la secuencia codificadora se obtiene a
partir del gen de la monoxigenasa P450_{sul}.
18. La casete de expresión según la
reivindicación 14ª, en la que dicha secuencia codificadora se
obtiene a partir del gen pehA.
\newpage
19. La casete de expresión según la
reivindicación 14ª, en la que dicho promotor
femenino-preferencial es aislable del clon pSH64 que
tiene el número de entrada NRRL B-21920 y la
secuencia codificadora de interés se obtiene a partir del gen
argE.
20. La casete de expresión según la
reivindicación 14ª, en la que dicho promotor
femenino-preferencial comprende la secuencia
expuesta en SEC ID No: 2 y la secuencia codificadora de interés se
obtiene a partir del gen argE.
21. La casete de expresión según la
reivindicación 14ª, en la que dicho promotor
femenino-preferencial comprende los nucleótidos 1 a
1093 de SEC ID No: 14 y la secuencia codificadora de interés se
obtiene a partir del gen argE.
22. Un promotor
femenino-preferencial aislable del clon genómico
pSH64 que tiene el número de entrada NRRL
B-21920.
23. El promotor
femenino-preferencial según la reivindicación 22ª,
en el que dicho promotor comprende los nucleótidos 1 a 1390 de SEC
ID No: 11.
24. Un promotor
femenino-preferencial que comprende la secuencia
expuesta en SEC ID No: 2.
25. Un promotor
femenino-preferencial que comprende los nucleótidos
1 a 1093 de SEC ID No: 14.
26. Una planta que comprende la casete de
expresión según la reivindicación 14ª.
27. Una planta que comprende la casete de
expresión según la reivindicación 16ª.
28. Una planta que comprende la casete de
expresión según la reivindicación 19ª.
29. Una planta que comprende la casete de
expresión según la reivindicación 20ª.
30. Una planta que comprende la casete de
expresión según la reivindicación 21ª.
31. La semilla de la planta según la
reivindicación 26ª pero que comprende la casete de expresión según
la reivindicación 14ª.
32. La semilla de la planta según la
reivindicación 27ª pero que comprende la casete de expresión según
la reivindicación 16ª.
33. La semilla de la planta según la
reivindicación 28ª pero que comprende la casete de expresión según
la reivindicación 19ª.
34. La semilla de la planta según la
reivindicación 29ª pero que comprende la casete de expresión según
la reivindicación 20ª.
35. La semilla de la planta según la
reivindicación 30ª pero que comprende la casete de expresión según
la reivindicación 21ª.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3952797P | 1997-03-03 | 1997-03-03 | |
| US39527P | 1997-03-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2263200T3 true ES2263200T3 (es) | 2006-12-01 |
Family
ID=21905956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES98907657T Expired - Lifetime ES2263200T3 (es) | 1997-03-03 | 1998-02-27 | Metodo para la produccion de semillas hibridas utilizando la esterilidad condicional femenina. |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0972058B1 (es) |
| JP (1) | JP2001512988A (es) |
| KR (1) | KR100505908B1 (es) |
| CN (1) | CN1193098C (es) |
| AT (1) | ATE332385T1 (es) |
| AU (1) | AU725706B2 (es) |
| BR (1) | BR9808824A (es) |
| CA (1) | CA2281862C (es) |
| DE (1) | DE69835144T2 (es) |
| ES (1) | ES2263200T3 (es) |
| HU (1) | HUP0002390A3 (es) |
| IL (1) | IL131505A0 (es) |
| PL (1) | PL336800A1 (es) |
| RU (1) | RU2222599C2 (es) |
| TR (1) | TR199902113T2 (es) |
| UA (1) | UA73070C2 (es) |
| WO (1) | WO1998039462A1 (es) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19639463A1 (de) * | 1996-09-26 | 1998-04-02 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Verfahren zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen |
| US6815577B1 (en) | 1997-03-03 | 2004-11-09 | Syngenta Participations Ag | Method of hybrid seed production using conditional female sterility |
| DK1054985T3 (da) * | 1998-02-20 | 2012-07-16 | Syngenta Ltd | Produktion af hybridfrø |
| US6515204B1 (en) * | 1999-10-05 | 2003-02-04 | Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Agriculture And Agri-Food | Corn silk gene and regulatory region |
| US6384304B1 (en) | 1999-10-15 | 2002-05-07 | Plant Genetic Systems N.V. | Conditional sterility in wheat |
| WO2002021925A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-21 | Minos Biosystems Limited | Pest control system |
| EP1370650A2 (en) * | 2001-03-12 | 2003-12-17 | Bayer CropScience N.V. | Novel genes for conditional cell ablation |
| WO2003003816A2 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-16 | Monsanto Technology Llc | Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof |
| CA2475485C (en) | 2002-02-26 | 2012-08-28 | Syngenta Limited | A method of selectively producing male or female sterile plants |
| MXPA04009778A (es) * | 2002-04-08 | 2004-12-13 | Pionner Hi Bred International | Exsercion de fibra sedosa mejorada bajo estres. |
| DE10254165A1 (de) | 2002-11-20 | 2004-06-03 | Icon Genetics Ag | Verfahren zur Kontrolle eines zellulären Prozesses in einem multizellulären Organismus |
| US7667096B2 (en) | 2003-06-03 | 2010-02-23 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Conditional sterility in plants |
| US20070174934A1 (en) * | 2003-07-08 | 2007-07-26 | Syngenta Limited | Method of selectively producing male or female sterile plants |
| WO2005070088A2 (en) | 2004-01-15 | 2005-08-04 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Chimeric sequences for tissue-specific gene expression in plants |
| US7268226B2 (en) * | 2005-01-13 | 2007-09-11 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Maize Cyclo1 gene and promoter |
| WO2010118477A1 (en) * | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Molecular Plant Breeding Nominees Ltd | Plant promoter operable in endosperm and uses thereof |
| CN101658129B (zh) * | 2009-09-18 | 2012-02-01 | 云南农业大学 | 雌性不育基因fst用于杂交水稻育种的方法 |
| CA2785432A1 (en) * | 2009-12-29 | 2011-07-28 | The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And P Rovidence Plantations | Male and female sterility lines used to make hybrids in genetically modified plants |
| CN113429468B (zh) * | 2020-03-05 | 2023-04-18 | 山东农业大学 | 大麦雄性不育基因msg3002及其应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990008828A2 (en) * | 1989-02-02 | 1990-08-09 | Paladin Hybrids Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| DE3810286A1 (de) * | 1988-03-25 | 1989-10-12 | Max Planck Gesellschaft | Transgene pflanze mit modifizierter physiologie, morphologie und modifiziertem hormonmetabolismus, gewebekulturen dieser pflanze und verfahren zu ihrer herstellung |
| EP0412006B1 (en) * | 1989-08-04 | 2000-11-29 | Aventis CropScience N.V. | Plants with modified flowers, seeds or embryos |
| HU214927B (hu) * | 1989-08-10 | 1998-07-28 | Plant Genetic Systems N.V. | Eljárás módosított virággal rendelkező növények előállítására |
| EP0825262A3 (en) * | 1989-12-29 | 1998-03-18 | Novartis AG | Tissue-specific toxin expression in plants |
| WO1992004454A1 (en) * | 1990-09-06 | 1992-03-19 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Compounds and constructs for producing male sterile plants |
| US5254801A (en) * | 1990-12-03 | 1993-10-19 | Monsanto Company | Heterologous dominant conditional lethal gene which is a phosphonate monoester hydrolase and use thereof in plants |
| DE4126414A1 (de) * | 1991-08-09 | 1993-02-11 | Hoechst Ag | Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung |
| WO1994025613A1 (en) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | Cornell Research Foundation, Inc. | Isolated dna elements that direct pistil-specific and anther-specific gene expression and methods of using same |
| DE19639463A1 (de) * | 1996-09-26 | 1998-04-02 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Verfahren zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen |
-
1998
- 1998-02-27 AT AT98907657T patent/ATE332385T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 EP EP98907657A patent/EP0972058B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 RU RU99120671/13A patent/RU2222599C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 JP JP53860398A patent/JP2001512988A/ja not_active Ceased
- 1998-02-27 PL PL98336800A patent/PL336800A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 CN CNB988030209A patent/CN1193098C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-27 IL IL13150598A patent/IL131505A0/xx unknown
- 1998-02-27 UA UA99094918A patent/UA73070C2/uk unknown
- 1998-02-27 TR TR1999/02113T patent/TR199902113T2/xx unknown
- 1998-02-27 WO PCT/US1998/003838 patent/WO1998039462A1/en active IP Right Grant
- 1998-02-27 DE DE69835144T patent/DE69835144T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 ES ES98907657T patent/ES2263200T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 HU HU0002390A patent/HUP0002390A3/hu unknown
- 1998-02-27 BR BR9808824-6A patent/BR9808824A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 AU AU63410/98A patent/AU725706B2/en not_active Expired
- 1998-02-27 CA CA2281862A patent/CA2281862C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 KR KR19997008020A patent/KR100505908B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001512988A (ja) | 2001-08-28 |
| PL336800A1 (en) | 2000-07-17 |
| KR20000075938A (ko) | 2000-12-26 |
| EP0972058A1 (en) | 2000-01-19 |
| UA73070C2 (en) | 2005-06-15 |
| CN1193098C (zh) | 2005-03-16 |
| KR100505908B1 (ko) | 2005-08-05 |
| DE69835144T2 (de) | 2006-11-16 |
| AU6341098A (en) | 1998-09-22 |
| HUP0002390A2 (hu) | 2000-11-28 |
| DE69835144D1 (de) | 2006-08-17 |
| CA2281862A1 (en) | 1998-09-11 |
| CA2281862C (en) | 2014-09-30 |
| ATE332385T1 (de) | 2006-07-15 |
| CN1249782A (zh) | 2000-04-05 |
| BR9808824A (pt) | 2000-07-04 |
| WO1998039462A1 (en) | 1998-09-11 |
| IL131505A0 (en) | 2001-01-28 |
| EP0972058B1 (en) | 2006-07-05 |
| TR199902113T2 (xx) | 1999-12-21 |
| HUP0002390A3 (en) | 2002-08-28 |
| AU725706B2 (en) | 2000-10-19 |
| RU2222599C2 (ru) | 2004-01-27 |
| MX9908098A (es) | 2000-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2263200T3 (es) | Metodo para la produccion de semillas hibridas utilizando la esterilidad condicional femenina. | |
| ES2242180T3 (es) | Metodos para la produccion de semillas hibridas. | |
| DK175585B1 (da) | Hankönssteril plante, kultur af celler fra en plante, promoter, DNA samt celler, planter og planteceller indeholdende dette DNA og endvidere fremgangsmåde og moderplanter til produktion af frö | |
| US20120084890A1 (en) | Regulatory sequences for expressing gene products in plant reproductive tissue | |
| JP4642239B2 (ja) | 作物植物での異系交雑および望ましくない遺伝子拡散を制限するための方法および遺伝子組成物 | |
| AU2010343047B2 (en) | Male and female sterility lines used to make hybrids in genetically modified plants | |
| JP2000116258A (ja) | 二元性潜在性細胞毒性法によるハイブリッド種子の産生方法 | |
| ES2385307T3 (es) | Producción de semillas híbridas | |
| KR20030031467A (ko) | 트랜스진의 유전을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물 | |
| AU642454B2 (en) | Expression of S-locus specific glycoprotein gene in transgenic plants | |
| US7525015B2 (en) | Prevention of transgene escape in genetically modified perennials | |
| JP2002507381A (ja) | 核の雄性不稔性植物、雄性不稔性植物を作出する方法および稔性を回復するための方法 | |
| ES2388522T3 (es) | Plantas transgénicas con una distribución controlada de un rasgo a una progenie | |
| HU224706B1 (en) | Novel uses of male sterility in plants | |
| JPH07507445A (ja) | 形質転換小麦 | |
| US6392123B1 (en) | Female-preferential promoters isolated from maize and wheat | |
| US20090165172A1 (en) | Methods and compositions for increasing biomass in genetically modified perennials used for biofuels | |
| CN103525809A (zh) | 介导植物生育力的构建体及其应用 | |
| MXPA99008098A (es) | Metodo de produccion de semillas hibridas utilizando esterilidad hembra condicional | |
| US20100031387A1 (en) | Prevention of transgene escape in genetically modified perennials |