MXPA04009778A

MXPA04009778A - Exsercion de fibra sedosa mejorada bajo estres.

Info

Publication number: MXPA04009778A
Application number: MXPA04009778A
Authority: MX
Inventors: Zinselmeier Christopher
Original assignee: Pionner Hi Bred International
Priority date: 2002-04-08
Filing date: 2003-04-08
Publication date: 2004-12-13
Also published as: AU2008264202A1; WO2003087313A2; AU2003233489B2; EP1572927A4; US20030221224A1; NZ535602A; AU2003233489A1; US20080307545A1; EP1572927A2; CA2481504A1; WO2003087313A3; US8017834B2; AU2008264202B2; CA2481504C; US7358419B2

Abstract

La invencion proporciona metodos para mejorar la exsercion o protuberancia de fibra sedosa del maiz bajo condiciones de estres y composiciones relacionadas con tales metodos, incluyendo acidos nucleicos y proteinas. La invencion ademas proporciona casetes de expresion recombinantes, celulas hospederas y plantas transgenicas.

Description

EXSERCION DE FIBRA SEDOSA MEJORADA BAJO ESTRES CAMPO TECNICO La presente invención se relaciona generalmente a la biología molecular de plantas. Más específicamente, se relaciona a ácidos nucleicos y métodos para modular su expresión en plantas. ANTECEDENTES DE LA INVENCION A lo largo de sus vidas, las plantas se someten rutinariamente a una variedad de estreses que actúan para impedir o alterar los procesos de crecimiento y desarrollo. El estrés para el crecimiento y desarrollo de las plantas de la agricultura tiene un impacto económico negativo en la forma de rendimientos reducidos, gastos incrementados para mejorar los efectos del estrés, o ambos. Dada la población humana incrementada del mundo y la disminución del área de tierra disponible para la agricultura, la mejora de la productividad de la agricultura es de capital importancia. Así, hay una necesidad por plantas de cultivo que sean mejores para tolerar los estreses y mantener la productividad bajo condiciones desfavorables. Mientras que los procedimientos de reproducción de plantas tradicionales continuarán siendo importantes para mejorar las plantas de la agricultura, las nuevas estrategias que son probables que tengan el impacto más significante en la mejora del cultivo implicarán ingeniería genética. Un entendimiento completo de los mecanismos moleculares y celulares usados por las plantas para evitar o tolerar los estreses ayudarán en el desarrollo de nuevas estrategias para mejorar la tolerancia al estrés de las plantas de la agricultura. Los estreses para las plantas pueden ser ocasionados por agentes tanto bióticos como abióticos. Por ejemplo, las causas bióticas de estrés incluyen la infección con un patógeno, alimentación de insectos, parasitismo por otra planta tal como muérdago y el apacentamiento por animales. Los estreses abióticos incluyen, por ejemplo, agua, disponible excesiva o insuficiente, intensidad de luz insuficiente, temperaturas extremas, sustancias químicas sintéticas tales como herbicidas y viento excesivo. Sin embargo, las plantas sobreviven y frecuentemente florecen, aun bajo condiciones desfavorables, usando una variedad de mecanismos internos y externos para evitar o tolerar el estrés. Las respuestas fisiológicas de las plantas al estrés reflejan cambios en la expresión del gen. El rendimiento de grano en Zea mays es dependiente " del número de ovarios que son iniciados, fertilizados y que se desarrollan a la madurez. La producción de grano reducida puede resultar de, ínter alia, una disminución en el número de primeros núcleos, la exserción o protuberancia de fibra sedosa restringida o prematura y/o el aborto del núcleo durante el desarrollo del grano. Las fibras sedosas del maíz comprenden los tejidos estigmáticos de la flor, que interceptan el polen llevado por el aire y que soportan el crecimiento del tubo de polen que resulta en la fertilización. La receptividad de la fibra sedosa al polen está limitada en duración y es afectada por factores ambientales. Por ejemplo, bajo condiciones de sequía, la exserción de fibra sedosa es retardada o restringida y de esta manera no puede ocurrir en el tiempo apropiado con relación al esparcimiento de polen. (Ver, por ejemplo, Herrero, M.P., y R.R. Johnson, Crop Science. 21:105-110, 1981) . De manera importante, el proceso de fertilización determina el número de núcleos y de esta manera ajusta un límite superior irreversible en el rendimiento de grano. Lo que se necesita en la técnica es un medio para estabilizar el rendimiento del maíz a través de medios ambientes al asegurar la exserción de fibra sedosa amplia y sincronizada. Esto se puede realizar a través de modificaciones transgénicas para crear una planta con proporciones constantes o incrementadas de exserción de fibra sedosa, aun bajo estrés, con relación a una planta no modificada . La modificación de la expresión de gen que afecta el crecimiento y el desarrollo de la fibra sedosa requiere el uso de promotores expresados exclusivamente o de preferencia en los tejidos sedosos; por ejemplo, ver la patente norteamericana 6,515,204. También se necesitan regiones de codificación capaces de mejorar el crecimiento y el desarrollo de la fibra sedosa. La presente invención cumple con estos y otros objetivos. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Generalmente, un objeto de la presente invención es proporcionar métodos para transformar plantas con construcciones . genéticas, que comprenden combinaciones novedosas de secuencias de promotor apropiadas y secuencias de codificación que resultan en plantas transformadas con desarrollo de fibra sedosa mejorada bajo condiciones de estrés, con relación a una planta no transformada bajo estrés. Además, los objetos de la presente invención están para proporcionar las plantas transgénicas que muestran desarrollo de fibra sedosa mejorada bajo estrés, y para proporcionar las construcciones genéticas. Por ejemplo, la división de la célula puede ser limitada al desarrollo de la fibra sedosa bajo estrés. La transformación con genes biosintéticos de citoquinina ayudarla a continuar induciendo la división de la célula a pesar del estrés a la planta. Las plantas de Arabidopsis transformadas con ipt de Agrobacterium' turnefaciens demostraron tolerancia a la inundación incrementada, correlacionada con la expresión incrementada de ipt.

(VanToai, T., y colaboradores, Abstract P518, Plant and Animal Genome VII Conference, San Diego, CA, Enero 17-21, 1999) . La expresión especifica de la semilla del gen tzs de Agrobacterium tumefaciens en el tabaco transgénico resultó en el peso y número de semilla incrementados. (Roeckel, P., y colaboradores, Physiologia Plantarum 102:243-249, 1998) . Dietrich y colaboradores (Plant Physiol, Biochem. 33(3) :327-336, 1995) mostraron que la actividad de división de la célula máxima dentro del endosperma del maíz en desarrollo coincidió con el pico en la concentración de citoquinina del núcleo total. Asi, los niveles de citoquinina incrementados en la fibra sedosa en desarrollo podrían servir para incrementar o mantener la división de la célula y la exserción de fibra sedosa bajo condiciones de estrés. Alternativamente o adicionalmente, los genes del ciclo de la célula, tal como ciclina D, ayudarían a continuar la inducción de la división de la célula y de esta manera mantener el desarrollo de la fibra sedosa a pesar del estrés a la planta. Cockcroft y colaboradores (Nature 405:575-579, 2000) encontraron que las plantas de tabaco transformadas con CycD2 bajo control de un promotor constitutivo han elevado las proporciones de crecimiento globales. Riou-Khamlichi y colaboradores (Science 283:1541-1544, 1999) reportaron que CycD3 podría inducir la división de la célula cuando se expresa constitutivamente en el callo de Arabidopsis transgénico. Así, la expresión incrementada de los genes del ciclo de la célula específicamente en el tejido sedoso podría promover la división de la célula y el crecimiento de la fibra sedosa. Alternativamente o adicionalmente, la transformación que resulta en la expresión dirigida, incrementada de simporters de sacarosa podría incrementar el suministro de carbón a las fibras sedosas en desarrollo. Los simporters actúan para acumular sacarosa del apoplasto y transportarlo a través de los límites de la célula, tal como en los elementos de tamiz de floema o las células asociadas. Los simporters también pueden transportar monosacáridos , y su actividad podría ser importante en el desarrollo de la fibra sedosa, proporcionando hexosas a las células en alargamiento para mantener la presión osmótica y proporcionar precursores para la síntesis macromolecular . Para una revisión, ver Williams y colaboradores, Trends in Plant Science 5(7):283-290 (2000). Existe evidencia para la especificidad de tejido y para la regulación transcr'ipcional de la expresión de simporters de sacarosa (Williams, supra, at pp . 287 y 289). Además, los estreses bióticos y abióticos pueden afectar la expresión de los simporters de sacarosa. Ver, por ejemplo, Noiraud y colaboradores, Plant Phusiology 122:1447-1455 (2000). Así, las construcciones que dirigen la expresión incrementada o sostenida de simporters de sacarosa en tejidos reproductores femeninos en etapas de desarrollo críticas podría ser útil en mantener el crecimiento y la función de las fibras sedosas. Leggewie y colaboradores (patente norteamericana 6,025,544) enseñan la transformación con secuencias transportadoras de sacarosa para la floración más temprana y más prolífica. La presente invención, en contraste, proporciona la transformación con secuencias transportadoras de sacarosa que resultan en el desarrollo de la fibra sedosa sostenida o mejorada bajo condiciones de estrés, especialmente sequía, densidad y/o estrés térmico. Alternativamente o adicionalmente, la transformación que da por resultado la regulación hacia arriba dirigida de las invertasas podría incrementar el suministro de carbón a las fibras sedosas en desarrollo. Las invertasas convierten la sacarosa en sus monosacáridos componentes, glucosa y fructosa. La actividad de la invertasa soluble que crea una concentración de soluto incrementada dentro de una célula serviría para acarrear agua en la célula y ocasionar que se expanda. En el maíz, una invertasa soluble, Ivr2, se ha mostrado que es específicamente inducida bajo el estrés de agua, y el incremento resultante en la acumulación de hexosa se especuló que incrementa la expresión osmótica que podría proporcionar resistencia a la sequía. (Kim y colaboradores, Plant Phisiology 124:71-84, 2000). La sobreexpresión de Ivr2 en los tejidos sedosos por lo tanto podría inducir la expansión de la célula deseable bajo condiciones de estrés de agua . Alternativamente o adicionalmente, la expresión incrementada de un antiporter de sodio dentro de los tejidos sedosos podría dar por resultado un desarrollo del tejido de la fibra sedosa mejorada bajo el estrés por sequía. La sobreexpresión en Brassica napus de AtNHXl, que codifica un antiporter de sodio vacuolar de la Arabidopsis, produce plantas con sensibilidad reducida a la sal. Los iones sodio se mueven en la vacuola, incrementando la concentración de soluto, que resulta en el agua que es acarreada en la célula. (Zhang y colaboradores, PNAS 98 (22 ): 12832-12836, 2001). La sobreexpresión de AtNHXl o un gen que codifica una proteína de función similar dentro de los tejidos sedosos del maíz por lo tanto- podría inducir la retención de agua incrementada y la expansión de la célula deseable bajo condiciones de estrés de agua. Tal gen puede ser del maíz. Alternativamente o adicionalmente, el potencial osmótico adecuado para la expansión de la célula podría resultar de la sobreexpresión dirigida de una pirofosfatasa vacuolar. Gaxiola y colaboradores, han reportado que la sobreexpresión del gen AVP1 de Arabidopsis, que codifica una pirofosfatasa vacuolar, dio por resultado una tolerancia a la sequía marcada, aparentemente a través de la acumulación vacuolar incrementada de soluto que ocasiona la retención de agua celular aumentada. (PNAS 98 (20) : 11444-11449, 2001). La sobreexpresión de AVP1 o un gen que codifica una proteina de función similar dentro de los tejidos sedosos del maíz por lo tanto podría inducir la retención de agua incrementada y la expansión de la célula deseable bajo condiciones de estrés de agua . Alternativamente o adicionalmente, las expansinas podrían ayudar a inducir la expansión de la célula de la fibra sedosa. Las expansinas son proteínas extracelulares que catalizan el agrandamiento de la pared celular al romper los enlaces no covalentes entre los polisacáridos de la pared celular. La expresión incrementada de genes de expansina se ha correlacionado con el crecimiento rápido del tallo en el arroz sumergido (Cho, H.T. & Kende, H., Plant Cell 9:1661-1671, 1997) y con el crecimiento de la raíz de plántulas de maíz bajo estrés de sequía (Wu, Y. y colaboradores, Plant Physiol, 111:765-772, 1996). La expresión dirigida de las expansinas podría ayudar en el agrandamiento de la célula, incrementando de esta manera la longitud de la fibra sedosa, particularmente bajo condiciones de estrés. Alternativamente o adicionalmente, la expresión dirigida de acuaporinas podría ayudar en la expansión de la célula de la fibra sedosa. Las acuaporinas, designadas TIPs (Proteínas Intrínsecas de Tonoplasto) o MIPs (Proteínas Intrínsecas de Membrana de plasma) , son proteínas de canal que facilitan el movimiento del agua a través de las membranas vacuolares o de plasma. El gen acuaporina de maíz ZmTIPl se expresa a altos niveles en las células de expansión, consistente -con la hipótesis de que las TIPs permiten la captación rápida de agua. (Chaumont y colaboradores, Plant Physiol. 117:1143-1152, 1998). La expresión regulada hacia arriba y dirigida de las acuaporinas, incluyendo aquellas endógenas al maíz y particularmente a aquellas expresadas en el tejido sedoso del maíz, podrían soportar la expansión de la célula de la fibra sedosa rápida y de esta manera promover el crecimiento del tejido sedoso. Ver también las patentes norteamericanas Nos. 6,313.375 y 6,313,376, incorporadas en la presente por referencia. Alternativamente o adicionalmente,. la expresión dirigida de los genes que codifican enzimas involucradas de la rafinosa sintasa pueden proporcionar tolerancia a la sequía, salinidad y/o al frío. Taji y colaboradores (Plant Jounal 29 (4) : 417-426, 2002) han reportado que "la galactinol sintasa inducible por estrés desempeña una función principal en la acumulación de galactinol y rafinosa bajo condiciones de estrés abióticas" y que "el galactinol y la rafinosa pueden funcionar como osmoprotectores en la tolerancia al estrés de sequía de las plantas". Por lo tanto, las construcciones que dirigen la sobreexpresión de galactinol sintasa o rafinosa sintasa en el tejido sedoso podría conducir a la exserción de fibra sedosa mejorada bajo estrés abiótico. Un objeto adicional de la invención es proporcionar secuencias de promotor activas exclusivamente o preferencialmente en las fibras sedosas y métodos de uso de las secuencias de promotor. En otros aspectos, la presente invención se relaciona a: 1) casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención operablemente enlazado a un promotor, 2) una célula hospedera en la cual se ha introducido en cásete de expresión recombinante y 3) una planta transgénica que comprende el cásete de expresión recombinante. La célula hospedera y la planta son opcionalmente " del maíz. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método de control mejorado de expresión de un producto endógeno o exógeno en una planta transformada o su progenie . Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para efectuar cambios útiles en el fenotipo de una planta transformada o su progenie. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para modular el desarrollo de una planta transformada o su progenie. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona a un método para modular la expresión de gen en una planta establemente transformada que comprende las etapas de (a) transformar una célula de planta con un cásete de expresión recombinante de la presente invención; (b) hacer crecer la célula de la planta bajo condiciones de crecimiento apropiadas y (c) regenerar una planta establemente transformada de la célula de planta en donde la secuencia de nucleótidos enlazada es expresada. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Revisión A. Acidos Nucleicos y Proteínas de la Presente Invención A menos que se mencione de otra manera, las secuencias de polinucleótido y polipéptido identificadas en las SEQ ID NOS : 1-26 representan polinucleótidos y polipéptidos ejemplares útiles en la presente invención. La Tabla 1 proporciona la identificación de las SEQ ID NOS: 1-26.

Nombre del Gen Polinucleótido Polipéptido SEQ ID NO. SEQ ID NO.

Promotor preferido 1, 26 de la fibra sedosa ("gl2") Isopentenil 2 3 transíerasa Ciclina D 4 5 Quinasa dependiente 6 7 de Ciclina a-expansina 8 9 ß-expansina 10 11 Acuaporina 12 13 Acuaporina 14 15 Acuaporina 16 17 Simporter de 18 19 sacarosa Invertasa soluble 20 21 Antiporter de sodio 22 23 Pirofosfatasa 24 25 vacuolar Utilidad Ejemplar de la Presente Invención La presente invención proporciona utilidad en tales aplicaciones ejemplares como la ingeniería de plantas de Zea mays para mostrar exserción de fibra sedosa mejorada, con relación a una planta no transformada, bajo condiciones de estrés ambiental, tales como sequía, alta densidad de plantas, o calor excesivo. La exserción de fibra sedosa mejorada puede comprender elementos de puntualidad y calidad, por ejemplo, exserción más rápida, longitud de la fibra sedosa más grande y emergencia de la fibra sedosa más completa y más uniforme a partir del retoño de mazorca. Tales mejoras en la exserción de fibra sedosa, pueden resultar de, por ejemplo, proporciones incrementadas de la división de la célula en el tejido sedoso, expansión incrementada de las células que componen las fibras sedosas y proporciones alteradas de flujo de agua y solutos dentro o en el tejido sedoso. Definiciones Las unidades, prefijos y símbolos pueden ser denotados en su forma SI aceptada. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos son escritos de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos son escritas de izquierda a derecha en la orientación amino a carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos mencionados dentro de la especificación son inclusivos de los números que definen el intervalo e incluyen cada número entero dentro del intervalo definido. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente mediante ya sea sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura IUPAC-IUBMB. Los nucleó.tidos , del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. A menos que se proporcione de otra manera, los términos de software, eléctricos y electrónicos como se utiliza en la presente son como se definen en The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5a edición, 1993). Los términos definidos enseguida son más completamente definidos por referencia a la especificación en conjunto. Los encabezamientos de sección proporcionados por toda la especificación no son limitaciones a los diversos objetos y modalidades de la presente invención. Por "amplificado" se propone la construcción de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico o múltiples copias complementarias a la secuencia de ácido nucleico usando por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico como un patrón. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de polimerasa (PCR), sistema de reacción en cadena de ligasa (LCR) , amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) , sistemas Q-Beta Replicasa, sistemas de amplificación basados en transcripción (TAS), y amplificación de desplazamiento de la hebra (SDA). Ver, por ejemplo, Diagnostic Molecular Microbiology: Principies and Applications, D.H. Persing y colaboradores, Ed., American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1993). El producto de amplificación es llamado un amplicón. Como se utiliza en 3a presente, "orientación antisentido" incluye la referencia a una secuencia de polinucleótido dúplex que está operablemente enlazada a un promotor en una orientación donde la hebra antisentido está transcrita. Le hebra antisentido es suficientemente complementaria a un producto de transcripción endógeno tal que la traducción del producto de transcripción endógeno es frecuentemente inhibida. Por "que codifica" o "codificado", con respecto a un ácido nucleico especificado, se propone que comprende la información para la traducción en la proteína especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteína- puede comprender secuencias intermedias (por ejemplo, intrones) dentro de las" regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias intermedias (por ejemplo, como en cDNA) . La información mediante la cual una proteína es codificada es especificada mediante el uso de codones . Típicamente, la secuencia de aminoácidos es codificada por el ácido nucleico usando el código genético "universal". Sin embargo, las variantes del código universal, tal como están presentes en algunos mitocondrios de plantas, animales y fúngales, la bacteria Mycoplasma capricolum, o el Macronucleus ciliado se puede usar cuando el ácido nucleico es expresado en las mismas . Cuando el ácido nucleico se prepara o se altera sintéticamente, se puede tomar ventaja de las preferencias de codón conocidas del organismo huésped propuesto. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser expresadas en especies de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias pueden ser modificadas para tener en cuenta las preferencias de codón especificas y las preferencias de contenido de GC de las monocotiledóneas o dicotiledóneas ya que estas preferencias se han mostrado que difieren (Murray y colaboradores Nucí. Acids. Res. 17:477-498 (1989)). Asi, el codón preferido del maíz para un aminoácido particular puede ser derivado de secuencias de gen conocidas del maíz. La utilización del codón de maíz para 28 genes de plantas de maiz se lista en la Tabla 4 de Murray y colaboradores, supra. Como se utiliza en la presente, "secuencia de longitud completa" en referencia a un polinucleótido especificado o su proteina codificada significa que tiene la secuencia de aminoácidos completa de una forma nativa (no sintética) , endógena, biológicamente (por ejemplo, estructuralmente o catalíticamente) activa de la proteína especificada. Los métodos para determinar si una secuencia es de longitud completa ' son bien conocidos en la técnica; incluyendo tales técnicas ejemplares como manchado de northern o western, extensión de cebador, protección SI y protección de ribonucleasa . Ver, por ejemplo, Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Clark, Ed. , Springer-Verlag, Berlín (1997). La comparación a las secuencias homologas (ortólogas y/o parálogas) de longitud completa conocidas también se puede utilizar para identificar secuencias de longitud completa de la presente invención. Adicionalmente, secuencias consensúales típicamente presentes en las regiones no transducidas 5' y 3' del mRNA ayudan en la identificación de un polinucleótido como longitud completa. Por ejemplo, la secuencia consensual ANNNNAUGG, donde el codón subrayado representa la metionina N-terminal, ayuda a determinar si el polinucleótido tiene un extremo 5' completo. Las secuencias consensúales en el extremo 3' , tales como las secuencias de poliadenilación, ayudan a determinar si el polinucleótido tiene un extremo 3' completo. Como se utiliza en la presente, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina en una especie foránea, o, si es de la misma especie, es sustancialmente modificado de su forma nativa en composición y/o sitio genómico mediante la intervención humana. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de aquel del cual se derivó el gen estructural o si es de la misma especie, uno o ambos son sustancialmente modificados de su forma original. Una proteína heteróloga puede originarse de una especie foránea o, si es de la misma especie, es sustancialmente modificada de su forma original mediante la intervención humana. Por "célula hospedera" se propone una célula que contiene un vector y soporte a la replicación y/o' expresión del vector. Las células hospederas pueden ser . células procarióticas tales como de E. coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, de insectos, anfibios o mamíferos. De preferencia, las células hospederas son células de plantas monocot iledóneas o dicotiledóneas. Una célula hospedera monocotiledónea particularmente preferida es una célula hospedera de maíz. El término "introducido" incluye la referencia la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica en donde el ácido nucleico puede ser incorporado en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástida o DNA mitocóndrico) convertido en un replicón autónomo, o transientemente expresado (por ejemplo, mRNA transíectado) . El término incluye tal medio de introducción de ácido nucleico como "transfección", "transformación" y "transducción" . El término "aislado" se refiere a material, tal como un ácido nucleico o una proteina, que está sustancialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con éste en su medio ambiente en que surge de manera natural. El material aislado opcionalmente comprende material no encontrado con el material en su medio ambiente natural, o si el material está en su medio ambiente natural, el material ha sido sintéticamente (no naturalmente) alterado mediante la intervención humana a una composición y/o colocado en una ubicación en la célula (por ejemplo, genoma u organelo celular) no nativa al material aislado. La alteración para producir el material sintético se puede realizar sobre el material dentro o removido de su estado natural. Por ejemplo, un ácido nucleico que surge de manera natural llega a ser un ácido nucleico aislado si es alterado, o si es transcrito del DNA que se ha alterado, por medio de la intervención humana realizada dentro de la célula de la cual se origina. Ver, por ejemplo, Compounds and Methods for Site Directed utagenesis in Eukaryotic Cells, Kmiec, patente norteamericana No. 5,565,350; In Vivo Homologous Sequence Targeting in . Eukariotic Cells; Zarling y colaboradores, PCT/US93/03868. Del mismo modo un ácido nucleico que surge de manera natural (por ejemplo, un promotor) llega a ser aislado si es introducido mediante medios que surgen de manera no natural a un sitio del genoma no nativo a ese ácido nucleico. Como se utiliza en la presente "ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, o quimeras del mismo, en forma ya sea de una sola o doble hebra, y a menos que se limite de otra manera, comprende análogos conocidos que tiene la naturaleza esencial de nucleótidos naturales en que ellos hidridan a ácidos nucleicos de una sola hebra de una manera similar a aquella de los nucleótidos que surgen de manera natural (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido) . Por "biblioteca de ácido nucleico" se propone una colección de moléculas de DNA o RNA aisladas que comprenden y sustancialmente representan la fracción transcrita completa de un genoma de un organismo especificado, o un tejido o tipo de célula de ese organismo. Las construcción de bibliotecas de ácido nucleico ejemplares, tales como las bibliotecas genómicas y de cDNA, es enseñada en las referencias de biología moleculares estándares tales como Berger y.Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques , Methods in Enzymology; Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego,. Ca (Berger); Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989); y Current Protocole in Molecular Biology, F.M. Ausubel y colaboradores, Eds . , Current Protocols, una empresa colectiva entre Greene Publishing Associates, Inc., y John Wiley & Sons, Inc. (1984) . Como se utiliza en la presente, "operablemente enlazado" incluye la referencia a un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia de promotor inicia y media la transcripción ' de la segunda secuencia. En general, operablemente enlazado significa que las secuencias de ácido nucleico que son enlazadas están contiguas, y donde es necesario unen dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en la misma estructura de lectura. Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye la referencia a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.), semillas y células de plantas y progenie de las mismas. La célula de planta, como se utiliza en la presente incluye, sin limitación, células aisladas de semilla, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raices, retoños, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. La clase de plantas que puede ser usada en los métodos de la invención incluye plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Una planta particularmente preferida es Zea -mays. Como se utiliza en la presente, "polinucleótido" incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido o quimeras o análogos de los mismos que tiene la naturaleza esencial de un desoxi- o ribo-nucleótido natural en que ellos hibridan, bajo condiciones de hibridación severas, a sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos como lo hacen los nucleótidos que surgen de manera natural y/o permiten la transducción en el mismo aminoácido (s) como lo hace el nucleótido ( s ) que surge de manera natural. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen estructural o regulatorio, nativo o heterólogo. A menos que' se indique de otra manera, el término incluye la referencia a la secuencia especificada asi como la secuencia complementaria de la misma. Asi, los DNAs o RNAs con cadenas principales modificadas para estabilidad o por otras razones son "polinucleótidos" como ese término se propone en la presente. Además, los DNAs o RNAs que comprenden bases inusuales, tal como inosina, o bases modificadas, tales -como bases tritiladas, por mencionar solo dos ejemplos, son polinucleótidos como el término se utiliza en la presente. Será apreciado, que una gran variedad de modificaciones se han hecho al DNA y RNA que sirven para muchos propósitos útiles conocidos para aquellos expertos en la técnica. El término polinucleótido como es empleado en la presente comprende formas químicamente, enzimáticamente o metabólicamente modificadas de polinucleótidos, así como las formas químicas de DNA y RNA características de los virus y células, incluyendo entre otras cosas, células simples y complejas. Los términos "polipéptido" , "péptido" y "proteína" se usan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos aplican a polímeros de aminoácido que surgen de manera natural, así como polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido que surge de manera natural correspondiente. La naturaleza esencial de tales análogos de aminoácidos que surgen de manera natural es que, cuando se incorporan en una proteina, esa proteína es específicamente reactiva a anticuerpos presentados a la misma proteína pero consisten completamente de aminoácidos que surgen de manera natural. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" también son inclusivos de modificaciones incluyendo, pero no limitados a, glicosilación, unión de lípido, sulfatación, gama-carboxilación de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ADP-ribosilación . Además, esta invención contempla el uso de las variantes terminales de amino tanto que contienen metionina como las que no contienen metionina de las proteínas de la invención. Como se utiliza en la presente, "promotor" incluye la referencia a una región de DNA corriente arriba desde el inicio de transcripción e involucrada en el reconocimiento y enlace de RNA polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de planta" es un promotor · capaz de iniciar la transcripción en células de plantas si o no su origen es una célula de planta. Promotores de plantas ejemplares incluyen, pero no están limitados a, aquellos que son obtenidos de plantas, virus de plantas, y bacterias que comprenden genes expresados en células de plantas tales como Agrobacterium o Rhizobium. Ejemplos de promotores bajo el control de desarrollo incluyen promotores que preferencialmente inician la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces o semillas. Tales promotores son referidos como "preferidos del tejido". Los promotores que inician la transcripción solamente en ciertos tejidos son referidos como "específicos del tejido". Un promotor específico del "tipo de célula" principalmente induce la expresión en ciertos tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Un promotor "inducible" o "represible" es un promotor que está bajo control ambiental. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción mediante promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Los promotores específicos del tejido, preferidos del tejido, específico del tipo de célula e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría de las condiciones. Como se utiliza en la presente, "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo a una célula derivada de una célula así modificada. Así, por ejemplo, células recombinantes expresan genes que no son encontrados en forma idéntica dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que son de otra manera anormalmente expresados, subexpresados o no expresados en todo, como un resultado de la intervención humana. El término "recombinante" como se utiliza en la presente no comprende la alteración de la célula o vector mediante eventos que surgen de manera natural (por ejemplo, mutación espontánea, transformación natural/transducción/transposición) tales como aquellos que ocurren sin la intervención humana. Como se utiliza en la presente, un "cásete de expresión recombinante" es una construcción de ácido nucleico, generada recombinantemente o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico especificados que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula hospedera. El cásete de expresión recombinante puede ser incorporado en un plásmido, cromosoma, DNA mitocóndrico, DNA de plástida, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye entre otras secuencias, un promotor y un ácido nucleico a ser transcrito. Los términos "residuo" y "residuo de aminoácido" y "aminoácido" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un aminoácido que es incorporado en una proteína, polipéptido, o péptido (colectivamente "proteína") . El aminoácido puede ser un aminoácido que surge de manera natural, a menos que se limite de otra manera, puede comprender análogos no naturales de aminoácidos naturales que pueden funcionar de una manera similar como los aminoácidos que surgen de manera natural.

El término "selectivamente híbrida" incluye la referencia a la hibridación, bajo condiciones de hibridación severas, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo de ácido nucleico especificada a un grado detectablemente más grande (por ejemplo, 2 veces sobre el antecedente) que es hibridación a las secuencias de ácido nucleico no objetivo y a la exclusión sustancial de ácido nucleico no objetivo. Las secuencias que hibridan selectivamente típicamente tienen de manera aproximada por lo menos 80% de identidad de secuencia, de preferencia 90% de identidad de secuencia y mucho más de preferencia 100% de identidad de secuencia (es decir, son complementarias) entre sí . El término "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" incluye la referencia a condiciones bajo las cuales una sonda selectivamente hibridará a su secuencia objetivo a un grado detectablemente más grande que las otras secuencias (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el antecedente) . Las condiciones severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, las secuencias objetivo puede ser identificadas que son 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajusfar para permitir alguna desigualación en la secuencia de modo que grados menores de similitud son detectados (sondeo heterólogo) . Generalmente, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud, opcionalmente menos de 500 nucleótidos en longitud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de ion Na, típicamente de manera aproximada 0.01 a 1.0 M de concentración de ion NA (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden obtener con la adición de agentes de desestabilizantes tal como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 al 35%, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC=NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50 a 45%, NaCl 1M, SDS al 1% a 37 °C, y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en 0.5X a IX SSC a 60 a 65°C. La especificidad es típicamente la función de los lavados de post-hibridación, los factores críticos que son la intensidad iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DNA, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Menkoth y Wahl, Anal. Biochem., 138:267-284 (1984): Tm = 81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/1L; donde es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos guanosina y citosina en el DNA, % de form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares bases. La Tm es la temperatura (bajo intensidad iónica y pH definido) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria híbrida una sonda perfectamente igualada. La Tm es reducida por aproximadamente 1°C por cada 1% de desigualación; así, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con =90% de identidad, la Tm puede ser disminuida 10°C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser aproximadamente 5°C menor que. el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una intensidad iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, o 4°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) ; las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9 o 10°C, menor que el punto de fusión térmico (Tra) : las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) . Usando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado y la Tra deseada, aquellos expertos ordinarios entenderán que las variaciones en la severidad de la hibridación y/o las soluciones de lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de desigualación resulta en una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) se prefiere incrementar ia concentración de 3SC de modo que se puede utilizar una temperatura más alta. La hibridación y/o condiciones de lavado se puede aplicar por al menos 10, 30, 60, 90, 120 o 240 minutos. Una guia extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hibridization wíth Nucleic Acid Probes, Part. I, Chapter 2 "Overview of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid robe assays", Elsevier, New York (1993); and Curren t Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel y colaboradores, Eds . , Greene Publishing and Woñey-Interscience, New York (1995) . Como se utiliza en la presente, "planta transgénica" incluye la referencia a una planta que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo.

Generalmente, el polinucleótido heterologo es establemente integrado dentro del genoma tal que el polinucleótido es pasado sobre generaciones sucesivas. El polinucleótido heterologo puede ser integrado en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante. "Transgénico" se utiliza en .la presente para incluir cualquier célula, linea de célula, callo, tejido, parte de planta o planta, el genotipo del cual se ha alterado mediante la presencia de ácido nucleico heterologo incluyendo aquellos transgénicos inicialmente alterados de esta manera asi' como aquellos creados mediante cruzas sexuales o propagación asexual desde el transgénico inicial. El término "transgénico" como se utiliza en la presente no comprende la alteración del genoma (cromosomal o extra-cromosomal) mediante métodos de reproducción de plantas convencionales o mediante eventos que surgen de manera natural tal como la fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, trans ormación bacterial no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea. Como se utiliza en la presente, "vector" incluye la referencia a un ácido nucleico usado en la introducción de un polinucleótido de la presente invención en una célula hospedera. Los vectores son frecuentemente replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado en los mismos.

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre un polinucleótido/-polipéptido de la presente invención con un polinucleótido/polipéptido de referencia: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia" y (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida usada como una base para comparación de secuencia con un polinucleótido/polipéptido de la presente invención. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de una secuencia de cDNA o de gen de longitud completa, o la secuencia de cDNA o de gen completa. (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" incluye la referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótido/polipéptido, en donde, la secuencia de polinucleótido/polipéptido puede ser comparado a una secuencia de referencia en donde la porción de la secuencia de polinucleótido/polipéptido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) comparados con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos/residuos de aminoácidos en longitud, y opcionalmente pueden ser 30, 40, 50, 100, 300, 400, 500, 600, 750, 1000, 1250, 1500, o más largo. Aquellos expertos en la técnica entienden que para evitar una similitud a una alta secuencia de referencia debido a la inclusión de espacio en la secuencia de polinucleótido/polipéptido, una sanción de espacio típicamente es introducida y es sustraída del número de igualaciones. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación se puede conducir mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); mediante la búsqueda por el método de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. 85:2444 (1988); "mediante implementaciones computerizadas de estos programas, incluyendo, pero no limitado a: CLUSTAL en el programa PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, California; GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package. Genetics Computer Group (GCG) , 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA. El programa CLUSTAL es bien descrito por Higgins y Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet y colaboradores, Nucleic Acids Research 16_10881-90 (1988 ) ; Huang y colaboradores, Computer Apliations in the Biosciences 8:155-65 (1992), y Pearson y colaboradores, Methods in Molecular Biology 24:307-331 (1994). La familia BLAST de programas que pueden ser usados para búsqueda de similitud de base de datos incluyen: BLASTN para secuencias interrogantes de nucleótidos contra secuencias de base de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias interrogantes de nucleótidos contra secuencias de base de datos de proteína; BLASTP para secuencias interrogantes de proteína contra secuencia de base de datos de proteína; TBLASTN para secuencias interrogantes de proteína contra secuencias de base de datos de nucleótidos; y TBLASTX para secuencias interrogantes de nucleótidos contra secuencias de base de datos de nucleótidos. Ver, Current Protocole in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel y colaboradores, Eds . , Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995); Altschul y colaboradores, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); y Altschul y colaboradores, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997). El software para realizar los análisis BLAST está públicamente disponible, por ejemplo, a través del National Center for Biotechnology Information. Este programa involucra primero identificar pares de secuencias de altos registros (HSPs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia interrogante, que ya sea igual o satisface algún registro de umbral de valor positivo T cuando es alineado con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. Que es referida como el umbral de registro de palabra cercano. Estos aciertos de palabras cercanos iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSPs más largos que los contienen. Los aciertos de palabra luego son extendidos en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en cuanto a que el registro de alineación acumulativo puede ser incrementado. Los registros acumulativos son calculados usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (registro de remuneración para un par de residuos de igualación: > 0) y N (registro de sanción para residuos de desigualación; siempre < 0). Para secuencias de aminoácidos, una matriz de registro se utiliza para calcular el registro acumulativo. La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección son detenidos cuando: el registro de alineación acumulativo desciende por la cantidad de X de su valor alcanzado máximo; el registro acumulativo va de cero o por debajo debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de registro negativo; o el final de cualquier secuencia es alcanzado. Los parámetros del programa BLAST W, T y X determina la sensibilidad y la velocidad de la' alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como errores una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un corte de 100, M=5, N=4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como errores una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de registro BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). Además de calcular el por ciento de identidad de secuencia, el programa BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993)). Una medición de la similitud proporcionada por el programa BLAST es la probabilidad de sumas más pequeñas (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad mediante la cual una igualación entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos ocurriría por posibilidad. Las búsquedas BLAST asumen que las proteínas pueden ser modeladas como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias que pueden ser tractos homopoliméricos , repeticiones de período corto o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad pueden ser alineadas entre proteínas no relacionadas aunque otras regiones de la proteína son completamente distintas. Un buen número de programas de filtro de baja complejidad pueden ser empleados para reducir tales alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros de baja complejidad SEG (Wooten and Federthen, Comput. Chem. , 17:149-163 (1993)) y XNU (Claverie and States, Comput. Chem., 17:191-201 (1993)) pueden ser empleados solos o en combinación. A menos que se mencione de otra manera, los valores de identidad/similitud de nucleótido y de proteina proporcionados en la presente se calculan usando GAP (GCG Versión 10) bajo valores de error. GAP (Programa de Alineación Global) también puede ser usado para comparar un polinucleótido o polipéptido de la presente invención con una secuencia de referencia. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970) para encontrar la alineación de ' dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y las posiciones de espacio y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menores espacios. Esto permite la previsión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe ser un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de las igualaciones para cada espacio que éste inserta. Si una sanción de extensión de espacio mayor que cero es elegida, GAP debe hacer, además como un aprovechamiento para cada espacio insertado de la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de espacio en la versión 10 del Wisconsin Genetics Software Package para secuencias de proteina son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos la sanción de creación de espacio de error es de 50 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es de 3. Para secuencias de polipéptidos , la sanción de creación de espacio de error es 8 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es 2. Las sanciones de creación de espacio y extensión de espacio pueden ser expresados como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consisten de 0 a 100. Asi, por ejemplo, las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio cada una independientemente pueden ser: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 o más grande. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Pueden existir muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. Por ciento de identidad es el por ciento de los símbolos que realmente se igualan. El Por Ciento de Similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud se registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50 en el umbral de similitud. La matriz de registro usada en la Versión 10 del isconsin Genetics Software Package es BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915). La alineación múltiple de las secuencias se puede realizar usando el método de alineación CLUSTAL (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros de error (SANCION DE ESPACIO=10, SANCION DE LONGITUD DE ESPACIO=10) . Los parámetros de error para las alineaciones por pares usando el método CLUSTAL son KTUPLE 1, SANCION DE ESPACI0=3, VENTANA=5 y DIAGONALES SALVADAS=5. (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido incluye la referencia a los residuos en las dos secuencias que son los mismos cuando se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a proteínas, se reconoce que las posiciones de residuos que no son idénticas frecuentemente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los residuos de aminoácido son sustituidos por otros residuos de aminoácido con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Donde las secuencias difieren de las sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba para corregir para la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren por tales sustituciones conservativas se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Típicamente esto involucra registrar una sustitución conservativa como una igualación parcial antes que una igualación completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, donde un aminoácido idéntico se le da un registro de 1 y a una sustitución no conservativa se le da un registro de 0, una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de sustituciones conservativas se calcula por ejemplo, de acuerdo con el algoritmo de Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:11-17 (1988) por ejemplo, es implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA) . (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en' la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en la cual la base de ácido nucleico idéntica o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Utilidades La presente invención proporciona, entre otras cosas, composiciones y métodos para modular (es decir, incrementar o disminuir) el nivel . de polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención en plantas. En particular, los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención pueden ser expresados temporalmente o espacialmente, por ejemplo, en etapas de desarrollo, en tejidos y/o en cantidades, que no son característicos de las plantas no recombinantemente diseñadas. La presente invención también proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleótidos de longitud suficiente y complementariedad a un polinucleótido de la presente invención para el uso como sondas o cebadores de amplificación en la detección, cuantificación o aislamiento de transcripciones de gen. Por ejemplo, los ácidos nucleicos aislados de la presente invención se pueden usar como sondas en la detección de deficiencias en el nivel de mRNA en clasificaciones para plantas transgénicas deseadas, para detectar mutaciones en el gen (por ejemplo, sustituciones, supresiones o adiciones) , para inspeccionar la regulación hacia arriba de la expresión o cambios en la actividad enzimática . en ensayos de clasificación de compuestos, para detección de cualquier número de variantes alélicas (polimorfismos), ortólogos o parálogos del gen, o para la mutagénesis dirigida al sitio en células eucarióticas (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,565,350). Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden usar para la expresión recombinante de sus polipéptidos codificados, o para el uso como inmunógenos en la preparación y/o clasificación de anticuerpos. Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden usar para el uso en la supresión de sentido o antisentido de uno o más genes de la presente invención en una célula hospedera, tejido o planta. La unión de agentes químicos que enlazan, intercalan, segmentan y/o reticulan a los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también -se puede utilizar para modular la transcripción o traducción.

La presente invención también proporciona proteínas aisladas que comprenden un polipéptido de la presente invención (por ejemplo, preproenzima, proenzima o enzimas) . La presente invención también proporciona proteínas que comprenden por lo menos un epítope a partir de un polipéptido de la presente invención. Las proteínas de la presente invención se pueden emplear en ensayos para agonistas o antagonistas de enzima de la función de enzimática, o para el uso como inmunógenos o antígenos para obtener anticuerpos específicamente inmunorreactivos con una proteína de la presente invención. Tales anticuerpos se pueden usar en ensayos para niveles de expresión, para identificar y/o aislar ácidos nucleicos de la presente invención a partir de bibliotecas de expresión, para la identificación de polipéptidos homólogos de otras especies, o para purificación de polipéptidos de la presente invención. Los ácidos nucleicos aislados y polipéptidos de la presente invención se pueden usar sobre una amplia gama de tipos de plantas, particularmente monocotiledóneas tales como las especies de la familia Gramineae incluyendo Hordeum, Sécale, Oryza, Triticum, Sorghum (por ejemplo, S. bicolor) y Zea (por ejemplo Z. Mays) , y dicotiledóneas tal como Glycine. Los ácidos nucleicos aislados y proteínas de la presente invención se pueden usar en especies de los géneros: Cucúrbita , Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria , Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna,. Citrus , Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis , Brassica , Rapanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscya us, Lycopersicon , Nicotiana , Solanum, Petunia, Digitalis , Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelangonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Curumis, Browallia, Pisum, Phaseolus, Lolium y Avena. Acidos Nucleicos La presente invención proporciona, entre otras cosas, ácidos nucleicos aislados de RNA, DNA y análogos y/o quimeras de los mismos, que comprenden un polinucleótido de la presente invención. Un polinucleótido de la presente invención es inclusivo de aquellos en la Tabla 1 y: (a) un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la presente invención tal como aquellos mencionados en la Tabla 1, incluyendo polinucleótidos ejemplares de la presente invención; (b) un polinucleótido aislado que es el producto de amplificación de una biblioteca de ácido nucleico de planta usando pares cebadores que selectivamente hibridan bajo condiciones severas a los sitios dentro de un polinucleótido de la presente invención; (c) un polinucleótido aislado que selectivamente híbrida un polinucleótido de (a) o (b) ; (d) un polinucleótido aislado que tiene una identidad de secuencia especificada con los polinucleótidos de (a) , (b) o (c) ; (e) un polinucleótido aislado que codifica una proteina que tiene un número especificado de aminoácidos contiguos a partir de un polipéptido prototipo, en donde la proteína es específicamente reconocida por los antisueros inducidos por la presentación de la proteína en donde la proteína no inmunorreacciona detectablemente con los antisueros que se han completamente inmunosorbidos con la proteína; (f) secuencias complementarias de los polinucleótidos de (a) , (b) , (c) , (d) o (e) ; (g) un polinucleótido aislado que comprende por lo menos un número específico de nucleótidos contiguos de un polinucleótido de (a), (b) , (c) (d) , (e) o (f ) ; (h) un polinucleótido aislado de una biblioteca de cDNA enriquecida de longitud completa que tiene la propiedad fisicoquímica de hibridar selectivamente a un polinucleótido de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) o (g) ; y (i) un polinucleótido aislado hecho mediante el proceso de: 1) proporcionar una biblioteca de ácido nucleico enriquecida de longitud completa, 2) hibridar selectivamente el polinucleótido a un polinucleótido de (a) , (b) , (c) , (d) , (e) ; (f)f (g) o (h), para de esta manera aislar el polinucleótido de la biblioteca de ácido nucleico. A. Polinucleótidos que Codifican un Polipéptido de la Presente Invención Como es indicado en (a) , anterior, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden un polinucleótido de la presente invención, en donde el polinucleótido codifica un polipéptido de la presente invención. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también, mediante referencia al código genético, describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto ordinario reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina; y UGG, que es ordinariamente el único codón para triptofano) se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica. Así, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención está implícita en cada secuencia de polipéptido descrita y está dentro del alcance de la presente invención. Por consiguiente, la presente invención incluye polinucleótidos de la presente invención y polinucleótidos que codifican un polipéptido de la presente invención. B. Polinucleótidos Amplificados a Partir de una Biblioteca de Acido Nucleico de Planta.

Como es indicado en (b) , anterior, la presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido de la presente invención, en donde los polinucleótidos son amplificados, bajo condiciones de amplificación de ácido nucleico, a partir de una biblioteca de ácido ¦ nucleico de planta. Las condiciones de amplificación de ácido nucleico para cada una de la variedad de métodos de amplificación sen bien conocidas para aquellos expertos ordinarios en la técnica. La biblioteca de ácido nucleico de planta puede ser construida a partir de .una monocotiledónea, tal como un cultivo de cereal. Ejemplos de cereales incluyen maíz, sorgo, trigo o arroz. La biblioteca de ácido nucleico de planta también puede ser construida de una dicotiledónea tal como soya, alfalfa o cánola. Las lineas de Zea mays B73, PHRE1, A632, BMS-P2#10, W23 y Mol7 son conocidas y públicamente disponibles. Otras lineas de maíz públicamente conocidas y disponibles se pueden obtener de la Maize Genetics Cooperation (Urbana, IL) . Las lineas de trigo son obtenibles de la Wheat Genetics Resource Center (Manhattan, KS) . La biblioteca de ácido nucleico puede ser una biblioteca de cDNA, una biblioteca genórnica, o una biblioteca generalmente construida a partir de transcripciones nucleares en cualquier etapa del procesamiento de intrón. En modalidades opcionales, la biblioteca de cDNA es construida usando un método de síntesis de cDNA de longitud completa enriquecido. Ejemplos de tales métodos incluyen Oligo-Capping (Maruyama, K. y Sugano, KS. GeneK 138:171-174, 1994), Biotinylated CAP Trapper (Caminci y colaboradores, Genomics 37:327-336, 1996) y CAP Retention Procedure (Edery, E . , Chu, L.L. y colaboradores, Molecular and Cellular Biology 15:3363-3371, 1995). Los tejidos que crecen rápidamente o las células que se dividen rápidamente son preferidos para el uso como una fuente de mRNA para la construcción de una biblioteca de cDNA. Las etapas de crecimiento del maíz son descritas en "How a Corn Plant Develops", Reporte Especial No. 48, Iowa State University of Science and Technology Cooperative Extensión Service, Ames, Iowa, Reimpreso en Febrero de 1993. Un polinucleótido de esta modalidad (o subsecuencias del mismo) se puede obtener, por ejemplo, al usar cebadores de amplificación que son selectivamente hibridados y el cebador extendido bajo condiciones de amplificación de ácido nucleico, a por lo menos dos sitios dentro de un polinucleótido de la presente invención, o a dos sitios dentro del ácido nucleico que flanquean y comprenden un polinucleótido de la presente invención, o a un sitio dentro de. un polinucleótido de la presente invención y un sitio dentro del ácido nucleico que lo comprende. Los métodos para obtener los extremos 5' y/o 3' de un inserto de vector son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo RACE (Rapid Amplifi catión of Complementary Ends). como es descrito en Frohman, M.A., en PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, T.J. White, Eds. (Academic Press, Inc., San Diego), pp. 28-38 (1990); ver también la patente norteamericana No. 5,470,722 y Current Protocols in Molecular Biology, Unit 15.6, Ausubel y colaboradores, Eds., Greene Publising and Wiley-Interscience, New York (1995); Frohman and Martin, Techniques 1:165 (1989) . Opcionalmente, los cebadores son complementarios a una subsecuencia del ácido nucleico objetivo que ellos amplifican, pero pueden tener una identidad de secuencia que varia de aproximadamente 85% a 99% con relación a la secuencia de polinucleótido a la cual ellos son diseñados para el templado. Como aquellos expertos en la técnica apreciarán, los sitios a los cuales los pares de cebadores selectivamente hibridarán son elegidos de tal manera que un ácido nucleico contiguo puede ser formado bajo las condiciones de amplificación de ácido nucleico deseadas. La longitud del cebador como es medida en nucleótidos contiguos es seleccionado del grupo de números enteros que consiste de por lo menos 15 a 50. Asi, los cebadores pueden ser de por lo menos 15, 18, 20, 25, 30, 40 o 50 nucleótidos contiguos en longitud. Aquellos expertos reconocerán que una secuencia de cebador alargada puede ser empleada para incrementar la especificidad de enlace (es decir templado) a una secuencia objetivo. Una secuencia de no templado en el extremo 5' de un cebador (un "extremo") puede ser adicionada, por ejemplo, para introducir un sitio de clonación en los extremos terminales del amplicón. Los productos de amplificación pueden ser introducidos usando sistemas de expresión bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Los productos de traducción resultantes pueden ser confirmados como polipéptidos de la presente invención, por ejemplo, al analizar la actividad catalítica apropiada (por ejemplo, actividad específica y/o especificidad del sustrato) o al verificar la presencia de uno o más epítopes que son específicos a un polipéptido de la presente invención. Los métodos para la síntesis de proteína a partir de patrones derivados de PCR son conocidos en la técnica y comercialmente disponibles. Ver, por ejemplo, Armersham Life Sciences, Inc, Catalog '97, p. 354. C. Polínucleótidos que Hibridan Selectivamente a un Polinucleótido de (A) o (B) . Como es indicado en (c) , anteriormente, la presente invención proporciona ácido nucleicos aislados que comprenden polínucleótidos de la presente invención, en donde los polínucleótidos selectivamente hibridan, bajo condiciones de hibridación selectivas, a un polinucleótido de las secciones (A) o (B) como es discutido en lo anterior. Así, los polinucleótidos de esta modalidad se pueden utilizar para aislar, detectar, y/o cuantificar ácidos nucleicos que comprenden las polinucleótidos de (A) o (B) . Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar para identificar, aislar, o amplificar clones de longitud completa o parcial en una biblioteca depositada. En algunas modalidades, los polinucleótidos son secuencias genómicas o de cDNA aisladas o de otra manera complementarias a un cDNA a partir de una biblioteca de ácido nucleico de dicotiledónea o monocotiledónea . Especies ejemplares de monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyen, pero no están limitadas a: maíz, cánola, soya, algodón, trigo, sorgo, girasol, alfalfa, avenas, caña de azúcar, mijo, cebada y arroz. La biblioteca de cDNA comprende por lo menos 50% a 95% de secuencias de longitud completa (por ejemplo, por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de secuencias de longitud completa). Las bibliotecas de cDNA pueden ser normalizadas para incrementar la representación de secuencias raras. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,482,845. Las condiciones de hibridación de baja severidad son típicamente, pero no exclusivamente, empleadas con secuencias que tienen una identidad de secuencia reducida con relación a las secuencias complementarias. Las condiciones de moderada y alta severidad opcionalmente pueden ser empleadas para secuencias de identidad más grande. Las condiciones de baja severidad permiten la hibridación selectiva de secuencias que tienen aproximadamente 70% a 80% de identidad de secuencia y pueden ser empleadas para identificar secuencias ortólogas o parálogas. D. Polinucleótidos que Tienen una Identidad de Secuencia Específica con los Polinucleótidos de (A) , (B) o (C) . Como se indica en (d) , anteriormente, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleótidos de la presente invención, en donde los polinucleótidos tienen una identidad especificada en el nivel de nucleótido a un polinucleótido como es descrito en lo anterior en las secciones (A), (B) o (C) , anteriores. La identidad puede ser calculada usando, por ejemplo, los programas BLAST, CLUSTAL o GAP bajo condiciones de error. El porcentaje de identidad a una secuencia de referencia es de por lo menos 60% y, redondeada hacia arriba al número entero más cercano, puede ser expresada como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consisten de 60 a 99. Asi, por ejemplo, el porcentaje de identidad a una secuencia de referencia puede ser por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. Los polinucleótidos/polipéptidos de la presente invención que tiene una identidad de secuencia especificada con un polinucleótido/polipéptido de la sección (A) , (B) o (C) pueden ser de una longitud (medida en nucleótidos o aminoácidos contiguos) seleccionada del grupo que consiste de 15 a la longitud del polinucleótido/polipéptido de (A) , (B) o (C) o cualquier valor entero entre éstos. Por ejemplo, la longitud de los polinucleótidos o polipéptidos puede ser 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 350, 400, 500, 750, 1000, 1250, 1500 o más grande. Opcionalmente, los polinucleótidos de esta modalidad codificarán un polipéptido que compartirá un epitope con un polipéptido codificado por los polinucleótidos de las secciones (A) , (B) o (C) . Asi, estos polinucleótidos codifican un primer polipéptido que induce la producción de antisuero que comprende anticuerpos que son específicamente reactivos a un segundo polipéptido codificado por un polinucleótido de (A) , (B) o (C) . Sin embargo, el primer polipéptido no enlaza al antisuero resaltado contra él mismo cuando el antisuero se ha completamente inmunosorbido con el primer polipéptido. Por consiguiente, los polinucleótidos de esta modalidad se pueden utilizar para generar anticuerpos para el uso en, por ejemplo, la clasificación de bibliotecas de expresión para ácidos nucleicos que comprenden polinucleótidos de (A) , (B) o (C) o para la purificación de, o en inmunoensayos para, polipéptidos codificados por los polinucleótidos de (A) , (B) o (C) . Los polinucleótidos de esta modalidad comprenden secuencias de ácido nucleico que pueden ser empleadas para la hibridación selectiva a un polinucleótido que codifica un polipéptido de la presente invención . La clasificación de polipéptidos para el enlace especifico al antisuero puede ser convenientemente obtenida usando bibliotecas de exhibición de péptido. Este método involucra la clasificación de colecciones grandes de péptidos para miembros individuales que tienen la función o estructura deseada. La clasificación de anticuerpo de las bibliotecas de exhibición de péptido es bien conocida en la técnica. Las secuencias de péptido exhibidas pueden ser de 3 a 5000 o más aminoácidos en longitud, frecuentemente de 5-100 aminoácidos de largo y frecuentemente de aproximadamente 8 a 15 aminoácidos de largo. Además de los métodos sintéticos químicos directos para generar bibliotecas de péptido, se han descrito varios métodos de DNA recombinantes . Un tipo involucra la exhibición de una secuencia de péptidos sobre la superficie de un bacteriófago o célula. Cada bacteriófago o célula contiene la secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de péptido exhibida particular. Tales métodos se describen en las publicaciones de patentes de PCT Nos. 91/17271, 91/18980, 91/19818 y 93/08278. Otros sistemas para generar bibliotecas de péptidos tienen aspectos de tanto la síntesis química in vitro y métodos recombinantes. Ver, las publicaciones de patentes de PCT Nos. 92/05258, 92/14843 y 97/20078. Ver también, las patentes norteamericanas Nos. 5,658,754, y 5,643,768. Las bibliotecas de exhibición de péptido, vectores y kits de clasificación son comercialmente disponibles de tales proveedores como Invitrogen (Carlsbad, CA) . E. Polinucleótidos que Codifican una Proteína que Tiene una Subsecuencia de un Polipéptido Prototipo y Reactividad Cruzada al Polipéptido Prototipo . Como es indicado en (e) , anteriormente, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleótidos de la presente invención, en donde los polinucleótidos codifican una proteína que tiene una subsecuencia de aminoácidos contiguos de un polipéptido prototipo de la presente invención tal como se proporcionan en (a), anteriormente. La longitud de los aminoácidos contiguos del polipéptido prototipo es seleccionada del grupo de números enteros que consisten de por lo menos 10 al número de aminoácidos dentro de la secuencia prototipo. Así, por ejemplo, el polinucleótido puede codificar un polipéptido que tiene una subsecuencia que tiene por lo menos 10, 15, 20, 15, 30, 35, 40, 45 o 50, aminoácidos contiguos del polipéptido prototipo. Además, el número de tales subsecuencias codificadas por un polinucleótido de la presente modalidad puede ser cualquier número entero seleccionado del grupo que consiste de 0 a 20, tal como 2, 3, 4, o 5. Las subsecuencias pueden ser separadas mediante cualquier número entero de nucleótidos del 0 al número de nucleótidos en la secuencia tal como por lo menos 5, 10, 15, 25, 50, 100 o 200 nucleótidos. Las proteínas codificadas por los polinucleótidos de esta modalidad, cuando se presentan como un inmunógeno, inducen la producción de anticuerpos policlonales que específicamente enlazan a un polipéptido prototipo tal como, pero no limitado a, un polipéptido codificado por el polinucleótido de (a) o (b) , anterior. Generalmente, sin embargo, una proteína codificada por un polinucleótido de esta modalidad no enlaza al antisuero resaltado contra el polipéptido prototipo cuando el antisuero se ha completamente inmunosorbido con el polipéptido prototipo. Los métodos para hacer y analizar la especificidad/afinidad de enlace del anticuerpo son bien conocidos en la técnica. Los formatos de inmunoensayo ejemplares incluyen ELISA, inmunoensayos competitivos, radioinmunoensayos , manchados de Western, ensayos inmunofluorescentes indirectos y similares. En un método de ensayo preferido, el antisuero completamente inmunosorbido y acumulado que es inducido al polipéptido prototipo puede ser usado en un ensayo de enlace competitivo para probar la proteína. La concentración del polipéptido prototipo requerida para inhibir 50% del enlace del antisuero al polipéptido prototipo es determinada. Si la cantidad de la proteína es requerida para inhibir el enlace el menor que dos veces la cantidad de la proteina prototipo, entonces la proteina se dice que enlaza específicamente al antisuero inducido al inmunógeno. Por consiguiente, las proteínas de la presente invención comprenden variantes alélicas, variantes conservativamente modificadas y modificaciones recombinantes menores a un polipéptido prototipo . Un polinucleótido de la presente invención opcionalmente codifica una proteína que tiene un peso molecular como la proteína no glicosilada dentro de 20% del peso molecular de los polipéptidos no glicosilados de longitud completa de la présente invención. El peso molecular se puede determinar fácilmente mediante SDS-PAGE bajo condiciones de reducción. Opcionalmente, el peso molecular está dentro de 15% de un polipéptido de longitud completa de la presente invención, más de preferencia dentro de 10% o 5%, y ' mucho más de preferencia dentro de 3%, 2% o 1% de un polipéptido de longitud completa de la presente invención. Opcionalmente, los polinucleótidos de esta modalidad codificarán una proteína que tiene una actividad enzimática específica de por lo menos 50%, 60%, 80% o 90% de un extracto celular . que comprende el polipéptido de longitud completa endógeno, nativo de la presente invención. Además, las proteínas codificadas por polinucleótidos de esta modalidad opcionalmente tendrán una constante de afinidad (km) sustancialmente similar y/o actividad catalítica (es decir, la constante de proporción microscópica, kcat) como en la proteína de longitud completa, endógena, nativa. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que el valor de kcat/km determina la especificidad para la competición de los sustratos y frecuentemente es referida como la constante de especificidad. Las proteínas de esta modalidad pueden tener un valor de kcat/km de por lo menos 10% de un polipéptido de longitud completa de la presente invención como es determinado usando el sustrato endógeno de ese polipéptido. Opcionalmente, el valor de kcat/km será de por lo menos 20%, 30%, 40%, 50% y mucho más de preferencia por lo menos 60%, 70%, 80%, 90% o 95% del valor de kcat/km del polipéptido de longitud completa de la presente invención. La determinación de kCat/ k-m y kcat km puede ser determinada mediante cualquier número de medios bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las proporciones iniciales (es decir, el primer 5% o menos de la reacción) se puede determinar usando técnicas de mezclado y muestreo rápido (por ejemplo, técnicas de flujo continuo, flujo detenido o enfriamiento rápido) fotolisis -instantánea o métodos de relajación (por ejemplo, saltos de temperatura) en conjunción con tales métodos ejemplares de medición como espectrofotometría, espectrofluorimetría, resonancia magnética nuclear, o procedimientos radioactivos. Los valores cinéticos son convenientemente obtenidos usando una gráfica de Linewaver-Burk o Eadie-Hofstee . F. Polinucleotidos Complementarios a los Polinucleotidos de (A) - (E) Como es indicado en (f), anteriormente, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleotidos complementarios a los polinucleotidos de los párrafos A-E, anteriormente.. Aquellos expertos en la técnica reconocerán, el par base de secuencias complementarias por toda la totalidad en su longitud con los polinucleotidos de las secciones (A) -(E)' (es decir, tienen 100% de identidad de secuencia sobre su longitud completa) . Las bases complementarias se asocian a través del enlace de hidrógeno en ácidos nucleicos de doble hebra. Por ejemplo, los siguientes pares bases son complementarios: guanina y citosina; adenina y timina; y adenina y uracilo. G. Polinucleotidos que son Subsecuencias de los Polinucleotidos de (A) -(F) Como es indicado en (g) , anteriormente, la presente invención proporciona ácidos nucleicos aislados que comprenden polinucleotidos que comprenden por lo menos 15 bases contiguas de los polinucleotidos de las secciones (A) hasta (F) como es descrito en lo anterior. La longitud del polinucleótido se da , como un número entero seleccionado del grupo que consiste de por lo menos 15 a la longitud de la secuencia de ácido nucleico de la cual el polinucleótido es una subsecuencia . Asi, por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención son inclusivos de polinucleótidos que comprenden por lo menos 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o 1000 nucleótidos contiguos en longitud desde los polinucleótidos de (A) -(F). Opcionalmente, el número de tales subsecuencias codificadas por un polinucleótido de la presente modalidad puede ser cualquier número entero seleccionado del grupo que consiste de 1 a 20, tal como 2, 3, 4 o 5. Las subsecuencias pueden ser separadas mediante cualquier número entero de nucleótidos de 1 al número de nucleótidos en la secuencia tal como por lo menos 5, 10, 15, 25, 50, 100 o 200 nucleótidos. Se pueden hacer subsecuencias mediante métodos sintéticos in vitro, biosintéticos in vitro, o recombinantes in vivo. En modalidades opcionales, las subsecuencias se pueden hacer mediante la amplificación de ácido nucleico. Por ejemplo, los cebadores de ácido nucleico serán construidos para hibridar selectivamente a una secuencia (o su complemento) dentro de, o coextensiva con, la región ' de codificación . Una subsecuencia de la presente invención puede comprender características estructurales de la secuencia de la cual se deriva. Alternativamente, una subsecuencia puede carecer de ciertas características estructurales de la secuencia más grande de la cual se deriva tal como un extremo poli (A) . Opcionalmente, una subsecuencia de un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un epitope en común con una secuencia de polipéptido prototipo como se proporciona en (a) , anteriormente, debe codificar un epitope en común con la secuencia de prototipo. Alternativamente, la subsecuencia no puede codificar un epitope en común con una secuencia prototipo pero puede ser usada para aislar la secuencia más grande, por ejemplo, mediante la hibridación de ácido nucleico con la secuencia de la cual se deriva. Las subsecuencias pueden ser usadas para modular o detectar la expresión del gen al introducir en las subsecuencias compuestos que enlazan, intercalan, segmentan y/o reticulan a los ácidos nucleicos. Compuestos ejemplares incluyen acridina, psolaren, fenant olina, naftoquinona, daunomicina o conjugados de cloroetilaminoarilo . H. Polinucleótidos de una Biblioteca de cDNA Enriquecida de Longitud Completa que Tiene la Propiedad Fisicoquímica de Hibridar Selectivamente a un Polinucleótido de (A) - (G) Como es indicado en (h) , anteriormente, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado de una biblioteca de cDNA enriquecida de longitud completa que tiene la propiedad fisicoquímica de hibridar selectivamente un polinucleótido de los. párrafos (A), (B) , (C) , (D) , (E) , (F) o (G) como es discutido en lo anterior. Los métodos de construcción de bibliotecas de cDNA enriquecidas de longitud completa son conocidos en la técnica y discutidos brevemente enseguida. La biblioteca de cDNA comprende por lo menos 50% a 95% de secuencias de longitud completa (por ejemplo, por lo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de secuencias de longitud completa) . La biblioteca de cDNA puede ser construida a partir de una variedad de tejidos de una monocotiledónea o dicotiledónea en una variedad de etapas de desarrollo. Especies ejemplares incluyen maíz, trigo, arroz, cánola, soya, algodón, sorgo, girasol, alfalfa, avena, caña de azúcar, mijo, cebada y arroz. Los métodos para hibridar. selectivamente un polinucleótido a partir de una biblioteca enriquecida de longitud completa a un polinucleótido de la presente invención con conocidos para aquellos expertos ordinarios en la técnica. Cualquier número de condiciones de severidad pueden ser empleadas para permitir la hibridación selectiva. En modalidades opcionales, la severidad permite la hibridación selectiva de secuencias que tienen por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencias sobre la longitud de la región hibridada. J. Productos de Polinucleótido Hechos Mediante un Proceso de Aislamiento de cDNA Como es indicado en (I) , anteriormente, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado hecho mediante el proceso de: 1) proporcionar una biblioteca de ácido nucleico enriquecida de longitud completa, 2) hibridar selectivamente el polinucleótido a un polinucleótido de los párrafos (A), (B) , (C) , (D), (E) , (F) , (G) o (H) como es discutido en lo anterior, y de esta manera aislar el polinucleótido de la biblioteca de ácido nucleico. Las bibliotecas de ácido nucleico enriquecidas de longitud completa se construyen como es discutido en el párrafo (G) y enseguida. Las condiciones de hibridación selectivas son como se discuten en el párrafo (G) . Los procedimientos de purificación de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. La purificación se puede- llevar a cabo convenientemente usando métodos en fase sólida; tales métodos son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica y están disponibles kits a partir de proveedores comerciales tales como Advanced Biotechnologies (Surrey, UK) . Por ejemplo, un polinucleótido de los párrafos (A) -(H) puede sr inmovilizado a un soporte sólido tal como una membrana/' cuenta o partícula. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,667,976. El producto de polinucleótido del presente proceso selectivamente es hibridado a un polinucleótido movilizado y el soporte sólido es subsecuentemente aislado de los polinucleótidos no hibridados mediante métodos que incluyen, pero no limitados a, centrifugación, separación magnética, filtración, electroforesis y similares. « 5 64 ] Construcción de Acidos Nucleicos. I Los ácidos nucleicos aislados de la presente ? invención se pueden hacer usando (a) métodos recombinantes 1 estándares, (b) técnicas sintéticas o combinaciones de los 5 mismos. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención serán clonados, amplificados o de otra manera construidos a partir de una monocotiledónea tal como maíz, arroz, o trigo, o una dicotiledónea tal como soya. Los ácidos nucleicos convenientemente pueden 10. comprender secuencias además de un polinucleótido de ' la s presente invención. Por ejemplo, un sitio de multiclonación que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasa puede ser insertado en el ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. También, secuencias 15 traducibles pueden ser insertadas para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-N histidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. Un polinucleótido de la . 20 presente invención puede ser unido a un vector, adaptador, o enlazador para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención. Se pueden adicionar secuencias adicionales a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o la ¦ 25 expresión, para ayudar en el aislamiento del polinucleótido, i -o para mejorar la introducción del polinucleótido dentro de una célula. Típicamente, la longitud de un ácido nucleico de la presente invención menos la longitud de su polinucleótido de la presente invención es menor que 20 kilopares bases, frecuentemente menor que 15 kb y frecuentemente menor que 10 kb. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y enlazadores es bien conocido y extensivamente descrito en la técnica. Para una descripción de varios ácidos nucleicos ver, por ejemplo,- Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1999 (La Jolla, CA) ; y Amersham Life Sciences, Inc. Catalog ' 99 (Arlington Heights, IL) . A. Métodos Recombinantes para la Construcción de Acidos Nucleicos Las composiciones de ácido nucleico aisladas de esta invención, tal como RNA, cDNA, DNA genómico o un híbrido de los mismos, . se puede obtener a partir de fuentes biológicas de plantas usando cualquier número de metodologías de clonación conocidas para aquellos expertos en la técnica. El algunas modalidades, las sondas de oligonucleótido qué selectivamente hibridan, bajo condiciones severas, a los polinucleótidos de la presente invención son utilizadas para identificar la secuencia deseada en una biblioteca de cDNA o DNA genómico. El aislamiento de RNA y la construcción de cDNA y las bibliotecas genómicas son bien conocidas ¦ para aquellos expertos ordinarios en la técnica. Ver, por ejemplo, Plant Molecular Biolcgy:_A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlín (1997); y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y colaboradores, Eds . , Greene Publising and Wiley-Interscience, New York (1995). Al. Bibliotecas de cDNA Enriquecidas de Longitud Completa Se han descrito un número de protocolos de síntesis de cDNA que proporcionan bibliotecas de cDNA de longitud completa, enriquecidas. Las bibliotecas de cDNA de longitud completa, enriquecidas son construidas para comprender por lo menos 60%, y más de preferencia por lo menos 70%, 80%, 90% o 95% de insertos de longitud completa . entre los clones que contienen insertos. La longitud del inserto de tales bibliotecas puede ser de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más kilopares bases. Los vectores para acomodar el inserto de estos tamaños son conocidos en la -técnica y comercialmente disponibles. Ver, por ejemplo, Stratagene's lambda ZAP Express (vector de clonación de cDNA con 0 a 12 kbs de capacidad de clonación). . Un método ejemplar de construcción mayor que 95% de biblioteca de cDNA de longitud completa pura es descrito por Carninci ¦ -y colaboradores, Genomics, 37:327-336 (1996).· Otros métodos para producir bibliotecas de longitud completa con conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Edery y colaboradores, Mol. Cell Biol, 15 (6) :3363-3371 (1995); y la solicitud de PCT O 96/34981. A2. Bibliotecas de cDNA Normalizadas o Sustraídas ; Una biblioteca de cDNA no normalizada representa la , población de- mRNA del tejido de la cual se elaboró. Puesto que los clones únicos son excedidos en número por los clones derivados de genes altamente expresados, su aislamiento puede 5 ser laborioso. La normalización de una biblioteca de cDNA es el proceso de crear una biblioteca en la cual cada clon es más igualmente representado. La construcción de bibliotecas normalizadas se describe en Ko, Nucí. Acids. Res., 18 (9) : 5705-5711 (1990); Patanjali y colaboradores, Proc. 10 Nati. Acad. U.S. A., 88:1943-1947 (1991); patentes norteamericanas Nos. 5,482,685, 5,482,845 y 5,637,685. En un método ejemplar descrito por Soares y colaboradores, la normalización dio por resultado la reducción de la abundancia de clones desde una gama de cuatro ordenes de magnitud a una 15 gama reducida de solamente 1 orden de magnitud. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91:9228-9232 (1994). v Las bibliotecas de cDNA sustraídas son otro medió' 1 para incrementar la proporción de especies de cDNA menos abundantes. En este procedimiento, el cDNA preparado de una 20 acumulación de mRNA es suprimido de las secuencias presentes en una segunda acumulación de mRNA mediante hibridación. Los híbridos de cDNA:mRNA son removidos y la acumulación de cDNA no hibridada restante es enriquecida para secuencias únicas a - esa acumulación. Ver, Foote y " colaboradores en, Plant I 25 Molecular Billogy A Laboratory Manual, Clark, Ed., Springer- « Verlag, Berlín (1997); Kho and Zarbl, Technique, 3(2):58-63 (1991); Sive and St. John, Nucí. Acids Res. 16(22): 10937 (1988); Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y colaboradores, Eds . , Greene Publishing and Wiley-Interscience , New York (1995) ; y S aroop y colaboradores, Nucí. Acids Res., 19(8): 1954 (1991). Los kits de sustracción de cDNA son comercialmente disponibles. Ver, por ejemplo, PCR-Select (Clontech, Palo Alto, CA) . Para construir bibliotecas genómicas, segmentos grandes de DNA genómico son generados mediante fragmentación, por ejemplo, usando endonucleasas de restricción, y son ligados con el vector de DNA para formar concatémeros que pueden ser empacados en el vector apropiado. Las metodologías para realizar estos fines, y los métodos de secuenciación para verificar la secuencia de ácidos nucleicos, son bien conocidas en ¦ la técnica. Ejemplos de técnicas biológicas moleculares apropiadas e instrucciones suficientes para dirigir a las personas expertas a través de muchas metodologías de construcción, clonación y clasificación se encuentran en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Vols, 1-3 (1989), Methods in Enzimology, Vol. 152: Guide to Molecular Cloning Techniques, Berger and Kimmel, Eds., San Diego: Academic Press, Inc. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y colaboradores, Eds., Greene Publishing and iley-Interscience, New York (1995) ; Plant Molecular Biology; A Laboratory Manual, Clark, Ed. , Springer-Verlag, Berlín (1997) . Los kits para la construcción de bibliotecas genómicas también están comercialmente disponibles. La biblioteca de cDNA o genómica puede ser clasificada utilizando una sonda basada en la secuencia de un polinucleótido de la presente invención, tales como aquellos descritos en la presente. Las sondas pueden ser utilizadas para hibridar con las secuencias de DNA genómico o de cDNA para aislar genes homólogos en la misma o diferente especies de plantas. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que varios grados de severidad de hibridación pueden ser empleados en el ensayo, y ya sea que la hibridación o el medio de lavado puede ser severo. Los ácidos nucleicos de interés también pueden ser amplificados a partir de muestras de ácido nucleico""" utilizando técnicas de amplificación. Por ejemplo, la tecnología de reacción en cadena de polimerasa (PCR) se puede utilizar para amplificar las secuencias de polinucleótidos de la presente invención y genes relacionados directamente de las bibliotecas de DNA genómico o de cDNA. La PCR y otros métodos de amplificación in vitro también pueden ser útiles, por ejemplo, para clonar secuencias de ácido nucleico que codifican para proteínas que son expresadas, para hacer ácidos nucleicos para el uso como sondas para la detección de la presencia del mRNA deseado en las muestras, para la secuenciación de ácido nucleico, o para otros propósitos. La proteina 32 del gen T4 (Boehringer Mannheim) se puede utilizar para mejorar el rendimiento de productos de PCR largos . Se han descritos métodos de clasificación basados en PCR. Wilfinger y colaboradores describen un método basado en PCR en el cual el cDNA más largo es identificado en la primera etapa, de modo que clones incompletos pueden ser eliminados del estudio. Bio Techniques-, 22 ( 3) : 481-486 ( 1997 ) .. Tales métodos son particularmente efectivos en la combinación con una metodología de construcción de cDNA de longitud completa, anterior. B. Métodos Sintéticos para la Construcción de Acidos Nucleicos . „ · "- -. Los ácidos nucleicos aislados de la presentex invención también se pueden preparar mediante síntesis química ' directa por métodos tal como el método de ; fosfotriéster de Narang y colaboradores, Meth. Enzymol. 68:90-99 (1979) ; el método de fosfodiéster de Brown y ; colaboradores, Meth. Enzymol. 68:109-151, (1979); el método de '/ dietilfosforamidita de Beaucage y colaboradores, Tetra. Lett. i 22:1859-1862. (1981); el método de triéster ' de fosforamidita '· en fase sólida descrito por Beaucage y Caruthers, Tetra.

Letts. 22 (20) .1859-1861 (1981), por ejemplo, usando un sintetizador automatizado, por ejemplo, como es descrito en Needham-VanDevanter y colaboradores, Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984); y el método de soporte sólido de la patente norteamericana No. 4,458,066. La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de una sola hebra. Este puede ser convertido en DNA de doble hebra mediante hibridación con una secuencia complementaria, o mediante la polimerización con una DNA polimerasa usando la única hebra como un patrón. Un experto reconocerá que mientras que la síntesis química de DNA es mejor empleada para secuencias de. aproximadamente 100 bases o menos, secuencias más largas se pueden obtener mediante la ligación de secuencias más cortas. Casetes de Expresión Recombinantes La presente invención además proporciona casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Una secuencia de ácido nucleico que% codifica para el polipéptido . deseado de la presente invención, por ejemplo un cDNA o una secuencia genómica que codifica un polipéptido de longitud completa de la presente invención, se puede usar para construir un cásete de expresión reccmbinante que puede ser introducido en la célula hospedera deseada. Un cásete de expresión recombinante típicamente comprenderá un polinucleótido en la presente invención operablemente enlazado a las secuencias de regulación de iniciación transcripcionales que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula hospedera propuesta, tal como dentro de los tejidos de una planta transformada . Por ejemplo, los vectores de expresión de plantas pueden incluir (1) un gen de planta clonado bajo el control de transcripción de las secuencias de regulación 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión de plantas también pueden contener, si se desea,, una región de regulación de promotor (por ejemplo, una que confiere expresión inducible o constitutiva, ambientalmente o desarrolladamente regulada o especifica/selectiva de la célula o tejido), un sitio de partida de iniciación de transcripción, un sitio de enlace de ribosoma, una señal de procesamiento de RNA, un sitio de terminación de transcripción y/o una señal de poliadenilación. Se puede emplear un fragmentó de promotor de planta' que dirigirá la expresión de un polinucleótido de la presente invención en todos los tejidos de una planta regenerada. Tales promotores son referidos en la presente como promotores "constitutivos" - y están activos bajo la mayoría de condiciones ambientales y estados de desarrollo o diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen la región de iniciación de transcripción 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV) , el promotor 1' o 2* derivado del T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, el promotor ubicuitin 1, el promotor Smas, el promotor de alcohol cinamilico de deshidrogenasa (patente norteamericana No. 5,683,439), el promotor Nos, el promotor pEmu, el promotor rubisco y el promotor GRP1-8. Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en un- tejido especifico o de otro modo puede estar bajo control ambiental o de desarrollo más preciso. Tales promotores son referidos en la presente como promotores "inducibles". Las condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción mediante promotores inducibles incluyen el ataque por patógenos, condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Ejemplos de promotores inducibles, son el promotor Adhl que es inducible mediante hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70 que es inducible por el estrés por calor y el promotor PPDK que es inducible por luz. Ejemplos de promotores bajo el control de desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción solamente, de preferencia, en ciertos tejidos, tales como hojas, raices, frutos, semillas o flores. Promotores ejemplares incluyen el promotor especifico de antera 5126 (patentes norteamericanas No. 5,689,049 y 5,689,051), promotor glob-1 y promotor de gama-zeina. La presente invención proporciona promotores con expresión limitada a, o mejorada en, fibras sedosas de maíz incluyendo el promotor gI2 ( SEQ ID N0:1 y SEQ ID NO:26). La operación de un promotor también puede variar dependiendo de su ubicación en el genoma . Así, un promotor inducible puede llegar a ser completamente o parcialmente constitutivo en ciertas ubicaciones. Los promotores tanto heterólogos como no heterólogos (es decir, endógenos) pueden ser empleados para la expresión directa de los ácidos nucleicos de la presente invención. Estos promotores también se pueden utilizar, por ejemplo, en casetes de expresión recombinantes para inducir la expresión de ácidos nucleicos antisentido para reducir, incrementar o alterar la concentración y/o composición de las proteínas de la presente invención en un tejido deseado. Así, en algunas modalidades, la construcción de ácido nucleico comprenderá un promotor, funcional en una célula de planta, operablemente enlazado a un polinucleótido de la presente invención. Los promotores útiles en estas modalidades incluyen los promotores endógenos que inducen la expresión de un polipéptido de la presente invención. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos aislados que sirven como elementos de promotor o mejoradores pueden ser introducidos en la posición apropiada (generalmente corriente arriba) de una forma no heteróloga de un polinucleótido de la presente invención para regular hacia arriba o hacia abajo la expresión de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, los promotores endógenos pueden ser alterados in vivo mediante mutación, supresión y/o sustitución (ver, Kmiec, patente norteamericana 5,565,350; Zarling y colaboradores, PCT/US93/03868 ) , o promotores aislados pueden, ser introducidos en una célula de planta en la orientación y distancia apropiadas a partir de un gen clonado de un . polinucleótido de la presente invención para controlar' la expresión del gen. La expresión del gen puede ser modulada bajo condiciones adecuadas para el crecimiento de la planta para alterar la concentración total y/o altera la composición de los polipéptidos de la presente invención en la célula de planta. Asi, la presente invención proporciona composiciones y métodos para hacer, promotores y/o mejoradores heterólogos operablemente enlazados a una forma endógena (es decir, no heteróloga) no nativa de un polinucleótido de la presente invención. Si se desea la expresión de polipéptido, generalmente _ es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de una región de codificación de un polinucleótido. La región de poliadenilación puede ser derivada del. gen natural, de una variedad de otros genes de plantas, o del T-DNA. La secuencia de extremo 3'. a ser, adicionada puede ser derivada de, por ejemplo, los genes nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente de otro gen de la planta, o menos de preferencia de cualquier otro gen eucariotico. - - Una secuencia de intrón puede ser adicionada a la región no traducida 5' o la secuencia de codificación para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción en las construcciones de expresión tanto de plantas como de animales se ha mostrado que incrementa la expresión del gen tanto en los niveles de mRNA y de proteina hasta 1000 veces. Buchman y Berg, Mol. Cell Biol . 8:4385-4405 (1988); Callis y colaboradores, Genes' Dev. 1: 1183-1200. (1987). Tal mejora del intrón de expresión del gen es típicamente más grande cuando es colocado cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de intrones de maíz, intrón 1, 2 y 6 Adhl, el intrón Bronze-1 son conocidos en la técnica. Ver generalmente, The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds . , Springer, New York (1994). El' vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente invención típicamente comprenderá un gen marcador que confiere un fenotipo seleccionable sobre las células de plantas. Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers y colaboradores, Meth, ' in Enzymol, 153:253-277' (1987).

Un polinucleótido de la presente invención puede ser expresado ya sea en la orientación de sentido o antisentido como sea deseado. Será apreciado que el control en la expresión de gen en cualquier orientación de sentido o antisentido puede tener un impacto directo sobre las características observables de la planta. La tecnología antisentido puede ser convenientemente utilizada para inhibir la expresión del gen en plantas. Para realizar esto, un segmento de ácido nucleico del gen deseado es clonado y operablemente enlazado a un promotor tal que la hebra antisentido de RNA será transcrita. La construcción luego es transformada en plantas y la hebra antisentido del RNA es producida. En células de plantas, se ha mostrado que el RNA antisentido inhibe la expresión del gen al impedir la acumulación de mRNA que codifica la enzima de interés, ver, por ejemplo Sheehy y colaboradores, Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 85:8805-8809 (1988); y Hiatt y colaboradores, patente'' norteamericana No. 4,801,340. . ·; - Otro método de supresión es la supresión de sentido (es decir, co-supresión) . La introducción de ácido nucleico configurado en la orientación de sentido se ha mostrado que es un medio efectivo mediante el cual bloquear la transcripción de los genes objetivo. Para un ejemplo de uso de este método para modular la expresión de genes endógenos, ver Napoli y colaboradores, The Plant Cell 2:279-289 (1990) y la patente norteamericana No. 5,034,323. Las moléculas de RNA catalíticas o ribozimas también se pueden utilizar para inhibir la expresión de los genes de planta. Es posible diseñar ribozimas que específicamente emparejan con virtualmente cualquier RNA objetivo y segmentan la cadena principal de fosfodiéster en una ubicación específica, para de esta manera inactivar funcionalmente el RNA objetivo. Al llevar a cabo esta segmentación, la ribozima no es por sí misma alterada, y de esta manera es capaz de reciclar y segmentar otras moléculas, haciéndola una enzima verdadera. La inclusión de secuencias de ribozima dentro de los RNAs antisentido confiere la actividad de segmentación de RNA en éstas, incrementando de esta manera la actividad de las construcciones. El diseño y el uso de ribozimas específicas de RNA objetivo es descrito en Haseloff y colaboradors, Nature 334:585-591 (1988) . " Una variedad de agentes de reticulación, agentes de' alquilación y especies de generación de radicales como grupos pendientes sobre polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar para enlazar, marcar, detectar y/o segmentar ácidos nucleicos. Por ejemplo, Vlassov, V.V. y colaboradores, Nucleic Acids Res. 1986) 14:4065-4076, describe el enlace covalente de un fragmento de DNA de una sola hebra con derivados de alquilación de nucleótidos complementarios a secuencias objetivas. Un reporte de trabajo similar por el mismo grupo es aquel por Knorre, D.G., y colaboradores, Biochi ie (1985) 67:785-789. Iverson y Dervan también mostraron la segmentación especifica de la secuencia del DNA de una sola hebra mediada por la incorporación de un nucleótido modificado que fue capaz de activar la segmentación. (J Am Chem Soc (1987) 109:1241-1243). Meyer, R.B. y colaboradores, J Am Chem Soc (1989) 111:8517-8519, efectúan la reciculación covaiente a un nucleótido objetivo usando un agente de alquilación complementario a la secuencia de nucleótidos objetivo de una sola hebra. Una reticulación fotoactivada a los oligonucleótidos de una sola hebra mediadas por psoralen fue descrita por Lee, B.L. y colaboradores, Biochemistry (1988) 27:3197-3203. El uso de la reticulación en sondas de formación de triple hélice también fue, descrito por Home y colaboradores, J Am Chem Soc (1990) 112.2435-2437. El uso de N4, N4-etanocitosina como un agente de alquilación para reticular oligonucleótidos de una solas hebra, también ha sido descrito por Webb y Matteucci, J Am Chem Soc . (1986) 108:2764-2765; Nucleic Acids Res (1986) 14:7661-7674; Feteritz y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 113:4000 (1991). Varios compuestos para enlazar, detectar, marcar y/o segmentar ácidos nucleicos son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5, 543, 507; ~5, 672, 593, 5, 484, 908; 5, 256, 648 y 5, 681, 941. _ Proteínas Las proteínas aisladas de la presente invención comprenden un polipéptido que tiene por lo menos 10 aminoácidos de un polipéptido de la presente invención ' (o variantes conservativas del mismo) tales como aquellas codificadas por cualquiera de los polinucleótidos de la presente invención como es discutido más completamente en lo anterior (Por ejemplo, Tabla 1). Las proteínas de la presenté invención o variantes de las mismas pueden comprender cualquier número de aminoácidos contiguos de un polipéptido de la presente invención, en donde ese número es seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 10 al número de residuos en un polipéptido de longitud completa de la presente invención. Opcionalmente, esta subsecuencia de aminoácidos contiguos es de por lo menos 15, 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos en longitud, frecuentemente por lo menos 50, 60, 70, 80 o 90 aminoácidos en longitud. Además el número de tales subsecuencias puede ser cualquier número entero seleccionado del grupo que consiste de 1 a 20, tal como 2, 3, 4 o 5. La presente invención además proporciona una proteína que comprende un polipéptido que tienen una identidad/similitud de secuencia especificada con un polipéptido de la presente invención. El porcentaje de identidad/similitud -de secuencia es un número entero seleccionado del /grupo que consiste de 50 a 99. Valores de identidad/similitud de secuencia ejemplares incluyen 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95%. La identidad de secuencia puede ser determinada usando, por ejemplo, los programas GAP, CLUSTALW o BLAST. Como aquellos expertos apreciarán, la presente invención incluye, pero no está limitada a, polipéptidos catalíticamente activos de la presente invención (es decir, enzimas) . Los polipéptidos catalíticamente activos tienen actividad específica de por lo menos 20%, 30% o 40%, y de preferencia por lo menos 50%, 60% o 70% y mucho más de preferencia por lo menos 80%, 90% ? 95% a aquella del polipéptido endógeno, nativo (no sintético) . Además, la especificidad de sustrato (kcat/km) es opcionalmente de manera sustancial similar al polipéptido endógeno, nativo (no sintético). Típicamente, la km será de por lo menos 30%,- 40% o 50% a aquella del polipéptido endógeno, nativo (no sintético) y más de preferencia por lo menos 60%, 70%, 80% o 90%. Los métodos para analizar y cuantificar mediciones de actividad enzimática y especificidad de sustrato (kcat/km) son bien conocidos para aquellos expertos en la' técnica. Expresión de Proteínas en Células Hospederas Usando los ácidos nucleicos de la presente invención, se puede expresar una proteína de la presente invención en una célula recombinantemente diseñada tal como células de bacterias, levadura, insectos, , mamíferos o de preferencia células de planta. Las células producen la proteina en una condición no natural (por ejemplo, en cantidad, composición,, ubicación y/o tiempo) , debido a que se han alterado genéticamente a través de la intervención humana para hacerlos de esta manera. Se espera que aquellos expertos en la técnica estén conscientes de los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteina de la presente invención. Ningún intento será hecho para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas. En breve resumen, la expresión de ácidos nucleicos aislados que codifica una proteína de la presente invención típicamente será -obtenida al enlazar operablemente. por ejemplo, el DNA o cDNA a un promotor, seguido por la incorporación en un vector de expresión. El vector puede ser adecuado para la replicación e integración en ya sea procariotas o eucariotas. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de transcripción y de traducción, secuencias de iniciación, y promotores útiles para la regulación de la expresión del DNA que codifica una proteína de la presente invención. Para obtener alto nivel de expresión de un gen clonado, es deseable construir vectores de expresión que contienen, en lo mínimo, un promotor fuerte a la transcripción directa, un sitio de enlace de ribosoma para la iniciación de traducción y un terminador de transcripción/traducción. Un experto en la técnica reconocerá que se pueden hacer modificaciones a una proteina de la presente invención sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones se pueden hacer para facilitar la clonación con una expresión o incorporación de la molécula ¦objetivo en una proteina de fusión. .Tales modificaciones son bien conocidas para aquellos expertos en la técnica e incluyen, por. ejemplo, una metionina adicionada al amino terminal para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) colocados en cualquier terminal para crear secuencias de purificación convenientemente ubicadas. Los sitios de restricción o codones de terminación también pueden ser introducidos. Síntesis de Proteínas Las proteinas de la presente invención pueden ser' construidas usando métodos sintéticos no celulares. La síntesis en ,. fase sólida de proteinas de menos de aproximadamente 50 aminoácidos en longitud se puede realizar al unir el aminoácido C-terminal de la secuencia a un soporte insoluble seguido por la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia. Las técnicas para la síntesis . en' fase sólida son descritas por Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis, pp. 3-284 en The / Peptides : Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A, : Merrifield y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963) y Stewart y colaboradores, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem, Co., Rockford, III. (1984). Las proteínas de longitud más grande pueden ser sintetizadas mediante la condensación de las terminales de amino y carboxi de fragmentos más cortos. Los métodos de formación de enlaces de péptido mediante la activación de un extremo terminal . de carboxi (por ejemplo, mediante el uso del reactivo de acoplamiento N, f -diciclohexilcarbodiimida ) son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Purificación de Proteínas Las proteínas de la presente invención pueden ser purificadas mediante técnicas estándares bien conocidas para aquellos expertos en la técnica. Las proteínas recombinantemente producidas de la presente invención pueden ser directamente expresadas o- expresadas como una proteína de fusión.. La proteína recombinante es purificada mediante, una combinación de lisis celular (por ejemplo, sonicación, prensa Frenen) y cromatografía de afinidad. Para productos de fusión, la digestión subsecuente de la proteína de fusión con una enzima proteolítica apropiada libera la proteína recombinante deseada./ Las proteínas de esta invención, recombinantes o 85. .. . . sintéticas, pueden ser purificadas a la pureza sustancial mediante técnicas estándares bien conocidas en la técnica, incluyendo la solubilización con detergente, precipitación selectiva con tales sustancias como sulfato de amonio, 5 cromatografía en columna, métodos de inmunopurificación y otros. Ver, por ejemplo, R. Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag : New York (1982); Deutscher, Guide to Protein Purification, Academic Press .(1990) . Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser resaltados a 10 las proteínas como es descrito en la presente. La purificación de E. coli puede ser obtenida siguiendo Ios- procedimientos descritos en la patente norteamericana No. 4,511,503. La proteína luego puede ser aislada de las células que expresan la proteína y además purificada mediante 15 técnicas de química de proteína estándar como es descrito en. la presente. La detección de la proteína expresada se obtiene '· ··. mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, radioinmunoensayo, técnicas de manchado de Western o inmuñoprecipitación . 20 Introducción de Acidos Nucleicos en Células Hospederas El método de introducción de un ácido nucleico de ' · la presente invención en una célula hospedera no es crítico para la presente invención. Convenientemente se utilizan los métodos de ' transformación o transíección. Por consiguiente, 25- una amplia variedad de métodos se han desarrollado para insertar una secuencia de DNA en el genoma de una célula hospedera para obtener la transcripción y/o traducción de la secuencia para efectuar cambios fenotipicos en el organismo. Asi, se puede emplear cualquier método que proporciona la introducción efectiva de un ácido nucleico. A. Transformación de la Planta Un ácido nucleico que comprende un polinucleótido de la presente invención es opcionalmente introducido en una planta. Generalmente, el polinucleótido primero ¦ será incorporado en un cásete o vector de expresión recombinante . Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden, ser introducidos en plantas de acuerdo con técnicas conocidas en el arte. Las técnicas para transformar una amplia variedad de especies de plantas superiores son bien conocidas y descritas en la literatura técnica, científica y de patentes. Ver, por ejemplo, Weising y colaboradores, Ann . Rev. Genet. 22:421-477 (1988). Por ejemplo, la construcción de DNA puede^ ser introducida directamente en el DNA genómico de la célula de la..,, planta · usando técnicas tal como electroporación, polietilenglicol (PEG), poración, bombardéo de partículas, suministro de fibra de silicio o microinyección de protoplastos de célula de planta o callo embriogénico . Ver, por ejemplo, Tomes y colaboradores, Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment, pp. 197-213 en Plant Ce.ll, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, eds. O.L. Gamborg and G.C. Phillips. Springer-Verlag Berlín Heidelberg New York, 1995; Ver, la patente norteamericana No. 5,990,387. La introducción de construcciones de DNA usando la precipitación con PEG es descrita en Paszkowski, y colaboradores, Embo J. 3:2717-2722 (1984) . Las técnicas de electroporación son descritas en Fromm y colaboradores, Proc . Nati. Acad. Sci. (USA) 82:5824 (1985) . Las técnicas de transformación balística son descritas en Klein y colaboradores, Nature 327:70-73 (1987) . Las técnicas de transformación mediada por Agrobacterium turnefaciens son bien descritas en la literatura, científica. Ver, por ejemplo Horsch y colaboradores, Science 233:496-498 (1984); Fraley y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 80:4803 (1983); y Plant Molecular Biology: A Laboratory Manual, Chapter 8, Clark, Ed., Springer-Verlag, Berlín (1997) . Las construcciones de DNA pueden ser combinadas con regiones flanqueantes 'de T-DNA adecuadas e introducidas en un vector huésped de ¦ Agrobacterium turnefaciens convencional. Las funciones de virulencia del huésped de Agrobac erium tu efaciens dirigirán la inserción de la construcción y el marcador adyacente en el DNA de la célula de planta cuando la célula es infectada por la bacteria. Ver, la patente norteamericana No. 5,591,616. Aunque el Agrobacterium "es principalmente útil en dicotiledóneas, ciertas mónocotiledóneas, pueden ser transformadas mediante Agrobacterium, Por ejemplo, la transformación con Agrobacterium del maíz es descrita en la patente norteamericana No. 5,550,318. Otros métodos de transfección o transformación incluyen (1) la transformación mediada por Agrobacterium rhizogenes (ver, por ejemplo, Lichtenstein and Fuller En: Genetic Engineering, vol. 6, P J Rigby, Ed., London, Academic Press, 1987; y Lichtenstein, C. P., and Draper, J. , En: DNA Cloning, Vol. II, D.M. Glover, Ed. Oxford., IRI Press, 1985). La solicitud PCT/US87/02512 ( O 88/02405 publicada el 7 de Abril de 1988) describe el uso de la cepa de A. rhizogenes A4. y su plásmido Ri junto con los vectores de A. Turnefaciens pARC8 o pA C16 (2) captación de DNA mediada por liposoma (ver, por ejemplo, Freeman y colaboradores, Plant Cell Physiol. 25:1353 (1984)), (3) el método de formación de vórtice (ver, por ejemplo, Kindle, Proc. Nati. Acad. Sci., (USA) 87:1228 (1990) . ' " N ' ¦ El DNA también puede ser introducido en las plantas mediante la transferencia de DNA directa en el polen como es descrito por Zhou y colaboradores, Methods in Enzymology, 101:433 (1983); D.. Hess, Intem Rev. Cytl, 107:367 (1987); Luo y , colaboradores, Plant Mol. Biol. Repórter, 6:165 (1988. La expresión de genes de codificación de polipéptido puede ser obtenida mediante la inyección de DNA en los órganos reproductores de una planta como es descrito por Pena y colaboradores, Nature, 325:274 (1987). El DNA también puede ser inyectado directamente en las células de embriones inmaduros y embriones desecados rehidratados como es descrito por Neuhaus y colaboradores, Theor. Appl. Genet, 75:30 (1987); y Benbrook y colaboradores, en Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, Mass, pp. 27-54 (1986) . Una variedad de virus de plantas que pueden ser empleados como vectores son conocidos en la técnica e incluyen el virus de mosaico de coliflor (CaMV) , geminivirus, virus de mosaico- de bromo y virus de mosaico de tabaco. B. Transfección de Procariotas, Eucariotas Menores y Células_ Animales Las células hospederas de animales y eucarióticas menores (por ejemplo, levadura) son competentes o se transforman competentes para la transfección por varios medios. Existen varios métodos bien conocidos de introducción de DNA en células animales. Estos incluyen: precipitación de fosfato de calcio, fusión de las células recipientes con protoplastos bacterianos que contiene el DNA, tratamiento de las células recipientes con liposomas que contienen el DNA, DEAE dextrano, electroporacion, biolistica y micro-inyección del .DNA directamente en las células. Las células transfectadas son cultivadas por medios bien conocidos en la técnica. Kuchler, R.J-. , Biochemical Methods in Cell Culture and Virology, Dowden, Hutchinson and Ross, Inc. (1977).

Regeneración de Planta Transgénica Las células de plantas que directamente resultan o se derivan de las técnicas de introducción de ácido nucleico pueden ser cultivadas para regenerar una planta completa que posee el genotipo introducido. Tales técnicas de regeneración frecuentemente dependen de la manipulación de ciertas fitohormonas en un medio de crecimiento de cultivo de tejido. Las células de planta pueden ser regeneradas, por ejemplo, a partir de células individuales, tejido de callo o discos de hojas de acuerdo con las técnicas de cultivo de tejido de plantas estándares. Es bien conocido en la técnica que varias células, tejidos y órganos de casi cualquier planta pueden ser cultivados exitosamente para regenerar una planta completa. La regeneración de la planta a partir de protoplastos cultivados es descrito en Evans y colaboradores, Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, Macmillan Publishing Company, New York pp. 124-176 (1983); y Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, CRC Press, Boca Ratón, pp. 21-73 (1985). La regeneración de plantas a partir de ya sea protoplastos de planta individual o varias explantas es bien conocido en la técnica. Ver, por ejemplo, Methods for Plant Molecular Biology, A. eissbach and H. Weissbach, eds., Academic Press, Inc.,/ San Diego, alif. (1988). Este proceso de regeneración y. crecimiento incluye las etapas de selección de células transformantes y retoños, plantar las raices de los retoños transformantes y el crecimiento de las plantitas en la tierra. Para el cultivo de células, de maíz y la regeneración, ver generalmente, The Maize Handbook, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994); Corn and Corn Improvement, 3a. Edición, Sprague and Dudley Eds., American Society of Agronomy, Madison, Wisconsin (1988) . Para la transformación y regeneración del maíz ver, Gordon-Kamm y colaboradores, The Plant Cell, 2:603-618 (990). La regeneración de plantas que contienen el polinucleótido de la presente invención- e- introducido por Agrobacterium a partir de explantas de hoja puede ser obtenido como es descrito por Horsch y colaboradores, Science, 227:1229-1231 (1985). En este procedimiento, los transformantes son cultivados en la presencia de un agente de selección en un medio que induce la regeneración de retoños en las especies de plantas que son transformadas como es' descrito por Fraley y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci (U.S. A.), 80:4803 (1983). Este procedimiento típicamente produce : retoños dentro de dos a cuatro ¦ semanas y estos retoños " transformantes luego son. transferidos a un medio inductor de raíz apropiado que contiene el agente selectivo y un antibiótico para prevenir el crecimiento bacteriano. Las plantas transgénicas^ de la presente invención pueden ser fértiles o estériles.

Un experto en la técnica reconocerá que después de que el cásete de expresión recombinante es establemente incorporado en plantas transgénicas y confirmado que es operable, éste puede ser introducido en otras plantas mediante cruzamiento sexual. Cualquiera de un número de técnicas de reproducción estándares pueden ser usadas, dependiendo las especies a ser cruzadas. En cultivos vegetativamente propagados, las plantas transgénicas maduras pueden ser propagadas mediante la toma de cortes o mediante técnicas de cultivo de tejido para producir plantas idénticas múltiples. Se hace la selección de transgénicos deseables y se obtienen nuevas variedades y se propagan vegetativamente para el uso comercial. En cultivos prepagados de semilla, las plantas transgénicas maduras puede ser autocruzadas para producir una planta endogámica homocigota. La planta endogámica produce semilla que contiene el ácido nucleico recientemente introducido. Estas 'semillas pueden ser' cultivadas para producir plantas con el fenotipo seleccionado. Las partes obtenidas de la planta regenerada, tales como flores, semillas, hojas, ramas, frutos y similares son incluidas en la invención, siempre y cuando estas partes comprendan células que comprenden el ácido nucleico aislado de la presente invención. La progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas también son incluidas dentro del alcance de la invención, siempre y cuando estas partes comprendan las secuencias de ácido nucleico introducidas. Las plantas transgénicas . que expresan un polinucleótido de la presente invención, pueden ser clasificadas para la transmisión del ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, mediante el inmunomanchado estándar y técnicas de detección de DNA. La expresión al nivel de RNA puede ser determinada inicialmente para identificar y cuantificar las plantas con expresión positiva. Las técnicas estándares para el análisis de RNA pueden ser empleadas e incluyen los ensayos de amplificación de PCR usando cebadores de oligonucleótido diseñados para amplificar solamente los patrones de RNA heterólogos y los ensayos de hibridación en solución usando sondas especificas de ácido nucleico heterólogas. Las plantas positivas de -RNA luego pueden ser analizadas para la expresión de proteina mediante el análisis de inmunomanchado de Western usando los anticuerpos específicamente reactivos de la presente' invención. Además, la hibridación in situ y la inmunocitoquímica de acuerdo con los protocolos estándares se puede hacer usando sondas de polinucleótido específicas del ácido nucleico heterólogo y anticuerpos, respectivamente, para localizar sitios de expresión dentro del tejido transgénico. Generalmente, un número de líneas transgénicas son . usualmente clasificadas para el ácido nucleico ' incorporado para identificar y seleccionar plantas con los perfiles de expresión más apropiados. Una modalidad preferida es una planta transgénica que es homocigota para el ácido nucleico heterólogo adicionado; es decir, una planta transgénica que contiene dos secuencias de ácido nucleico adicionadas, un gen en el mismo sitio en cada cromosoma de un par de cromosomas. Una planta transgénica homocigota que puede ser obtenida al acoplar sexualmente (autoprocesamiento) una planta transgénica heterocigota que contiene un solo ácido nucleico heterólogo adicionado, al germinar algo de la semilla producida y al analizar las plantas resultantes para la expresión alterada, de un polinucleótido de la presente invención con relación a una planta de control (es decir, nativa, no transgénica) . El cruzamiento hacia atrás a una planta parental y el cruzamiento de distinto tipo con una planta no transgénica también son contemplados. Modulación de los Niveles de Polipéptido y/o Composición La presente invención además proporciona un método para la modulación (es decir, incremento o disminución) de la concentración o relación de los polipéptidos de la presente invención en una planta o parte de la misma. La modulación se puede efectuar al incrementar o disminuir la concentración y/o la relación de los polipéptidos de la presente invención en una planta. El método comprende introducir en una célula de planta un cásete de expresión recombinante que comprende un polinucleótido de la presente invención, como es descrito en lo anterior, para obtener una célula de planta transgénica, cultivar la célula de planta transgénica bajo condiciones de crecimiento de célula de planta transgénica e inducir o reprimir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en la planta transgénica durante un tiempo suficiente para modular la concentración y/o las relaciones de los polipéptidos en la planta transgénica o parte de la planta. . En algunas modalidades, la concentración y/o relaciones de polipéptidos de la presente invención en una planta pueden ser modulados al alterar, in vivo o in vitro, el promotor de un gen para regular hacia arriba o hacia abajo la expresión del gen. En algunas modalidades, las regiones de codificación de genes nativos de la presente invención puede ser alterados por medio de la sustitución, visión, inserción o depresión para disminuir la actividad de la enzima codificada. Ver, por' ejemplo, Kmiec, patente norteamericana No. 5,565,350; Zarling y colaboradores, PCT/US93/03868. Y en algunas modalidades, un ácido nucleico aislado (por ejemplo, un vector) que comprende una secuencia de promotor s transfectado en una célula de planta. Subsecuentemente, una célula de planta que comprende el promotor operablemente enlazado a un polinucleótido de la presente invención es seleccionada por medios conocidos para aquellos expertos en la técnica tales como, pero no limitados a, manchado de Southern, secuenciación de DNA o análisis de PCR usando cebadores específicos al promotor y al gen y al detectar los amplicones producidos de los mismos. Una planta o parte de la planta alterada o modificada por las modalidades anteriores es cultivada bajo condiciones de formación de planta durante un tiempo suficiente para modular la concentración y/o relaciones de polipéptidos de la presente invención en la planta. Las condiciones formadoras de plantas son' bien conocidos en la técnica y discutidas brevemente, supra. En general, la concentración o las relaciones de los polipéptidos es incrementada o disminuida por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90% con relación a una planta de control nativa, parte de planta, o célula que carece del cásete de expresión recombinante mencionado en lo anterior. La modulación en la presente invención puede ocurrir durante y/o subsecuente al crecimiento de la planta a la etapa de desarrollo deseada. La modulación de expresión de ácido, nucleico- temporalmente y/o en tejidos particulares puede, · ser controlada al emplear el promotor apropiado operablemente enlazado a un polinucleótido de la presente invención en, por ejemplo, la orientación de sentido o antisentido como es discutido en mayor detalle, supra. La inducción de la expresión de un polinucleótido de la presente invención también' puede ser controlada mediante la administración exógena de una cantidad efectiva de compuesto de inducción. Los promotores inducibles y compuestos de inducción que activan la expresión de estos promotores son bien conocidos en la técnica. En modalidades preferidas, los polipéptidos de la presente invención son modulados en monocotiledóneas, particularmente maíz. UT s y Preferencia de Codón En general, la eficiencia de traducción se ha encontrado que es regulada mediante elementos de secuencia específicos en la región de no codificación o no traducida 5' (5' UTR) del RNA. Las porciones de secuencia positivas incluyen las secuencias consensúales de iniciación de traducción (Kozak, Nucleic Acids Res 156:8125 (1987) y la estructura de terminación de 7-metilguanosina (Drummond y colaboradores, Nucleic Acids Res. 13:7375 (1985)). Los elementos negativos incluyen estructuras de vuelta de tallo ^ 5' UTR intramoleculares, estables (Muesing y colaboradores, Cell 48:691 (1987)) y secuencias AUG o estructuras de lectura abierta cortas precedidas por un AUG apropiado en la 5' UTR (Kozak, supra, Rao y colaboradores, Mol. And 'Cell. Biol. ·.· 8:284 (1988)). Por consiguiente, la presente invención proporciona regiones no traducidas de 5' y/o 3' para la modulación de la traducción de secuencias de codificación heterólogas. . ,' Además, los segmentos que codifican el . polipéptido de los polinucleótidos de la presente invención pueden ser modificados para alterar la utilización de codón . La utilización de codón alterada puede ser empleada para alterar la eficiencia de traducción y/o optimizar la secuencia de codificación para la expresión en un huésped deseado, tal como para optimizar la utilización de codón en una secuencia heteróloga para la expresión en el maíz. La utilización de codón en las regiones de codificación de los polinucleótidos ' de la presente invención puede ser analizada estadísticamente usando paquetes de software, comercialmente disponibles tal como "Codon Preference" disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group (Ver Deveraux y colaboradores, Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984)) o MacVector 4.1 (Eastman Kidal Co., New Haven, Conn.) . Así, la presente invención proporciona una frecuencia de utilización de codón característica de la región de codificación de por lo menos uno de los polinucleótidos de la presente invención.'' El número de polinucleótidos que puede ser usado para determinar una frecuencia de utilización de codón puede ser cualquier número entero de 1 al número de polinucleótidos de la presente invención ' como es proporcionado en la presente. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias de longitud completa. Un número ejemplar de secuencias para el análisis estadístico puede ser por lo menos 1, 5, 10, 20, 50 Tergiversación de Secuencia La presente invención proporciona métodos para la tergiversación de secuencia usando polinucleótidos de la presente invención, y composiciones que resultan de los mismos. La tergiversación de secuencia es descrita en la publicación de PCT No. O 97/20078. Ver también, Zhang, J. H., y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Scí . USA 94:4504-4509 (1997) . Generalmente, la tergiversación de secuencia proporciona un medio para generar bibliotecas de polinucleótidos que tienen una característica deseada que puede ser seleccionada o clasificada. Las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes son generadas a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada, que comprenden regiones de secuencia que tiene identidad de secuencia sustancial y pueden ser homólogamente recombinadas in vi tro o in vivo. La población de polinucleótidos recombinados en secuencia comprende una subpoblación ' de" polinucleótidos que poseen características deseadas o ventajosas y que pueden ser seleccionadas mediante un método de selección o clasificación adecuado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo capaz de ser seleccionado o detectado en un sistema de clasificación, y pueden incluir propiedades de: una proteína codificada, un elemento de transcripción, una transcripción que controla la secuencia, procesamiento de RNA, estabilidad de RNA, conformación de cromatina, traducción u otra propiedad de expresión de un gen o transgen, un elemento replicativo, un elemento de enlace de proteina o similar, tal como cualquier característica que confiere una propiedad seleccionable o detectable. En algunas modalidades, la característica seleccionada será una km disminuida y/o kcat incrementada sobre la proteína de tipo silvestre, como es proporcionado en la presente. En otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado de la tergiversación de secuencia tendrá una afinidad de enlace de ligando más grande que el polinucleótido de tipo silvestre no tergiversado. El incremento en tales propiedades puede ser de por lo menos 110%, 120%, 130%, 140% o por lo menos 150% del valor del tipo silvestre. Secuencias Genéricas y Consensúales Los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención además incluyen a aquellos que tienen: (a) una' secuencia genérica de por lo menos dos polinucleótidos o polipéptidos ' homólogos, respectivamente, de la presente invención; y, (b) una secuencia consensual -de por lo menos tres polinucleótidos o polipéptidos homólogos, respectivamente, de la presente invención. La secuencia genérica de la presente invención comprende cada especie de polipéptido o polinucleótido comprendido por la secuencia genérica de polipéptido o polinucleótido, respectivamente.

Las especies, individuales comprendidas por un polinucleótido que tiene una secuencia consensual de aminoácidos ? ácido nucleico puede ser usada para generar anticuerpos o producir sondas o cebadores de ácido nucleico para clasificar homólogos en otras especies, géneros, familias, órdenes, clases, fílums o reinos. Por ejemplo, un polinucleótido que tiene una secuencia consensual de una familia del gen de Zea mays puede ser usado para generar anticuerpo o sondas o cebadores de ácido nucleico para otras especies de Gramineae tal como trigo, arroz o sorgo. Alternativamente, un polinucleótido que tiene una secuencia "consensual generada de genes ortólogos puede ser usada para identificar o aislar ortólogos de otra entidad taxonómica. Típicamente, un polinucleótido que tiene una secuencia consensual será por lo menos 9,- 10, 15, 20, 25, 30 o 40 aminoácidos en longitud o 20, 30, 40, 50, 100 o 150 nucleótidos en longitud. Como aquellos expertos en la técnica están conscientes, una" sustitución de aminoácido conservativa puede ser usada para aminoácidos que difieren entre las secuencias alineadas pero son del mismo grupo de sustitución conservativa ¦ como es discutido en lo anterior. Opcionalmente, no más de 1 o 2 aminoácidos conservativos son sustituidos para cada' longitud de 10 aminoácidos de secuencia consensual. Las secuencias similares usadas para la generación de una secuencia consensúa! o genérica incluyen cualquier número y combinación de variantes alélicas del mismo gen, secuencias ortólogas o parálogas como es proporcionado en la presente. Opcionalmente, secuencias similares usadas en la generación de una secuencia consensual o genérica son identificadas usando la probabilidad de sumas más pequeñas (P(N)) del programa BLAST . Varios proveedores de software de análisis de secuencia son listados en el capitulo 7 de Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel y colaboradores, Eds . , Current Protocols, una empresa colectiva entre Greene Publishing Associates, Inc. y John iley & Sons, Inc. (Suplemento 30). Una' secuencia de polinucleótido se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de sumas más pequeñas en una comparación del ácido nucleico de prueba al ácido nucleico de referencia es menor que aproximadamente 0.01, más de preferencia menos de aproximadamente 0.01 o 0.001, y mucho más de preferencia menos de aproximadamente 0.0001 o 0.00001. Polinucleótidos similares pueden ser alineados y una secuencia consensual o genérica generada usando el software de alineación de secuencia múltiple disponible de un número de proveedores comerciales tal como el software PILEUP de Genetics Computer Group' s (Madison, WI), Vector NTI's (North Bethesda, MD) , ALIGNX o Genecode's (Ann Arbor, MI) SEQUENCHER. Convenientemente, los parámetros de error de tal software pueden ser usados para generar secuencias consensúales o genéricas. Detección de Acidos Nucleicos La presente invención proporciona además métodos para detectar un polinucleót ido de la presente invención en una muestra de ácido nucleico que se sospecha de contener un polinucleótido de la presente invención, tal como un lisado de célula de planta, particularmente un lisado de maíz. En ¦ algunas modalidades, un gen cognado de un polinucleótido de la presente invención . o porción del mismo puede ser amplificado antes de la etapa de poner en contacto la muestra de ácido nucleico con un polinucleótido de la presente invención. La muestra de ácido nucleico se pone en contacto con el polinucleótido para formar un complejo de hibridación. El polinucleótido híbrida bajo condiciones severas a un gen que codifica un polipéptido de la presente invención. La formación del complejo de hibridación se utiliza para detectar un gen que codifica un polipéptido de la presente • invención en la muestra de ácido nucleico. Aquellos expertos • apreciarán que un ácido nucleico aislado que comprende un polinucleótido de la presente invención debe carecer de secuencias de hibridación cruzada en común con los genes no objetivo que produciría un resultado positivo falso. La detección del complejo de hibridación puede ser obtenida usando cualquier número de métodos bien conocidos. Por ejemplo, la muestra de ácido nucleico, una porción de la misma, puede ser analizada mediante formato de hibridación incluyendo, pero no limitado a, ensayos de hibridación en fase de solución, en fase sólida, en fase mezclada o in situ. Las 'marcas detectables adecuadas para el uso en la presente invención incluyen cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos , radioisotópicos, fotoquimicos, bioquímicos, inmunoquímicos , eléctricos, ópticos o químicos. Las marcas útiles en la presente invención incluyen biotina para el manchado con el conjugado de estreptavidina marcada, cuentas magnéticas, tintes fluorescentes, radiomarcas, enzimas y marcas colorimétricas . Otras marcas incluyen ligandos que enlazan anticuerpos marcados con fluoróforos, agentes quimioluminiscentes y enzimas. La marcación de los ácidos nucleicos de la presente invención se obtiene fácilmente tal como mediante el uso de cebadores de PCR marcados. En ciertas modalidades, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser usadas en combinación ("apilada") con otras secuencias de polinucleótido de interés con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de cualquiera de uno o más de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser apilados con cualquier gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de cualidades deseadas, incluyendo pero no limitadas a cualidades deseables para el alimento para animales tales como genes de alto contenido de aceite (por ejemplo, la patente norteamericana No. 6, 232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (patentes norteamericanas Nos. 5,990,389; 5,885,801; 5,885,802; 5,703,409), cebada de alto contenido de lisina (Williamson y colaboradores (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO " ; 98/20122); y proteínas de · alto contenido de metionina - . . (Pedersen y colaboradores (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; ¦- ,. ·' Kirihara y colaboradores (1988) Gene- 71:359; y usumura y colaboradores (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digeribilidad incrementada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud norteamericana No. de serie 10/053,410, presentada el 7 de Noviembre del. 2001); y tiorredoxinas (solicitud norteamericana. No. de serie -j 10/005, 429, presentada el 3 de diciembre del" 2001)), "las "- ; descripciones de las "cuales son incorporadas en la presente ·· _ por referencia. Los polinucleótidos de la presente invención . también"*- ueden ...ser apilados con cualidades deseables para la resistencia a los insectos, a las enfermedades- o a los herbicidas (por ejemplo, proteínas · tóxicas de Bacillus ^ Thuringiensis '. patentes . norteamericanas Nos.. 5,366,892; ·..'.:· 5,747, 450; -5, 737, 514; . 5, 723,756; · 5, 593, 88Í; Geiser. ~.y\^¾ colaboradores" (1986). Gene 48:109)'; lectinas. (Va Damme y -' .-- colaboradores (1994) Plant Mol. - Biol. 24:825); genes de desintoxicación de fumonisina (patente norteamericana No. 5,792,931); genes de resistencia a la avirulencia y a la enfermedad (Jones y colaboradores (1994) Science -266:789; Martin y colaboradores (1993) Science 262:1432; Mindrinos y colaboradores (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a la resistencia al herbicida tales como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar); y resistencia a glifosato (gen EPSPS) ) ; y cualidades deseables para el procesamiento o productos de proceso tal como alto contenido de aceites (por ejemplo, patente norteamericana No. 6,232,544; WO 94/11516) ) , aceites modificados (por ejemplo, genes- de ácido graso desaturasa (patente norteamerciana No. 5,952,544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa) , almidón sintasas (SS), enzimas de ramificación' de ·.· almidón. -(SBE')-("y .enzimas de ramificación de almidón (SDBE)); y '- poliméros o bioplásticos (por ejemplo, patente norteamericana No .~""5", 602 , 321 ; .béta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintasa y* acetóácétil-CoA reductasa (Schubert y colaboradores (1988) J. Bacterio!. ' 170:5837-5847) facilita ¦ la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs) ) , las descripciones · de" las cuales "son incorporadas en- la presente * por referencia. '·: También-- ; "se·*~podrían combinar los polinucleótidos · * de.' la presente invención con polinucleótidos que afectan las cualidades agronómicas tal como la fertilidad masculina (por ejemplo, ver la patente norteamericana No. 5,583,210), resistencia del tallo, tiempo de floración o las cualidades de tecnología de transformación tal como la regulación del ciclo celular o la dirección del gen (por ejemplo, O 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Estas combinaciones apiladas pueden ser creadas mediante cualquier método, incluyendo, pero no limitado a la reproducción cruzada de plantas mediante cualquier metodología convencional o TopCross, o la transformación genética. Si las cualidades son apiladas al transformar genéticamente las plantas, la secuencia de polinucleótido de interés puede ser combinada en cualquier tiempo y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende una o más cualidades puede- ser utilizada como' el objetivo para introducir cualidades adicionales mediante la transformación subsecuente. Las cualidades pueden ser introducidas simultáneamente en un protocolo de co-transformación con los polinucleótidos de interés proporcionados mediante cualquier combinación de - cásete de transformación. Por ejemplo, si serán introducidas dos secuencias, ' las dos secuencias pueden ser contenidas en casetes de transformación separados (trans) o contenidos en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de las secuencias de interés puede ser inducida por el mismo promotor o por promotores diferentes. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión de un polinucleótido de interés. Esto puede ser acompañado mediante cualquier combinación de otros casetes de combinación de supresión o cásete de sobreexpresión para generar la combinación deseada de cualidades en la planta. Las plantas transformadas de la invención se pueden usar en un programa de reproducción de plantas. El objetivo de la reproducción de plantas es combinar, en una sola variedad o híbrido, varias cualidades deseables. Para cultivos en campo, estas cualidades pueden incluir, por ejemplo, la resistencia a enfermedades y a los insectos, tolerancia al calor y a la sequía, tiempo reducido para la madurez del cultivo, mayor rendimiento y mejor . calidad' agronómica. Con la cosecha mecánica de muchos cultivos, la uniformidad de las características de la planta tal como la germinación y el establecimiento del tallo, la proporción de crecimiento, madurez y la altura de la planta y mazorca, es deseable. La reproducción de plantas tradicional es una herramienta importante en desarrollar nuevos y mejorados cultivos comerciales. Esta invención comprende métodos para producir una planta de maíz al cruzar una primera planta de /. : maíz parental con una segunda planta de maíz parental en donde una o ambas de las plantas de maiz parental es una planta transformada que muestra vigor incrementado, como es descrito en la presente. Las técnicas de reproducción de plantas conocidas en la técnica y usadas en un programa de reproducción de plantas de maiz incluyen, pero no están limitadas a, la selección recurrente, selección en volumen, selección en masa, cruzamiento hacia atrás, reproducción de pedigri, reproducción de polinización abierta, selección mejorada del polimorfismo de longitud de fragmento de restricción, selección mejorada del marcador genético, haploides duplicados y transformación. Frecuentemente se · utilizan combinaciones de estas técnicas. El desarrollo de híbridos de maíz en un programa de reproducción de plantas de maíz requiere, en general, el desarrollo de líneas endogámicas homocigotas, el cruzamiento": de estas líneas y la evaluación de las cruzas. Existen muchos métodos analíticos disponibles para evaluar el resultado de una cruza. El método más antiguo y más tradicional de análisis es la observación de cualidades fenotípicas. Alternativamente, se puede examinar el genotipo de una planta . - " Una cualidad genética que se ha diseñado en una planta de maíz particular usando técnicas de transformación, podría ser movida a otra línea usando técnicas de reproducción tradicionales que son bien conocidas en las técnicas de reproducción de plantas. Por ejemplo, un procedimiento de cruzamiento hacia atrás es comúnmente usado para mover un transgen desde una planta de maíz transformada a una línea endogámica de élite, y la progenie resultante entonces comprendería el(los) transgen (es ) . También, si se utilizó una línea endogámica para la transformación entonces las plantas transgénicas podrían ser cruzadas a una línea endogámica diferente con el fin de producir una planta de maíz híbrida transgénica. Como se utiliza en la presente,-"cruzamiento" puede referirse a una cruza simple de X por Y, o el proceso de cruza hacia atrás, dependiendo del contexto. El desarrollo de un híbrido de maíz en un programa de reproducción de plantas de maíz involucra tres etapas: (1). la selección de plantas de varias acumulaciones de germen plasma para las cruzas de reproducción iniciales; (2) el autocruzamiento de las plantas seleccionadas de las cruzas de reproducción para varias generaciones para proporcionar una serie de líneas endogámicas o que, mientras que diferentes entre sí, se reproducen realmente y son altamente uniformes y (3) el cruzamiento en las líneas endogámicas seleccionadas con diferentes líneas endogámicas para producir los híbridos. Durante el proceso endogámico en el maíz, el vigor de las líneas disminuye. El vigor es restaurado cuando dos líneas endogámicas diferentes son cruzadas para producir el híbrido. Una consecuencia importante de la homocigocidad y homogeneidad de las líneas endogámicas es que el híbrido creado al cruzar un par definido de líneas endogámicas siempre será el mismo. Una vez que las líneas endogámicas que dan un híbrido superior se han identificado, la semilla híbrida puede ser reproducida indefinidamente mientras que la homogeneidad de los parentales endogámicos sea mantenida. Las plantas transgénicas de la presente invención se pueden utilizar para producir un híbrido de una sola cruza, un híbrido de tres vías o un híbrido de doblé cruza. Un híbrido de una sola cruza se produce cuando dos líneas endogámicas son cruzadas para producir la progenie Fl . Un híbrido de doble cruza se produce a partir de cuatro líneas endogámicas cruzadas en pares (AxB y CxD) y luego los dos híbridos Fl se cruzan nuevamente (AxB) x (CxD) . Un híbrido de cruza de tres vías se produce a partir de tres líneas endogámicas , donde dos de las líneas endogámicas son cruzadas (AxB) y luego el híbrido Fl resultante es cruzado con la tercera línea endogámica (AxB) x C. Mucho del vigor híbrido y la uniformidad mostrada por los híbridos Fl se pierde en la siguiente generación (F2). Consecuentemente, la semilla producida por los híbridos es consumida antes que plantada. Aunque la 'presente invención se ha descrito en algún detalle por medio de la ilustración y ejemplo para - . . n2 propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones pueden ser llevados a cabo dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Ejemplo 1 Este ejemplo describe la construcción de una biblioteca de cDNA . El RNA total puede ser aislado de tejidos de maíz con el Reactivo TRIzol (Life Technology Inc. Gaithersburg, MD) usando una modificación del procedimiento de isotiocianato de guanidina/ácido-fenol descrito por Chomczynski y Sacchi (Chomcsynski, P., y Sacchi, N. Anal. Biochem. 162, 156 (1987)). En resumen, las muestras de tejido de planta son pulverizadas en nitrógeno liquido antes de la adición del Reactivo TRIzol y luego homogenizadas adicionalmente con un mortero y triturador. La adición de cloroformo seguido por la centrifugación es conducida para la separación de una fase acuosa y una fase orgánica. El RNA total se recupera mediante la precipitación con alcohol isopropilico a partir de la fase acuosa. La selección de poli (A) +RNA del RNA total puede ser realizada usando el sistema PolyATact (Promega Corporation, Madison, WI) . Los cebadores oligo(dT) biotinilados se utilizan para hibridar los extremos poli (A) 3' sobre el mRNA. Los híbridos se capturan usando estreptavidina acoplada a partículas paramagnéticas y un soporte de separación magnético. El mRNA luego es lavado a condiciones de alta severidad y eluido mediante agua desionizada libre de Rnasa. La síntesis de cDNA y la construcción de bibliotecas de cDNA unidireccionales se puede realizar usando el sistema SuperScript Plasmid System (Life Technology Inc. Gaithersburg, MD) . La primera hebra de cDNA es sintetizada al cebar un cebador oligo (dT) que contiene un sitio Notl. La reacción es catalizada mediante SuperScript Reverse Transcriptasa II a 45°C. La segunda hebra de cDNA es marcada con alfa-32P-dCTP y una porción de la reacción analizada mediante electroforesis en gel de agarosa para determinar los' tamaños de cDNA. Las moléculas de cDNA más pequeñas que 500 pares bases y los adaptadores no ligados son removidos mediante la cromatografía en Sephacryl-S400. Las moléculas de cDNA seleccionadas son ligadas en el vector pSPORTl entre los sitios Not I y Sal I. Alternativamente, las bibliotecas de cDNA pueden ser preparadas mediante cualquiera de muchos métodos disponibles- Por ejemplo, los cDNAs pueden ser introducidos con vectores de plásmido al primero preparar las bibliotecas de cDNA en los vectores Uni-ZAPMR XR de acuerdo con el protocolo del fabricante (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) .. Las bibliotecas Uni-ZAPMR XR se convierten en bibliotecas de plásmido de acuerdo con el protocolo proporcionado por Stratagene. En la conversión, los insertos • — ?4 de cDNA serán contenidos en el vector de plásmido pBluescript. Además, los cDNAs pueden ser introducidos directamente en los vectores de precorte Bluescript II SK(+) (Stratagene) usando T4 DNA ligasa (New England Biolabs) , seguido por la transcripción en células DH10B de acuerdo con el protocolo del fabricante (GIBCO BRL Products). Una vez que los insertos de cDNA están en los vectores de plásmido, los DNAs de plásmido se preparan a partir de colonias bacterianas aleatoriamente recolectadas que contienen los plásmidos pBluescript recombinantes , o las secuencias de cDNA de inserto son amplificadas por medio de la reacción en cadena de polimerasa usando cebadores específicos para las secuencias de vector que flanquean las. secuencias del cDNA insertadas. Los DNAs de inserto amplificados o DNAs de plásmido son secuenciados en reacciones de secuenciación de^ tinte-cebador para generar secuencias de cDNA parciales^ (etiquetas de secuencia expresadas o "ESTs", ver Adams y colaboradores (1991) Science 252:1651-1656). Las ESTs resultantes se analizan usando un secuenciador fluorescente Perkin Elmer Modelo 377. Ejemplo 2 Este método describe la construcción de una biblioteca de cDNA enriquecida de longitud completa. Una biblioteca de cDNA de longitud completa enriquecida puede ser construida usando una de dos variaciones del método de Carninci y colaboradores, Genomícs 37:327-336. 1996. Estas variaciones están basadas en la introducción química de un grupo de biotina en el residuo de diol de la estructura de terminación 5 ' del mRNA eucariótico para seleccionar cDNA de primera hebra de longitud completa. La selección ocurre al atrapar el residuo de biotina en los sitios de terminación usando cuentas magnéticas recubiertas con estreptavidina seguido por el tratamiento de Rnasa I para eliminar los cDNAs incompletamente sintetizados. El cDNA de segunda hebra es sintetizado usando procedimientos establecidos tales como aquellos proporcionados en el kit " "SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning" de Life Technologies' (Rockville, D) . Las bibliotecas hechas mediante este método se han mostrado que contienen 50% a 70% de cDNAs de longitud completa. Los métodos de síntesis de primer hebra se detallan-., enseguida. Un asterisco denota que el reactivo fue obtenido de Life Technologies, Inc. A. Método de síntesis 1 de cDNA de primera hebra (con trehalosa) mRNA (10 ug) - 25 µ? ^cebador. Not I (5 ug) 10 µ? ¦^solución reguladora de Ia hebra 5x 43 µ? •* DTT 0. lm 20 µ? *mezcla de dNT P 10 mm 10 µ? BSA 10 ug/µ? 1 µ? Trehalosa (saturada) 59.2 µ? Inhibidor de RNasa (Promega) 1.8 µ? *Superscript II RT 200 u/µ? 20 µ? glicerol al 100% 18 µ? Agua 7 µ? El mRNA y el cebador Not I se mezclan y se desnaturalizan a 65°C durante 10 min. Ellos luego se enfrian sobre hielo y los otros componentes se adicionan al tubo. La incubación es a 45°C durante 2 min. Veinte microlitos de RT (transcriptasa inversa) se adicionan a la reacción y se" inicia el programa en el termociclador (MJ Research, Waltham, MA) : Etapa 1 45°C 10 min Etapa 2 45°C -0.3°C/ciclo, 2 segundos/ciclo Etapa 3 proceder a 2 por 33 ciclos Etapa 4 35°C 5 min Etapa 5 45°C 5 min Etapa 6 45°C 0.2°C/ciclo, 1 seg/ciclo Etapa 7 proceder a 7 por 49 ciclos Etapa 8 55 °C 0.1°C/ciclo, 12 seg/ciclo Etapa 9 proceder a 8 por 49 ciclos Etapa 10 55°C 2 min Etapa 11 60°C 2 min Etapa 12 proceder a 11 por 9 veces Etapa 13 4°C todo el tiempo Etapa 14 final. B. Método de síntesis 2 de cDNA de primera hebra mRNA (10 g) 25 µ? agua 30 µ? ^cebador adaptador Not I (5 µ?) 10 µ? 65°C durante 10 min, enfriar sobre hielo, luego adicionar los siguientes reactivos, *primera solución reguladora 5x 20 µG *DTT 0.1 10 µ? *mezcla de dNTP 10 mM 5 µ? Incubar a 45°C durante 2 min, luego adicionar 10 µ? de *Superscript II RT (200 u/µ?), iniciar el siguiente programa: Etapa 1. 45°C durante 6 seg, -0.1°C/ciclo Etapa 2 proceder a 1 por 99 ciclos adicionales Etapa 3 35°C durante 5 min Etapa 4 45 °C durante 60 min Etapa 5 45°C durante 10 min Etapa 6 4°C todo el tiempo Etapa 7 final: Después de la síntesis de cDNA de Ia hebra, el DNA es extraído mediante fenol de acuerdo con los procedimientos estándares, y luego precipitado en NaOAc y etanol, y almacenado en -20 °C.

C. Oxidación- del grupo diol del mRNA para la marcación de biotina. El cDNA de primera hebra se gira hacia abajo y se lava una vez con EtOH al 70%. La pelotilla se resuspende en 23.2 µ? de agua tratada con DEPC y se coloca sobre hielo. Preparar 100 mM de NaI04 frescamente, y luego adicionar los siguientes reactivos: mRNA : cDNA de primera hebra (iniciar con 20 g de RMA) 4ß.4µ1 NaI04 100 mM (frescamente hecho) 2.5 µ? NaOAc 3M pH 4.5 Hacer 100 mM de NaI04, usar 21.39 µg sw NaI04 para 1 µ? de agua . Envolver el tubo en una lámina delgada e incubar sobre hielo durante 45 min. Después de la incubación, la reacción luego se precipita en: NaCl 5M 10 µ? SDS al 20% 0.5 µ? Isopropanol 61 µ? Incubar sobre hielo por al menos 30 min, luego girarlo hacia abajo a una velocidad máxima a 4°C durante 30 min y lavar una vez con etanoi ai 70% y luego EtOH al 80%. D. Biotinilación del grupo diol de mRNA Resuspender el DNA en 110 µ? de agua tratada con DEPC, luego adicionar los siguientes reactivos: SDS al 20% . , ' 5 µ? - · 119 . . .. . . .

NaOAc 2M pH 6.1 5 µ? Hidrazina de biotina 10 mm (frescamente hecha) 300 µ? Envolver en una lámina delgada e incubar a temperatura ambiente durante la noche. E. Tratamiento de RNasa I Precipitar DNA en: NaCl 5M 10 µ? NaOAc 2M pH 6.1 75 µ? mRNA biotinilado: cDNA 420 µ? EtOH al 100% (2.5 Vol) 1262.5 µ? (Realizar esta precipitación en dos tubos y separar" los 420 µ? de DNA en 210 µ? cada uno, adicionar 5 µ? de NaCl 5M, 37.5 µ? sw NaOAc de 2M pH 6.1 y 631.25 µ? de EtOH al 100%). Almacenar a -20°C durante al menos 30 min. Girar el-.

DNA hacia abajo a 4°C a una velocidad máxima durante 30 min. y lavar con EtOH al 80% dos veces, luego disolver el DNA en 70 µ? de agua libre de RNasa. Acumular dos tubos y terminar con 140 µ?. Adicionar los siguientes reactivos: RNasa Uno 10 ?/µ? 40 µ? : CDNA de Ia hebra : RNA 140 µ? Solución reguladora 10X 20 µ? Incubar durante 37 °C durante 15 min. Adicionar 5 µ? de 40 µg/µl de tRNA de levadura a cada muestra para la captura . F. Captura de cDNA de Ia hebra de longitud completa Bloquear las cuentas con tRNA de levadura: Cuentas 1 mi tRNA de levadura 40 µg/µl 5 µ? Incubar sobre hielo durante 30 min con mezclado, lavar 3 veces con 1 mi de NaCl 2M, EDTA 50 mm, pH 8.0. ¦ Resuspender las cuentas en 800 µ? de NaCl 2M, EDTA 50 mm, pH 8.0, adicionar la muestra tratada con RNasa I 200 µ?, e incubar la reacción durante 30 min a temperatura ambiente. Capturar las cuentas usando el soporte magnético, guardar el sobrenadante e iniciar los siguientes lavados: 2 lavados con NaCl 2M, EDTA 50 mm, pH 8.0, 1 mi cada vez, 1 lavado con SDS al 0.4%, 50 µg mi de tRNA, 1 lavado con Tris-Cl 10 mm, pH 7.5, EDTA 0.2 mm, NaCl 10 mm,. glicerol al 20%, 1 lavado con 50 µg/ml de tRNA, 1 lavado con solución reguladora de cDNA de Ia hebra G. Síntesis de cDNA de segunda hebra Resuspender las cuentas en: ¡ *primera solución reguladora 5X 8 µ? *DTT 0.1 mM 4 µ? *mezcla de dNTP 10 mu 8 µ? . . *2a solución reguladora 5X 60 µ? *ligasa de E. coli 10 U/µ? 2 µ? *DNA polimerasa de E . coli 10 ?/µ? 8 µ? *RnasaH de E. coli 2?/µ1 2 µ? P32 dCTP 10 µ??/µ? 2 µ? O agua hasta 300 µ? 208 µ? Incubar a 1G°C durante 2 hr con mezclado de la reacción en cada 30 min. Adicionar 4 µ? de T4 de DNA polimerasa e incubar durante 5 min adicionales a 16¾C. Eluir el cDNA de 2a hebra de las cuentas. Usar un soporte magnético para separar el cDNA de-2a hebra de las cuentas, luego resuspender las cuentas en 200 µ? de agua, y luego separar nuevamente, acumular las muestras (aproximadamente 500 µ?) , Adicionar 200 µ? de agua a las cuentas, luego. 200 µ? de fenol : cloroformo, rotar en vórtice y girar para separar la muestra con fenol. Acumular el DNA con untamente (aproximadamente 700 µ?) y usar fenol para limpiar el DNA nuevamente, el DNA luego es precipitado en 2 µg de glicógeno y 0.5 vol de NH40Ac 7.5M y 2 vol . de EtOH al 100%. Precipitar durante la noche. Girar hacia abajo la pelotilla y lavar con EtOH al 70%, secar con aire la pelotilla. DNA . 250 µ? DNA 200 µ? NH40AC 7.5 125 µ? NH40Ac 7.5M ¦ 100 µ? EtOH al 100% 750 µ? EtOH al 100% . 600 µ? Glicógeno 1µ?/µ1 2 µ? Glicógeno 1µ?/µ1 2 µ? ?. Ligación del adaptador Sal I Resuspender la pelotilla en 26 µ? de agua y usar 1 µ? para el gel de TAE. Ajustar la reacción como sigue: cDNA de 2a hebra 25 µ? ^solución reguladora1 de ligasa de DNA T4 5X 10 µ? ^Adaptadores Sal I 10 µ? *T4 DNA ligasa 5 µ? Mezclar suavemente, incubar la reacción a 16°C durante la noche. Adicionar 2 µ? de ligasa el segundo día e incubar a temperatura ambiente durante 2 horas (opcional) . Adicionar 50 µ? de agua a la reacción y usar 100 µ?. de fenol para limpiar el DNA, 90 µ? de la fase superior se transfiere a un nuevo tubo y se precipita en: Glicógeno 1 µg/ l DNA de fase superior NH40Ac EtOH al 100% - ¦ Precipitar a -20°C durante la noche Girar hacia abajo la pelotilla a 4°C y lavar en EtOH al 70%, secar la pelotilla. I. Digestión, d Not I cDNA de segunda hebra 41 µ? ^solución reguladora 3 de reacción 5 µ? * Not I 15 u/µ? 4 µ? . Mezclar suavemente e incubar la reacción a 37 °C durante 2 hr. Adicionar 50 µ? de agua y 100 µ? de fenol, rotar en vórtice y tomar 90 µ? de la fase superior a un nuevo tubo, luego adicionar 50 µ? de NH40Ac y 300 µ? de EtOH. Precipitar durante la noche a -20 °C. La clonación, la ligación y la transformación se realizan según el kit de síntesis Superscript cDNA. Ejemplo 3 Este ejemplo la secuenciación de cDNA y la sustracción de biblioteca. Las colonias individuales se pueden recolectar y el-DNA preparado ya sea mediante PCR con los cebadores delanteros . MI3 y los cebadores traseros M13, o mediante el aislamiento de plásmido. Los clones de cDNA pueden ser secuenciados usando los cebadores traseros M13. Las bibliotecas de cDNA se colocan sobre una placa de agar de 22 x 22 cm2 a una densidad de aproximadamente 3,00 colonias por placa. Las placas se incuban en una incubadora a 37 °C durante 12-24 horas. Las colonias se recolectan en placas de 384 cavidádes mediante un colector de colonias robotico, - Q-bot (GENETIX Limited). Estas placas se incuban durante la noche a 37 °C. Estas placas se incuban durante la noche a 37°C. Una vez que se colectan suficientes colonias, ellas son aseguradas sobre membranas de nylon de 22 x 22 cm2 usando Q-bot. Cada membrana contiene 9,216 o 36,864 colonias. Estas membranas se colocan sobre una placa de agar con un antibiótico apropiado. Las placas se incuban a 37 °C durante la noche. Después . de que las colonias se recuperan en el segundo dia, estos filtros se colocan sobre un papel filtro prehumedecido con solución desnaturalizante durante cuatro minutos. Luego se incuban en la parte superior de un baño de agua hirviendo durante cuatro minutos adicionales. Los filtros luego se colocan sobre papel filtro prehumedecido con solución neutralizante durante cuatro minutos. Después la solución en exceso se remueve . al colocar los filtros sobre, papel de filtro seco durante un minuto, el lado de la colonia de los filtros se coloca en la solución de proteinasa K, se incuban a 37°C durante 40-50 minutos. Los filtros se colocan en papeles filtro secos ' para secar durante la. noche. El DNA luego es reticulado a la membrana de nylon mediante el tratamiento con luz UV. La hibridación de la colonia se conduce como es descrito por Sambrook, J. , Fritsch, E.F. and Maniatis, T., (in Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2a Edición) . Las siguientes sondas pueden ser usadas en la hibridación de la colonia: 1. cDNA de primera hebra del mismo tejido como se hizo la biblioteca para remover los clones más redundantes. 2. 48-192 clones de cDNA más redundantes de la misma biblioteca basado en los datos de secuenciación previos. 3. 192 clones de cDNA más redundantes en la base de datos de la secuencia maíz completa. 4. Un oligonucleótido Sal-A20: TCG ACC CAC GCG TCC GAA AAA AAA AAA AAA AAA AAA, remueve los clones que contienen un extremo poli A pero no cDNA. 5. Clones de cDNA derivados de rRNA. La imagen de la autoradiografia se explora en la computadora y las direcciones de intensidad de señal y la colonia fria de cada colonia son analizadas. El rearreglo de. las colonias frías de placas de 384 cavidades a placas de 96 cavidades se conduce usando Q-bot. Ejemplo 4 Este ejemplo describe la identificación del gen a partir de una búsqueda de homología por computadora. Las · identidades del gen se pueden determinar al conducir búsquedas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F. , y colaboradores, (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; ver también www . ncbi . nlm . nih . gov/BLAS / ) bajo los parámetros de error para la - similitud a secuencias contenidas en la base de datos "nr" BLAST (que comprende todas las traducciones de CDS GenBank no redundantes, secuencias derivadas del Brookhaven Protein Data Bank, de estructura tridimensional, la última mayor liberación de la base de datos de secuencia de proteina SWISS-PROT, EMBL y bases de datos DDBJ) . Las secuencias de cDNA se analizan para la similitud con todas las secuencias de DNA públicamente disponibles contenida en la base de datos ' "nr" usando el programa BLASTN. Las secuencias de DNA se traducen en todas las estructuras de lectura y se comparan para la similitud con todas las secuencias de proteina públicamente disponibles contenidas en la base de datos "nr" usando el programa BLASTX (Gish, . and States, D. J. Nature Genetics 3:266-272 (1993)) proporcionado por el NCBI. En algunos casos, los datos de secuenciación de dos o más clones que contienen segmentos-, sobrepuestos de DNA se utilizan para construir secuencias de, DNA contiguas . ' Las alineaciones de secuencia y los cálculos de por ciento de identidad se pueden utilizar usando el programa Megalign del cuadro de computación de bioinformática LASERGENE {DNASTAR Inc., madison, WI). La alineación múltiple de la secuencia se puede realizar usando el método de alineación Clustal (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros de error (SANCION DE ESPACIO=10, SANCION DE LONGITÜD=10) .' Los parámetros de error para las alineaciones por pares usando el método Clustal son KTUPLE 1, SANCION DE ESPACIO=3, VENTANA=5 y DIAGONALES SALVADAS=5. Ejemplo 5 Este método describe la expresión de transgenes en células monocotiledóneas . Se puede construir un transgen que comprende un cDNA que codifica los presentes polipéptidos, tal como ipt (SEQ ID NO: 2) o ivr2 (SEQ ID NO: 20), en la orientación de sentido con respecto a un promotor preferido de fibra sedosa del maíz, tal como g/2 (SEQ ID NO: 1 o 26), que están ubicados 5' al fragmento cDNA, y una secuencia de terminación-apropiada, tal como el extremo 3' de zeina 10 kD, ubicado al fragmento de cDNA. El fragmento de cDNA de este gen puede ser generado mediante la reacción en cadena de .polimerasa (PC ) del clon cDNA usando cebadores de oligonucleótido apropiados.. Los sitios de clonación (Ncol o Smal) se pueden incorporar en los oligonucleótidos para proporcionar la orientación apropiada del fragmento de DNA cuando es insertado en el vector ¦ digerido pML 103 como es descrito enseguida. La amplificación luego se realiza en una PCR estándar. El DNA amplificado luego es digerido con enzimas de restricción Ncol y Smal y fraccionado en un gel de agarosa. La banda apropiada puede ser aislada del gen y combinada con un fragmento Ncol-Saml de 4.9 kb del plásmido pML 103. El plásmido pML 103 se ha depositado bajo los términos del Tratado de Budapest en .. .. . . .. . . 128 - - · . ..

ATCC (Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209), y lleva el número de acceso ATCC 97366. El segmento de DNA del pML 103 contiene un fragmento de promotor Sall-Ncol de 1.05 kb del gen de zeina de 27 kD del maíz y un fragmento Small-Sall de 0.96 kb desde el extremo 3' del gen de zeina de 10 kD del maíz en el vector pGem9Zf(+) (Promega). El vector y el DNA de inserto pueden, ser ligados, a 15 °C durante la noche, esencialmente como es descrito (Maniatis) . El DNA ligado luego puede ser utilizado para transformar XLl-Blue de E. coli (Epicurian Coli XL-1 Blue; Stratagene) . Los transformantes bacterianos pueden ser-clasificados mediante la digestión de la enzima de restricción del DNA de plásmido y el análisis de secuencia de nucleótidos limitado usando el método de terminación de cadena de dideoxi (Sequenase DNA Sequencing Kit; U. S. Biochemical) . La construcción de plásmido resultante comprendería un transgen que codifica, en la dirección 5' a 3' , el promotor de zeina de 27 kD del maíz, un fragmento de cDNA que .codifica los presentes polipéptidos y la región 3' de zeina de 10 kD. El transgen descrito en lo anterior luego puede ser introducido en células de maíz mediante el siguiente procedimiento. Los embriones de maíz inmaduros pueden ser disectados de las cariópsides en desarrollo derivadas de las cruzas de - las líneas de maíz endogámicas H99 y LH132. Los .. - .. - .-·-.- . —. - 129 embriones se , aislan de 10 a 11 días después de la polinización cuando ellos están de 1.0 a 1.5 mm de largo. Los embriones luego se colocan con el lado del eje enfrentado hacia abajo y en contacto con el medio N6. solidificado en agarosa (Chu y colaboradores, (1975) Sci . Sin. Peking 18:659-668) . Los embriones se mantienen en la oscuridad a 27°C. El callo embriogénico friable que consiste . de masas no diferenciadas de células con proembrioides somáticos o embrioides cortados en estructuras suspensoras prolifera desde el escutelo de estos embriones inmaduros. El callo embriogénico aislado de la explanta' primaria puede ser cultivado en el medio N6 y subcultivado en este medio cada 2 o 3 semanas. El plásmido, P35S/AC (Hoechst Ag, Frankfurt, Alemania) o equivalente se puede utilizar en los experimentos de transformación con el fin de proporcionar un marcador seleccionable . Este plásmido contiene el gen Pat (ver la publicación de patente Europea 0 242 236) que codifica la fosfinotricina acetil transferasa (PAT) . La enzima PAT confiere resistencia a los inhibidores de glutamina sintetasa herbicidas " tal como fosfinotricina . El gen pat en P35S/Ac está bajo el control del promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812) y la región 3' del gen 'nopalina sintasa del T-DNA del plásmido Ti de Agrobacterium Turnefaciens.

El método de bombardeo de partículas (Klen y colaboradores, (1987) Nature 327:70-73) se puede utilizar para transferir genes a las células de cultivo de callo. De acuerdo con este método, partículas de oro (1 um en diámetro) se recubren con DNA usando la siguiente técnica. Diez µg de DNAs de plásmido se adicionan a 50 µ? de una suspensión de partículas de oro (60 mg por mL) . Cloruro de calcio (50 µ?, de una solución 2.5 M) y base libre de espermidina (20 µ? de una solución 1.0 M) se adiciona a las partículas.' La suspensión . se gira en vórtice durante la adición de estas soluciones. Después de 10 minutos, los tubos se centrifugan brevemente- (5 seg a 15, 000 rpm) y el sobrenadante se remueve. Las partículas se resuspenden en 200 µ? de etanol puro, se centrifugan nuevamente y el sobrenadante se remueve. El enjuague de etanol se realiza nuevamente y las particulas.se. resuspenden en un volumen final de 30 µ? de etanol. Una alícuota (5 µ?) de las partículas de. oro recubiertas con DNA se pueden colocar en el centro de un disco volante Kapton : (Bio-Rad Labs). Las partículas luego se aceleran en el tejido de maíz con" un Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad Instruments, Hércules CA) , . usando una presión de helio . de 1000 psi, una distancia de espacio de 0.5 cm y una distancia de vuelo de 1.0 cm. Para el bombardeo, el tejido embriogénico se coloca en papel filtro sobre medio N6 solidificado en agarosa. El tejido se arregla como un lecho delgado y se cubre en un área circular de aproximadamente 5 cm de diámetro. La caja petri que contiene el tejido puede ser colocada en la cámara del PDS-1000/he aproximadamente 8 cm desde la criba de detención. El aire en la cámara luego se evacúa a un vacio de 28 pulgadas de Hg. El macroportador se acelera con una onda de choque de helio usando una membrana de ruptura que se revienta cuando la presión de He en el tubo de choque alcanza 1000 psi. Siete días después del bombardeo, el 'tejido puede, ser transferido al medio N6 que contiene glucosinato (2 mg por litro) y carece de caseína o prolina. El tejido continúa creciendo lentamente en este medio. Después de 2 semanas adicionales el tejido puede ser transferido al N6 fresco que contiene glucosinato. Después de 6 semanas, áreas de aproximadamente 1 cm de diámetro de callo activamente creciendo, pueden ser identificadas en algunas de las placas que contienen el medio complementado con glucosinato. Estos, callos pueden continuar creciendo cuando se subcultivan en el medio selectivo. Las plantas pueden ser regeneradas a partir del callo transgénico al primero transferir agrupaciones de tejido al medio N6 complementado con 0.2 mg por litro de 2,4-D. Después de dos semanas el tejido puede ser transferido al medio de regeneración (Fromm y colaboradores, (1990) Bio/Technology 8: 833-839) .

Ejemplo 6 Este ejemplo escribe la expresión de transgenes en células dicotiledóneas. Un cásete de expresión especifico de semilla compuesto del promotor y el terminador de transcripción del gen que codifica la subunidad ß de la proteina de almacenamiento de semilla, faseolina del frijol Phaseolus vulgaris (Doyle y colaboradores, (1986) J. Biol. Chem. 261:9228-9238) se puede usar para la expresión de los presentes polipéptidos en la soya transformada. El cásete de faseolina incluye aproximadamente 500 nucleótidos corriente-arriba (5') desde el codón de- iniciación de traducción y aproximadamente 1650 nucleótidos corriente abajo (3' ) desde el codón de detección de traducción de faseolina. Entre las regiones 5' y 3' están los sitios de endonucleasa de. restricción únicos Neo I (que incluye el codón de iniciación^ de traducción ATG) , Smal, Kpnl y Xbal. EL cásete completo está flanqueado por los sitios Hind III.. El fragmento de cDNA de este gen puede ser generado mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) del clon de cDNA utilizando cebadores de oligonucleótido apropiados. Los sitios . de clonación pueden ser incorporados en los oligonucleótidos para proporcionar la orientación apropiada del fragmento de DNA cuando es insertado en l vector de expresión. La amplificación luego se realiza como es descrito ,. . , . 133 en lo anterior, y el fragmento aislado se inserta en un vector püC 18 que lleva el cásete de expresión de semilla. Los embriones de soya luego pueden ser ransformados con el vector de expresión que comprende secuencias que codifican los presentes polipéptidos . Para inducir embriones somáticos, cotiledones, de 3-5 mm de longitud disectados de semillas inmaduras esterilizadas en la superficie de la variedad de cultivo de soya A2872, pueden ser cultivados en la luz u oscuridad a 26°C sobre un medio de agar apropiado durante 6-10 semanas. Los embriones somáticos que producen embriones secundarios luego son extirpados y. colocados en un medio liquido .adecuado. Después de la selección repetida para agrupaciones de embriones somáticos' que se multiplicaron como embriones de etapa globular, temprana, las suspensiones se mantienen como es descrito, enseguida. Los cultivos .en suspensión embriogénicos de soya pueden ser mantenidos en 35 mL de medio liquido sobre un agitador rotatorio, 150 rpm, a 26°C con luces fluorescentes en un programa de dia/noche de 16:8 horas. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de medio liquido. Los. cultivóos en suspensión embriogénicos de soya luego pueden ser transformados mediante el" método de bombardeo con pistola de partículas (Klein y colaboradores, (1987) Nature (London) 327:70-73, patente norteamericana No. 4,945,050). Un instrumento Du Pont Biolistic PDS1000/HE (retroajuste de helio) se puede utilizar para estas transformaciones . Un gen marcador selecciónatele que puede ser utilizado para facilitar la transformación de la soya es un transgen compuesto el promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812), el gen higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E . coli; Gritz y colaboradores, (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen nopalina sintasa del T-DNA del plásmido Ti. de Agrobacterium Turnefaciens . El cásete de expresión de semilla que comprende la región 5' de faseolina, el fragmento que codifica el presente polipéptido y la' región 3' de faseolina, se puede aislar como un fragmento de restricción. Este fragmento luego puede ser insertado en un sitio de restricción único del vector que lleva el gen marcador. A 50 µ? de una suspensión de partículas de oro de 1 µp? 60mg/mL se adicionan (en orden) : 5 µ? de. DNA (1 µg/µl), 20 µ? de espermidina (0.1 M) y 50 µ? de CaCl2 (2.5 M) . La preparación de partículas luego se agita durante tres •minutos, se gira en una microcentrífuga durante 10 segundos y el sobrenadante se remueve. Las partículas recubiertas con DNA luego se lavan una vez en 400 µ? de etanol al 70% y se resuspenden en 40 µ? de etanol anhidro. La suspensión de DNA/partícula puede ser sonicada tres veces durante un segundo cada uno. Cinco microlitros de las partículas de oro recubiertas con DNA luego se cargan en cada disco rr.acro portador . Aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas se coloca en una caja petri vacía de 60x15 mm y el líquido residual se remueve del tejido con una pipeta. Para cada experimento de transformación, normalmente se bombardean de manera aproximadamente 5-10 placas de tejido. La presión de ruptura de la membrana se ajusta a 1100 psi y la cámara se evacúa a un vacío de 28. pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente 3.5 pulgadas lejos de la criba de retención y se bombardea tres veces. Después del bombardeo, el tejido puede ser dividido a la mitad y colocado nuevamente en el líquido y cultivado como es descrito en lo anterior. Cinco a siete días después del bombardeo, el medio líquido puede ser intercambiado con medio fresco, y siete a doce días después del bombardeo con medio fresco que contiene 50 mg/ml. de higromicina. Este . medio selectivo puede ser renovado cada semana. Siete a ocho semanas después del bombardeo, se puede observar tejido transformado, verde creciendo de las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en matraces individuales para generar, nuevos cultivos en suspensión, embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Cada nueva linea se puede tratar cono un evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego pueden ser subcultivadas y mantenidas como agrupaciones de embriones inmaduros o regenerados en plantas completas mediante la maduración y germinación de embriones somáticos individuales. E emplo 7 Este ejemplo describe la expresión de un transgen en células microbianas. Los cDNAs que codifican los presentes polipéptidos pueden ser insertados en el vector de expresión pBT430 de E. coli T7. Este vector es un derivado de pET-3a (Rosenberg y colaboradores, (1987) Gene 56:125-135) que emplea el sistema T7 RNA polimerasa de bacteriófago/promotor T7. El plásmido pBT430 se construyó al primero destruir los sitios EcoR I y Hind III en pET-3a en sus posiciones originales. Un adaptador" de oligonucleótido que contiene los sitios EcoR I y Hind III se insertó en el sitio BamH I de pET-3a. Esto creó pET-3aM con sitios de clonación únicos adicionales para la inserción de genes en el vector de expresión. Luego, el sitio Nde I en la posición de la iniciación de transducción se convirtió en un sitio Neo I usando las mutagénesis dirigida al oligonucleótido. . La .secuencia de DNA de pET-3aM en esta región, 5' -CATATGG', se convirtió a 5'-CCCATGG en pBT430.

El DNA de plásmido que contiene un cDNA puede ser apropiadamente dirigido para liberar un fragmento de ácido nucleico que codifica la proteina. Este fragmento luego puede ser purificado en un gel de agarosa de baja fusión NuSieve GTG al 1% (FMC) . La solución reguladora y agarosa contienen 10 µg/ml de bromuro de etidio para la visualización del fragmento de DNA. El fragmento luego puede ser purificado del . gel de agarosa mediante la digestión con Gelasa (Epicentre Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, precipitado con etanol, secado y resuspendido en 20 µ? de agua. Los adaptadores de oligonucleótido apropiados pueden ser ligados al fragmento usando T4 DNA ligasa (New England Biolabs, Beverly, MA) . El fragmento que contiene los adaptadores ligados puede ser purificado de los adaptadores en. exceso usando agarosa de baja fusión como es descrito en lo anterior.. El vector pBT430 es digerido, desfosforilado con fosfatasa alcalina (NEB) y desproteinizado . con' fenol/cloroformo como es descrito en lo anterior. El vector pBT430 preparado y el fragmento luego puede ser ligado a 16°C durante 15 horas seguido por la transformación en las celdas electrocompetentes DH5 (GIBCO BRL) . Los transformantes pueden ser seleccionados sobre placas de agar que contiene el medio LB y 100 µ?/p?? de ampicilina. Los transformantes que contienen el gen que modifican los presentes polipéptidos luego se clasifican para la orientación correcta con respecto al promotor T7 mediante el análisis de enzima de restricción. Para la expresión de alto nivel, un clon de plásmido con el inserto de cDNA en la orientación correcta en relación al promotor T7 puede ser transformado en la cepa BL21 (DE3) de E. coli (Studier y colaboradores, (1986) J. Mol. Biol. 189: 113-130) . Los cultivos son cultivados én el medio LB que contiene ampicilina (100 mg/L) a 25°C. A una densidad óptica de 600 nm de aproximadamente 1, se puede adicionar IPTG ( isopropiltio- -galactosidasa, el inductor) a una concentración final de 0.4 mM * y la incubación se puede continuar durante 3 h a 25°. Las células luego son cosechadas mediante centrifugació y resuspendidas en 50 µ? de Tris-HCl 50 mM a un pH de 8.0 que contiene DTT 0.1 mM y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 0.2 mM. Una pequeña cantidad de cuentas de vidrio de 1 mm se pueden adicionar y la mezcla se puede sonificar 3 veces durante aproximadamente 5 segundos cada vez con un sonicador de microondas. La mezcla es centrifugadá y-la concentración de proteina del sobrenadante determinada. Un microgramo. de proteina de fracción soluble del cultivo puede ser separado mediante la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida . Los geles se pueden observar para, las bandas de proteina que migran al peso molecular esperado. Los ejemplos anteriores se proporcionan para ilustrar la invención pero- no para limitar su alcance Otras variantes de la invención serán fácilmente evidentes para un experto ordinario en la técnica y están comprendidas por las reivindicaciones adjuntas. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patentes y programas de computadora citados aquí, se incorporan en la presente por referencia.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para mejorar la exserción de fibra sedosa en una planta de Zea mays bajo estrés, con relación a una planta de Zea mays no transformada bajo estrés, 5 caracterizado porque comprende transformar la planta o su antecesora con una construcción que comprende un promotor especifico de fibra sedosa o preferido de fibra sedosa operablemente enlazado a un polinucleótido que codifica un polipéptido que incrementa la división celular. i0
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor especifico de fibra sedosa o preferido de fibra sedosa comprende la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 26.
3. El método de conformidad con la reivindicación 15 1, caracterizado porque el polinucleótido codifica la isopentenil transferasa.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el polinucleótido que codifica la isopentenil transferasa comprende la SEQ ID NO: 2 0
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polinucleótido codifica la ciclina D.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, ' caracterizado porque el polinucleótido que codifica la 5 ciclina D comprende la SEQ ID NO: 4.
7. El método de conformidad con la reivindicación
I, caracterizado porque el polinucleótido codifica una quinasa dependiente de ciclina. 8. El método de conformidad con la rei indicación 7, caracterizado porque el polinucleótido que codifica una quinasa dependiente de ciclina comprende la SEQ ID NO: 6.
9. Un método para mejorar la exserción de fibra sedosa en una planta, de Zea mays transformada bajo estrés, con relación a una planta de> Zea mays no transformada bajo estrés, caracterizado porque comprende transformar la planta o su antecesora con una construcción que comprende un promotor específico de fibra sedosa o preferido de fibra sedosa operablemente enlazado a un polinucleótido que codifica un polipéptido que incrementa la proporción o grado de expansión celular.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el promotor específico de fibra^' sedosa o preferido de fibra sedosa comprende la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 26.
11. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido codifica una proteína de expansina.
12. El método de conformidad con la" reivindicación II, caracterizado porque el polinucleótido que codifica una proteína de expansina comprende la SEQ ID NO: 8 o 10.
13. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido codifica una acuaporina.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polinucleótido que codifica una acuaporina comprende la SEQ ID NO: 12, 14 o 16.
15. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido codifica un simporter de sacarosa.
16. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido que codifica un simporter de sacarosa comprende la SEQ ID NO: 18.
17. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido codifica la invertasa soluble.
18. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el polinucleótido que codificarla^-invertasa soluble comprende la SEQ ID NO: 20.
19. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el ¦ polinucleótido codifica un antiporter de sodio.
20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque, el polinucleótido que codifica un antiporter de sodio comprende la SEQ ID NO: 22.
21. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el polinucleótido codifica una pirofosfatasa vacuolar.
22. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el polinucleótido que codifica una pirofosfatasa vacuolar comprende la SEQ ID NO: 24.
23. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende una secuencia de promotor activa exclusivamente o preferencialmente en las células del tejido sedoso de una planta de Zea mays , que comprende un polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 26.
24. Un ácido nucleico aislado, caracterizado porque comprende un polinucleótido que codifica una acuaporina y que además comprende la SEQ ID NO: 12, 14 ó 16.
25. Un cásete de expresión recombinante, caracterizado porque comprende un miembro de la reivindicación 23 operablemente enlazado a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 y 24.
26. Una célula hospedera, caracterizada porque comprende un cásete de expresión recombinante de la reivindicación 25.
27. Una planta transgénica, caracterizada porque comprende un cásete de expresión recombinante de la reivindicación 25.
28. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la planta es una monocotiledónea .
29. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la planta es una dicotiledónea .
30. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la planta es seleccionada del grupo que consiste de maíz, soya, girasol, sorgo, cánola, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, cacahuate y cacao.
31. Una semilla transgénica de la planta transgénica de la reivindicación 27.
32. Un polinucleótido, caracterizado porque selectivamente híbrida, bajo condiciones de hibridación severas y un lavado en 0.1 X SSC a aproximadamente 65 °C, a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las SEQ ID NOS: 1, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 y 26.
33. Un método para mejorar la exserción de fibra sedosa en una planta de Zea mays transformada bajo estrés, con relación a una planta de Zea mays no transformada bajo estrés, caracterizado porque comprende transformar la planta o su antecesora con una construcción que comprende un promotor específico de fibra sedosa o preferido de fibra sedosa operablemente enlazado a un polinucleótido que codifica rafinosa sintasa.
34. Un método para mejorar la exserción de fibra sedosa en una planta de Zea m'ays transformada bajo estrés, con relación a una planta de Zea mays no transformada bajo estrés, caracterizado porque comprende transformar la planta o su antecesora con una construcción que comprende un promotor especifico de fibra sedosa o preferido de fibra sedosa operablemente enlazado a un polinucleótido que codifica galactinol sintasa.