UA73070C2 - Method for hybrid seed production with use of conditional female sterility - Google Patents
Method for hybrid seed production with use of conditional female sterility Download PDFInfo
- Publication number
- UA73070C2 UA73070C2 UA99094918A UA99094918A UA73070C2 UA 73070 C2 UA73070 C2 UA 73070C2 UA 99094918 A UA99094918 A UA 99094918A UA 99094918 A UA99094918 A UA 99094918A UA 73070 C2 UA73070 C2 UA 73070C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- promoter
- female
- plant
- gene
- expression cassette
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 64
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 title claims description 29
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 claims abstract description 80
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 75
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 36
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 35
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 31
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 239
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 135
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 46
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 45
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 claims description 42
- 241000209140 Triticum Species 0.000 claims description 38
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 claims description 36
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 27
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 27
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 claims description 18
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 claims description 18
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 claims description 16
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 claims description 8
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 7
- 101150044854 repA gene Proteins 0.000 claims description 6
- 230000010154 cross-pollination Effects 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 240000001090 Papaver somniferum Species 0.000 claims description 3
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000012876 topography Methods 0.000 claims 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 25
- 238000012546 transfer Methods 0.000 abstract description 18
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 48
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 48
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 47
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 35
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 35
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 31
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 30
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 28
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 23
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 22
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 17
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 16
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 15
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 15
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 15
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 15
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 14
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 14
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 13
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 13
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 12
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 11
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 11
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 10
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 9
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 9
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 8
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 8
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 7
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 7
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 7
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 6
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 6
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 5
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 5
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ZEEBBLHXZHVTJG-UHFFFAOYSA-N 2-[[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]methylamino]acetic acid Chemical compound OCC(O)COP(O)(=O)CNCC(O)=O ZEEBBLHXZHVTJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000209510 Liliopsida Species 0.000 description 4
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 4
- 229940125377 Selective β-Amyloid-Lowering Agent Drugs 0.000 description 4
- -1 acetyl- Chemical group 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 4
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 241000724328 Alfalfa mosaic virus Species 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 3
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 3
- 241001233957 eudicotyledons Species 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 2
- 244000020551 Helianthus annuus Species 0.000 description 2
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000233855 Orchidaceae Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 2
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 2
- 229940100389 Sulfonylurea Drugs 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 2
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 2
- 230000010165 autogamy Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 101150014207 bag gene Proteins 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 230000010200 gynoecium development Effects 0.000 description 2
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 108010058731 nopaline synthase Proteins 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 6-[(5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl)oxy]-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid;cyclohexanamine Chemical compound [NH3+]C1CCCCC1.O1C(C([O-])=O)C(O)C(O)C(O)C1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 JXCKZXHCJOVIAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150048714 75 gene Proteins 0.000 description 1
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 1
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 1
- 241001312221 Anthurium Species 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000726103 Atta Species 0.000 description 1
- 241000786798 Atya Species 0.000 description 1
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 1
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000219310 Beta vulgaris subsp. vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000000536 Brassica rapa subsp pekinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000499436 Brassica rapa subsp. pekinensis Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 244000000626 Daucus carota Species 0.000 description 1
- 235000002767 Daucus carota Nutrition 0.000 description 1
- 239000005504 Dicamba Substances 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 101001091269 Escherichia coli Hygromycin-B 4-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000004005 Nypa fruticans Species 0.000 description 1
- 235000005305 Nypa fruticans Nutrition 0.000 description 1
- 101150053185 P450 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 231100000674 Phytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 241000710078 Potyvirus Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 108700005079 Recessive Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000052708 Recessive Genes Human genes 0.000 description 1
- 101150098533 SOST gene Proteins 0.000 description 1
- BFBNYRRHXRBIIO-UHFFFAOYSA-N SSOSS Chemical compound SSOSS BFBNYRRHXRBIIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 101001091268 Streptomyces hygroscopicus Hygromycin-B 7''-O-kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000021536 Sugar beet Nutrition 0.000 description 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 108091027569 Z-DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 150000001447 alkali salts Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 101150008083 ant gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 101150067977 ap gene Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- RYXHOMYVWAEKHL-UHFFFAOYSA-N astatine atom Chemical compound [At] RYXHOMYVWAEKHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940058679 baza Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000006900 dealkylation reaction Methods 0.000 description 1
- IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N dicamba Chemical compound COC1=C(Cl)C=CC(Cl)=C1C(O)=O IWEDIXLBFLAXBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000010191 monoecy Effects 0.000 description 1
- HOEFWOBLOGZQIQ-UHFFFAOYSA-N morpholin-4-yl morpholine-4-carbodithioate Chemical compound C1COCCN1C(=S)SN1CCOCC1 HOEFWOBLOGZQIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005562 seed maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 101150024950 sstT gene Proteins 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940124530 sulfonamide Drugs 0.000 description 1
- 150000003456 sulfonamides Chemical class 0.000 description 1
- YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N sulfonylurea Chemical class OC(=N)N=S(=O)=O YROXIXLRRCOBKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000010144 wind-pollination Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8233—Female-specific, e.g. pistil, ovule
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/829—Female sterility
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Botany (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Physiology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pretreatment Of Seeds And Plants (AREA)
- Seeds, Soups, And Other Foods (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
Опис винаходу
Ця заявка затверджує права попередньої заявки США Моб60/039527, зареєстрованої З березня 1997 року. 2 Галузь винаходу
Цей винахід стосується одержання гібридного насіння рослин. Зокрема, винахід стосується способу одержання гібридного насіння, використовуючи як одну батьківську рослину гібриду рослину, трансформовану рекомбінантним геном, який, якщо експресується в жіночих репродуктивних структурах, дає протеїн, що каталізує перетворення застосовуваного екзогенно прототоксину на токсин, таким чином роблячи запліднення неефективним. Винахід також стосується використання умовно-стерильних жіночих рослин разом з умовно-стерильними чоловічими рослинами для більш продуктивного одержання гібридного насіння; рекомбінантних геномів, корисних для винаходу; трансгенних рослин, що містять рекомбінантні геноми; та нових промоторів, корисних для експресії в жіночих репродуктивних структурах рослини.
Рівень техніки 19 Значну увагу привертає гетерозис в сільськогосподарських культурах завдяки його помітному впливу на збільшення врожаю. Підвищена продуктивність при схрещуванні різних сортів кукурудзи була вперше виявлена наприкінці 19 сторіччя і відтоді розвивалася згідно з методичними генетичними процедурами. Звичайним способом для підвищення врожаю гібридної кукурудзи є створення багатьох інбредних ліній, одержання інтеркросів і визначення, які гібриди є більш продуктивними в певній місцевості.
Успіх гібридної кукурудзи став причиною для селекціонерів рослин для вивчення існування та важливості гібридної сили в багатьох інших видах, які є економічно важливими. Загалом, гібриди виявляють підвищений вихід врожаю в порівнянні з негібридними сортами. Гібриди зазвичай більш придатні для використання факторів росту і дають більший ефект на одиницю факторів росту, таких як вода та добриво. В стресових умовах гібриди загалом мають перевагу над батьківськими сортами за рахунок більш стабільної продуктивності в широкому с 29 діапазоні умов навколишнього середовища. Гібридам властива одноманітність насіння або плодів та термінів Ге) достигання, що часто полегшує збирання врожаю та підвищує цінність продукції на ринку. Гібрид може також поєднувати риси, які важко або неможливо поєднати іншим способом. Це особливо стосується багатьох міжвидових та міжродових гібридів. Загальним висновком з дослідження є те, що гібридна сила, звичайний феномен рослин, має достатню значимість для виправдання комерційного використання за умови винайдення о 30 відповідних способів. -
Протягом багатьох років гібридну силу визначали як широкорозповсюджений феномен рослин і тварин.
Комерційні гібриди багатьох сільськогосподарських культур широко використовуються. До них належать о кукурудза, сорго, цукровий буряк та соняшник. Інші широко використовувані сільськогосподарські культури, такі со як пшениця, овес та рис, й досі вирощуються головним чином як інбредні сорти. Дослідження проводяться на
Зо цих й інших сільськогосподарських культурах, що може дозволити широке використання комерційних гібридів у - майбутньому, але головним обмежуючим фактором в розвитку нової гібридної сільськогосподарської культури є брак способів економічного одержання гібридного насіння для цих сільськогосподарських культур.
Традиційне масове одержання гібридного насіння здійснюється висадженням окремих рядків або блоків « жіночих батьківських ліній і чоловічих батьківських ліній для їх запилення. Збирають лише насіння з жіночих З 40 батьківських рядків. Для того, щоб переконатися, що це насіння є гібридним насінням без домішок власного с насіння, повинні застосовуватися способи контролю за запиленням жіночих батьківських рослин для того, Щоб з» переконатися, що насіння, яке утворилося на них, є результатом перехресного запилення, а не самозапилення.
До відомих способів контролю за запиленням належать механічні, хімічні або генетичні.
Видалення здатного до запилення пилку з жіночих батьківських рослин може бути досягнуто ручним 45 каструванням у деяких однодомних видів, таких як кукурудза. Таке видалення здатного до запилення пилку і досягається за допомогою висмикування або відрізання чоловічих суцвіть (волоті) у рослин з жіночої оз батьківської популяції. Ця проста процедура запобігає самозаплідненню механічною обробкою жіночих рослин перед тим, як пилок почне розповсюджуватись. Проте, більша частина корисних сільськогосподарських рослин о мають функціональні чоловічі та жіночі органи в одній квітці, що робить кастрацію нездійсненною. Навіть, де -І 20 це й можливо, ця форма одержання гібридного насіння потребує важких людських зусиль і, таким чином, є дорогою. Для того, щоб уникнути використання людської праці, необхідної для запобігання самозапліднення у с гібридних ліній, у деяких видів були використані генетичні фактори, які обумовлюють чоловічу стерильність.
Чоловічу стерильність у жіночих батьківських рослин можна контролювати генами ядра або цитоплазматично-генетичною системою. Генетична чоловіча стерильність контролюється генами ядра, в яких алелі стерильності, як правило, є рецесивними стосовно алелей родючості.
ГФ) Генетична чоловіча стерильність зустрічається у багатьох видів. Звичайно, вона контролюється одним рецесивним геном, що повинен бути гомозиготним для того, щоб викликати чоловічу стерильність. Селекціонери, о які використовують генетичну чоловічу стерильність для одержання гібридного насіння, звичайно одержують фенотипічно однорідну жіночі лінію, що дає 5095 чоловічих стерильних і 5095 здатних до запилення чоловічих 60 рослин. Вихід насіння для цих ліній підвищують відокремленням, збираючи насіння з рослин, гомозиготних на ген чоловічої стерильності, що запилюються рослинами, гетерозиготними на ген чоловічої стерильності, і, отже, здатними до запилення. Для одержання комерційного гібридного насіння з генетичною чоловічою стерильністю 506 жіночих рослин із здатними до запилення чоловічими органами потрібно видалити з поля як тільки їх фертильність можна буде визначити. Потреба у застосуванні людської сили для відокремлення фертильних бо рослин від жіночих рослин значно обмежує використання генетичної чоловічої стерильності при одержанні гібридного насіння. Існує кілька проблем, пов'язаних з цією системою одержання комерційного гібридного насіння. По-перше, не можна відокремити фертильні рослин від бажаних стерильних чоловічих рослин серед жіночої популяції. Генетичні стерильні чоловічі рослини потрібно зберігати, схрещуючи їх з фертильними
Чоловічими рослинами. Половина РЕ. рослин від такого схрещування була б стерильною, але решта рослин була б фертильною. Таким чином, небажані фертильні чоловічі рослини серед популяції жіночих рослин можуть розповсюджувати пилок і зменшувати вихід бажаних чоловічих батьківських рослин.
Успішне використання цитоплазматичної чоловічої стерильності для комерційного одержання гібридного насіння потребує стабільної стерильної чоловічої цитоплазми, відповідного джерела пилку і ефективної системи 7/0 перенесення пилку з чоловічих батьківських рослин на стерильні чоловічі жіночі рослини. До того ж, цитоплазматично-генетична система чоловічої стерильності потребує трьох ліній для одержання одного схрещуваного гібриду; А лінії (стерильна чоловіча), В лінії (фертильна чоловіча підтримуюча) і К лінії (фертильна чоловіча з відтворюючими генами). Одержані трьома шляхами чоловічі стерильні цитоплазматично-генетичні продукти схрещування включали підтримання і одержання чотирьох ліній, А і В лінії з однієї інбредної й фертильні чоловічі інбредні з інших двох.
Крім того, гниль кукурудзи, викликана НеїІтіпіпозрогішт таудіз, Касе Т., яка сильна пошкоджує гібриди кукурудзи з цитоплазматичною стерильною чоловічою Т-цитоплазмою, виявляли чутливість до одержання гібридного насіння промисловим чином, основаним на одному джерелі стерильної чоловічої цитоплазми. Для гібридної кукурудзи більша частина виробників насіння повернулась до ручної або механічної кастрації і 2о Запилення вітром.
Гібридне насіння можна також одержати, використовуючи хімікати, що блокують або вбивають утворення життєздатного пилку. Ці хімікати, що мають назву гаметоциди, використовуються для створення короткочасної чоловічої стерильності. Проте, вартість, придатність хімікатів і надійність застосування обмежують одержання гібридного насіння через використання гаметоцидів. с
Були також описані молекулярні способи одержання гібридного насіння. Такі способи трансформують рослини конструктами, що містять антисмислову ДНК й інші гени, які здатні контролювати утворення здатного до і) запилення пилку в рослинах. Такі регенеровані рослини є функціонально стерильними чоловічими рослинами і використовуються для одержання гібридного насіння схрещуванням з пилком фертильних чоловічих рослин.
Головними недоліками цих підходів є те, що вставлений за допомогою генетичної інженерії ген чоловічої о
Зо стерильності, що є антисмисловою послідовністю або РНКазою, може зберігатися лише в гетерозиготному стані.
Вони є фундаментально такими ж, що і природні генетичні чоловічі стерильні рослини в тому, що їх треба - підтримувати схрещуванням з ізогенними чоловічими фертильними лініями. Це є найбільшою проблемою на полі о для схрещування гібридів, де площа велика і вихід обмежений. Гетерозиготні жіночі батьківські рослини, з яких лише 5095 будуть чоловічими стерильними рослинами, потрібно висаджувати в рядки поруч з чоловічими о батьківськими рослинами, які є донорами пилку, і 5095 фертильних жіночих батьківських рослин потрібно М видалити Це легше здійснити на створених за допомогою генної інженерії чоловічих стерильних рослинах, тому що ген резистентності до гербіциду може бути з'єднаний з геном чоловічої стерильності, і розбризкування гербіциду може бути використане для видалення фертильних рослин, але все ж таки це значить, що жіночі батьківські рядки потрібно висаджувати в подвійній кількості для того, щоб одержати такий самий вихід на акр « нашої системи. Це викликатиме деяке зменшення виходу внаслідок конкуренції. Розбризкування гербіциду також пл) с обумовлює зменшення виходу, тому що резистентні рослини ніколи не матимуть 10095 захисту від гербіциду, і витрати на розбризкування гербіциду будуть відчутними. ;» Недоліком цих традиційних систем одержання гібридного насіння є потреба у висаджуванні окремих рядків або блоків чоловічих і жіночих батьківських ліній. Фізична відстань між донорами чоловічого пилку і жіночими рослинами - реципієнтами пилку приводить до зменшення ефективності перенесення пилку, поганого утворення -І насіння на жіночих батьківських рослинах, потреби у застосуванні більших площ для одержання рослин-донорів пилку та зменшення виходу гібридного насіння на одиницю площі. Цей недолік є особливо гострим при о вирощуванні сільськогосподарських видів, таких як пшениця, що вивільнює малу кількість пилку, і пилок не о ефективно переноситься вітром. Традиційні способи одержання гібридного насіння при застосуванні до пшениці потребували від однієї третьої до двох третіх поля для одержання чоловічих рослин-донорів пилку (доппзоп і
Ш- Зсптіаї, Адм. Адгопоту 20:199-233 (1968); МУйївоп, Ріапі Вгеедіпд Кеміемв 303-309 (1989)). Результатом є о занадто висока вартість одержання насіння гібридної пшениці, що робить таке одержання неможливим, незважаючи на наявність способів одержання гібридного насіння та доведений гетерозис.
Щоб досягти більш економічного одержання гібридного насіння для пшениці й інших сільськогосподарських ов Культур, необхідно звести чоловічі і жіночі батьківські рослини ближче одну до одної, щоб зробити перенесення пилку більш ефективним. Чоловічі і жіночі батьківські рослини потрібно пересаджувати в тих самих рядках на (Ф, відстань, що складає сантиметри, ніж висаджувати в окремі блоки рядків так, щоб насіння можна було збирати ка лише з жіночих батьківських рослин. Оскільки не можливо здійснити збирання насіння лише з жіночих батьківських рослин, коли вони так щільно розташовані, необхідно запобігти утворенню життєздатного насіння на бор чоловічих батьківських рослинах та запобігти утворенню життєздатного пилку на жіночих батьківських рослинах.
Одним способом запобігання утворенню життєздатного насіння є використання жіночих стерильних рослин.
Жіноча стерильність, що зустрічається в природі, була виявлена у кількох сільськогосподарських культур (Нопта апа Раїак, удойгпа! ої Негеайу 55:143-145 (1964); Зпіегдо апа МУіпіагсгуК, Ргоїоріазта 187:31-38 (1995);
Уивіиз апа Меуег, доцгпа! ої Негеййу 54:167-168 (1963); Наппа апа РомеїІЇ, доигпа! ої Негеайу 65:247-249 65 (1974); Вгом/п апа Віпопат, Стор Зсіепсе 24:1207-1208 (1984)), але існують проблеми в підтриманні цих ліній, і вони комерційно не використовуються. Спосіб побудови домінантного гена жіночої стерильності був описаний
(ЕР 412006 А1 (1990); Соідтап еї аІ., ЕМВО доишгпа! 13.2976-2984 (1994)), але знову підтримання стерильної жіночої лінії, що містить цей ген, є проблематичним завдяки неспроможності створити лінію, гомозиготну по гену жіночої стерильності. Був описаний спосіб підтримання і використання цього гена жіночої стерильності при одержанні гібридного насіння (ЕР 402270 (1990)). Проте, цей спосіб потребує введення гена жіночої стерильності, гена-відтворювача першого гена чоловічої стерильності, другого гена чоловічої стерильності і двох генів резистентності до гербіцидів з комплексі серій послідовних трансформацій для створення жіночо-стерильної чоловічої батьківської лінії, і він потребує введення першого гена чоловічої стерильності, гена-відтворювача гена жіночої стерильності і гена резистентності до гербіциду в комплексі серій послідовних 70 трансформацій для створення чоловічо-стерильної жіночої батьківської лінії. Обробка гербіцидом потрібна для відбору вірних генотипів в кожному циклі збільшення ліній, і для одержання гібридного насіння поле для одержання потребує обробки одним з гербіцидів для видалення небажаних генотипів, які утворюються внаслідок процесу. Хоча вищезгадана система могла б мати економічну перевагу завдяки пересаджуванням чоловічих і жіночі ліній, вона все ж є занадто складною для комерційного використання.
Таким чином, існує потреба у простому, економічному способі для одержання гібридного насіння.
Короткий опис винаходу
Цей винахід пропонує спосіб одержання гібридного насіння, що складається з одержання умовних жіночих стерильних рослин, які містять промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, функціонально з'єднаний з кодуючою послідовністю, яка кодує фермент, що каталізує перетворення прототоксину на токсин; 2о висадження умовної жіночої стерильної рослини з чоловічою стерильною рослиною; індукції жіночої стерильності застосуванням прототоксину на умовну жіночу стерильну рослину; і одержання гібридного насіння. У одному кращому втіленні винаходу рослину або піддають звичайному самозапиленню або звичайному перехресному запиленню. В особливо кращих втіленнях рослину вибирають з групи, що складається з кукурудзи, пшениці і ячменю. Винахід також пропонує гібридне насіння, одержане способом винаходу. с
Винахід також пропонує експресійну касету, що складається з промотору, активного переважно в жіночих репродуктивних органах, функціонально з'єднаного з кодуючою послідовністю, яка кодує фермент, що каталізує і) перетворення прототоксину на токсин. У кращому втіленні промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, функціонально з'єднаний з кодуючою послідовністю гена агоЕ. У кращих втіленнях до промоторів, активних переважно в жіночих репродуктивних органах, належить промотор з В200і4-2 клону, Р2б (со зо клону або Р19 клону. У особливо кращому втіленні промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, є промотором з В200і4-2 клону або Р19 клону, функціонально з'єднаний з кодуючою послідовністю агоЕ. -
До додаткових втілень кодуючих послідовностей, корисних у винаході, належать ті, що одержані з гена (су
Р4АБОу-монооксигенази і гена репА.
Винахід також пропонує рослини, що містять експресійну касету, яка складається з промотору, активного о з5 переважно в жіночих репродуктивних органах, функціонально з'єднаного з кодуючою послідовністю, яка кодує (р. фермент, що каталізує перетворення прототоксину на токсин, і насіння таких рослин.
Ще одним об'єктом винаходу є використання прототоксину у способі індукції жіночої фертильності в рослині, яка містить промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, функціонально з'єднаний з кодуючою послідовністю, яка кодує фермент, що каталізує перетворення прототоксину на токсин, і індукції «
Жіночої стерильності застосуванням прототоксину до рослини. в с Іншим об'єктом винаходу є використання кодуючої послідовності гена агдаЕ у способі одержання гібридного . насіння, де кодуюча послідовність агдЕ функціонально з'єднана з промотором, активним переважно в жіночих а репродуктивних органах, який при експресії каталізує перетворення прототоксину на токсин, таким чином індукуючи жіночу стерильність.
Опис винаходу -І Визначення та термінологія
Термін "жіноча репродуктивна структура", який використовується в цьому винаході, визначає ті частини о рослини, які містять плодолистик або гінецей (давнім усталеним терміном, використовуваним стосовно гінецею, о був "маточка"). Плодолистик квітки рослини включає, крім іншого, приймочку, стовпчик, зав'язь і клітини або 5ор тканини, які містять приймочку, стовпчик і зав'язь Як використовується в цьому винаході, "промотор, активний ш- переважно в жіночих репродуктивних органах" - це промотор, що має транскрипційну активність лише або о головним чином в одній або кількох клітинах або тканинах жіночої репродуктивної структури рослини. "Експресійна касета", як використовується в цьому винаході, - це послідовність ДНК, здатна спрямовувати експресію гена в клітинах рослин, що містять промотор, функціонально з'єднаний з ділянкою, що кодує дв послідовність амінокислот, яка функціонально з'єднана з ділянкою термінації. Ген може бути рекомбінантним, це означає, що принаймні один компонент гена є гетерологічним стосовно принаймні одного іншого компонента
Ф) гена. Ген може також зустрічатися в природі, але той, що був одержаний в рекомбінантній формі, корисній для ка генетичної трансформації рослини. "Прототоксин", як використовується в цьому винаході, - це хімічна речовина з мінімальною фітотоксичністю, бор що може бути активована дією ферменту з утворенням продукту реакції, що є токсичним для клітин рослини або порушує функції клітин рослини способом, достатнім для затримання, пригнічення або запобігання нормальному росту, розвитку або метаболічній активності. Токсичний продукт реакції в цьому винаході має назву "токсин." У винаході прототоксин застосовують екзогенно до рослини, що може бути здійснено будь-якими засобами, які сприяють поглинанню листям і коренем, прямому контакту з потрібними частинами рослини або переміщенню з 65 однієї частини рослини до іншої. "Жіноча фертильність", як використовується в цьому винаході, означає, що жіночі репродуктивні структури рослини здатні підтримувати утворення життєздатного насіння при запиленні функціональним або життєздатним пилком. "Жіноча стерильність", як використовується в цьому винаході, означає, що жіночі репродуктивні структури рослини не здатні підтримувати утворення життєздатного насіння при запиленні функціональним або Життєздатним пилком. "Умовна жіноча стерильність", як використовується в цьому винаході, означає, що жіноча стерильність проявляється при екзогенному застосуванні прототоксину, який після цього активується ферментом з утворенням токсичного продукту реакції. "Чоловіча стерильність", як використовується в цьому винаході, означає, що чоловічі репродуктивні структури рослини нездатні утворювати життєздатний або функціональний пилок. 70 Регулювання жіночої фертильності рослин
Одним з корисних аспектів цього винаходу є використання його для регулювання утворення життєздатного насіння рослин в польових умовах шляхом контролю жіночої фертильності. Фертильність жіночих структур можна регулювати одержанням трансгенної рослини, що містить складену або рекомбінантну нуклеотидну послідовність, яка кодує фермент, що каталізує перетворення прототоксину на токсин, який, якщо експресується 7/5 Під контролем промотору, активного переважно в жіночих репродуктивних органах, робить жіночі репродуктивні структури нездатними до утворення життєздатного насіння при екзогенному застосуванні прототоксину. Як було згадано вище, трансгенним рослинам властива умовна жіноча стерильність, оскільки жіноча стерильність регулюється присутністю прототоксину. Перетворення прототоксину на токсин в репродуктивних структурах жіночої рослини змогло б запобігти утворенню життєздатного насіння за допомогою кількох механізмів залежно
Від того, коли, і в яких клітинах або тканинах промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, знаходиться в активованому стані. Запобігання утворенню життєздатного насіння можна дося/гти, крім іншого: 1) порушенням нормального розвитку маточки так, що маточка більше не буде спроможною до запліднення, 2) інгібуванням проростання пилку в маточку утвореним токсином, 3) порушенням розвитку життєздатних гамет і 4) порушенням розвитку насіння після запліднення. с
В одному втіленні цього винаходу прототоксин застосовують екзогенно на трансгенні рослини в польових умовах, і перетворення прототоксину на токсин відбувається в жіночій репродуктивній структурі. Утворенню і) життєздатного насіння запобігає дія токсину в жіночій репродуктивній структурі.
Кодуючі послідовності та прототоксини, корисні в цьому винаході
До корисних кодуючих послідовностей винаходу належить, крім іншого, будь-яка послідовність, яка кодує о зо протеїн, здатний перетворювати прототоксин на токсин. Ці кодуючі послідовності можуть бути гомологічного або гетерологічного походження. -
В одному кращому втіленні кодуюча послідовність гена агоЕє функціонально з'єднана з промотором, активним (су переважно в жіночих репродуктивних органах. Експресія цього рекомбінантного гена в трансгенній рослині приводить до виникнення умовної жіночої стерильності в присутності прототоксину М-ацетилфосфінотрицину ме) (М-ацетил РРТ). Продуктом гена агоЕ є М-ацетил-і -орнітин-деацетилаза Е. соїї, яка має широку специфічність до ї- гідролізу субстратів типу К-СО-МН-СН(СН 2)-К2)-СООН. Внаслідок цієї активності продукт гена агдЕ каталізує перетворення прототоксину ацетил-фосфінотрицину на токсин фосфінотрицин (РРТ) (Кієїе еї аІ., Те Ріапі
Уошгпа! 9:809-818 (1996)).
В іншому кращому втіленні кодуюча послідовність гена Рі505у-монооксигенази, СРМУТО5А1, функціонально «
З'єднана з промотором, активним переважно в жіночих репродуктивних органах. Ця експресія приводить до в с виникнення умовної жіночої стерильності в присутності сульфонаміду прототоксину. Спрямування . РАБбБО5у-монооксигенази Зігеріотусевз дгізеойиз ов хлоропласт приводить до М-деалкілування сполуки и?» сульфонілсечовини К7402 (2-метилетил-2,2-дигідро-М-((4,6-диметоксипіримідин-2-іл)амінокарбоніл/)-1,2-бензотіазол-7-сульфонамід-1,1-діок бид і перетворює його на токсин (О'Кееге еї а!. Ріапі Рпузіоіоду 105:473-482 (1994)). -І У ще одному кращому втіленні кодуючу послідовність гена репА функціонально з'єднують з промотором, активним переважно в жіночих репродуктивних органах, і ця експресія приводить до проявлення умовної жіночої о стерильності в присутності прототоксину гліцерилгліфосату. Продукт гена репА ВигКпоїдегіа сайуорпійї штаму о РО2982 є гідролазою фосфонатного моноетеру, яка каталізує перетворення прототоксину гліцерилгліфосату на 5р токсин гліфосат (Ооївоп еї а!., Ріапі доигпа! 10:383-392 (1996). - Вищезгадані приклади наведені з метою ілюстрації, а не обмеження. Будь-яка кодуюча послідовність, яка о кодує фермент, що каталізує перетворення прототоксину на токсин, може бути використана у винаході за умови, що вона функціонально з'єднана з промотором, активним переважно в жіночих репродуктивних органах.
Промотори, корисні у цьому винаході
Для того, щоб здійснити винахід, бажано, щоб вищезгадані нуклеотидні послідовності, що кодують фермент, який каталізує перетворення прототоксину на токсин, були функціонально з'єднаними з 5 регуляторною (Ф, послідовністю, яка спрямовує експресію таким чином, що експресія відбувається переважно в жіночих ка репродуктивних структурах рослини Ця особливість експресії гарантує, що вплив експресованого ферменту буде здійснюватися лише в тих тканинах або клітинах, які необхідні для утворення життєздатного насіння, і не буде бо завдавати шкоди рослині окрім впливу на фертильність.
До промоторів, активних переважно в жіночих репродуктивних структурах рослини, корисних в цьому винаході, належать, крім іншого: промотори дводольних, такі як модифікований 513 промотор (ЮО2еїКаїпз: еї аї|..
Ріапі СеїЇ 5:855 (1993)), промотор тютюну ді (Соідтап еї аі., ЕМВО 4). 13:2976-2984 (1994)), промотор АСІ 5 (бамідде еї аї.. Ріапі Сеїї 7:721-733 (1995)) і промотор тютюну ТТ51 (Спецпод еї аї.. СеїЇ 82:383-393 (1995)). 65 Всі вищезгадані промотори були перевірені і виявились функціональними в трансгенних рослинах. До промоторів однодольних належить промотор плодолистик-специфічного гена 27АС2 кукурудзи (ТПіеззеп е: аї.,
Сепе 156:155-166 (1995)).
Крім того, послідовності промоторів в геномній ДНК, що експресуються переважно в жіночих репродуктивних структурах, можна виділити за допомогою кДНК, відомої в галузі. До таких промоторів належать, крім іншого, промотори генів Ебр7 і РбБр11 Агабрідорзів (Апдепепі еї аї.. Ріапі СеїЇ 7:1569-1582 (1995)) і жіноче-специфічні
КДНК орхідеї 040, 0108, 039, 0126 і 0141 (Мадеаи еї! а/ї., Ріапі Сеї! 8:213-239 (1996)).
Гени, які експресуються переважно в жіночих репродуктивних органах, корисні для певних видів рослин, можуть бути клонованими за допомогою виділення нових транскриптів, що експресуються в жіночих тканинах, використовуючи способи, відомі фахівцям у галузі. Ці способи включають виділення РНК з жіночих тканин, таких /о0 як волоть кукурудзи або маточки пшениці і диференційний скринінг способами, такими як диференційне проявлення, вибране за допомогою РСК вирахування кДНК і субтрактивне створення бібліотеки кДНК для виділення клонів КДНК, що експресуються переважно в жіночих тканинах, а не в інших частинах рослини, таких як листок, корінь або китиця. Тканинна специфічність цієї клонованої КДНК може бути підтверджена
Нозерн-блотингом. Послідовності промоторів клонів, що екс пресуються переважно в жіночих репродуктивних 7/5 структурах, можуть бути одержані, використовуючи виділені нові кКДНК як зонди для скринінгу бібліотеки геному.
Можуть бути виділені геномні клони, які містять 5'їі 3' регуляторні послідовності, необхідні для експресії в жіночій тканині. Ці послідовності можуть бути використані для створення експресійних касет для експресії рекомбінантних генів переважно в жіночих тканинах.
Інші регуляторні елементи, корисні у винаході 5 регуляторна ділянка експресійної касети може також містити інші енхансерні послідовності. Було виявлено, що багато послідовностей підсилюють експресію генів в трансгенних рослинах. Наприклад, відомі кілька лідерних послідовностей вірусів, що не підлягають трансляції, які підсилюють експресію. Зокрема виявилось, що лідерні послідовності вірусу мозаїки тютюну (ТММ, "М/-послідовність"), вірусу зеленої мозаїки кукурудзи (МСМУ) і вірусу мозаїки люцерни (АМУ) є ефективним для підсилення експресії (наприклад, Саїїс еї сч ов а. Мисі. Асійв Кев. 15:8693-8711 (1987); ЗКигевзкі еї а. Ріапі Моїес. Віої. 15:65-79(1990)). До інших лідерних послідовностей, відомих у галузі, належать, крім іншого: (8)
Лідерні послідовності пікорнавірусу, наприклад, лідерна послідовність ЕМСМ (енцефаломіокардитна 5-некодуюча ділянка) (ЕІгоу-5іеїп, О., Ецегві, Т.К., апа Могз, В. РМАБ ОА 86:6126-6130 (1989));
Лідерні послідовності потівірусу, наприклад, лідерна послідовність ТЕМ (вірус гравіювання тютюну) о зо ХАїїївоп еї аїі., (1986); лідерна послідовність МОМУМ (вірус карликовості та мозаїчності кукурудзи); Мігоіоду, 154:9-20); -
Лідерна послідовність протеїну, що зв'язується з важкими ланцюгами імуноглобуліну людини (ВіР), (Масе|ак, о
Юр. б., апа Загпому, Р., Майшге, 353: 90-94 (1991);
Лідерна послідовність, що не підлягає трансляції, з протеїну оболонки мРНК вірусу мозаїки люцерни (АММ ме)
РНК 4), (Ообіїпо, 5.А., апа Сенпгке, І, Майшге, 325:622-625 (1987); ї-
Лідерна послідовність вірусу мозаїки тютюну (ТММ), (Саїйс, О.К. еї аїЇ., Моіесціаг Віоду ої КМА, стор.237-256 (1989); і лідерна послідовність МСММ (Іоттеї, 5.А. еї аї., Мігоїоду, 81:382-385 (1991). Див. також, ЮеїПа-Сіорра еї а!. Ріапі Рпузіоіоду, 84:965-968 (1987).
Було виявлено, що різні інтронні послідовності підсилюють експресію при з'єднанні з 5'-регуляторною « ділянкою, зокрема в клітинах однодольних. Наприклад, було виявлено, що інтрони гена Ап кукурудзи значно з с підсилюють експресію гена дикого типу під його рідним промотором при введенні в клітини кукурудзи (Саїйїв еї . аі.. Сепез Юемеїіор. 1:1183-1200(1987)). и?» Крім промоторів, різні З'--термінатори транскрипції також можна використовувати в цьому винаході.
Термінатори транскрипції відповідають за термінацію транскрипції і вірне полі«аденілювання мРНК. До придатних термінаторів транскрипції і тих, які відомі як такі, що функціонують в рослинах, належать: термінатор Саму -І 355, термінатор Іті, термінатор нопалінсинтетаза, термінатор гро Е9ЗУ гороху та інші, відомі в галузі. Ці термінатори можуть бути використані як в однодольних, так і в дводольних рослинах. о Трансформація рослин о Експресійні касети цього винаходу можуть бути введені в клітину рослини кількома визнаними в галузі 5р шляхами. Фахівці в галузі розумітимуть, що вибір - способу залежатиме від типу рослини, тобто однодольної або дводольної, вибраної для трансформації. До о придатних способів трансформації клітин рослин належать, крім іншого, мікроін'єкція (Стгозвзмуау еї аї,
ВіоТссппідцез 4320-334 (1986)), електропорація (Кіддз еї аїЇ., Ргос. Май). Асай. 5сі. ОБА 83.5602-5606 (1986), опосередкована Адгорасіегішт трансформація (Ніпспее еї аї., Віоїесппоіоду 6:915-921 (1988)), пряме ов перенесення генів (Разакомузкі ебг а, ЕМВО У. 3:2717-2722 (1984)) та балістичне прискорення часток, використовуючи пристрої, які можна придбати в Адгасейи5, Іпс.; Мадисон, штат Вісконсін і ВіоКкайд, Геркулес, (Ф) штат Каліфорнія (див. наприклад; Запіога еї аії.,, патент США Мо4945050; і МсСабе еї аї., ВіоФесппоіоду ка 6:923-926 (1988)). Також. див., УУеіззвіпдег еї- аЇ., Аппиуаі! Кем. Сепеї. 22:421-477 (1988); Запога еї аї.,
Рапісціаїе Зсіепсе апа Тесппооду 5:27-37 (1987)(цибуля); СпНгівіои сеї аї.,, Ріапі РнНузіоІї. 87:671-674 во (1988)(соя); МесСаре сеї аї., Віоїесппоірду 6:923-926 (1988)(соя); Оаца еї а! Віобесппоіоду 8:736-740 (1990Урис); Ківій ей аЇ, Ргос. Май. Асай. Зсі. ОБА, 85:4305-4309 (1988)(кукурудза); Ківїп езаї.,
Віо/Гесппоіоду 6:559-563 (1988)(кукурудза); КіІеїп еї аїЇ., Ріапі РПузіої. 91:440-444 (1988)(кукурудза); Еготт ег аїЇ.,, Віо/Тесппоїоду 8:833-839 (1990)(кукурудза); і Согдоп-Катт ей аїЇ.,, Ріапі Се! 2:603-618 (1990)(кукурудза); Змар еї аЇ., Ргос. Май. Асад. Зсі. ОЮБА 87: 8526-8530 (1990)(хлоропласт тютюну); Колієї! еї 65 аІ., Віобїесппоіїоду 11: 194-200 (1993)(кукурудза); Зпітатоїо еї аіЇ., Майте 338: 274-277 (1989Хрис); СпНгізвіви еї аї.. Віоїесппоіоду 9: 957-962 (1991УХрис); Європейська патентна заявка ЕР 0 332 581, Но еї аї.
(огспгадгазз та інші Рооідеае); МавіїЇ еї аї., ВіоФесппоіоду 11: 1553-1558 (1993)Хпшениця); УУеекв еї аї.,
Ріапі Рпузіої. 102: 1077-1084 (1993)Хпшениця); УУап апа І етаих, Ріапі Рпузіо!. 104, 37-48 (1994)3(ячмінь).
Одна найкраща серія втілень для введення експресійних касет цього винаходу в кукурудзу бомбардуванням мікрочастками описана Патенті США, реєстраційний номер 08/008374, включеному сюди цілком шляхом посилання Ще одним кращим втіленням є спосіб трансформації протопласту кукурудзи, як описано в
Європейський патентній заявці ЕР 0292435 та в патенті США Мо5350689, включених сюди цілком шляхом посилання. Одна найкраща серія втілень для введення експресійних касет цього винаходу в пшеницю бомбардуванням мікрочастками описана в патенті США Мо5610042, включеному сюди цілком шляхом посилання. 70 Трансформація рослин може бути здійснена однією молекулою ДНК або багатьма молекулами ДНК (тобто, котрансформацією), і обидва ці способи придатні для використання з експресійними касетами цього винаходу.
Існує багато векторів для трансформації рослин і експресійні касети цього винаходу можуть бути використані разом з будь-яким з таких векторів Вибір вектора залежатиме від вибраного способу трансформації і вибраних видів для трансформації.
Існує багато векторів для трансформації, що використовують Адгорасіегішт (Штегїасіепв. Ці вектори типово містять принаймні одну Т-ДНК граничну послідовність, а також вектори, такі як рВІМ19 (Вемап, Мисі Асіаз Кез. (1984)). В одному кращому втіленні експресійні касети цього винаходу можуть бути вставлені в обидва з бінарних векторів рСІВ20О0 і рСІВ2001 для використання з Адгорасіегішт. Ці векторні касети для
Адгорасіепит-опосередкованої трансформації створювали наступним чином ріуБ/б5Ккап створювали 2о розщепленням Маг ргуУз7/5 (Зсптіапайзег 8 НеїїпеКі, У Васіегіо!. 164: 446-455 (1985)), дозволяючи вирізання гена резистентності до тетрацикліну, після чого проводили вставлення фрагмента Ассі з рОС4К, що несе МРТІЇ (Меззвіпд 5 Міета, Сепе 19: 259-268 (1982), Вемап еї аЇ., Майшге 304-184-187 (1983); МеВгіде еї аї., Ріапі
Моїіесшіаг Віоіоду 14: 266-276 (1990)) Хпо! лінкери приєднували до фрагмента ЕсокМ рсСіВ?7, який містить лівий і правий кінець Т-ДНК, рослино-селективний рекомбінантний ген поз/пріїй і полілінксер рОС (КоїПпзіевїп еї аї., сч об бЗепе 53: 153-161 (1987)) та ХПпоІ-розщеплений фрагмент клонували в Заїй-розщеплений ртОз7/5Кап для створення рСІВ200 |див. також Європейський патент (ЕР) Мо0332104, приклад 19). рСІВ200 містить наступні і) унікальні полілінкерні сайти рестрикції: ЕсокіІ, Зв, Крпі, Ваоїїї, ХриЇ ії ЗаїЇ. Плазміда рСІВ2001 є похідною рРСІВ200, яку створювали вставленням в "полілінкер додаткових сайтів рестрикції. Унікальними сайтами рестрикції в полілінкері рСІВ2001 є ЕсокКіІ, 580, Крпі, Воаїїї, Хваї, заї!Ї, Міш, ВеїЇ, Амгії, Араї, Нраї і о зо ЗМІ. рСІВ2О01, крім того, що містить ці унікальні сайти рестрикції також має рослинну й бактеріальну селекцію канаміцином, ліві та праві кінці Т-ДНК для Адгорасіегіпт-опосередкованої трансформації, - функціональну складову (ПА, похідну КК2, для мобілізації між Е. соїї та іншими хазяїнами й функціональні о складові Огії та ОгіМ також з КК2. Полілінкер рРСІВ2001 придатний для клонування рослинних експресійних касет, що містять свої власні регуляторні сигнали. ме)
Ще одним вектором, корисним для Адгобрасіегійт-опосередкованої трансформації, є бінарний вектор реСІВІО, ї- який містить ген, що кодує резистентність до канаміцину для селекції рослин, праві та ліві граничні послідовності Т-ДНК і містить послідовності з плазміди рКК252, придатної для використання в багатьох хазяях, дозволяючи їй реплікуватися в Е соїї і Адгорасіегічт. Його будова описана КоїНзівїп еї а)., Сепе 53: 153-161 (1987). Були створені різні похідні рСІВ10, які містять ген гігроміцин В-фосфотрансферази, описані Огії» еї « а, бепе 25: 179-188 (1983). Ці похідні дозволяють проводити селекцію трансгенних клітин рослини лише на з с гігромщині (рСІВ743) або гігроміцині та канаміцині (рСІВ715, рСІВ717).
Й Способи, в яких використовуються або форма прямого перенесення генів, або а Адгорасіегічт-опосередковане перенесення, зазвичай, але не обов'язково, втілюють з селективним маркером, який може надавати резистентності до антибіотику (наприклад, канаміцину, гігроміцину або метотрексату) або гербіциду (наприклад, фосфінотрицину). Вибір селективного маркера для трансформації рослини не є, однак, -І обмежуючим для винаходу, . якщо тільки експресія цієї резистентності та її біохімічна активність не впливає на вибір перетворення прототоксину на токсин, вибраний для використання при створенні умовної фертильності. о Для певних видів рослин можна використовувати різні селекційні маркери на антибіотик або гербіцид. До о селекційних маркерів, що зазвичай використовуються при трансформації, належать: ген пріїЇ, який надає 5р резистентності до канаміцину й споріднених антибіотиків (Меззіпуд 5 Міеіта, Сепе 19: 259-268 (1982); Вемап еї
Ш- аІ., Маїшге 304:184-187 (1983)), ген раг, який надає резистентності до гербіциду фосфінотрицину (МУпіе еї о аІ., Мисі Асідйз Кез 18:1062 (1990), Зрепсег еї аІ., Тпеог Аррі Сепеї 79:625-631(1990)), ген при, який надає резистентності до антибіотику гігроміцину (Віоспіпдег 5: Оіддеітапп, Мо! СеїІ Віої 4: 2929-2931), ген ант, який надає резистентності до метотрексату (Воцгоціз ей аі., ЕМВО). 2:1099-1104 (1983)), ген дв манозофосфатізомерази, який дозволяє проводити селекцію на манозі, як джерелі вуглецю (ЕР 530129, МО 94/20627). (Ф, Одним таким вектором, корисним для способу прямого перенесення генів разом з селекцією гербіцидом ка Вазіа (або фосфінотрицином), є рСІВ3064. Цей вектор оснований на плазміді рСІВ246, яка містить промотор
Самм 355 у функціональному з'єднані з геном 5ИЗ5 Е. сої і термінатором транскрипції Самм 355, та описаний у во РСТ опублікованій заявці МО 93/07278, включеній сюди шляхом посилання. Одним геном, корисним для надання резистентності до фосфінотрицину, є ген Баг із Зігеріотусевз Ппудгозсорісив (Тпотрзоп ейа!І.,, ЕМВО У 6: 2519-2523 (1987)). Цей вектор придатний для клонування експресійних касет для рослин, що містять свої власні регуляторні сигнали. Варто відмітити, однак, що використання гена раг як селективного маркера може заважати втіленню цього винаходу, якщо він також здатний експресуватися в жіночих репродуктивних структурах рослини. 65 Ця проблема може бути вирішена використанням промоторів, які регулюють, експресію в клітині або культурах тканин, використаних для трансформації, але не приводять до експресії гена Баг в жіночих репродуктивних структурах.
Іншим трансформаційним вектор є вектор ро/2 (Зпітатоїйо еї аіЇ. Майте 338, 274-276 (1989), який містить ген гігроміцинфосфотрансферази Зігеріотусез (прі), функціонально з'єднаний з послідовностями промотору 355 і термінатору 355.
Ще одним вектором для трансформації є реОС35, який використовує ген дигідрофолатредуктази Е. сої (ОНЕК) як селективний маркер, що надає резистентності до метотрексату. Використовували РСК для ампліфікації промотору 355 (-800п.н.), інтрону б з гена дані кукурудзи (-55О0п.н.) і лідерної послідовності, що не підлягає трансляції, 55 (18п.н.) з РОСІЮ. 250п.н фрагмент, що кодує ген дигідрофолатредуктази типу ЇЇ 7/0 ЕЕ. Соїї, також ампліфікували РСК ії ці два РСК-фрагменти з'єднували з фрагментом зЗасі-РзМ з рВІ221 (Сіопейфесі)), який містив основу вектора рист19 і термінатор нопалінсинтази. Складання цих фрагментів привело до утворення раОс19, яка містить промотор 355, з'єднаний з послідовністю інтрону 6, лідерну послідовність свИ5, ген ОНЕК і термінатор нопалінсинтази. Заміна лідерної послідовності 505 в реОС19 на лідерну послідовність МСММ привела до утворення вектора рвеОос35 реОс19 і рвОс35 несуть ген резистентності до ампіциліну, похідний від рОС, і мають Ніпайїїї, 5рАї, Рв і Есок) сайти, придатні для клонування чужорідних послідовностей.
Одержання гібридного насіння, використовуючи умовну жіночу стерильність
Для того, щоб одержати гібридне насіння без домішок насіння, створеного за допомогою самозапилення, повинні застосовуватись способи для запобігання самозапиленню жіночих батьківських рослин і перехресному 2о Запиленню чоловічими батьківськими рослинами. Це звичайно досягається механічними способами, генетичною чоловічою стерильністю або хімічними гібридизуючими агентами (СНА). Наприклад, для кукурудзи сучасним процесом є механічна обробка жіночої (або тієї, де утворюється насіння) батьківської рослини, і цей процес потребує багато часу і людських зусиль. У разі пшениці регулювання фертильності механічними засобами є нездійсненним з точки зору одержання насіння, а генетичні джерела чоловічої стерильності не створені сч ов Комерційно. Способи одержання гібридного насіння, основані лише на регулюванні запилення, потребують, щоб блоки чоловічих батьківських рослин були фізично відокремленими від блоків жіночих батьківських рослин, і) оскільки чоловічі батьківські рослини утворюватимуть насіння самозапиленням. Використання цього винаходу з метою одержання гібридного насіння пропонує переваги надійності, легкості використання і, що найбільш важливо, дозволятиме висаджування чоловічих і жіночих батьківських рослин разом, що приведе до більш о зо ефективного перенесення пилку, потреби в меншій кількості чоловічих батьківських рослин і більш економічного одержання гібридного насіння. -
Для того, щоб одержати гібридне насіння, використовуючи винахід, потрібна трансгенна батьківська рослина, (су яка експресує фермент, який каталізує перетворення прототоксину на токсин переважно в жіночих репродуктивних структурах. Одержання трансгенних рослин, що мають цей генотип, описане вище. Трансгенні о з5 рослини, що містять складені або рекомбінантні гени цього винаходу, можуть бути створені гомозиготними й ча підтримуватися необмежено довго, використовуючи загальноприйняті способи селекції рослин.
Також необхідною для одержання гібридного насіння згідно з винаходом є батьківська рослина, яка має чоловічу стерильність. Чоловіча стерильність - це недолік або нездатність утворювати життєздатний або функціональний пилок. Чоловіча стерильність може виникати від пошкоджень, що приводять до неутворення « пилку або браку функціональної здатності пилку при його формуванні. Таким чином, або пилок не утворюється, пт») с або, якщо й утворюється, то він або нежиттєздатний, або нездатний до ефективного запліднення за нормальних умов. з Відомо багато джерел чоловічої стерильності для використання в одержанні гібридного насіння (Каші, Маїе еегійу іп Ніднег Ріапів, Зргіпдег-Мепад (1988)) Гени цитоплазматичної чоловічої стерильності, що
Зустрічаються в природі, і їх використання були описані для кукурудзи (І еміпдз, Зсіепсе 250942-947 (1990), -І пшениці (Тогіуата еї аїЇ.,, ОУрп У Вгеей. 3:517-524 (1993)) тютюну (СегвієЇ еї аїЇ., Сепеїйїсв 89:157-169 (1978)), жита (Зіеіпрот сеї аїЇ., Тпеог Аррі. Сепеї. 85:822-824 (1993)) соняшника (СтгоцигіПаї еї аї., Ріапі о Мої. Віої. 16:415-426 (1991)), сої (Оамів, патент США Мо4763441 (1988)), Вгазвіса (Сгеіоп еї аїЇ.,, Мої Сеп. о Сепеї 243:540-547 (1994)), моркви (Кіадаула еї а), бех Ріапі Кергод 7:41-50 (1994)), сорго (Спеп еї аї., 5о РіапЕ Мої Вісї 28:799-809 (1995)), рису (Кадомакі еї аі., Мої. Сеп Сепеї 224 10-16 (1990)) і ячменю (Каші і ш- Біпдп, Суюбіоз 66 71-85 (1991)). о Також відоме створення складеного або рекомбінантного генів чоловічої стерильності. Було виявлено, що ген, який кодує Д-1,3-глюканазу, якщо експресується з промотору, активного лише в клітинах тапетуму пиляка, викликає чоловічу стерильність в трансгенних рослинах (УУогтаї еї аїі., Ріапі Сеї! 4:759-771 (1992)). Було показано, що ген, який кодує незмінений мітохондріальний ген аїро пшениці, викликає чоловічу стерильність, якщо експресується з конститутивним промотором Саму- 355 в трансгенних рослинах (Нетоціа еї а!, Ргос. Май. іФ) Асад. Зсі ОБА 902370-2374 (1993)). Було показано, що ген, який кодує фермент РНКазу, викликає чоловічу ко стерильність, якщо експресується з промотором, активним лише в клітинах тапетуму пиляка в трансгенних рослинах (ОеВіоск еї аЇ, Ріапі 189:218-225 (1993); ЕР Мо344029; Магіапі еї аЇ, Майте 347:737-741 (1990). бо Було показано, що експресія антизмістовної РНК, комплементарної до гена, є критичною для утворення пилку й викликає чоловічу стерильність в трансгенних рослинах (ЕР Мо513884). Крім того, існує багато інших промоторів, активних у чоловічих репродуктивних органах, що є добре відомими у галузі і можуть бути використані при створенні складених генів чоловічої стерильності. До цих промоторів належать промоторні послідовності для експресії в пилку, тапетумі або інших структурах пиляка. До прикладів промоторів, активних у чоловічих б5 репродуктивних органах, належать, крім іншого, промотор ГАТ52 (Тмеї еї а), Оем. 109 705-13 (1989), промотор А127 томатів (Ооївоп еї аї.Ріапі 9.10, 383-392. (1996)), промотор тод кукурудзи (Натійоп еї аї.
Зех.Ріапі Кергод. 2:08-212 (1989)) промотор СОРК кукурудзи (Сцегго еї аЇ.,, МоЇ. Сеп Сепеї. 224:161-168 (1990)), промотори апіз2 і апі430, активні у пиляках, описані в патенті США Мо5477002, включений сюди цілком шляхом посилання. Крім того, послідовності промоторів кКДНК, специфічних до пиляків, можуть бути клоновані за
Допомогою виділення відповідних геномних послідовностей ДНК і визначення промоторних регуляторних ділянок, наприклад, виділенням послідовностей промоторів для гена Р450, специфічного до стовпчика пиляка орхідеї (Мадеац еї аї., Ріапі СеїЇ 8:213-239 (1996)) і Вср1і Агарідорзіз (Хи ей а). Ргос. Май Асай. збі. 92:2106-2110 (1995)). Таким же, чином, нові гени, активні у чоловічих репродуктивних органах, можуть бути виділеними різними способами, такими як диференційне виявлення, кКДНК. виявлення РСК селекцією і 70 диференційний скринінг бібліотеки КДНК. Як тільки ці послідовності будуть ідентифіковані, відповідні геномні послідовності можуть бути виділені, промоторні ділянки характеризовані й ці послідовності потім використані як промоторні ділянки для створення експресійних касет, що експресуватимуться в чоловічих репродуктивних органах.
Вищезгадані штучні гени чоловічої стерильності мають недоліком те, що їх дія є конститутивною й 7/5 домінантною. Як тільки трансгенна рослина створена, вона назавжди стає стерильною по чоловічих репродуктивних органах, що робить підтримання рослинних ліній важким і неможливим для створення гомозиготної, справжньої рослинної лінії, що піддається селекції.
Були описані інші категорії генів чоловічої стерильності, в яких чоловічий стерильний фенотип є умовним.
У цій категорії, чоловіча фертильність порушується лише після застосування хімічного прототоксину. В одному прикладі умовної чоловічої стерильності був описаний ген, що кодує М-ацетил-! -орнітин-деацетилазу, яка каталізує перетворення прототоксину М-ацетил-! -фосфінотрицину на гербіцидний токсин І-фосфінотрицин (Кгівїе еї аї, Ріапі Хдоигпа! 9:809-818 (1996); ЕР Мо531716 А2 (1992)). Трансгенні рослини, що експресували цей ген в клітинах тапетуму пиляка, набували чоловічої стерильності лише після обробки прототоксином -
М-ацетил-! -фосфінотрицином. В іншому прикладі умовної чоловічої стерильності був описаний ген, що кодує сч бактеріальний цитохром Р4і50, який каталізує перетворення сульфонілсечовини прототоксину К7402 на гербіцидний токсин (МУО 91/03561; О'Кеете еї аї., Ріапі Рпузіоїоду 105:473-482 (1994)). Трансгенні рослини, що і) експресували цей ген в клітинах тапетуму пиляка, набували чоловічої стерильності лише після обробки прототоксином К7402. В іншому прикладі умовної чоловічої стерильності був описаний ген, що кодує гідролазу фосфонатного- моноетеру, яка каталізує перетворення прототоксину гліцерилгліфосату на гербіцидний токсин о зо Гліфосат (Ооївоп, еї аї., Ріапі у). 10: 383-392(96)). Трансгенні рослини, що експресували цей ген в клітинах тапетуму пиляка, набували чоловічої стерильності лише після обробки прототоксином гліцерилгліфосату. -
Будь-які з джерел чоловічої стерильності, описані вище або відомі в галузі, можуть бути застосованими в о цьому винаході. До цих джерел належить будь-яка чоловіча стерильна генетична система, що зустрічається в природі, або трансформований в певні жіночі батьківські лінії складений або рекомбінантний ген. ме)
Згідно з винаходом утворення життєздатного насіння запобігається в рослині з умовною жіночою ї- стерильністю (чоловіча батьківська рослина) внаслідок перетворення прототоксину на токсин у репродуктивних структурах жіночої рослини, і утворення пилку запобігається на рослинах з чоловічою стерильністю (жіноча батьківська рослина). Для одержання гібридного насіння гомозиготне насіння чоловічих батьківських рослин і жіночих батьківських рослин висаджують в полі, таким чином дозволяючи ефективне перенесення пилку. В « одному прикладі використання цього винаходу для одержання гібридного насіння, жіноча батьківська рослина є в с чоловіча стерильною внаслідок будь-яких засобів і чоловічу батьківську рослину піддають генній інженерії для утворення жіночої стерильності в присутності належно застосовуваного екзогенно прототоксину. Після ;» застосування прототоксину в певний час протягом розвитку рослину лише утворення життєздатного насіння буде результатом чоловічого батьківського (жіночою стерильного) пилку, запилюючого жіночі батьківські (чоловічі стерильні) насінні зачатки. У кращому способі-використання цього винаходу жіночу батьківську рослину -І піддають генній інженерії для виникнення чоловічої стерильності при застосуванні прототоксину, тоді як чоловічу батьківську рослину піддають генній інженерії для виникнення жіночої стерильності в присутності того о ж прототоксину. Для одержання гібридного насіння дві батьківські лінії висаджують разом і після застосування о прототоксину в певний час протягом розвитку рослини одержують лише гібридне насіння. За допомогою цих засобів може бути одержане будь-яке бажане гібридне насіння.
Ш- Для одержання гібридного насіння пшениці чоловічу батьківську рослину піддають генній інженерії для о виникнення жіночої стерильності в присутності належно застосовуваного екзогенно прототоксину і жіночу батьківську рослину піддають генній інженерії для виникнення чоловічої стерильності в присутності того ж прототоксину. Обидві трансгенні батьківські лінії роблять гомозиготними і кількість насіння збільшують ов стандартними методами в цій галузі. Для одержання гібридного насіння гомозиготне насіння підданих генній інженерії чоловічих і жіночих батьківських ліній висаджують разом у співвідношенні чоловічих до жіночих (Ф, рослин, визначеному для забезпечення ефективного запилення. В належний час протягом розвитку рослини ка прототоксин застосовують на полі для одержання насіння. Після дозрівання насіння збирають врожай на цілому полі, враховуючи лише гібридне насіння. во Приклади
Наступні приклади описують матеріали й способи, використані в здійсненні винаходу, і наступні результати.
Вони запропоновані шляхом ілюстрацій, і їх перерахування не повинно вважатися обмеженням винаходу.
Приклад 1: Рослини тютюну, які є умовними по жіночій стерильності
Створювали плазміду реНн5в8, що містила АЗ13 промотор (від -339 до -79 промотору ЗІ О.43, з'єднували з б5 Від -46 до «8 промотору Самм 355, ОгеїкаІнв еї аї, Ріапі сеїї 5: 855-863 (1993)) і з'єднували з геном аю9єЕ (ПОСЛІДОВНІСТЬ Мо3) у вірній трансляційній рамці зчитування Д5З13 промотор - це промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах.
Ген агЕ одержували з геномної ДНК Е.сої за допомогою РСК реакцій з праймером 5-ТАТСТАСАССАСАООТОТОТСААСААДАТОАА-З3 (послідовність Мо5) і праймером 5-ССТСТАСАТТОСООСАСТОСАСТТТО-3 (послідовність Моб). Створений фрагмент клонували в рОєЕМ-ТА (Зігабедепе) і підтверджували вірність послідовності. Використовуючи цикли РСК і етапи субклонування, розміщували рослинну трансляційну консенсусну послідовність і сайт Ватні вище сайту початку трансляції агоЕ, використовуючи РСК праймери, ЗСОСОЗАТССТАААСААТОААДАААСАААТТАССОСС-3! (послідовність Мо?7) і
ССОССТАвОСОСТТААТОССАССААДААТССО-3 (послідовність Мо8) Цей продукт потім приєднували нижче 7/0 промотору АЗІЗ в плазміді рЗ3НІ5 (промотор АЗ1З в рійсзспрі 5К) і термінатор транскрипції поз додавали до
З' кінця гена р-глюкуронідази (505). Цю д513-агдЕ-пов касету потім приєднували як фрагмент ЕсоК1 в рСІВ200, що містить кінці Т-ДНК і функціональний в рослинах селективний маркер, такий як резистентність до канаміцину.
Ця плазміда мала назву рензгв.
Плазміду рЕАТ00 створювали таким же чином, що й рзН5Бв8, описану вище, за винятком того, що ген агзє 75 (послідовність Мо3) замінює ген БИ5 в 091-505 (Соідтап еї аі., ЕМВО 3. 13:2976-2984 (1994)) у вірній трансляційній рамці зчитування, використовуючи належні ферменти рестрикції. ЗТІС1-агдЕ потім приєднують у вектор, такий як рСІЗ200, що містить кінці Т-ДНК, 3" послідовності термінації й функціональний в рослинах селективний маркер, такий як резистентність до канаміцину. Промотор 5091 - це промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах.
Листкові диски тютюну трансформували, як описано в Ногзгсі еї аї, Зсіепсе 227:1229-1231 (1985), плазмідою рзн58. Присутність вставлених трансгенів підтверджували РСК. Нозерн-блотинг РНК, одержаної з жіночої тканини, використовували для підтвердження тканино-специфічної експресії гена агдоЕ в трансгенних рослинах.
Ці рослини були самофертильними і мали фенотип умовної жіночої стерильності. Т1 насіння збирали після самозапилення. Трансген жіночої умовної стерильності рЕА100 також вводили в тютюн, використовуючи такісамі су процедури. (5)
Приклад 2: Рослини тютюну, які є умовними по чоловічій стерильності Створювали плазміду рЗНбО з промотором ТА29 (Кгіеїе еї аї., Ріапі У 9:809-818 (1996)) з'єднану з геном агюЕ. Промотор ТА29 тютюну клонували за допомогою РСЖК, використовуючи праймери 5-ААСТОСАОСТТТТТООСТТАССОААТОС-3 (послідовність Ме9) і '-САСАСТАСТТТТАОССТААТТТСТТТААСТААААДАС-З: (послідовність Мо10). Серіями етапів «3 субклонування фрагмент ТА29 з'єднували з вищого боку агоЕ, що містить рослинну консенсусну трансляційну послідовність, як описано в Прикладі 1, і термінатор транскрипції поз додавали до 3' гена агоЕ. ТА29-агдЕ-пов - касету клонували між кінцями Т-ДНК в плазміді рЗУСОСОН1, яка також містить рослинний селективний маркер - («в гігроміцин. Створена плазміда мала назву ренбо.
Листові диски тютюну трансформували, як описано в Ногзсй еї а!., Зсіепсе 227:1229-1231 (1985), плазмідою о з5 рЗНбО. Присутність вставлених трансгенів підтверджували за допомогою РОК. Нозерн-блотинг РНК, одержаної з ч- жіночої тканини використовували для підтвердження тканино-специфічної експресії гена агдЕ в трансгенних рослинах. Ці рослини були самофертильними і мали фенотип умовної чоловічої стерильності. Т1 насіння збирали після самозапилення. «
Листкові диски тютюну також трансформували рокК7З, що містить експресійну касету гена аг9Е під контролем промотору ТА29 (Кгієїе еї аї., Ріапі У. 9:809-818 (1996)), як описано в Ногесі еї аї., Зсіепсе 227:1229-1231 - с (1985). Присутність вставлених трансгенів підтверджували за допомогою РОК. Нозерн-блотинг РНК, одержаної з а пиляків, використовували для підтвердження тканино-специфічної експресії гена агдЕ в трансгенних рослинах. "» Ці рослини були самофертильними і мали фенотип умовної чоловічої стерильності. Насіння покоління 11 збирали після самозапилення.
Приклад 3: Хімічна обробка трансформованих рослин тютюну надає тканино-специфічної стерильності -і Насіння покоління Т1 як з умовно жіночо-стерильними рослинами (трансформованими рЕАТ00), так і з о умовно чоловічо-стерильними рослинами (трансформованими рОоК7З) висаджували в грунт. Як тільки кільчики досягали достатнього розміру, листкову тканину перевіряли за допомогою РОК на присутність трансгена агоєс. (ав) РСК-позитивні рослини переносили до теплиці. Ці рослини були повністю фертильними при відсутності -1 50 застосовуваного екзогенно прототоксину. Підгрупу умовно жіночо-стерильних рослин і підгрупу умовно чоловічо- стерильних рослин обообляли прототоксином ацетил-?РРТ протягом стадій зростання. Внаслідок переважного (42) перетворення прототоксину на токсин, оброблені умовно чоловічо-стерильні рослини ставали чоловічо-стерильними і умовно жіночо-стерильні рослини ставали жіночо-стерильними. Рослини, що не підлягали обробці, залишалися повністю фертильними. Пилок з оброблених жіночих стерильних рослин збирали | використовували для запилення маточок оброблених чоловічих стерильних рослин, які були жіночими батьківськими рослинами. Запліднення відбулось і гібридне насіння одержували з чоловічих стерильних рослин. о Приклад 4: Одержання клонів ДНК нових генів, що переважно експресуються в жіночих репродуктивних ко структурах кукурудзи
Спочатку ідентифікували волоть-специфічний кКДНК-фрагмент, використовуючи набір для виявлення кДНК 60 РОСК-селекцією Сіопіесп (Каталог Сіопіесп Мо К7! 804-1). Виділяли поліА мРНК з волоті кукурудзи, що розвивається, цілої китиці, листка і кореня тканин кукурудзи інбредної лінії СО00526 після процедур, визначених в наборі для швидкого виділення поліА мРНК (Каталог Зігаїадепе Мо200348). КДНК синтезували з поліА мРНК кожної тканини і розподіляли на "тестерну КДНК", у цьому випадку представлену кДНК волоті, і "драйверну кКДНК", що складалася з еквівалентної кількості КДНК китиці, листка і кореня. Виявлення кДНК і 65 ампліфікацію РОК виконували, як описано в інструкції користувача. Продукти РОК субклонували в ТА-клонуючий вектор, рСКІЇ (Каталог Іпийгодеп Мо К2000-01). Кожний субклон піддавали скринінгу на тканинну специфічність в
Нозерн-блотах з 5мкг загальної МРНК тканин волоті, китиці, листка і кореню кукурудзи. Клон В20О0Її, у 145п.н., виявив волоть-специфічну експресію. В200і волоть-специфічний фрагмент кКДНК використовували для скринінгу бібліотеки кКДНК волоті, що розвивається. Створювали бібліотеку КДНК волоті, використовуючи поліА мРНК, виділену з волоті, взятої від початків 184см довжиною, згідно з процедурами, описаними детально в наборі для клонування кДНК бБігаїадепе 7ар Сідараск І Со Сіопіпд Кї (Каталог Зігаїадепе Мо200402). Клони, що гібридизувались до зонду В200і, відбирали на аналіз послідовності. Один клон, розміром 772п.н., містив послідовність зонду В20О0і. Цей клон, В20014-2, використовували як зонд в Нозерн-блотах, що містили 1мкг поліА
МРНК з тканин волоті, китиці, листка й кореня кукурудзи. Експресію спостерігали лише у волоті. Послідовність 70 КДНК клону В200і4-2 наведена в послідовності Мо1.
Для того, щоб виділити відповідну геномну ділянку, використовували кКДНК В2001і4-2 як зонд для скринінгу геномної бібліотеки кукурудзи Мо17 (Зігаїадепе). Виділяли Х-клони, які гібридизувалися лише з зондом
В200і4-2. Саузерн-блотинг і рестрикційне картування використовували для ідентифікації геномних фрагментів, що містять відповідну послідовність КДНК з 5 ії З'-ділянками. Фрагмент Ватні -6,5 т.п.н. виділяли одним з 75 позитивних Х-клонів і субклонували в Вінпевзстгірі ЗК. (Зіга(адепе) і називали раНнбаі.
Геномний клон В200і4-2, ренба4, що містить 5' і 3З'-регуляторні ділянки аналізували секвенуванням. Також використовували комп'ютеризоване сканування для ідентифікації передбачуваних промоторних елементів.
Послідовність 5 і З'--регуляторної ділянки гена, що експресується переважно в жіночих репродуктивних структурах, що міститься в геномному клоні реНб4 наведена в послідовності Мо11. Клон реНба віддавали на
Зберігання на умовах Будапештського договору, укладеного 27 лютого, 1998, до Відомства сільськогосподарських досліджень, колекції патентних культур (МКК), Північного регіонального дослідницького центру, 1,815,МУогй Опімегейу Зігееї, Пеорія,-штат Іллінойс 61604, США, і отримували реєстраційний номер
МАК. В-21920.
Рекомбінантний геном, який експресується переважно в репродуктивних структурах жіночої рослини, Ге! створювали наступним чином. 5'-регуляторну ділянку в 431 п.н. В200і ампліфікували реНбаі за допомогою РОК, (5) використовуючи праймери: 5-ААААСТОСАСОААТТСАСТОСТОАООСАССОА-3 (послідовність Мо12) і 5-ВБСООБАТССТІСТТОСТОТАСТССТООАССАСО-3; (послідовність Мо13) і клонували як фрагмент Рай-Ватні в розО10, який містить ЗИ5, з'єднаний з послідовністю термінації поз. Касету В200і-505-пов потім субклонували «(2 як фрагмент ЕсокіІ в ренбаі, розщеплену ЕсокКі, ефективно розміщуючи 5И5-пов нижче від регуляторної ділянки м
В2001 (нуклеотиди 1-3790 послідовності Ме11). Ця плазміда мала назву рентТо.
Регуляторну ділянку В200іЇ з раН7О, як описано вище, клонували як ВаП-ВатнНі фрагмент в В5-К5 (ав) (5ігаїадепе) і З'-регуляторну ділянку В200і з ренб4 додавали нижче як фрагмент ЕсокМ (нуклеотид 4427-6397 с послідовності Мо11). Ця плазміда мала назву реН7З. Плазміду реН74 створювали частковим розщепленням
Ватні рзНІЗ і вставленням фрагмента ДНК, що містить агоЕ (з прикладу 1) в місці сайту Ватні, ефективно - розміщуючи агоЕ між 5' і З'-регуляторними ділянками В200).
Приклад 5: Одержання клонів кКДНК нових генів, що експресуються переважно в жіночих репродуктивних структурах пшениці «
Специфічний щодо маточки фрагмент кДНК виділяли з ИС703 пшениці, використовуючи метод диференційного виявлення мРНК (Каталог Сеппипіег МоМ502), як описано в інструкції для набору. Праймерами, - с що використовували для ідентифікації специфічного щодо маточки фрагмента кДНК, були АР-18 і Т 42 СА. и Фрагмент субклонували в рРОЕМ-ТА клонуючий вектор (Каталог Рготеда МоАЗб62А) і називали Р2б6. Клон Р2б "» використовували як зонд для Нозерн-блотингу, що містить 5мкг загальної мРНК тканин маточки, пиляка, листка і кореня пшениці, і перевіряли на тканинну специфічність. Створювали бібліотеку КДНК маточки пшениці, використовуючи маточки, виділені з пшениці ОС7О3, згідно з процедурами, визначеними в наборі для клонування -і КДНК Зігаїадепе 7ар СідаРаск ІІ Соїд (Каталог Зігаїадепе Мо200402). Клони, що гібридизувалися з зондом Р2б, сю відбирали для аналізу послідовності. Один клон, Р26-А4, був 881п.н. довжиною і містив 203Зп.н послідовність
Р26. Нозерн-блоти, що містили 5мкг загальної мРНК з чотирьох стадій розвитку маточок, А) початкова, Б) поява, («в) В) зріла і Г) фертильна, а також пилку, листка й кореню, гібридизували з 881п.н. зонду Р26-А4. Експресію, що відбувалася переважно в маточці, спостерігали в маточках з дуже малою експресією в корені. -і їй ШИ й й .
Другий специфічний щодо маточки фрагмент кКДНК також виділяли з ШС70ОЗ пшениці, використовуючи такі 62 самі процедури, що й вищезгадані. Цей фрагмент субклонували в РОЕМ-ТА клонуючий вектор (Каталог Рготеда
МоАЗ62А) і називали Р19. Клон Р19 використовували як зонд в Нозерн-блотах, що містив 5мкг загальної мРНК з тканин маточки, пиляка, листка і кореня пшениці, і перевіряли на тканинну специфічність. Створювали бібліотеку КДНК маточки пшениці, як описано вище. Клони, що гібридизувалися з зондом Р19, відбирали для о аналізу послідовності. Один клон, Р19-ОА, був 649п.н. довжиною і містив послідовність Р19. Нозерн-блоти, що містили бмкг загальної МРНК з чотирьох стадій розвитку маточок, А) початкова, Б) появлення, В) зріла і Г) їмо) фертильна, а також пилку, листка й кореню, гібридизували з зондом 649 РІ19-ОА. Експресія переважно відбувалася в маточці. 60 Приклад 6: Одержання геномних клонів нових генів, що експресуються переважно в репродуктивних структурах жіночої рослини пшениці, і ідентифікація промоторної ділянки
Для того, щоб виділити відповідну геномну ділянку, КДНК Р26-А4 використовували як зонд для скринінгу звичайної геномної бібліотеки пшениці ШС70О3, одержаної з двохтижневих кільчиків. Бібліотеку створювали частковим розщепленням Мро! загальної геномної ДНК з наступним приєднанням 8-22т.п.н. фракції з 65 ВатнНі-розщепленої Х-ЕМВІ З ДНК (Каталог Сіопіесп Мо С5 10131). Виділяли 7Х-клони, які гібридизувалися лише з зондом Р26-А4. Саузерн-блотинг і рестрикційне картування використовували для ідентифікації геномних фрагментів, що містили відповідні послідовності КДНК з 5і і З'-ділянок. 5.5т.п.н. фрагмент Хваї! виділяли з одного з позитивних Х-клонів і субклонували в Віпезсгірі 5К- (Зігаїадепе). Ця плазміда мала назву рСІВ10302.
Клон Р26-А4 віддавали на зберігання на умовах Будапештського договору, укладеного 27 лютого, 1998, до
Відомства сільськогосподарських досліджень, колекції патентних культур (МКК), Північного регіонального дослідницького центру, 1815 Могій ОМпімегейу Зігееї, Пеорія, штат Іллінойс 61604, США, і отримували реєстраційний номер МКК. В-21655.
Геномний клон Р26-А4, рСІВ 10302, що містить 5'-регуляторні ділянки, аналізували секвенуванням. Також використовували комп'ютерне сканування для ідентифікації передбачуваних промоторних елементів. Далі 7/0 5-ділянки піддавали картуванню ендонуклеазами рестрикції й визначали початковий сайт транскрипції за допомогою способів КАСЕ РСК і захистом РНКазою. Послідовність 5'-регуляторної ділянки гена, що експресується переважно в жіночих репродуктивних органах і міститься в геномному клоні Р26-А4, наведена в послідовності Мо2.
Для, того, щоб виділити відповідну геномну ділянку КДНК Р19 використовували як зонд для скринінгу звичайної геномної бібліотеки пшениці ШС703, одержаної з двотижневих кільчиків, як описано в прикладі 6.
Виділяли Х-клони, які гібридизувалися лише з зондом Р19. Саузерн-блотинг і рестрикційне картування використовували для ідентифікації геномних фрагментів, що містили відповідні послідовності КДНК з 5 і 3-ділянок. Фрагмент Хпо! «8т.п.н. виділяли з одного з позитивних Х-клонів і субклонували в Віцезсгірі ЗК (5ігаїадепе), що одержала назву Х2-1.
Геномний клон Р19, що містив 5' і 3'-регуляторні ділянки аналізували секвенуванням послідовності. Також використовували комп'ютерне сканування для ідентифікації передбачуваних промоторних елементів. Далі, 5Іі і
З-ділянки піддавали картуванню ендонуклеазами рестрикції. Послідовність 5'-регуляторної ділянки гена, що експресується переважно в жіночих репродуктивних структурах, що містилась в геномному клоні Х2-1, наведена в послідовності Мо14. Клон Х2-1 віддавали на зберігання на умовах Будапештського договору, укладеного 27 Ге! лютого, 1998, до Відомства сільськогосподарських досліджень, колекції патентних культур (МКК), Північного о регіонального дослідницького центру, 1815 Могій ОМОпімегейу бЗігеєеї Пеорія, штат Іллінойс 61604, США, і отримували реєстраційний номер МАК. В-21919,
Приклад 7: Створення складених генів, які експресуються переважно в репродуктивних структурах жіночої рослини (ав)
Створювали плазміду рЕА2О0 за допомогою функціонального з'єднання, - використовуючи стандартні способи, відомі у галузі, наступних компонентів: 1) регуляторних ділянок Р2б, як описано вище (пів 1-3987), - 2) фрагмента ДНК, що містить ген агоЕ, підданий сгенній інженерії зі створенням сайтів рестрикції («в для-приєднання АТО відкритої рамки зчитування агдЕ в рамку з сайтом початку трансляції (АТО у пі 3987) фрагмента Р2б, таким чином, приєднуючи вище регуляторну ділянку Р2б з агуЕ і 3) вектор, що містить о З-послідовності термінації, які є функціональними в рослинах Експресія агдЕ під контролем промотору Р26б6 ї- приведе до утворення продукту гена агдЕ переважно в жіночій репродуктивній структурі рослини. 5-регуляторні ділянки РІ19 (нуклеотиди 1-1093 послідовності Мо14), розрізані Реї І, сайт фермента рестрикції, знайдений вище від послідовностей Р19 в плазміді Х2-1, і Мсо! (нуклеотид 1088 послідовності Мо14) « в місці АТО Р19, приєднували до реОс15, розрізану Рваї! і Мсо! (рБОС15 містить ген БИ5 і термінатор поз з 70 сайтом Рзії, що знаходиться з 5' кінця до гена (305 і Мсо І у місці АТО гена (35). Ця плазміда мала назву рХВІ. - с Плазміду ріЗдагд створювали, використовуючи стандартні способи, відомі у галузі, функціональним а з'єднанням наступних компонентів: 1) регуляторні ділянки Р19, як описано вище, 2) фрагмент ДНК, що містить "» ген агоЕ підданий генній інженерії зі створенням сайтів рестрикції для приєднання АТО відкритої рамки зчитування агоЕ в рамку з сайтом початку трансляції (АТО у положенні 1090 послідовності Мо14) фрагмента Р19, таким чином приєднуючи вище регуляторну ділянку РТ з агдЕ і 3) вектор, що містить 3-послідовності -і термінації, які є функціональними в рослинах. Експресія агоЕ під контролем промотору Р2б приведе до с утворення продукту гена агдаЕ переважно в жіночій репродуктивній структурі рослини.
Короткочасну експресію генів у репродуктивних структурах жіночої рослини визначали передачею інтактним (ав) тканинам. Квіткову тканину пшениці (маточки й пиляки) висаджували на середовище Мурашиге (Мигазпіде) і - 50 Скуга (ЗКо0с9), що містить 1596 мальтозу. ДНК рХВІ або р5Н7О осаджували на мікрометрові золоті частки, використовуючи стандартні процедури. Дві пластинки-мішені з 20 маточками і пиляками на мішень обстрілювали 62 2 або З рази з гелієвим пристроєм ЮиРопі ВіоїївіїсвФ, використовуючи розривний тиск 7,58мМПа. Пластинки обстрілювали з використанням 80 - коміркового фільтру між платформою каретки й мішенню. Мішені розміщували в темряві при 262С протягом 16 годин після бомбардування перед тим, як тканини переносили до середовища для розвитку 505 (100мг Х-глюк. в 200мл 0.05М фосфату натрію рН 7) протягом від 2 до 24 годин о при 372С. Гени СИ5 в рХВІ і рен7О проявляли активність С в маточках. Контрольні аналізи трансформації р ЗНО у тканинах волоті кукурудзи виявили експресію (305 в жіночих тканинах. де Приклад 8: Трансформація пшениці рекомбінантним геном, який кодує протеїн, що каталізує перетворення прототоксину на токсин переважно в жіночих репродуктивних структурах 60 Незрілі ембріони (0,75-1,0мм довжиною) генотипу ШС70О3 висаджували на середовище Мурашиге і Скуга, що містить Змг/л 2,4-О і 395 цукрози. Після приблизно 4 годин ембріони висаджували віссю ембріонів до низу на планшети, що містили середовище Мурашиге та Скуга з 1595 мальтозою, 395 цукрозою і Змг/л 2,4-О, вкриті фільтрувальним папером, що підтримував блок агарози, який містив ті самі компоненти. Ембріони піддавали плазмолізу протягом 2-3 годин перед бомбардуванням. 65 ДНК рЕА2ОО ї р0035 осаджували на мікрометрові золоті часточки, використовуючи стандартні процедури.
Чотири пластинки-мішені з 20 ембріонами на мішень бомбардували двічі гелієвим пристроєм ЮиРопі ВіоїївіїсеФ),
використовуючи розривний тиск 7,58МПа. Пластинки обстрілювали з використанням 80-коміркового фільтру між платформою каретки й мішенню. Мішені розміщували в темряві при 26 9С протягом 24 годин після бомбардування перед тим, як блоки з ембріонами викладали на планшети, що містили середовище Мурашиге та Скуга з Змг/л 2,4-О0 і 395 цукрозою. Окремі ембріони видаляли з блоків і розміщували прямо на свіже середовище того ж складу після ще 48 годин.
Приблизно через 6 тижнів після перенесення гена відповідну тканину розміщували на середовище Мурашиге та Скуга з Змг/л 2,4-О0 і Зо цукрози з 0,2мг/л метотрексату протягом З тижнів. Потім тканину переносили на регенераційне середовище, що складалося з середовища Мурашиге та Скуга з мг/л 7еайп гірозіде і мг/л 7/0 метотрексату. Після 2 тижнів, регенеровані кільчики переносили до стерильних контейнерів, що мали назву "СА7в8в" з половинною іонного силою солей середовища Мурашиге та Скуга, 295 цукрози, 1мг/л МАА і або 4, або 8мг/л метотрексату.
В іншому прикладі незрілі ембріони (0,75-1,0мм довжиною) генотипу ШС70О3 обробляли, як описано вище, за винятком того, що використовували середовище Мурашиге та Скуга, що містило 2мг/л 2,4-О. Після приблизно 4 75 годин ембріони висаджували віссю ембріону до низу на планшети, що містили середовище Мурашиге та Скуга з 1596 мальтозою, 395 цукрозою і 2мг/л 2,4-О, вкриті фільтрувальним папером, що підтримував блок агарози, який містив ті самі компоненти. Ембріони піддавали плазмолізу протягом 2-3 годин перед бомбардуванням.
ДНК реЕА2ОО, рзН7І4 або р19аго, разом з рибБі-Нуд, що містили промотор убіквітину кукурудзи, функціонально з'єднаний з геном гігроміцинфосфотрансферази, осаджували на мікрометрові золоті часточки, використовуючи го стандартні процедури. Чотири пластинки-мішені з 20 ембріонами на мішень бомбардували двічі гелієвим пристроєм ЮиРопі - Віоїївіс5Ф, використовуючи розривний тиск 7,8МПа Пластинки обстрілювали з використанням 80-коміркового фільтру між платформою каретки й мішенню. Мішені розміщували в темряві при 262С протягом 24 годин після бомбардування перед тим, як блоки з ембріонами викладали на планшети, що містили середовище Мурашиге та Скуга з Змг/л 2,4-0 і 395 цукрозою. с
Приблизно за З тижні після перенесення гена, відповідну тканину розміщували на середовище Мурашиге та
Скуга з Змг/л 2,4-О і 395 цукрози. Потім тканину переносили на регенераційне середовище, що складалося з і) середовища Мурашиге та Скуга з 395 цукрози, 5мг/л БАЗ, мг/л МАА і 20 мг/л гігроміцину. За 2 тижні тканину, що регенерується, переносять на середовище Мурашиге та Скуга з 395 цукрозою і 2Омг/л гігроміцином. За 2 тижні, що регенерується, переносять до стерильних контейнерів, що мали назву "СЗА7в8в" з половинною іонною силою о солей середовища Мурашиге та Скуга, 295 цукрози, мг/л МАА та 2Омг/л гігроміцину.
ДНК екстрагували з тканини листків рослин, що були піддані трансформації, і проводили РОК на присутність т генів айїт або пуд селективних маркерів і гена агоаЕ. РСК-позитивні рослини переносили до теплиці для о розмноження. Протягам етапів цвітіння збирали маточки з кожної трансгенної рослини і РНК, одержаної з цієї тканини. Експресію аг9Е підтверджували Нозерн-блотингом. Рослин піддавали самозапиленню і збирали о насіння. ч-
Приклад 9: Одержання складених генів, які експресуються переважно в чоловічих репродуктивних структурах
Плазміду роК7З використовують як початковий матеріал. Видаляли послідовності термінації ТА29-агдЕ-3' як касету з вектора Адгорасіегіцт-опосередкованої трансформації і вставляли в рВішевзсгірі КОЖ, використовуючи « належні ферменти рестрикції. Створена плазміда мала назву РМА20О0.
Пиляк-специфічний промотор Вб створювали з плазміди рЗОВМЕЇ, яка містила Зт.п.н. геномний клон, - с субклонований як фрагмент ЕсокІ-МНеї! з ресоВбаі (див. патент США Мо5470359). Кінці фрагменту 1558п.н. Араї ц иХраі! робили "тупими", клонували в Віцезсгірі (К5) у Зта !/| сайт. Трансляційний конструкт гена агдЕ "» створювали, як було попередньо описано в Прикладі 2. Створена плазміда мала назву ренвбв.
Пилок-специфічний промотор 7та9 Лт.п.н. фрагмент Ніпаїй-РримМміІ 7таоа13 (Натійоп еї аЇ. Зехица! Ріапі Кергодисіп 2, 208-212 (1989)) клонували з рСІВ391 в рійезсгірі, як фрагмент Ніпаїї-5таї!. Додавали ділянку -І термінації транскрипції поз як фрагмент ВатнНі-Хвраї. Потім приєднували кодуючу послідовність для агдаЕ як
Ватні фрагмент (з Прикладу 1) у сайт Ватні, ефективно розміщуючи агоЕ між промотором 7та і послідовністю
Мн термінації поз. Ця плазміда мала назву 7тадага. ав) Приклад 10: Трансформація пшениці рекомбінантним геном, який експресується переважно в чоловічих репродуктивних органах і Плазміди рИБі-Нуд, що містили промотор убіквітину кукурудзи, функціонально з'єднували з геном с гігроміцинфосфотраийсферази, і РМА2О00, ренНб8 або р/тдагд використовували як рекомбінантні послідовності для трансформації незріліх ембріонів пшениці, як описано в Прикладі 8. Рослини регенерували і РСК використовували для підтвердження присутності трансгена агоЕ. Трансгенні рослини переносили до теплиці. Пиляки і РНК, одержану з цієї тканини, збирали протягом етапів цвітіння і експресію агаЕ підтверджували
Нозерн-блотингом. Рослини піддавали самозапиленню і збирали насіння. о Приклад 11: Трансформація кукурудзи рекомбінантним геном, який кодує протеїн, що каталізує перетворення іме) прототоксину на токсин переважно в жіночих репродуктивних структурах
Одержували калус типу | з незрілих зиготичних ембріонів генотипу СО00526, використовуючи стандартні бо способи культивування. Для перенесення гена приблизно З0Омг калусу типу | готували нарізанням лезом скальпелю, промиваючи З рази стандартним культуральним середовищем, що містило 1895 цукрози, і відразу переносили на напівтверде культуральне середовище, що містило 1895 цукрози. За приблизно 4 години тканину бомбардували, використовуючи пристрій РОЗ-1000/Не від ВіоКкай. Одну з наступних плазмід. рЕА200, рен74 або р1Заго, разом з реОос35, осаджували на мікрометрові золоті частки, використовуючи стандартний протокол від 65 ВіоКай. Приблизно за 16 годин після перенесення гена калус переносили на стандартне культуральне середовище, що містило 295 цукрозу і 2мг/л метотрексату. Калус субкультивували на селекційне середовище протягом 8 тижнів, після чого калус, що вижив ріс переносили до стандартного середовища для регенерації для одержання рослин. Одержують рослини і дають їм номери. Рослини перевіряли за допомогою РСК на присутність гена агоЕ і РСК-позитивні рослини переносили до теплиці. Під час цвітіння збирали-колоски, одержували РНК з цих тканин і експресію аг9Е підтверджували Нозерн-блотингом.
Як альтернатива, рослини трансгенної кукурудзи одержують бомбардуванням мікрочастками незрілих ембріонів. Колоски генотипу СО00526 піддають самозапиленню і незрілі зиготичні ембріони одержують приблизно за 10 днів. Приблизно 840 незрілих зиготичних ембріонів розподіляли серед 14 різних пластинок-мішеней, що містили середовище, здатне індукувати і підтримувати утворення ембріогенного калусу. 7/0. Незрілі зиготичні ембріони переносили відразу на те ж середовище, але яке містило 1295 цукрози. За 5 годин незрілі зиготичні ембріони бомбардували з рЕА200 або р5Н7/4 або р19баго, разом з рос35, використовуючи пристрій РОБ-1000/Не від Віокад. Плазміни осаджували на мікрометрові золоті частинки згідно з опублікованою процедурою від ВіоКайд, як описано вище. Частинки прискорювали, використовуючи розривний тиск гелію 10,68МПа. Кожну пластинку-мішень обстрілювали двічі препаратом плазміди і золотих часток. Селекційний агент /5 метотрексат застосовують у дозі 2мг/л в день перенесення гена і підвищували дозу після приблизно одного місяця. Таким чином одержаний ембріогенний калус регенерували в присутності селекційного агента метотрексату.
Одержують рослини і дають їм номери. Рослини перевіряли за допомогою РСК на присутність гена агоЕ і
РСЕ-позитивні рослини переносили до теплиці. Під час цвітіння збирали колоски, одержували РНК з цих тканин і експресію агоЕ підтверджували Нозерн-блотингом.
Приклад 12: Трансформація кукурудзи складеним геном, який кодує протеїн, що каталізує перетворення прототоксину на токсин переважно в чоловічих репродуктивних структурах
Плазміди рМА200, реНб8 або р/тдагд і рОс35 використовують як рекомбінантні послідовності для трансформації незрілих ембріонів кукурудзи, як описано в Прикладі 11. Рослини регенерують і РСК сч ов Використовують для підтвердження присутності трансгена агдЕ. Трансгенні рослини переносили до теплиці. Під час цвітіння збирали качани, одержували РНК з цих тканин і експресію агоЕ підтверджували Нозерн-блотингом. і)
Рослини піддавали самозапиленню і збирали насіння.
Приклад 13: Трансформація ячменю, який кодує протеїн, що каталізує перетворення прототоксину на токсин переважно в жіночих репродуктивних структурах о зо Збирали колоски ячменю (сорту СоЇдеп Рготізе) з незрілими ембріонами приблизно від 1,5 до 2,5мм у розмірі, поверхню стерилізували 15905 (г/г) знебарвлювачем (5,2595 гіпохлорит натрію) протягом 10 хвилин і - промивали п'ять разів стерильною водою. Незрілі ембріони вирізалися з молодих зернівок і розрізались вздовж. о їх висаджували на середовище, що індукувало калус (УУап і І стаих, Ріапі Рпузіоїоду 104.37-48 (1994)), що містило основні солі Мурашига та Скуга з ЗО0г/л мальтози, мг/л тіамін-НСІ, 0,25г/л міо-інозитолу, г/л і) гідролізату казеїну, 0,69г/л проліну, 2,5мг/л дикамба і піддавали загущенню З,5г/л РНуїаде(Фф(Зідта). ї-
Для бомбардування ембріонів ембріони інкубували щитком до верху в темряві при 24-28 «С протягом 1-3 днів. В день трансформації ембріони розміщували в центрі чашки Петрі (100х15мм) з утворенням кільця ДНК з плазмід рЕА2О00 або рзН74, або р1іЗагд, разом з риБрі-пнуд осаджували на 0,6 або 1,0мкм золотих частках (Віо-Кай) згідно з інструкцією ЮОиРопі Віоїїзіс Рапісіе ЮОеїїмегу Зувіетв. Кожну чашку з ембріонами « бомбардували раз гелієвим пристроєм ЮиРопі РОБЗ-1000, використовуючи розривний тиск 7,58МПа. Після шщ с бомбардування ембріони переносили до свіжого середовища для індукції калусу щитком до низу. За 3-7 днів й після бомбардування ембріони переносили до селекційного середовища (середовище для індукції калусу 1Омг/л «» гігроміцину) протягом приблизно 14 днів. Калус, що утворився, подрібнюють на маленькі шматки і зберігають окремо. У наступних культивуваннях калус переносять на свіже селекційне середовище з 2Омг/л гігроміцину приблизно кожні 21-28 дні. Після 2-3 культивувань калус, що вижив, переносили до ЕНС середовища (Нипіег, -і Р.О. їпезів. МУуе СоМеде, МОпімегейу ої ІГопдоп, Авлтога, Кепі 1988) з 1-Змг/л б-бензил-амінопурину і 10-20мг/л гігроміцину для регенерації рослин. Рослини регенерували при 23-2592С під флуоресцентним світлом. о Зелені кільчики, що утворилися, або паростки, переносили до основного середовища Мурашиге та Скуга, що не ав) містило гормонів, у 25х100мм чашку Петрі. Рослини переносили до контейнера Мадепіа ЗА7 для подальшого розвитку, коли вони досягли 2-Зсм у розмірі. і Для бомбардування калусу ембріони інкубували щитком до низу в темряві при 24-28 «С протягом принаймні 62 10 днів. У день трансформації ембріогенний калус з культивованих ембріонів подрібнювали на маленькі шматки і розміщували в центрі чашки Петрі. Перенесення ДНК і наступні етапи регенерації рослин такі самі, як і ті, що описані в способі бомбардування ембріонів.
Рослини перевіряли за допомогою РОК на присутність трансгена і ті, що виявились позитивними, переносили о до теплиці. Під час цвітіння збирали колоски і одержували РНК з цих тканин. Експресію агаЕ підтверджували
Нозерн-блотингом. Рослин піддавали самозапиленню і збирали насіння. іме) Приклад14: Трансформація ячменю складеним геном, який кодує протеїн, що каталізує, перетворення прототоксину на токсин переважно в чоловічих репродуктивних структурах 60 Використовували плазміди рРМА200 або розНнбв, або р/тодаго і рОрі-Нуд як рекомбінантні послідовності для трансформації незрілих ембріонів ячменю і калусу, як описано в Прикладі 13. Рослини регенерували і РСК використовували для підтвердження присутності трансгена аг9Е. Трансгенні рослини переносили до теплиці. Під час цвітіння збирали качани, одержували РНК з цих тканин і експресію агоЕ підтверджували Нозерн-блотингом.
Рослини піддавали самозапиленню і збирали насіння. 6Е Приклад 15: Хімічна обробка трансформованих рослин надає умовної стерильності
Насіння з покоління Т 4 рослин, трансформованих рЕА2О0 або рЗНІ4, або р1Заго (що надає умовної жіночої стерильності) і рослин, трансформованих рМА200 або рОнНб8, або р/тдагд (що надає умовної чоловічої стерильності) висаджували в грунт. Як тільки кільчики виростали до достатніх розмірів, тканину листка перевіряли за допомогою РСК на присутність трансгена агоє.
РСЕ-позитивні рослини переносили до теплиці. Ці рослини були повністю фертильними. Підгрупу рослин, що містили рЕА200 або рзН74, або р19аго, і підгрупу, що містила рРМА200 або рзнбв8, або р/таго, обробляли прототоксином ацетил-?РТ протягом зростання. Рослини, трансформовані РМА200 або рзнбв8, або р/тдага (гомозиготи, потрібні для конструкту промотору 7тодагд пилку), були чоловічо-стерильними внаслідок перетворення ацетил-?РТ на РРТ в чоловічих репродуктивних структурах. Рослини, трансформовані рЕА2оОо 70 або раН74, або р19аго, були жіночо-стерильними внаслідок перетворення ацетил-РРТ на РРТ в репродуктивних структурах жіночої рослини. Необроблемі рослини, трансформовані рЕА200, або реН74, , або р1даго і рРМА2О0О, або разНбв8, або р/тдаго були повністю фертильними.
Приклад 16: Одержання гібридного насіння пшениці, використовуючи трансгенні рослини, які перетворюють прототоксин на токсин в репродуктивних структурах жіночої рослини
Трансгенні рослини пшениці з Прикладів 8 і 10, які були трансформовані рЕА200 або рзН74, або р19ага (що надає умовної жіночої стерильності) і рМА200 або рзнНб8в, або р/тдаг (що надає умовної чоловічої стерильності), піддають селекції як рослинні лінії, гомозиготні по кожному трансгенові, і насіння розмножують стандартними способами. Гомозиготне насіння з рослин, що містило рЕА200 або рЗН74, або р19аго, і рослин, що містили рРМА200 або р5Нбв8, або р/тдагд висаджували в співвідношенні чоловічих до жіночих батьківських, 2о достатнім для забезпечення ефективного перенесення пилку У певний час протягом розвитку рослини прототоксин ацетил-?РРТ застосовують в польових умовах. Після дозрівання насіння збирають врожай з цілого поля, вибираючи лише гібридне насіння.
Усі публікації та патентні заявки, згадані в цьому описі, розраховані на рівень фахівців у галузі, яких цей винахід стосується. Усі публікації та патентні заявки включені сюди шляхом посилання так само, як і кожна сч 2г5 окрема публікація або патентна заявка була особливо й окремо вказана як така, що включена шляхом посилання. і)
Хоча вищезгаданий винахід був описаний в деяких місцях шляхом ілюстрації і прикладу з метою чіткості пояснення, буде очевидно, що певні зміни й модифікації можуть бути зроблені, не виходячи з об'єму доданої формули винаходу. о зо СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ (1) ЗАГАЛЬНІ ДАНІ: - () ЗАЯВНИК Кроссланд, Лілі Д о
Харпер, Стасі М (ї НАЗВА ВИНАХОДУ СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ ГІБРИДНОГО НАСІННЯ З ВИКОРИСТАННЯМ УМОВНОЇ о
ЖІНОЧОЇ СТЕРИЛЬНОСТІ Й ча (ії) КІЛЬКІСТЬ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ 14 (м) АДРЕСА ДЛЯ ЛИСТУВАННЯ (А) АДРЕСАТ: Момагііз Согрогайоп- Раїепі 8 Ттадетагк ЮОері. (Б) ВУЛИЦЯ: Р О. Вох 12257 « (Б) МІСТО: Кезеагесй Ттіапдіеє Рагк з с (п ШТАТ: МОСМУ
Й (Д) КРАЇНА: ОЗА и? (Е) ІНДЕКС: 22057 (у-у ЕЛЕКТРОННИЙ ВАРІАНТ: (А) ТИП НОСІЯ: Гнучкий диск -І (Б) КОМП'ЮТЕР- ІВМ-сумісний (Б) ОПЕРАЦІЙНА СИСТЕМА РО-БО5/М5-БО5 о (Д) ПРОГРАМНЕ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ Раїепіїп Кеїеазе її 1.0, Мегвіоп 41.30 о (мі) ДАНІ ЩОДО ЦІЄЇ ЗАЯВКИ: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: 05 ТВА ш- (Б) ДАТА РЕЄСТРАЦІЇ: 27 02 1998 о (Б) КЛАСИФІКАЦІЯ: (мі) ДАНІ ЩОДО ПОПЕРЕДНЬОЇ ЗАЯВКИ: (А) НОМЕР ЗАЯВКИ: 05 (ргох) 5Б (мії) ДАНІ ЩОДО АДВОКАТА/АГЕНТА (А) ІМ'Я Пейс, Гарі М (Ф, (Б) РЕЄСТРАЦІЙНИЙ НОМЕР 40403 ка (Б) НОМЕР СПРАВИ/НОМЕР РЕЄСТРА: СОС 1915/Ккезд (2) ТЕЛЕКОМУНІКАЦІЙНІ ДАНІ: 60 (А) ТЕЛЕФОН: 919-541-8582 (Б) ТЕЛЕФАКС: 919-541-8689 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Мо: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 772 равзе раїге 65 (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (БУ ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична
(Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: інша нуклеїнова кислота (А) ОПИС: /опис - "послідовність КДНК для транскрипту, що транскрибується переважно в жіночих Депродуктивних органах, має назву В20014-2" (її) ППОТЕТИЧНІСТЬ: немає (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Мо1:
СТОСТАССТО СТОСАССАСТ АСАССААСАА АтТоссобстТстТ АСААСТСТОоС ДесттотостТт 60 70 СОТСсТОСТТТ ТОобСсСтТСАСТтТ СсСсттІСТОООС ТТССТОСАСо ТІСТСТАСбС ААСобАССТС 1720
АСТСААСССА АТООСТСТОО ДСТОААСААТ ААТСТОААСС СТОСАССАСА ссстТобоСсТтС 180
АМССАТОАСА АСТОСТТТОС ТОСТООАТАС ААССАТОСТО САССОТАТОО АЛАСААССАС 240
ССАОбАТАСО СТОСССОАСО АЛАСЛОССЛА ССТОСАТАСо ОСОССОБАСО АЛАСАСТСАО оо
СССОБАТАСО СТОСАССАТА САДОСОССАТ САСССТОСТо ОСООСТАССО СТСТОБАСАА 3Б6о
ССАбООССТО САТСТОСАТО ТОБАССАСОС ТАТССАСОТо ССААТОСтТАС ТОСТОСОТАС 420
СОССАТОАСА АТОСТОСТОС САСТОССАСТ СОТОССОСАА АТОССААТОоС тТоОТОСотТАС 480
ССАССАССАС САСССООСОС ТТАТОСАСОС СОСТАСОбСА СТООТАСТОС ТАСАССАССА 540
СБАСОСОСАТ АТСАТОСССо ТОСТОСТОСА СААСОССТАСО СТОООСАВАА СТАССААСАл 60
СААССОСТТА ТОСТАСТТТА ТОТТАААТАА АСОВТССАТТ СТТСАТОТОА СТОАССААТТ вБ6о
ТАВОССАСТОА АССАТСТТОА СТоСОТОТТАТ ТТОТОТРТАСС АТАТОТАТТО СТТОТТЕТАТ 720
СТТТААСАТО ААТОТАСАСС ОСТАТТТОСТА АААВАВАЛАА ААЛАААЛАЛА АХА 772 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Ме2: с () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: о (А) ДОВЖИНА 4126п.н. (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (БУ ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна | «в) (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ППОТЕТИЧНІСТЬ: не має ге (їх) ВЛАСТИВІСТЬ: | «в) (А) ІМ'Я/КЛЮЧ: ТАТА сигнал (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 3864 со (їх) ВЛАСТИВІСТЬ: - (А) ІМ'Я/КЛЮЧ: тівс властивість (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 3912 (М) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /функція-"сайт початку транскрипції" « (їх) ВЛАСТИВІСТЬ: (А) ІМ'ЯХЛЮЧ: тізс властивість - с (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 3983 "з (М) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /функція - "сайт АТО, використаний для трансляційних з'єднань" " (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Мо2:
ТСТАСАТТАТ ТСААТСТАСТ ССАТСТОСССА САСТСААССА ААТАТССССТ АСАСССААТА бо
УТАААСТТОТ ТАТТТАСАТТ ТССТТАТАТС АТОСАТАМАТО ТСТАТТАТТО АТОСТАСААТ 120 - І ТСТАТТААСС АСАААСТТОА ТАСАТОТОТО САТАСАТАЗА СААЛАСАСАС ТОТСССТАОТ 180
Ге) АДСССТСТАС ТАСАТТАССТ СОТТААТСАА АСАТОСТТАА СТТТОСТААС САТАТАСАТо 240
ТОТТОТСАТТ ТОАТОААСОС САТСАСАТТА ТТАССАСААТ САТОТСАТОС АСАЛСАСССА зо о 7 - 50 (42)
Ф) іме) 60 б5
ТСССТТАТСТ ТАССАТАТТО АТССТТСАСТ ТТТАТТОСТА ТТОСТТТСТТ САТОТСАТАТ зво
АСАТАТТСАТ ТТОАСТАТСА САТТАТОСАА СТСССОСАТА ССАСАбОТАТ АССсТтТОоТоТо 420
СТАТСАААСА ТСАСААСАТА АСТАССТОАТ ТАТАДАСАТО СТСТАСАОСА АТСТОСВАЛо АВо
СТОоТТТІСТтТС ССТТАССАТА САТССАСАТТ АССАТТТОТС АСТССбАСТА ТСАТАСАССТ 540
АТАТСТОСОС ССТСТОССТА АТССАСАТСА ТААТААСССТ ТСТААССААТ СТСАСТААТО 500
ДОТЕАТТТСТ ОССАТОАТОТ АТТАСОСААС САСТАЛАСВО АСТТОССОСТ ААССАСАТТО во
ААСТАОСТАТ СААДБСАТАССО АССАТОСААТ СТОСОССААС ТААСАТАССО АТСАСААдАСОо 720
АААТААТОСТА ТОТТІСТСАТТ АСССТАССАС ССАТАААСАТ СТТСАТАСАА ТАТОСТОССБАА 780
СТААТАТСАС САТССАССТР ССОСТОТТОС ТТАТТОАСТО САСАССТоТС ТОСОТСАТСТ 840
СТАСАТААТТ СТОССААСТСО ТАСОСТСОбС АСОСТТААСС ТТООАТОАСО АТТТТСТАТТ 800
АТАТОАСТТО ТСТСАТТТОоС ТОАССОААТО ТТСТТССбАС ТСССОСАТОА САТСАСАСАС 560
АТОАССАССА СТСТООАААА ТОТТОАСАСО ТАААСАТТСА ТАТАТТІСТАС САТОАТАТТо 1020
БСАСАССОСА АСТАТТСССС СОСТАССОСС ТАСАТАТСоС СТСАССОБАА бообТІСсТоС 1080
ССАТеССССС ООСААТТАСА ТОСОССТААТ СОСССААСАА ОСОБАСАТАС САбССССТАС 1140 сосостосте скссссАтТоТ АСОССААВАТ ААССОССААС СААМО, лАсто ОДАСАТАСАА 1200.
АССАСОСОбА бСААТТСбОоС СТоССССТТС СтТРСТоТОСТ СССТСАТОСТ ТОоСсТтТтТоССсс 17650
СТСОСАТОАА ТАССОДАСОС ОССАСОСССА АТТОСБАСОС ССАСААСТАС САТТОССТОСтТ 1320
АСтТтТСбооСо СССССтТТооС ТоССТоТоСтТ ССССТССААС СТАТАТАТАТ САСОСООСАС 1380
СОСТАСААСА САСАССААСС АТІСТТАСТС СТСТОоСОсССо ССССССТОСА САСТТТАСоС 1440
СТОССАТСАТ АТТСАСАТАС ТОСТТАСОСО ААССОСТоСо СОСАТСАСТТ САССАТТАСТ 1500
АТСАССАСОС САСТОТОСТО АСОСААСТАТ САТТОССАСАС ТТТОСТАСАТ СААСАСТТОО 1550 се
АООСАСОТСА ТОСАСТТСАА СОТСТОСАСА АСТСОСАССТ ССССТАСАТТ СОСТОСТТСА 1620 ге)
ТОБОСТСОБАА СОАСААСААС ТГТОАССАСА ТСААССОСОТ ТОТСАААСОС ТТОСАСТТТО 1689
ОСТСТАСОобо АОТАСОТОСА САСАСТСТОС СССТОТСОТТ ССТАТОСАТС ТОСТАСАТАб 1740
АТСТТОСОТО АССССАССАА ТТТТТТТОАДА АТТОСАТОСТ АТСОТТТСССА АСАССААСАТ 1800
СТОБАСОБАС АТССАААССА ОСССССОСТТ СТССОССТОС ЛАДАССАТСА СТТССбСАТо 1860 -
СТООБССАСео СБОАТТОСОС СССТАСАЛСС АСАСААССТ СбАСССААСА АСААСАССАТ 1920 ч-
САААСАСОТо СОСТИТОСАС СОСОСТОДСО САСООСТТАА СТАСССАСОА ССААСТОЛАС 1980 ав бОАССОСААС СТОСТТССАА ТСТТСТОСАС ТОСССОСАСТ АДОСТТТСТТС АТСОССССАТ 7040
ТОСАТОССТОА ААСТОСААСТ ААТССССТОА ТОСТТТТОСТ ТАТТСАТААС ААСАТАТОСА 2100 і
ТСАТТСААСТ ААТОСССТАСТ САААСААТАТ ТТСААСАААС ТТСАТТТАТО ТАТОССААТО 2150 у
ССАТСТОДАТ ОССАССССТС ААААТОСТАА АССАСАААСА ТТСССААдСС ТТСААСААТО 2220
ТАСАТТТТТО СТТААССОСАТ ССААСАТСАС ДАТОАСТСТА ТАСААЛАССС ААТАСААТТА 2280 « - с з й -І (95) (ав) -1 2 «2
Ф) ко во бе -1 9-
ААЛССОЛАТО АОСТТТТАСТ САРОСАСТАС ТТССССААСТ ССТТАБАСАТ АТТОСТССЛА 2340
АЛСССТСАбС САСАСССТСА САТТСАТСТА ТТТССААААС ССТАААСССТ АТСТОССТОС 2400
САССААААСА САТССАЛССС САСССАССАА БАТАСАСТТО АСАТАСТООС ТОССТАЛАСС 2460
САЛОСААСТТ ССТОССАССО СОАТСАСССТ ССООТСТСАС СОААСАССАС РТСССАдССТ 2520
ТСТОТААССТ АТСАТТТСАТ СТОССАААТТ СССАБАССТТ ТОБАТАССТС ТТАССБААСТ 25Во
СТОААЛАСТО АТТАССТСАТ САССАТТСОО ТСТСАССССА СТОТТСТАТС СОоСтТСТеСАСС 2640
САЛААТТСТО ААСТТСАЛАС СТТТТОТОСТ АСТОСОССТО АССААСТСАТ ТТСАТоСОСТ 2790
СССАСТОАСТ АСТССАТААА СОТОоТОТОСТ ТАСТОССТАТ АТАТАССТСС АСССАТТССА 2760 то ССААСТСТСА САСАССААТС АССАССАЛАС ТАССАСТТОС САТАТТСАТТ ТТСТСАСАСА 2820
СААССАССТО САСТТСТСТТ САААТСААОС ССАТТССАСТ ССАДССТТТС АТСТТТСАТЕ 2880
ТСТАТССССС ТСААСТООСТ ТТССАСТСТА СТСАТІСТОС ТОССАСАТАб ССАЛАТСТОоТ 2940
САСАСААТСА ТТОбСТСТТС АССТСАСТАТ СТТТТОАААС АСАААДАТАА СбАСТТСАТС 3000
АССААСААСА АСАТСТАТТА ССТТТСТСАС АСТООТОТСТ ТОСАБАТТОС ТТАСОсТоТСА 3060
СТТСОбАССС ТССЛАСАТОТ ОСАСТТОААС СААССАСТТТ ОТАААОСТАА АСАСАТСОСС 3120
ТАСТТСАТОА АСАТТТАССТ САСТОАСОСТ АСТСОСТТСАТ СОССОТААСС САТОСТСАСА З189
ТАСАТААССТ ТОСАТТТСАТ СТТССАААСС СССТОСТТТА ТОТІСАТАТО САААСТСТТТ 3240
АСТТІСТОСТ СССТАСТААС ТТАСАСТТОС АТСОТАТАСАС ТОТСАСААСА СТІСТТАСАА 3300
ТТОССААААС ТТОССТАСАА ТТААААТТОС СААААССТСА АСТТТТТАСТ ТОССААСТАС 3360
ТСТААтТоСсоС тТсСоссстАС ТАСАССТАСТ ТСССАТОСТА САЛАСТСАСо ССОСОСТСТА 3420
СТССССССоС АТСАСТСТОд АбСОСТОСТС АССТОСАТОА АТОСАСОСТА АССоСстТтСте заво
СТОБАСАСОоС ТРРТСОБОСА СААСОСТТТТ тсостТобоАС сСотТОостТоТоо сосоАооссо 3549 с
ТОТАТОТАТС ТОСААТОСОсС ТОСТТІСТоТО СОБТТТОТОС АААААСОСАС ААССАбАТОС 3600 Ге)
СТССАСАСАТ СААТАССАТА СТОСАТТОСА ТОСТАААТТТ САТСТАААСА СССАТОСАСАТ 36БО
АССОССТТСА АТСАТАААТТ АСАТССТААС ТАСССОАТСС АСАТОАТТОС АСАСАСТТТА 3729
АСОСТСАСАС АТОСАСТТАА ТОСТСАССАТ СААСАААСАТ СТОСАССССА СОССАТІСТо 3780 ав!
ССАСТОСССТ САТТТАСАСС СТОСССАТСТ ССОССОСТОо АСТСТССАТС ССАССАТАСО 3840
ТАСТСССУТО СТОСТОСТСО СССТАТТТАА АССССААОСТ ТСАССАСАСС АААТОСАСТА 3900 -
СТАССААССА ТСТСАСОСОС ААСАСААСАС АСАСССДАТА СААСССАСАТ СССТАССТОС 3950 (ав)
ТРТОСТАСАС ТАСАОСООСО ССАТООССАА СААбОБСТСА бОосСАСТОССо ССТСТСТоСтТ 4025 со сстетоссто сссстоссос СОСАСАСССТ ССТООСТОСС АССАССАТОС ССОСТОСАСС 4080
Зо ТОоССооСсТо ОСОСААСССТ САСТТССОСС СОССОССОСС АСОбАА 4126 ї- (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Моз: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 2070 пар основ « (Б) ТИП: нуклеїнова кислота з с (БУ ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна ;» (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (її) ІППОТЕТИЧНІСТЬ: немає (їм) ВЛАСТИВІСТЬ: -І (А) ІМ'ЯЖЛЮЧ: СО5 (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 211..1362 о (Г) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /продукт- "М-ацетилорнітинза" о (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ : послідовність Мо3: - 50 (42)
Ф) іме) 60 б5
ССОТСАСТАСС ТСТОСОССАС СОТАССОССТ СОСАСССАСА АТСАССОТАТ ТСААСАТОСо 50
СОСТАТТСАС СТТІСТТАТСТ СТОСТТОССА СОСТТАААССТ ААЛАСАТТСА ССТТАСооСТ 120
ОСТСОоСтТТТТ АТТАСОСТСА АСОТТАСТОТ АТТТГТАТТС АТАААТАСТО САТСААТАТТ 180
САТАСТАТСА ТОАССАСАСО ТОТОСТСААСА АТО АЛЛА ААС ОААА ТТА ССО сССА ТТ 234
Меє пуб АБп о Пув Печ Ро Рго Ре . 1 5
АТС бАб АТТ ТАС СбС о бстТ Сто АТТ ССС АСА ССТ ОТСА АТА АбСООСС АСо 282
І1ї1е біб І1е Туї Агур А13 Пе І1їе Аїа Тіх Рго Зекх Іїє бехт Азїа ТНг Є
Й 15 20 Й
САВ САС ОСА СТО САТ САА АСС ДАТ СА САТ о ТТА АТС АСТ Сто сто боб 330 70 біз біз діа Пед Азр о Сіп бет Авп Аза Авроїем Т1іє тот бео Без Аза 25 зо 35 40
САС ОТОоб ТТТ ААА САТ ОТТО бос ТТо ААТ СТО САЛА СТО САС ССТ СТ ССА 378
Ар Тер РБе ПцубБ Ар Ге біу Рпе Ахп о Маї бі Маї бібогго Маї рРкго 45 50 55
СБА АСТ ССС ААС о ААА ТТО ААТ АТС СТО ССА АСТ АТС ббА САС боб ост 426 біу ть Агу Азп о Бук Рбе Ап Меє Мем Аїа бег І1їе біу біп Сіу Аза 75 бо 65 Й 70 собсоосс о тто тТто сто бсСо ббб САТ АСС бАТ АСО сто СсСА ТТ САТ САС аті4
СсіУу біу Пей Пе премї Аза біу Нів ТагоАбБр ТВі Маї Рго РБпе Авр о АБр 75 во 85 сот Сбс тоб АС ССС САТ ССО ТТТ АСА СТО АСО САС САТ САС ОСС ААо 522 сіу Аго Тур ТЬБх Агу Абр оРго Ре Тік оПпецп Тпт йіц Нів Авр біу Був во . 95 100
СТТ ТАС бос ТТА СОС АСС ССС САС АТО ААА СОС ТтТТ о тТтТТ осо ТТ АТС 570 цеч Туг б1у Пец сі1у Тру А1їа Азр Мес Пцув Сіу ве Рре Аза Ріе Ії116 105 110 115 120
СТЕ САТ ССО СТА СОС САТ ТС САС СТО АС АЛА СТО ААА АЛЛА ССо Сто 618
Без Азр А1а цеч Ак Азр оМаї Азр о Маї ТВт Бу Бе Був Буз Рго Пен 125 130 135 се
ТАС АТТ СТО ССО АСТ ОСТ бАТ САА САЛА АС АСТ АТО ССС СбА особ сот 666
Тук Іїє Прес Аїа Тиг А)а Ар бі бі Трг одер Меє Ата Сіу діа лго Ге) 140 145 150
ТАТ ТТТтТ бос о сАА АСТ оС бос сто сосС ССб САТ тТОоС СсС АТО АТ бос 714
Тут Рпе Аза біб ТЬБІ ТВі Аза реп дкго Рко Авр о Сув Аїа ї11е їіє біу 155 160 165 («в
САА СС АСС ТСА СТА САА соб СТА СОС ОСА САТ АКАД ОСТ САТ АТ тот 762 біо Рго Тьгобег беш б)іп Ріо Ма) Ахоу Ліа Ні Пувє біу Ніз 11е Бек - 170 175 180
ААСОБСС АТС ССТ АТТ САб бос сло Тов боб САС ТОС АОС САТ СсСА СсА 810
Авзп А1а 112 Аго ї1е біп біу біп бех Сіу Ні бег беї Ар Рго А1а 185 190 195 200 с
СОС БА СТТ ААС ОСТ АТС САА СТА АТО САС САС СОС АТС ббо САТ АТ 858
Мт сіу Уа) деп Аза ІЗе Сім цеш Мех Ні Авр діа І1є Сб1у Ніє 112 - 295 210 215
ТТ САЛА ОТТО СОС ОбАТ ААС СТО ААА САА ССТ ТАТ САС ТАС САЛА соб оттт 906
Без біп Без Ак А5р о Азло без Бу бій Аа Туг Ніз Тут біб Аїа Ре 220 225 230 й «
АСС СТО ССА ТАС ССТ АСО СТО ААС СТО бо САТ дТТ САС обстТ сос сс 954
ТЬг Хаї Ркго Туг Рго ТБгоГеп Абп Бен біу Ніб Ііїе Ні Сіу Сіу Авр шщ 235 240 245 с ОСТ ТСТ ААС ОСТ АТТ ТоС ССТ о ТоС ТОТ САС ОТТО САТ АТО САТ АТТ ОсстТ 1902
Аїа бек АБп о Ако І1іве Суб Аза Сув Су5 Сі цей Нів Меї Ар ї16 Ага "з 250 255 260 п соб сто ССтТ ОСС АТО АСА СТО ААТ бАА СТТ ААТ соСТ ТО СТО АС ОбАТ 1050
Рто Ге Рго Сіу Меє Тв цей Азп бій Пем Азп біу Бей рез Азп Ар 265 270 275 780 -І ссА тт ссСтТ сСсСо сто АбС САЛА СОС ТосС сСсо ост сстТ СТО Со сто БАС 1088
Аіїа пем Аіз Рго Маї бек бі Агу Ткр о Рго біу Агу Бех тТпг Ма1ї А5р о 285 230 235
САС СТО САТ СС СОС АТС ССТ бос ТАТ САА ТОС ССА ССб ААТ САТ САА 1146 о бі» беч Ні Рго Рго Її Рго сіу Тук бі Суб Рго Рко Абп Ні сіп 302 . 305 310 -І 20 СТО СТТ бАд сто СТтТ САС ААА ТТ СТО ОбА ССА ААА АСС ОСА сто сто 1194
Бец маї біз маї Уаї СВ Пуз ей опец біу АтТа Буз Тптх січ Маї Ма) 315 320 325
ААС ТАС ТСТ АСС САЛА ССб ССО ТТТ АТТ САЛА Со тТтТА ТОоС соб Ас сто 1242
АзпоТугт Сув Тпх Сі Аїа Рго Ре ї1є біп Тпу Без Суз Рго ТПхоТєо 330 335 зао сто тТтТо соб ССТ БОС ТСА АТТ ААТ САС ОСТ САТ САА ССТ САТ САА ТАТ 1290
Уаї ео Сіу Рго біу бек Іїе Аяп бір А1іа Нів біп Рго Азр бій Туг 345 350 355 360
СТО БАХА АСА СОС ТТТ АТС ААб ССС АСС СОС бАА Сто АТА АСС САС СТА 1338 ко Гео сій ТВг Ага РБе ї11е Гує Рго Тпї Агу біб рез Ії11е Тих біп Маї 365 370 зт
АТТ САС САТ ТТТ ОТОС тоб САТ ТАА ААССТАСССС ССАТАдСССо стобсоссос 1392 во ТІ1е Нів Ні Вре Суб Тгр Нів " 380
АТССОССОСтТ СТТСССАДАС ТССАСТОССО СААТААТСТС ССАТОССАТС СТТоСоСАТоС 1452
ТТАТОССАСС ТАСАСТСАСТ САААССАТОС ССААСССТАб бСССбАТААС ссостеосоСс 1512
СОСАТССОСС АСТОТТОССА ААСТОСАСТО ССОСААТААТ СТСССАТОСО АТАСТТОСОоС 1572 65 АТСТТАТССС АСССАСАСТО АСТСАЛАССА ТОСССААСТО ТАбОССССАТ ААсСссССоСТСС 16122
СОССБСАТОС СОСАСТСТТо ССАААСТОСА СТОССОСААТ ААТОТСССАТ СССАТАСТТо 1692
СбСАТСТТАТ СССАССТАСА ССТТТОСТСТ ТАСТТОСОСС САТТТТТТАА САТТТССАТА 1752
АСТТАСОСТТ АТТТАААОСОо ТСОТОААТТТ ЛАТСАССТАА АТТССТеСтТА ТтТАТтТОоТТ 1812
ТОСТСАЛОСО АТІТСОСАСС ЛРТТОАСОТС АССОСТТТТА СОТООСТТТА ТААЛАСАССА 1872
СОААЛАССКА АСССССАОС ТАТТСОСОСО лАтТОоСоВвсст СААССАТАСА СООСтТАТСАА 1932
АСОАТААСАТ ССоСТоТСтТо СбОТААТАТО ААССААСЛАТ АТТССОСАТТ СССТАСТААТ 13972
СТСАСТАТОС ТСООСАААСТ ССТОСбАСАХА АССАТСААОС АТОССТТОСО АСААСАСАТТ 2052
СТТСААСОСС ТАСАААСТ 2070 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Мод: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА- 384 амінокислоти (Б) ТИП: амінокислота /5 (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: протеїн (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Мо4:
Мек руз Авп опуз Без Рго Рко Ріє І1еє біз Іїе Туг Акд Аіа Гви 112 1 5 о . 15
Аза Так оРко бет І)е бет Аза ТПт бі) бі Аза Пез АБроб3іп бех АБа 29 25 Й 30
Аїа Авєр цем ї11є Таг оПпеч Пец А1а АБвр Тур Ре Ілує Ар Пе біу Рне 35 40 45
Аве оуаї бі Уаї біп Рго Маї Рко с1у Тпг Агу АБп Пух Рпе Авп Меє 50 55 бо
Меч Аїа Бек т11е С1у біп сі1іу А1їа біу сіу рем Пец Ццеч Аїа біу Ні сем 65 та 15 80 7 о
Тк оАвр отак оуаї Рго Рве Авр о Авр о біу Ахо Ткр Так Ага Азр о Рго ле 85 зо 95
Тркгобез ТБгобішю Ні Азробіу Пу5з Пец Туг біу Пейш Сіу ТБт Аза Абр 100 105 110
Мес ух біу Рне Рпе А1їа Ріе Іїе цей Азр Аіїа Меч Агу АзроМаї Азр (ав) 115 120 125 30 їч-
Уаї ТвгоБуб Пец ім5 Пує Рго Бе Туг Ії це Аіа Тпу Аза Абр бі 130 135 140 біз ТвтІ бех Меб Аїа 05іу Аїа Агу Тут Ріпе діа бі» Твх ТБг Аза без 145 150 155 160 с
Ат Руто АвроСуб А1а І1іє І1є Сіу бі рго Твгобехт Цеу біп Рго Маї 165 170 175 35 о
Ат Аїа Ні Був б1у Ніз І1е Бек Авп Аіа ї11е Агд Ї1їе біп біу біп ів8о 185 190
Бет біу Ні5 бег Бег Азр Рхго Аіа дк біу Маї Азп Аїа Т1є 610 без 135 200 205 «
Мек Ні Авр діа І12 біу Ніз Ізїє Мем бій рес Ага АБр Авт Бей Пух 40 210 215 220 З с біч Ага Туг Ніз Тугк бій А1а Рне ТІ Уаї Рго Тук Рко Тв Бей доп 225 230 235 710 ;» п тем б1іу Ніз 1)е Ні5 біу б1іу Авр діа беї Аєд Ато 116 Сух Лід Су 245 25О 255
Суз бро Пео Нів Месє др 116 Аго Ро Пес Рго біу Меб ТЬІ Цей деп 45 260 2655 270 - І б)з цем Авпоб1іу реч цею Ази АвролЛіа Гео Ліа Рго Маї дек бій Ахта 275 280 285 о Тер Рко біу Ага Гей трі Уаї Авр обіш рем Нів Рко Рго ї11е Рго біу 290 295 300
Тук сіб Субв Рго Рго Абзп о Ніб біп о бешп Уаї біз Уа1ї аз сії Був Бей - 50 305 310 315 320
Бен сіу Аїа цув Тк обі маї Маї АБп Тут Су5 ТВк бій діа рго рве о 325 330 335
І1е біп Твх Пер Сув Рго Трг опе Уа! Без Ссіу Рко біу бех І1е деп 340 345 350
Сіп Аіа Нів біп Рго Ар обі Туг Ге біб Тег АтЯ Рпе 118 Був РІЗ 355 зво 365
ГФ) ТАх Агу біб Пе Іїє ТВвгобіп Уа) І1є Ні Кі5 Рпе Суз ТтТгр о Нів " 370 315 380 то (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Моб: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: 60 (А) ДОВЖИНА: З1п.н. (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (БУ ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ інша нуклеїнова кислота бо (А) ОПИС: /опис - "праймер для агоє"
(ії) ІППОТЕТИЧНІСТЬ: немає (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Моб:
ТАТСТАСАСС АСАССТОТСТ СААСАААТСА А 31 9 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Моб: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 26п.н. (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: інша нуклеїнова кислота (А) ОПИС: /опис - "праймер для агоє" (ії) ІППОТЕТИЧНІСТЬ: немає (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Моб:
СОТСТАСАТТ ОСООСАСТОС АОТТТС 26 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Мо?7: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: З5п.н. (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: інша нуклеїнова кислота (А) ОПИС: /опис - "праймер для агоє" (ії) ІППОТЕТИЧНІСТЬ: немає с (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовності Мо7: (5)
СОСОСАТССТ АДАСААТОАА АААСАААТТА ССОСС
(2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Мов: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: З1п.н. | «в) (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична - (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна | «в) (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: інша нуклеїнова кислота (А) ОПИС: /опис -- "праймер для агоЕ" о (ії) ППОТЕТИЧНІСТЬ: немає ї- (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Мо8:
ОСОССТАСОС ОСТТААТОСС АОСАДАДАТО С 31 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Мео: « () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 27п.н. З с (Б) ТИП: нуклеїнова кислота "» (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична " (Г) ТОПОЛОГІЯ лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: інша нуклеїнова кислота (А) ОПИС: /опис - "праймер для ТА29" - (ії) ІППОТЕТИЧНІСТЬ: немає 2) (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Ме9:
ААСТОСАОСТ ТТТТООТТАО СОСААТОС 27 о (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Мо10: -І 50 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: 35 п.н. ме, (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна 59 (ї) ТИП МОЛЕКУЛИ: інша нуклеїнова кислота
ГФ) (А) ОПИС: /опис - "праймер для ТА29" (ії) ІППОТЕТИЧНІСТЬ: немає де (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Мо10:
САСАСТАСТТ ТТАССТААТТ ТСТТТААСТА ААДАС 35 60 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Мо11: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА. 6596п.н (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична б5 (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна
(її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (її) ІППОТЕТИЧНІСТЬ: немає (їм) ВЛАСТИВІСТЬ: (А) ІМ'Я/КЛЮЧ: промотор (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 1..3790 (В) СПОСІБ ІДЕНТИФІКАЦІЇ: експериментальний (ГЛ) ІНША ІНФОРМАЦІЯ- /функція - "5'-регуляторна ділянка В200і4-2" /доказ - експериментально (їм) ВЛАСТИВІСТЬ: 70 (А) ІМ'Я/КЛЮЧ: тівзс сигнал (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 4427..6397 (В) СПОСІБ ІДЕНТИФІКАЦІЇ: експериментальний (ГЛ) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /функція- "3З'-регуляторна ділянка В200і4-2" /доказ - експериментально (їм) ВЛАСТИВІСТЬ: (А) ІМ'Я/КЛЮЧ: тівс властивість (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 3789..3791 (О ІНША ІНФОРМАЦІЯ: Липсіоп- "АТО ігапзіайоп віаг (їм) ВЛАСТИВІСТЬ: (А) ІМ'Я/КЛЮЧ: тівс властивість (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 4402..4404 (Г) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /функція- "термінація трансляції" (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Мо11:
ООАТОСТТАС АТСТТТАССТ ОСАСОТТАСТ ТАСТОСАААТ СТАДАСАСАА САССААТАСС 60
ТСААСССАСА АТОСАСААСА САТСАССАСТ СТСААСТОСТ ТАССТСАААС АСССАЛАССА 120
СААТІТТСбА ТОСААСААСТ АСАТОСАААС АССТАСТААС АААССБАСТС ТТОТАСААТО 180 с 29 ДАСТАССТАС ААТАСААСТА АЛАДАСАТОС ССААААТТТО ССОСАТССТТ ТТОСААТОСА 240 о
АССлЛААСОСТ ТТОТАСТГТТО СААСАТТОТТ СААСОТСАТТО ЛАСАТСАТТС АбСАСТАСОоС 00
АТАОСТСТОб СССАССТАСС ТОТСАЛОССТ АбОСТАбСбА АЛАдСАСОТОС ТТАССТААСА 360
СТАТТССТТА СТААССТоТТ СТТТООТТСА АССАСААЛАО АБОСААСАСТ ДАТТАОСААТ 420 ав)
АССТОСТОСТ СОТАТСТОТТ АТСАТОСААТ САТСАТСОСТ ТТТТОТТТОб ТТОСААССАА 480 М
ТОТОАССАСТ САЛАТАбССТ СССАТТСААТ САТАССТАбА ТОбОАССАТТ ААТОАТТТтТТ 5410
САСАВОССТО ТАТСАбАТСТ САСТОТОАТО САТТОСАССС ТАТТОСЛАСС АВАТТТААдОо ооо о
ТТАТСАТААС АСАТАСССАТ СТАААСТААТ САСТТСССТА ААТОССТСААЛА ССАДАСАТТА ББо Гео)
САТЛАААСТТО АТАССАТСАА ТОТААТТААА ААСТАСАТОТ САСССААТАТ ТТАТАСАССо т20 ча
СТСАССТТАТ ТОСАТАТАСА ААСТСАЛААА ТАССАСТТАА СТТТТТТТАС ААТТАТТСАТ тво
ТТАТАТАдДСС АТААТССОСТ ААТТТТАТСТ ТАСАТАТАТА ТТОСАТАСТТ СТТТТОСОСА вао
САСААТСТТО АТСАСАСОСТ ТТОСТТССТо ТСААСТСААС СААТСТАТСТ тТстТтТТоСоСсТТ 890 «
СТААСТТТСТ ТТІСАССССТО ССАЛАСТСАА СССАТТТОСС ТСССТТСАТТ ТСТОАСТТСА 950
СТІСАСАТТО ТАСАЛАСТСА АДССАСТСТСТ СТССАТТІТАС ТТСТААСТТА ССТТТАСТТТ 1020 - с СТОСАААСТО ААССОСАТСТТ ТССоТОоСтТТоА СТІТТОСТТТ ТАСТТСАТОТ ТСТАТАВАСТ 1080 :з» ССАСТАДТОС стетттстто АСТРСТТОоСтТ ТОСТТСТААТ СААСАТСАТС СТААЛААТАА 1140
АТАТСАААТА ААТАСААААА ТАСТТСТТАА ТОЛАСТТТОо АААССТАЛСС САТТОСАТТТ 1200
СТОССОСАбОСС АААТСССТАА СААСААСССС ТАОТОСОСАА ААСССТОСТС ТОААОСТАСо 1250 -І ААТССТТТСА ААТТАТСАТТ ТОСАССАСАС СТАЛААТОТТ АТОСТСААСС ТТСАСАСТТо 1320
ТОТАТТОСАС СТТАССАССТ САСТАСТТТС ОАТТТСАААТ ТТСТААТОАС СААСТТТСАА 1380 о САЛАСТСАСо ТАТАТААССА АСТТСААСОоС ТСАСТТТТОА ССАААСССАТ СТАТАСАТАС 1440 (ав) ССТОСТТТСТ ОбОТСАТАСТ ТТОСТАСТОС ТТТОАТОААА АСААСАОСТА ТІСТТОСАТО 1500 -І 50 ТТТТТАТОАА ТАЛАДССТТТ ТАТОТОААСТ СТОТТТОТАС АТОТОТОТАТ ААСССТТОСА 1560
АССААСТТАТ ССССТТОТТО АТТОТОДАСС ТТАТОАААСТ ААТТСССААС ТОАТААСТТО 1520 с сТТТТтТтТтТотТ ТІСТІСТАТТ АТОСТТТОооТ ТСАСТОСТТТ ТІОТСтТТОСА ТОоТТТАстТсТ 1680
ТОААТОСААТ ССССАТСТОТ СТТСТТАТСА ТТТТСАССАТ САТТТАСААС АТТТССААСТ 1740
СТСТАССТТА АААСТРОТТО АТСАТСАААС СЛАСТСАТТО АССТІТОСАА АСТАСТТОСТ 1800
ССАТОДЛАССА АСТОСТТААТТ ТТОТТТАСАС ДАААААТАТТ ААССАСОБАА ТОСАААСАСТО 1860
Ф) СТАААСТСТА ДАСТАСАТСА АТСТОТТСТО ТТТАААТАСТ ТСАТТАСТАЄ САСОСТОСАС 1920 ко ТТІССТТОСТтТ ТАбСАТТТоТ ТОССТТАСАТ тТОТАЛОЖТСА ТАСААСАТСО САСТОТАТСА 1950 60 б5
ТУТБАТСТСТ ААТОСТАТТТ САААСАТТОС АСТТТТТСТТ ТСАСССАТСА АЛАСТСЛАСА 2040
АТТААСТСТС ААТОТАСТТО САТТТІСТТС ТТТОААЛТОАо АТОСАСТАСС ААТТТАСААС 2100
СТАТЛАТАЛА АТАСАССАТА ААССТТАААС СССССАААСС САДАССССТА ЛАССТТОССС 2160
ССТАСТОСОС СССССОСТАА ТСАСТСАТАС АСАТОбАТТТ АСсСосссСтТтТтТо боблАоТоОоСТ 2220
ААТССОТААТ ССТОССАСАТ АТАТСАТТТТ АТТТСТТТТЕ ТТТОТАТТТТ ТТГАААСТТС 2780
САТАТТТТТА СТТТСАЛАТС ССТТОССТАТ ТТТСАЛАТТТ ССТТТСАССА СААЛСТСТТС 2340
ААКТААТССА ТАСТАТТТАТ АСАААЛАТТС ОСАТСАЛЛАС ТТТТТАСААТ ТТАСААААТТ 2400
САААТТСАЛА АССССТСАТА СОСТОСАССС СТОСОССАТС САТААСАСОС ТАбССООАТТ 7469
ТАТСААТСОС СТТССТОВСС АТТСАТОССА ОСТСОСТОСС АТОСАССААС ТАЛАТАСААТ 2520
ССАТООАТСА СААДАСТАААС ТАТОТСССАА САСТСААСАТ СТОТААСАТС АТТСсТТОТТа 2580
АССАТАТОАТ ДАТТТАСТТЄ ТСАТАЛСААЛ АТААВОААТА САССАЛЬАТС САСТТТОСТО 2640 75 СТСТІТООСЬ ТООСТСТТУА ОССООСТОСА ОСТОАСАСТС АТТАТОААСС ССТАТСАЛАТ 2700
АСТААЛАЛАА СООСТОСТТО ТОСАСАССОС ТССАЛСЛОСТ АТАССССТТТ ТАТТСТТОСС 2760
АССПАДАССА СААЛАДАССТ ДОСТТСТАСТ СОСТОСТАСА ТТТТТСТСАТ АССОтТеАТТСС 2820
АВААСАДАТА САТААТААСТ ТОТТТРТОССА ААСАЛАТТОС ААЛАТСССТО СооСстТоСсоСст 2880
АСАСААССТА АССАСАТААЛА АСАААСАСЛО СССАЛАСТОТ ТТТСАСАССА ОССЛОЛОССС 2920 тостьлодос ттоттсостт АТАССААТОС ЛОАЛОСОВАТ ТОСЛОСАСАТ ТАЛАТЕАСТА 3500
ССАССОСАТТ ТААТССССТС СААТСТОСТТ СТОЛАТТОСТ АТААССОААС АТОСОСТАЛА 3060
ССАСОССТТТ СТАТОСТІС ТСТТАЄАЛСАЄ СААТСОВАТА ААМСТССТСТ ОСТАСТТЄТТ 3120
ТТСбССОТТА АТТССТОСТО ОСТАССТТСТ ОССАТТОСАТ ССАТТСАТОС АТАСТОСТОС 3180 с 285 ТАААТТААСА ТОСТАСАТСТ ТТТАТТСТОТ САТОСТСТОС ТСАССАСТОС ТСТСАСАСАЛ 3240 о
СТОСААТТТА ТІСТОССАЄС АТАСТТАААЛА САССТСТТАТ ТОСАСТАСАС ТАССВАТАТС 3300
ТАСТАСТОТА ОСООТАСТАТ АТТТСАСАТА АСТЛОССАСТ СТАЛТТСТЬС СТСТТАТТСТ 3360
АМАССТСАТТ СААТТСАСТС СТОАСОСАСС САТОООСААС ЛАТОААТТСТ САТОСТСОСТ 3420
ТРСААСААСА САТОТАССТС СТСТОСТАСТ АСАТТАССАЄ АСТОТТТОСТ ТТАТАСАЄАС 3480 о
ТААТТІТТТАА ТІТАТСТАТТ ТТАТТТТААТ ААТТТАСАСА СТААААТАСА АТАДААТОСА 354О -
ОСААСАЛАСС АЛАСАСОСТТ ТАЛАТОСССО АТСООСТОСА АТТТТТТССА ТАСТАСТАСТ 3600 о
ССАОТААТАА САСТТАТССТ СОСТОССТСС СТТОССААСС ССТСАТСАСТ ССАСТТАТТТ 3660
ТТОСТАТАСС САТОСАЛОСТ ТСТАСАССТТ ССАСССАТОС ТТТСОССОСТ ТСТСТАТАЛА 3720 Шк з5 АТОСАСССАС ТОСАТТТССА ТАТТСТСААС СОССССААСС СТОСАССТАС ТОБАСОАСТА зво че
САССААСААА ТОСООСТСАА СААСТСТОСА СсСТТСТОоСТтТОо стТОоТОооТтТТтТ ССТСТСАСТО зво
СТТСТСТТСС ТОСЛОСТТОТ СТАСОСАЛАФС САССТСАСТО ААСССЛАТОС ТТОСТААТСС 3900 сТОТСТСТОС СТОСТРТСТо ТОТТСТОСАС ТАСТСТТААС АТТАСТССАТ САЛТТААСТА 3960 «
СААССАТТТТ АЛАСААССТА ТАТСТТТТТО ТОСТТСАТТС ТТТСТТСАТС САСОСТСТОС 4020 - с ;» п -1 (95) («в) - 50 (42)
Ф) іме) бо б5
АСТСААСААТ АДАТОСТОААОС СТОСЛОбАСА ОССТОСОСТО ААССАТСАСА АСТОоСТТТоС 4О80
ТОСТОбАТАС лЛАССАТОСТО САССОТАТОС АААСЛАССАС ССАОСАТАСО стобСОоСАСО 4140
АВАСАСССАА ССТОбАТАСо ССОБСССАСС АААСАСТСАС СССОСАТАСО СТОбБАССАТА 4200
СААССОССАТ САСССТОобТОо СССОСТАСОС ОТСТССАСАА БОдОСОССТО БАТОТОбАТОо 4250
ТОСАСОСАССО ТАТОСАОСТО ОСАЛТОСТАС ТОСТОБОТАС СОСОСАТОАСА АТОоСТОооТоб 43720
САТТОБСАСТ ССТОССБСАА АТОССААТОС ТОСТООСОТАС ССАССАССАС СОСОСОСТТА а4АЗЕо
ТОБАОСбСОоС ТАССОСАСТо СТАСТССТАС АОСАССАССА СОСОСАТАТС АТСССОСТОоо 44240
ТОСТОСАСАА СОСТАСОСТО ОССАСААСТА СОСААСАЛСАА СОССТТАТОС ТАСТТТАТОТ 4509 то ТАААТАААСС АТССАТТСТТ САТСТСАСТО АБСААТТТАА ССАСТСААСС АТСТТСАСТС 4560
ОТСТТАТТТО ТОТТАССАТА ТОТАТТСАТТ СОСТТТТАТОТТ ТААСАТОААЛТ СТАСАССССТ 46520
АТТІОТАТОТ ССААСТОСТТ ССАТОСАСАТ САЛАЛАМААА СОСАСААААА САТСАОСААА 4680
ССАТОСТТТС СТІССООТОО АССАБАТТТО СССТОАТАТТ ТАТТОАСТАА ААДАЛАТТСТ 4740
АТСТСТОССА САТТОТТТСА АСТАААЛОСТ АСАСОССТОАС АТТТТОТАСС СОдДАААТТОС 800
АКСОААААСА ТОТССААССТ СОАЛАТТАТТ ОТАТАТАТТС ТААТОСАТАТ АТАТААСОСТА 86
АТСАБААССА АААТТОТГТТС СААСТСАТТТ ТТТСАСААТО САВСАСТСАА АСАТОСАТОоС 4920
СОСОБАБССАА ССАТОСАбСТ бОСТТССССТ ОССОСТОСАА АТССТАТАСА бОССТОСТАА 4980 2 о ВСАСТССССТ ААААТТАСАТ СТТАТОТТРО ТСАТТАТОТО ТІТТТААСАТТ ТТСАТТАТТС 5950
АТОСАТОСТТТ ССАТАТААСА СТАТТІТТСАА ТТАТСАТАТТ ТОТСТАТТОТ БАСТОСТТТА 5100
ССССССотТттТ ОСТТСТАТТА СТСТТАССАТ СТОТСАСАСС СССАТТТААО ОбАСАААТАХ 5160
ССААССОТОА АСТІТТАСАА ТОТТАСАОТО ТАТАСАСАТА ААТСТСАТАА ТААТАТТАСА 9220
СТАСТРІТАС ААТОСССААС ТСТТАСАААА ТААААСАТАА АСАТААААТО ААСТААААТО 52ВО с
САТСТТТОСС СССААТААСТ СААСТОАААС АСОССАТСТА ААТСАСАТСО ААСТОСТОСТ 5340 Ге) тТОтТатоосто СТСТТОААСС ЛоСоОоТосСтТтТ СТоСТОТооОо СОСТОТОАСА САБСААСОоСТ 5400
САССТСАСАС АТСАТСАТАС СТСААСААСТ ТСТОСАСААА ССАСТСАССА ТОААТТСАдС 5460
ААТОСТОССА ОСТСАТСТТА ТСТОТАдДООС ТОАТАААСАА ТААСОСТТАА АбСТОААСАТ 5520 о
ТОСТТЕТААТ ААСТТОСТСА АДАТТТТАТТ АСТАСТТАСТ АААТОТААСТ ССАТАССАДА 5580
ССАТААТАСА ААТААТАСАА СААДААТТААТ АААТОАТСТС АТАСААТССА ААТСАСАЛАТ 5ЕгО -
ТОАСТТТААС ТТССАТААТТ ТААТССТОСС АСАСТОСТОА СТТОСТСАТО АСССТСсАССстТ 5700 ав)
СООСТАСТАТ АССАСТТТТА САСТСТОСАС АСОТТОТАСС СТОТАСССАТ ААСТСАТСТТ 5760 со
АСССАТСТОС СААСССАТСС ССАСТСССАТ АСАССТОТАС СААССААОСО АСОСАССОСА 5820
Зо АТАСТАСОАС СССТТТАСАА АСТТССАСТА ССТТОССАДА АСССОСТАСА СТТТАТОССА 5880 -
АСАССАСТТА СААСААТССС ССОТСТОАТС ССААТТОСАС СААААТСААС СССААААССТ 2340
ССТТОСАТОС ААСТССССТА СТОСССТТоС СОСТТТСССо ТААССТАСТО ТТССАСТАСС 6ово
ТТТССТЛАТТ АСТТАСССАА боостТотТсАТ ТССТСССТТА ТОСТоССАСо ТОТТТСТОАА 6обо « сСттТААССТОС АТОТТССААТ ТАВЛСАТТААТ САТОТТСАСА ТОААСАТААА ТААЛАТААСА 6120 - с ААТААТТОСА АСАТССАТАТ ААТСАТАТАТ ТААСССКЛАЛА ССАТОТОААС СААТАССААА 5180 ч » АСТАСССААС ТСАТТСАССо СТААСААОСТ АДААСАСТТАА АСАСТОСТАСО ОТОАССТАТТ 656240 " ССОТСССАТС АСААТТАДАС СТАТОСАТОА АТААСТОАТА ТТАДАСАЛСА ТТАТТОСОТА 5300
ТАЛАВОСТОСТ СААССбСАСА АСТРОССТТС ААТОСАССТОС ТАСТСААСАА СТТСТАТСТо 6360 - 45 СТООбСАССА ССАТСССССо СОСТОСАбСА АТТОСАТАТС ААССТТАТСО АТАСССТССА 6420
ССТОБАСОСО СОбССССОТА СССААТТОСС ССТАТАСТОА ОТСОТАТТАС АЛТТСАСТоС біво (95) ССОоТССТРТТ АСААССТОСТ бАСТООСААА ЛАСССТОБСО ТТАСССААСстТ тТААТССССТІ 6540 ав) ССАБСАСАТС ССССТРТСОС САОСТОССОСТ ААТАССОСААб АСОСССОСАС ССАтТсе 6596 -1 50 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ ІО Мо12 () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: «2 (А) ДОВЖИНА: З2пП.н. (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна о (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: інша нуклеїнова кислота (А) ОПИС: /опис -- "праймер для В200Ї" ко (ії) ІПОТЕТИЧНІСТЬ: немає (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Мо12: бо // дАдАСТОСАб СААТТСАСТО СТОАСОВАбО ВА 32 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Мо13: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: (А) ДОВЖИНА: З3Зп.н. (Б) ТИП: нуклеїнова кислота бо (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична
(Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: інша нуклеїнова кислота (А) ОПИС: /опис - "праймер для В200Ї" (ії) ІППОТЕТИЧНІСТЬ: немає (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовності Мо13:
ССОООАТССТ ТСТТОСТОТА СТОСТССАСС АСО 33 (2) ДАНІ ЩОДО ПОСЛІДОВНОСТІ Мо14: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛІДОВНОСТІ: 70 (А) ДОВЖИНА: 1093п.н. (Б) ТИП: нуклеїнова кислота (В) ЛАНЦЮГОВІСТЬ: одинична (Г) ТОПОЛОГІЯ: лінійна (її) ТИП МОЛЕКУЛИ: ДНК (геномна) (ії) ІППОТЕТИЧНІСТЬ: немає (їм) ВЛАСТИВІСТЬ: (А) ІМ'Я/КЛЮЧ: тівс властивість (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 1090..1092 (В) СПОСІБ ІДЕНТИФІКАЦІЇ: експериментальний (ГЛ) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /функція - "ініціація трансляції АТО" /доказ - експериментально (їх) ВЛАСТИВІСТЬ: (А) ІМ'ЯХЛЮЧ промотор (Б) РОЗТАШУВАННЯ: 1..1093 (В) СПОСІБ ІДЕНТИФІКАЦІЇ: експериментальний сч (ГЛ) ІНША ІНФОРМАЦІЯ: /функція - "5'-регуляторна ділянка Р19" /доказ - експериментально (хі) ОПИС ПОСЛІДОВНОСТІ: послідовність Мо14: і)
СТОБАССАТС ААТТТААААТ СААААСОСАА ДААСТОТААА АССТОСТОСА СЛААЛАТААС 6
СТСССААССТ ТССААЛААСС СССАССАССб ССТСССАССА ААСТОСАТТА СстТобоСоСсо 120
СААААСТАСС СТАССАЛАСА АТСАССТОАА ССТААСССАТ СТСТСАААТС ТООАТоССАС 180 ав)
Зо САБСААТСАА ССССАТОССТ ТСАСААССАА ААСААСОССО ТСАСАСАСАА ОСТТТОСАТА 240
ТТСАТСАСАС ДАСАССАААА ТААСАСТАСО ТОССТСАТТО СТТАТТТТОТ ТТОСТСАТАТ зва -
АДАСАСТАССТ ССАСТТСААС ССАСОТОТАТ АТОТСТАТОСС СОССАСТТСТ АТССТТАОСА 360 | «в)
ААСАСТАТАА АТАСАТССАТ ТСАТСТАСОТ АТСТСТСАСС СТСТТТАСТТ ТТООСТТОСА 429 Гео)
АТААТААТАС САССАААСАС АСТАССОСАС САСААТАСТА САТАТАСССА ТОСТОАТААТ 480
САТАСАСССС ТСААТТСТАС СТОТОТССАС ОТСОААСТАА САСАССООАА САТСАСОоСТОо 540 ге
СТОАТОСАВО АСАСТАССОС СТТТОБАСОС ТТООСАТСЬС СТАССТТТОб АтТоСсСсТооСА во
ТОААТСААСТ СОТОТСОТСС ОСТАОСТТСС ОССТАССАСС САСОоСАОСАО АБССАбССАО 650 «
СЬАСТААСАС СОБССААСТА ТССЬСТООАС ТТОААТОСАС САСОТССААОо сТоТоСоСсоТ 7120
СААССАТТСТ ССТСАССОТА СТСАТООСОА ОСТОСТОСАС ТТСАСТОСАТ ОСТСТАСоТС 780 - с ТАБССТАБАО ТОТТСААССО АТТСТТАСАС СоСССотТоСб СОАТТСАТТА бАСобстТОоСС 840 :з» СбСАбСТОСО СТОТТСАТТА ТОСССТОСАТ СТТТСТТТАА тТоЗСТСАССтТ сстТоостТооо Зоо
СОБСОАТСОС СОСОТАСОСТ СОСТАССТСТ СОСОССАТОС САТОСАСАТо бссоостТобо 950
ОССАСОоССо ТОССТОбССА ОСТАТАААТА ССССАбССОО САБСТОСТАС АТССАТСТСС 1020 -І 15 АСАСААСТАС САСТАСАСТС САСТОССАТС АСАСАСАСОС АСАСАССТОС ААСАССОАСА 1080 с СССТоАСссСА То шов ть ня и 1093 («в) - 50 (42)
Ф) іме) 60 б5
Засі
В5ІХІ
Забі!
Мої
Еаоі
Хтайй 10518,5саї Ога(н.222 ра св т. Ніпоїї 805 ре одн о / Нифіобв Ват : йо 0 Бад55о с 5558, Ам соя Ві, Ре бот 9147 АН. : зупро з. АТ 6 «сову вто, Краї Зпромогор ХУ свасі 740. |Ніпаїй 8743, Ара! ФМсої, 1827 |Сіаї вт42,Огаї «М Ассі 8734, Хної У а Заї 8534, Ніпані --ДЗ «РІЧ В Хної в) / 740 8188 зас - Ха , ц 10958 п.н. Е у, Р19 клон й й рес сс
У Ніваіат38 й Ре,4938
Фіг с
І. т 9336 о
Ватні оре хтаї "Мов 9177,Руці! Водій,
Засії | Амтіі,327 о 9300
З
8207, са нн - : т Ніпан 1306
У Ніпаши513 («в атр ч Ніпа!н 1586 . у Зсаї1790 со іш ї- ренеЯ | Мап,2168 3536 тн. Ж | Басуг4в8
З 2125 6658, РУ я / Мовьивви б43в,Крпі-2 В / « база ра! У вгобі гДНК й
ВАке ; у А ва17,баї ц 4 о) с ЗВО " і
Есо ке рей 6378, ба 5696,620 ши пи "» 6372,Ватні/ 5469,5асі - - Ніпан 3675 и 6334,5асі 5401,5асі Васі З870 7 5288, Маг Есовум424 5220,9са! Мдеі4576 499789 4696,5аї -і о : Фіг. 2 («в)
Claims (35)
1. Спосіб одержання гібридного насіння, який включає: (а) одержання рослини з умовною жіночою стерильністю, яка містить промотор, активний переважно в Жіночих репродуктивних органах, вибраний із групи, яка включає промотор, виділений із геномного клону о кукурудзи, що має реєстраційний номер МАК. В-21920; промотор, виділений із геномного клону пшениці, що має реєстраційний номер МКК. В-21655; і промотор, виділений із геномного клону пшениці, що має реєстраційний ю номер МКК. В-21919; функціонально з'єднаний з кодуючою послідовністю, яка кодує фермент, який каталізує перетворення прототоксину на токсин, бо (б) висаджування рослини з умовною жіночою стерильністю з чоловічою стерильною рослиною, (в) індукування жіночої стерильності застосуванням прототоксину до рослини з умовною жіночою стерильністю, і (г) одержання гібридного насіння.
2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгадана рослина є рослиною, якій за нормальних умов бо властиве самозапилення.
З. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгадана рослина є рослиною, якій за нормальних умов властиве перехресне запилення.
4. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що вищезгаданою рослиною, якій за нормальних умов властиве самозапилення, є пшениця.
5. Спосіб за п. 2, який відрізняється тим, що вищезгаданою рослиною, якій за нормальних умов властиве самозапилення, є ячмінь.
6. Спосіб за п. З, який відрізняється тим, що вищезгаданою рослиною, якій за нормальних умов властиве перехресне запилення, є кукурудза.
7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгаданим промотором, активним переважно в жіночих 7/0 репродуктивних органах, є промотор, виділений із геномного клону кукурудзи, що має реєстраційний номер
МАК. В-21920.
8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгаданим промотором, активним переважно в жіночих репродуктивних органах, є промотор, виділений із геномного клону пшениці, що має реєстраційний номер МКК. В-21655.
9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгаданим промотором, активним переважно в жіночих репродуктивних органах, є промотор, виділений із геномного клону пшениці, що має реєстраційний номер МКК. В-21919,
10. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгадану кодуючу послідовність, яка кодує фермент, який каталізує перетворення прототоксину на токсин, одержують з гена, вибраного з групи, яка складається з гена 2о агЕ, гена Р4505у-монооксигенази і гена репА.
11. Спосіб за п. 10, який відрізняється тим, що вищезгадану кодуючу послідовність одержують з гена агоєЄ.
12. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що вищезгаданим прототоксином є ацетил-фосфінотрицин.
13. Експресійна касета, яка містить промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, вибраний із групи, яка включає промотор, виділений із геномного клону кукурудзи, що має реєстраційний номер с ов МЕКІ. В-21920; промотор, виділений із геномного клону пшениці, що має реєстраційний номер МКК. В-21655; і промотор, виділений із геномного клону пшениці, що має реєстраційний номер МКК. В-21919; функціонально і) з'єднаний з кодуючою послідовністю, яка представляє інтерес, яка кодує фермент, який каталізує перетворення прототоксину на токсин.
14. Експресійна касета за п. 13, яка відрізняється тим, що вищевказану кодуючу послідовність одержують з о зо "Гена, вибраного з групи, яка складається з гена агоЕ, гена Р450.|-монооксигенази і гена репА.
15. Експресійна касета за п. 14, яка відрізняється тим, що кодуючу послідовність одержують з гена агоЕ. -
16. Експресійна касета за п. 14, яка відрізняється тим, що кодуючу послідовність одержують з гена о Р4АБбО5у-монооксигенази.
17. Експресійна касета за п. 14, яка відрізняється тим, що кодуючу послідовність одержують з гена репА. ме)
18. Експресійна касета за п. 13, яка відрізняється тим, що вищезгаданий промотор, активний переважно в ї- жіночих репродуктивних органах, виділяють із геномного клону кукурудзи, що має реєстраційний номер МАК. В-21920; і кодуючу послідовність, яка представляє інтерес, одержують з гена агоє.
19. Експресійна касета за п. 13, яка відрізняється тим, що вищезгаданий промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, виділяють із геномного клону пшениці, що має реєстраційний номер МАК. « В-21655; і кодуючу послідовність, яка представляє інтерес, одержують з гена агоє. з с
20. Експресійна касета за п. 13, яка відрізняється тим, що вищезгаданий промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, виділяють із геномного клону пшениці, що має реєстраційний номер МАК. з В-21919; і кодуючу послідовність, яка представляє інтерес, одержують з гена агоє.
21. Промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, який можна виділити з геномного клону В200і4-2, що має реєстраційний номер МЕНІ. В-21920. -І
22. Промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах за п. 21, який відрізняється тим, що вищезгаданий промотор містить нуклеотиди 1 - 1390 ЗЕО ІЮ МО:11. о
23. Промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, який можна виділити з геномного о клону Р26, що має реєстраційний номер МКК В-21655.
24. Промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах за п. 23, який відрізняється тим, що - вищезгаданий промотор має послідовність, наведену в 5ХЕО ІЮ МО:2. о
25. Промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах, який можна виділити з геномного клону Р19, що має реєстраційний номер МКК. В-21919.
26. Промотор, активний переважно в жіночих репродуктивних органах за п. 25, який відрізняється тим, що вищезгаданий промотор містить нуклеотиди 1 - 1093 ЗЕО ІЮ МО:14.
27. Рослина, яка містить експресійну касету за п. 13. Ф)
28. Рослина, яка містить експресійну касету за п. 15. ка
29. Рослина, яка містить експресійну касету за п. 18.
30. Рослина, яка містить експресійну касету за п. 19. во
31. Рослина, яка містить експресійну касету за п. 20.
32. Насіння рослини за п. 27, яке містить експресійну касету за п. 13.
33. Насіння рослини за п. 28, яке містить експресійну касету за п. 15.
34. Насіння рослини за п. 29, яке містить експресійну касету за п. 18.
35. Насіння рослини за п. 30, яке містить експресійну касету за п. 19. 65 36. Насіння рослини за п. 31, яке містить експресійну касету за п. 20.
Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних мікросхем", 2005, М 6, 15.06.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с о «в) їч- «в) со м. ші с з -І (95) («в) - 50 (42) Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US3952797P | 1997-03-03 | 1997-03-03 | |
| PCT/US1998/003838 WO1998039462A1 (en) | 1997-03-03 | 1998-02-27 | Method of hybrid seed production using conditional female sterility |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA73070C2 true UA73070C2 (en) | 2005-06-15 |
Family
ID=21905956
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA99094918A UA73070C2 (en) | 1997-03-03 | 1998-02-27 | Method for hybrid seed production with use of conditional female sterility |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0972058B1 (uk) |
| JP (1) | JP2001512988A (uk) |
| KR (1) | KR100505908B1 (uk) |
| CN (1) | CN1193098C (uk) |
| AT (1) | ATE332385T1 (uk) |
| AU (1) | AU725706B2 (uk) |
| BR (1) | BR9808824A (uk) |
| CA (1) | CA2281862C (uk) |
| DE (1) | DE69835144T2 (uk) |
| ES (1) | ES2263200T3 (uk) |
| HU (1) | HUP0002390A3 (uk) |
| IL (1) | IL131505A0 (uk) |
| MX (1) | MX9908098A (uk) |
| PL (1) | PL336800A1 (uk) |
| RU (1) | RU2222599C2 (uk) |
| TR (1) | TR199902113T2 (uk) |
| UA (1) | UA73070C2 (uk) |
| WO (1) | WO1998039462A1 (uk) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19639463A1 (de) * | 1996-09-26 | 1998-04-02 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Verfahren zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen |
| US6815577B1 (en) | 1997-03-03 | 2004-11-09 | Syngenta Participations Ag | Method of hybrid seed production using conditional female sterility |
| DK1054985T3 (da) | 1998-02-20 | 2012-07-16 | Syngenta Ltd | Produktion af hybridfrø |
| CA2321269C (en) * | 1999-10-05 | 2007-06-26 | Therese Ouellet | Corn silk gene and regulatory region |
| US6384304B1 (en) | 1999-10-15 | 2002-05-07 | Plant Genetic Systems N.V. | Conditional sterility in wheat |
| AU2001287853A1 (en) * | 2000-09-11 | 2002-03-26 | The Foundation For Research And Technology, Institute Of Molecular Biology And Biotechnology | Pest control system |
| WO2002072804A2 (en) * | 2001-03-12 | 2002-09-19 | Bayer Bioscience N.V. | Novel genes for conditional cell ablation |
| AU2002315526A1 (en) | 2001-07-06 | 2003-01-21 | Monsanto Technology Llc | Methods for enhancing segregation of transgenes in plants and compositions thereof |
| AU2003207323B2 (en) | 2002-02-26 | 2007-09-13 | Syngenta Limited | A method of selectively producing male or female sterile plants |
| WO2003087313A2 (en) | 2002-04-08 | 2003-10-23 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Enhanced silk exsertion under stress |
| DE10254165A1 (de) | 2002-11-20 | 2004-06-03 | Icon Genetics Ag | Verfahren zur Kontrolle eines zellulären Prozesses in einem multizellulären Organismus |
| WO2005001101A1 (en) | 2003-06-03 | 2005-01-06 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Conditional sterility in plants |
| CA2529614C (en) * | 2003-07-08 | 2012-05-15 | Syngenta Limited | A method of selectively producing male or female sterile plants |
| US7491811B2 (en) | 2004-01-15 | 2009-02-17 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Repressor-mediated tissue-specific gene expression in plants |
| MX2007008486A (es) * | 2005-01-13 | 2008-02-15 | Pioneer Hi Bred Int | Gen y promotor cyclo1 de maiz. |
| WO2010118477A1 (en) * | 2009-04-17 | 2010-10-21 | Molecular Plant Breeding Nominees Ltd | Plant promoter operable in endosperm and uses thereof |
| CN101658129B (zh) * | 2009-09-18 | 2012-02-01 | 云南农业大学 | 雌性不育基因fst用于杂交水稻育种的方法 |
| CA2785432A1 (en) * | 2009-12-29 | 2011-07-28 | The Board Of Governors For Higher Education, State Of Rhode Island And P Rovidence Plantations | Male and female sterility lines used to make hybrids in genetically modified plants |
| CN113429468B (zh) * | 2020-03-05 | 2023-04-18 | 山东农业大学 | 大麦雄性不育基因msg3002及其应用 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3810286A1 (de) * | 1988-03-25 | 1989-10-12 | Max Planck Gesellschaft | Transgene pflanze mit modifizierter physiologie, morphologie und modifiziertem hormonmetabolismus, gewebekulturen dieser pflanze und verfahren zu ihrer herstellung |
| EP0456706B1 (en) * | 1989-02-02 | 2005-05-04 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Molecular methods of hybrid seed production |
| DK0412006T3 (da) * | 1989-08-04 | 2001-03-05 | Aventis Cropscience Nv | Planter med modificerede blomster, frø eller embryoer |
| DE69034268D1 (de) * | 1989-08-10 | 2011-03-03 | Bayer Bioscience Nv | Pflanzen mit modifizierten Blüten |
| EP0825262A3 (en) * | 1989-12-29 | 1998-03-18 | Novartis AG | Tissue-specific toxin expression in plants |
| IL99413A0 (en) * | 1990-09-06 | 1992-08-18 | Du Pont | Compounds and constructs for producing male sterile plants |
| US5254801A (en) * | 1990-12-03 | 1993-10-19 | Monsanto Company | Heterologous dominant conditional lethal gene which is a phosphonate monoester hydrolase and use thereof in plants |
| DE4126414A1 (de) * | 1991-08-09 | 1993-02-11 | Hoechst Ag | Deacetylasegene zur erzeugung von phosphinothricin oder phosphinothricyl-alanyl-alanin, verfahren zu ihrer isolierung und ihre verwendung |
| WO1994025613A1 (en) * | 1993-05-03 | 1994-11-10 | Cornell Research Foundation, Inc. | Isolated dna elements that direct pistil-specific and anther-specific gene expression and methods of using same |
| DE19639463A1 (de) * | 1996-09-26 | 1998-04-02 | Hoechst Schering Agrevo Gmbh | Verfahren zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen |
-
1998
- 1998-02-27 HU HU0002390A patent/HUP0002390A3/hu unknown
- 1998-02-27 CA CA2281862A patent/CA2281862C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 DE DE69835144T patent/DE69835144T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 AT AT98907657T patent/ATE332385T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 CN CNB988030209A patent/CN1193098C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-02-27 MX MX9908098A patent/MX9908098A/es unknown
- 1998-02-27 KR KR19997008020A patent/KR100505908B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 AU AU63410/98A patent/AU725706B2/en not_active Expired
- 1998-02-27 ES ES98907657T patent/ES2263200T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 BR BR9808824-6A patent/BR9808824A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 PL PL98336800A patent/PL336800A1/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 EP EP98907657A patent/EP0972058B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-02-27 RU RU99120671/13A patent/RU2222599C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-02-27 JP JP53860398A patent/JP2001512988A/ja not_active Ceased
- 1998-02-27 WO PCT/US1998/003838 patent/WO1998039462A1/en active IP Right Grant
- 1998-02-27 IL IL13150598A patent/IL131505A0/xx unknown
- 1998-02-27 TR TR1999/02113T patent/TR199902113T2/xx unknown
- 1998-02-27 UA UA99094918A patent/UA73070C2/uk unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2281862C (en) | 2014-09-30 |
| AU6341098A (en) | 1998-09-22 |
| HUP0002390A3 (en) | 2002-08-28 |
| EP0972058A1 (en) | 2000-01-19 |
| ES2263200T3 (es) | 2006-12-01 |
| CN1193098C (zh) | 2005-03-16 |
| CN1249782A (zh) | 2000-04-05 |
| DE69835144D1 (de) | 2006-08-17 |
| PL336800A1 (en) | 2000-07-17 |
| TR199902113T2 (xx) | 1999-12-21 |
| JP2001512988A (ja) | 2001-08-28 |
| DE69835144T2 (de) | 2006-11-16 |
| EP0972058B1 (en) | 2006-07-05 |
| HUP0002390A2 (hu) | 2000-11-28 |
| ATE332385T1 (de) | 2006-07-15 |
| AU725706B2 (en) | 2000-10-19 |
| KR20000075938A (ko) | 2000-12-26 |
| BR9808824A (pt) | 2000-07-04 |
| KR100505908B1 (ko) | 2005-08-05 |
| WO1998039462A1 (en) | 1998-09-11 |
| RU2222599C2 (ru) | 2004-01-27 |
| IL131505A0 (en) | 2001-01-28 |
| MX9908098A (es) | 2000-07-01 |
| CA2281862A1 (en) | 1998-09-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA73070C2 (en) | Method for hybrid seed production with use of conditional female sterility | |
| Fry et al. | Transformation of Brassica napus with Agrobacterium tumefaciens based vectors | |
| US8124843B2 (en) | Methods and genetic compositions to limit outcrossing and undesired gene flow in crop plants | |
| US8710301B2 (en) | Method for producing male sterile plants using plant beclin 1/ATG6 expression | |
| AU2005203861B2 (en) | Method of producing sterile plant, plant obtained by using the same and use thereof | |
| RO120270B1 (ro) | Inducerea sterilităţii masculine la plante, prin expresia la nivele ridicate a avidinei | |
| MXPA99008098A (en) | Method of hybrid seed production using conditional female sterility | |
| IE904716A1 (en) | Expression of s-locus specific glycoprotein gene in¹transgenic plants | |
| US20230081632A1 (en) | Immature inflorescence meristem editing | |
| JP2002507381A (ja) | 核の雄性不稔性植物、雄性不稔性植物を作出する方法および稔性を回復するための方法 | |
| US20220275383A1 (en) | Sterile genes and related constructs and applications thereof | |
| JP3755876B2 (ja) | 選択マーカーを含まない組換え植物の作出方法、ならびに該方法により作出される組換え植物 | |
| JP6506065B2 (ja) | 葯特異的にプロモーター活性を有するｄｎａ、及びその利用 | |
| US6392123B1 (en) | Female-preferential promoters isolated from maize and wheat | |
| Metz | Transgenic broccoli (Brassica oleracea var. italica) and cabbage (var. capitata) | |
| Jordan et al. | Transformation in Linum usitatissimum L.(flax) | |
| Feng | The molecular basis of mitchondrial genome rearrangements in pearl millet and sorghum | |
| Cassan-Wang | Auxin-Dependent Transcriptional Regulation During Fruit Development | |
| MXPA00008850A (en) | Glyphosate as a gametocide | |
| MXPA97009731A (en) | Induction of male sterility in plants through the expression of high levels of avid |