DE19639463A1 - Verfahren zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Deacetylasegenen zur Erzeugung transgener Pflanzen unter Einsatz gewebespezifischer Promotoren. In diesen Pflanzen kann die Entwicklung bestimmter Pflanzenteile gezielt verhindert werden.

Phosphinothricin (PTC, 2-Amino-4-methylphosphinobuttersäure) ist ein Glutaminsynthetase(GS)-Inhibitor. PTC ist ein "Baustein" des Antibiotikums Phosphinothricyl-Alanyl-Alanin. Dieses Tripeptid (PTT) ist aktiv gegen Gram­ positive und Gram-negative Bakterien und auch gegen den Pilz Botrytis cinerea. PTT wird von dem Stamm Streptomyces viridochromogenes Tü494 produziert, der bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen unter den Nummern DSM 40736 und DSM 4112 hinterlegt und erhältlich ist. Aus der Deutschen Patentschrift 2717 440 ist bekannt, daß PTC als Totalherbizid wirkt. In der veröffentlichten Anmeldung (EP-A-0257542) ist beschrieben, wie man mit Hilfe eines Phosphinothricin-N- Acetyltansferase(pat)-Gens Herbizid-resistente Pflanzen herstellt. Die von dem pat- Gen kodierte Phosphinothricin-N-Acetyltransferase modifiziert das intrazellulär auftretende PTC und detoxifiziert das Herbizid.

Die vorliegende Erfindung beschreibt nun die Verwendung von Deacetylasegenen (dea), deren Expressionsprodukte intrazellulär N-Acetyl-Phosphinothricin (N-Ac- PTC) bzw. N-Ac-PTT deacetylieren können und so wieder antibiotisch aktiv machen zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen.

Ein N-Acetyl-Phosphinothricin-Tripeptid-Deacetylasegen läßt sich aus S. viridochromogenes Tü494 isolieren. Auf dem bereits bekannten 4.0-kb BamHl- Fragment (EP-A-0 257 542) liegt stromabwärts vom pat-Gen das dea-Gen. Dieses Gen liegt auf einem BgIII-BamHI-Fragment und ist durch die Sequenz genau bestimmt (Fig. 1 und Tab. 1). Die Proteinsequenz ist durch die DNA-Sequenz definiert.

Als Translationsstartkodon dient ein ATG-Kodon, das in Bakterien und in Pflanzen erkannt wird; die Shine-Dalgarno-Sequenz ist durch Unterstreichen hervorgehoben. Dieses Gen kodiert in der PTT-Biosynthese den letzten Schritt, die Deacetylierung von inaktivem N-Acetyl-Phosphinothricin-Tripeptid zum aktiven PTT.

Von vielen Enzymen ist bekannt, daß ihre Spezifität nicht auf ein Substrat begrenzt ist. So dient die vom pat-Gen kodierte Phosphinothricin-N-Acetyltransferase in der PTT-Biosynthese eigentlich zur Acetylierung von Desmethyl-PTC und kann aufgrund ihrer Unspezifität zur Detoxifizierung von PTC verwendet werden. Durch Überexpression des dea-Gens (mit Hilfe geeigneter Promotoren oder durch Klonierung auf high-copy-Vektoren) kann eine nicht hinreichend spezifische N- Acetyl-PTT-Deacetylase nun zur Aktivierung von N-Acetyl-Phosphinothricin eingesetzt werden.

Weitere dea-Gene lassen sich aus E. coli gewinnen. Es wurde nämlich gefunden, daß sich in E. coli - im Gegensatz zu anderen Bakterien (z. B. Rhizobien und Streptomyceten) - nach Klonierung des pat-Gens in geeignete Expressionsvektoren (Strauch et al., Gene, 63, 65-74,1988; Wohlleben et al., Gene, 70, 25-37,1988) im sogenannten PAT-Assay (Doktorarbeit Inge Broer, Fakultät für Biologie der Universität Bielefeld, Expression des Phosphinthricin-N-AcetyItransferase-Gens aus Streptomyces viridochromogenes in Nicotiana tabacum, S. 42-43,1989) keine Aktivität nachweisen läßt. Außerdem ist das pat-Gen in niedriger Kopienzahl in E. coli nicht in der Lage, PTT-Resistenz zu verleihen, da die endogene Deacetylase die Wirkung der Phossphinothricin-N-Acetyltransferase aufhebt. Schließlich kann diese Deacetylase-Aktivität durch die effektive Hemmung der GS-Aktivität nach Zugabe von N-Acetyl-Phosphinothricin direkt nachgewiesen werden. N-Ac-PTC wird durch die Deacetylase zu PTC umgesetzt, das dann in bekannter Weise die GS hemmt, was sich im y-Glutamyl-Transferase-Assay (Bender et al., J. Bacteriol. 129, 1001-1009,1977) messen läßt. Dies liegt an einer endogenen Deacetylase-Aktivität von E. coli.

Diese Aktivität sollte nicht in der argE-Mutante, die literaturbekannt ist, zu finden sein (Baumberg, Molec. Gen. Genetics 106,162-173. 1970). Weitere E. coli Deacetylase-Mutanten sind leicht selektionierbar: Nach klassischer (Delic′ et al., Mut. Res. 9, 167-182, 1970; Drake und Baltz, Ann. Rev. Biochem. 45, 11-38,1976) bzw. Tn5-Mutagenese (Kleckner, Ann. Rev. Genet. 15, 341-404, 1981) lassen sich auf mit PTT supplementiertem Minimalmedium solche Mutanten dadurch erkennen, daß nur sie nach Transformation mit einem in einen Niedrigkopienzahlvektor klonierten pat-Gen wachsen können.

Damit läßt sich das Deacetylasegen aus E. coli durch Anlegen einer Genbank in z. B. der E. coli argE-Mutante bzw. in einer neu isolierten Mutante mit herkömmlichen Verfahren (Maniatis et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982) isolieren.

Verfahren zur Isolierung weiterer Deacetylasegene ergeben sich aus dem oben Beschriebenen: Z.B. Isolierung neuer Organismen, die trotz Anwesenheit eines pat- Gens auf einem Niedrigkopienzahlvektor PTT-sensitiv sind, und anschließende Isolierung eines Deacetylasegens.

Pat- und dea-Gene können in einem weiteren Aspekt der Erfindung zusammen mit gewebespezifischen Promotoren eingesetzt werden, um die Entwicklung bestimmter Pflanzengewebe gezielt zu verhindern. Eine spezielle Anwendung ist z. B. die Herstellung weiblich steriler Pflanzen.

Die Herstellung von Hybridsaatgut in der Pflanzenzüchtung ist davon abhängig, eine Selbstbefruchtung der Mutterpflanze mit großer Sicherheit zu vermeiden. In der Natur kommen für viele Pflanzenarten männlich sterile Mutanten vor, die in der Züchtung eingesetzt werden. Der molekulare Mechanismus der cytoplasmatischen männlichen Sterilität (cms) ist bis heute nicht vollständig geklärt. Auch gibt es für viele Kultursorten, wie z. B. Beta vulgaris keine cms-Variante. Es ist daher von großem Interesse für die Landwirtschaft, auf molekulargenetischem Wege definierte sterile Mutanten aller wichtigen Kultursorten zu erzeugen. Die Firma PGS/Belgien hat in der Patentanmeldung PCT/EP 89100495 eine solche Methode vorgestellt. Sie beruht auf der Zerstörung des die Pollenmutterzellen umgebenden Gewebes (Tapetum). Zu diesem Zweck wird ein RNAse-Gen mit einem Tapetum-spezifischen Promotor (Mariani et al.; Nature 347, 737-741, 1990) fusioniert. Die ausschließliche Expression des Gens in den Tapetumzellen sorgt für die selektive Zerstörung des Gewebes und verhindert damit die Bildung reifen Pollens. Eine Pflanze, die dieses Gen trägt, sollte nur nach Fremdbefruchtung Samen bilden können.

Ein wesentlicher Nachteil dieses Systems ist die Tatsache, daß Nachkommen dieser Pflanze ebenfalls männlich steril sind und daher im Feld, wo sie auf Selbstbefruchtung angewiesen sind, keine Samen bilden können. Dies gelingt nur dann, wenn der männliche Partner der Kreuzung ein Gen trägt, das die Wirkung der RNAse in den Nachkommen aufheben kann. Dies soll nach der oben genannten offengelegten Patentanmeldung durch das barstar-Gen erfolgen. Tatsache hierbei ist, daß nur genetisch veränderte, das heißt transgene Partner in der Kreuzung genutzt werden können.

Nachstehend sind Verfahren zur Herstellung von weiblich (female) sterilen Pflanzen (fs-Pflanzen) vorgestellt, die es zulassen, transgene Mutterpflanzen mit beliebigen artgleichen Partnern zu kreuzen. Dies wird durch Kombination eines dea-Gens unter Kontrolle eines Promotors, der selektiv in den weiblichen Organen aktiv ist. gegebenenfalls in Verbindung mit einem konstitutiv exprimierten pat-Gen erreicht. Durch Applikation von PTC bzw. PTT wird gezielt die Glutaminsynthethase in den Zellen gehemmt und diese zum Absterben gebracht. Ein noch einfacheres System besteht in der Herstellung transgener Pflanzen, die lediglich ein einziges Fremd- Gen enthalten, nämlich ein dea-Gen unter Kontrolle eines gewebespezifischen, hier weiblich spezifischen-Promotors, sowie Applikation von N-Ac-PTC bzw. N-Ac-PTT auf die Pflanze.

Verallgemeinert umfaßt die Erfindung folglich die gewebespezifische Inhibierung mit Hilfe eines Deacetylasegens.

• 1) Durch Pat-Aktivität PTT bzw. PTC-resistente Pflanzen (z. B. erzeugt wie in EP 0257542 oder EP 0 242 236 beschrieben) werden mit einem Deacetylasegen unter Kontrolle des in Pflanzen gewebespezifisch aktiven Promotors transformiert. Nach Applikation von PTT oder PTC führt die Expression des Deacetylasegens zur Aufhebung der Phosphinothricin-N-Acetyltransferase-Aktivität in den entsprechenden Geweben. Diese werden dann selektiv abgetötet, während die restliche Pflanze resistent ist.

Durch Verwendung von N-Acetyl-Phosphinothricin bzw. N-Acetyl-Phosphinothricin- Tripeptid kann dieses System vereinfacht werden. Beide Substanzen sind nicht als Herbizid aktiv, werden aber von Pflanzen aufgenommen, transportiert und nicht sofort abgebaut. Eine Deacetylaseaktivität für N-Acetyl-Phosphinothricin und N- Acetyl-Phosphinothricin-Tripeptid ist bisher in Pflanzen nicht nachgewiesen. So läßt sich das oben beschriebene 2-Gen-System auf ein 1-Gen-System reduzieren und damit entscheidend vereinfachen, wie unten weiter ausgeführt: Beliebige Pflanzen können mit einem Streptomyceten-Deacetylasegen unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors transformiert werden. Nach Applikation von N- Acetyl-Phosphinothricin oder N-Acetyl-Phosphinothricin-Tripeptid führt die gewebespezifische Expression zum sofortigen Absterben des entsprechenden Gewebes.

Als gewebespezifische Promotoren können alle beschriebenen Promotoren Verwendung finden, deren selektive Expression in bestimmten Geweben, vorzugsweise den weiblichen Organen nachgewiesen ist. Der Begriff weibliche Organe umfaßt in diesem Zusammenhang den Gametophyten sowie das ihn umgebende oder benachbarte Gewebe, wie z B. Gynoceum (Fruchtblätter), Samenanlagen, Plazenta, Pistill (Fruchtknoten, Griffel, Narbe).

So beschreiben z. B. Robert et al. Stigma-spezifische Promotoren aus Raps (Robert et al., 1994), Sato et al. Pistil-spezifische Promote wurden ebenfalls beschrieben (Sato et al., 1991; Dzelzkalns et al., 1993, WO 94/25613).

Für das erfindungsgemäße Verfahren kommen jedoch auch Promotoren in Frage, die zwar nicht speziell in den weiblichen Organen aktiv sind, die jedoch in einem Gewebe exprimiert werden, das essentiell für die Entwicklung der funktionellen Blüte, des Embryos und des Samens sind.

Natürlich sind auch alle neu isolierten Promotoren mit ähnlichen Eigenschaften geeignet. Außer gewebespezifischen Promotoren können auch solche Promotoren eingesetzt werden, die einer anderen Art der Regulation (z. B. zeitlich, streßbedingt, umweltabhängig) unterworfen sind und die gewebespezifisch auftritt.

Diese Verfahren ermöglichen des weiteren die Analyse der Differenzierung der Zellregulation sowie die Erzeugung von Pflanzen in denen die Entwicklung bestimmter Pflanzenteile gezielt verhindert wurde. Das Verfahren kann vorzugsweise zur Herstellung weiblich steriler Pflanzen eingesetzt werden.

Beispiel 1 Fusion des Deacetylasekodierbereichs mit eukaryontischen Transkriptionssignalen

Aus einem E. coli Stamm wurde das Plasmid pPRI (siehe EP-0 257 542) isoliert und mit BamHl und Bglll gespalten. Die verdaute DNA wurde in einem Agarosegel aufgetrennt und ein 0.9 kb Fragment aus dem Gel isoliert. Der Vektor pROKl (Baulcombe et al., Nature 321, 446-449, 1986) wurde ebenfalls mit BamHl restringiert. Die beiden Ansätze wurden vereinigt und ligiert. Das Ligationsgemisch wurde nach E. coli S1 7.1 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791, 1983) transformiert. Auf kanamycinhaltigen Medien wachsende Kolonien wurden auf Nitrozellulosefilter übertragen und nach 12h Inkubation bei 37°C lysiert. Die DNA der Bakterien wurde auf dem Filter fixiert, das aus dem Agarosegel isolierte 0,9kb Fragment wurde durch Inkubation bei 100°C einzelsträngig gemacht. Anschließend wurde der fehlende Strang mit Klenowpolymerase und Digoxigenin markierten Nukleotiden aufsynthetisiert. Der markierte Strang wurde als Probe zur Hybridisierung mit der auf den Filter gebundenen bakteriellen DNA genutzt. Hybridisierende Klone ließen sich mit Hilfe einer Antikörperreaktion nachweisen. Die DNA der positiven Klone wurde mittels Qiagen-Lyse isoliert und mit BamHI/EcoRI sowie BamHI/HindIII verdaut. Diese Restriktion ermöglicht die Bestimmung der Orientierung des inserierten 0.9kb Fragmentes. Das Plasmid mit der Orientierung I wurde als pIB17.1, das mit der Orientierung II als pIB17.2 bezeichnet (siehe Fig. 2).

Beispiel 2 Nachweis der Deacetyliernng von N-Acetyl-PTC und N-Acetyl-PTT durch das Deacetylasegen

Es konnte gezeigt werden, daß die in dem Vektor pROKI klonierten eukaryontischen Transkriptionssignale auch eine Expression in R. meliloti, A. tumefaciens und E. coli ermöglichen.

Die Plasmide pIB17.1 und pIB17.2 wurden daher mittels 2-Faktor-Kreuzung in den Rhizobium meliloti Stamm 2011 transferriert. Durch Inkubation von R. meliloti Wildtypstämmen mit radioaktiv markiertem N-Acetyl-PTC konnte gezeigt werden, daß dieser Stamm N-Acetyl-PTC nicht deacetyliert. (Nach Inkubation von pIB17.1 tragenden Stämmen mit N-Acetyl-PTC und N-Acetyl-PTT kann die Deacetylierung mittels Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden). Es konnte ebenfalls gezeigt werden, das R. meliloti sehr sensitiv auf PTC und PTT reagiert. Daher läßt sich die Deacetylierung auch über die Hemmung der R. meliloti Glutaminsynthetasen durch das freigesetzte PTC nachweisen.

Beispiel 3 Transfer des modifizierten Deacetylasegens in Nicotiana tabacum

Das in Beispiel 1 modifizierte Deacetylasegen wurde mittels einer 2-Faktor Kreuzung nach A. tumefaciens LBA4404 transferiert. Mit den so entstandenen Stämmen LBA4404/17.1 und LBA4404/17.2 wurden Nicotiana tabacum Blattscheiben inkubiert und nach 3 Tagen auf ein Kanamycin haltiges Sprossinduktionsmedium umgesetzt. Regenerierende kanamycinresistente Sprosse können durch Southern-hybridisierung auf die Anwesenheit des Deacetylasegens getestet werden. Nach Behandlung mit N-Acetyl-PTC oder N-Acetyl-PTT werden dann die Pflanzen durch das freigesetzte PTC bzw. PTT abgetötet.

Beispiel 4 Konstruktion eines Vektors zur transienten Expression des modifizierten Deacetylasegens in E. coli und Tabakprotoplasten

Das modifizierte Deacetylasegen aus pIB17.1 und pIB17.2 wurde durch EcoRI/HindIII Verdauung aus den Plasmiden herausgeschnitten. Die restringierte DNA wurde im Agarosegel aufgetrennt und jeweils ein 0,9 kb Fragment isoliert. Der Vektor pSVB28 (Arnold und Pühler, Gene 70,171-179, 1988) wurde ebenfalls mit EcoRI/HindIII verdaut. Die beiden Ansätze wurden vereinigt und ligiert. Nach Transformation in den ß-Galactosidase-negativen E. coli Stamm JM83 zeigten alle Vektor tragenden Klone eine Blaufärbung, während Klone, die einen Vektor mit Insertion des Deacetylasegens tragen weiß blieben. Aus den so identifizierten Klonen wurde die DNA isoliert und mit EcoRI/HindIII verdaut. Anhand des Restriktionsmusters ließen sich die Klone mit dem modifizierten Deacetylasegen erkennen. Die konstruierten Vektoren tragen die Bezeichnung pIB27.1 und pIB27.2 (siehe Fig. 2). Sie liegen in E. coli mit großer Kopienzahl vor.

Beispiel 5 Transiente Expression des modifizierten Deacetylasegens in Tabakprotoplasten

Aus den in Beispiel 4 konstruierten E. coli Stämmen wurde die Plasmid-DNA isoliert. Junge Tabakblätter wurden mit Verdauungsenzymen für 20h inkubiert. Die aus dem Blattgerippe fallenden Protoplasten wurden gereinigt und in einem Transferpuffer mit Polyethylenglycol (PEG) und der isolierten DNA inkubiert. Anschließend wurden die Protoplasten gewaschen und in einer Kulturflüssigkeit (K3-Medium) aufgenommen. Nach 3 Tagen Inkubation bei schwacher Beleuchtung wurden die regenerierenden Protoplasten aufgeschlossen und die Rohextrakte mit radioaktiv markiertem N-Acetyl-PTC und N-Acetyl-PTT inkubiert. Das deacetylierte PTC bzw. PTT läßt sich über Dünnschichtchromatographie nachweisen.

Beispiel 6 Verfahren zur Erzeugung männlich steriler Kulturpflanzen unter Verwendung des Deacetylasegens aus S. viridochromogenes unter Kontrolle eines tapetumspezifischen Promotors

Das Deacetylasegen aus Streptomyces viridochromogenes wird mit einem pistilspezifischen Promotor fusioniert und über Agrobakterien vermittelte Blattscheiben-Transformation in Tabakzellen eingebracht. Die aus diesen Zellen regenerierenden Pflanzen werden zu einem beliebigen Zeitpunkt vor der Blüte mit N-Acetyl-PTC oder N-Acetyl-PTT gespritzt. Es kann gezeigt werden, daß N-Acetyl- PTC in der Pflanzenzelle stabil ist und in alle Zellen transportiert wird. Keine der beiden Substanzen hat erkennbare negative Folgen für die Wildtyppflanze. Sobald sich die ersten Pistilzellen bilden. beginnen sie mit der Expression des Deacetylasegens. Das in der Zelle gespeicherte N-Acetyl-PTC oder N-Acetyl-PTT wird durch das Enzym deacetyliert und damit in seine wirksame Form überführt. Es hemmt die Glutaminsynthetase der Zellen und führt so zu einem schnellen Absterben. Funktionsfähige Embryonen oder Samen können nicht mehr entstehen. Trotzdem wird die Entwicklung der männlichen Fortpflanzungsorgane beeinträchtigt. Zusätzlich ist auch die Bildung der Deacetylase unterbrochen. Umliegende Zellen werden nicht beeinträchtigt. Wird die Pflanze nicht mit N-Acetyl-PTC oder N-Acetyl- PTT behandelt, ist sie voll fertil. Damit erübrigt sich eine Aufhebung der fs durch ein Gen des männlichen Partners der Kreuzung. G(eichzeitig liegt eine genau definierte Mutation vor, die ohne Auswirkungen auf die Wüchsigkeit und Nutzbarkeit der Pflanze bleibt.

Referenzen:
Dzelzkalns et al., The Plant Cell, Vol 5 855-863, August 1993.

Robert et al., Plant Molecular Biology 26,1217-1222,1994.

Sato et al. The Plant Cell, Vol. 3, 867-876, September 1991

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit selektiv zerstörbaren Pflanzenteilen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Deacetylasegen unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors bringt und die betreffenden Gewebeteile durch geeignete rechtzeitige Behandlung mit N-Acetyl-PTC oder N-Acetyl-PTT zum Absterben bringt.

2. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit selektiv zerstörbaren Pflanzenteilen, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze eine PTC-Resistenz besitzt und zusätzlich ein Deacetylasegen unter Kontrolle eines gewebespezifischen Promotors erhält und die betreffenden Gewebeteile durch geeignete rechtzeitige Behandlung mit PTC oder PTT zum Absterben bringt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Deacetylasegen aus einem Bodenmikroorganismus stammt und die Pflanze mit N- Acetyl-PTC bzw. PTC behandelt wird.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Deacetylasegen unter der Kontrolle eines Promoters exprimiert wird, der spezifisch in den weiblichen Organen aktiv ist.

5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß weiblich sterile Pflanzen erzeugt werden.

6. Weiblich sterile Pflanzen oder deren Teile herstellbar nach einem Verfahren gemäß Anspruch 1.