DE69333310T2 - Anthere-spezifische cDNA-Sequenzen, genomische DNA-sequenzen und rekombinante DNA-sequenzen - Google Patents

Anthere-spezifische cDNA-Sequenzen, genomische DNA-sequenzen und rekombinante DNA-sequenzen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet Pflanzengenmanipulation. Sie betrifft hauptsächlich neue DNA-Sequenzen, die von dem Ant43D-Genomklon abgeleitet sind und die als Promotoren einer Anthere-spezifischen Transkription von assoziierten exprimierbaren und vorzugsweise codierenden DNA-Sequenzen in rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen fungieren. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner rekombinante oder chimäre DNA-Sequenzen, die die Promotoren gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten und die speziell in der Anthere einer Pflanze exprimiert werden. Die genannten rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen können zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, jedoch speziell von transgenen männlich sterilen Pflanzen, verwendet werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt ferner Anthere-spezifische cDNA-Sequenzen und genomische DNA-Sequenzen, die geeigneterweise bei der Isolierung der Anthere-spezifischen Promotorsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
  • Die Erzeugung von männlichen sterilen Pflanzen ist von ökonomischen Interesse bei der Produktion von Hybridsamen. Männliche Sterilität verhindert eine Selbstbestäubung, die andernfalls in vielen Pflanzenspezies auftritt und eine Züchtung und Hybridsamenproduktion behindert.
  • Eine Transkription von zahlreichen Pflanzengenen wird in temporaler und räumlicher Weise gesteuert. Die Regulation der Genaktivität wird durch die Wechselwirkung von trans-wirkenden Faktoren und cis-Regulatorelementen in der Promotorregion eines Gens vermittelt.
  • Von speziellem Interesse sind Gene. die hauptsächlich oder ausschließlich in dein Sexualgewebe der Pflanze, wie beispielsweise dem Anthere- oder Pollengewebe exprimiert werden. Derartige Gene können zur Expression von Polypeptiden verwendet werden, die nicht natürlicherweise in der Anthere oder den Pollen produziert werden. Beispielsweise kann die Promotorregion aus einem Anthere-spezifischen Gen zur Expression eines Polypeptids verwendet werden, das die Bildung von lebensfähigen Pollen bei Expression in den Antherezellen unterbricht, was zu einer männlichen sterilen Pflanze führt.
  • Die europäische Patentamneldung EP 0 420 819 A1 beschreibt die Verwendung eines Wun1-Gens zur Herstellung von männlichen sterilen Pflanzen.
  • Die US 5 086 169 A beschreibt die Isolierung der Promotorregion aus dein Zml3-Klon eines Pollen-spezifischen Gens von Mais und seine Verwendung zur Expression von Genen in Pollen.
  • Die internationale Patentamneldung WO 89 10 396 A beschreibt die Verwendung männlicher steriler DNAs und Anthere-spezifischer cDNAs TA13, TA26 und TA29. Die Entwicklungsexpressionsprofile von TA 13 und TA29 passten mit den durch die Anmelder isolierten beiden cDNA-Klone ANT5 bzw. ANT45 zusammen.
  • Die internationale Patentanmeldung WO 90 08 825 A beschreibt drei Gensequenzen pMS10, pMS14 und pMS18 und ihre Verwendung in rekombinanten DNA-Sequenzen mit dem GUS-Reportergen. Kein Anzeichen einer Expression ist angegeben.
  • Die internationale Patentamneldung WO 90 08 831 A beschreibt ein Unterbrechergen, das als das Säugetierentkopplungsprotein (UCP) -Gen bekannt ist, das die Atmung in Zellen hemmt.
  • Die internationale Patentanmeldung WO 90 08 828 beschreibt molekulare Methoden einer Hybridsamenproduktion, bei denen rekombinante DNA-Moleküle unter Verwendung von Pollen-spezifischen Promotoren zur Steuerung der Produktion von fertilen Pollen in Pflanzen verwendet werden.
  • Es ist folglich die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, DNA-Sequenzen, die von dem Ant43D-Genomklon abgeleitet sind und die die Anthere-spezifiscle Expression von Genen in Pflanzen zu steuern vermögen, bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, rekombinante oder chimäre DNA-Sequenzen, die die erfindungsgemäßen Promotoren enthalten, und die speziell in der Anthere einer Pflanze exprimiert werden, sowie Vektoren, die die rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen umfassen, bereitzustellen. Die genannten DNA-Sequenzen oder Vektoren können zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, jedoch speziell von transgenen männlich sterilen Pflanzen, verwendet werden.
  • Das Anthere-spezifische Genomklon Ant43D kann geeigneterweise zur Herstellung von Anthere-spezifischen Promotor-DNA-Sequenzen und zur Ligation der Promotorsequenzen in einer operablen Weise an exprimierbare DNA-Sequenzen, die für ein gewünschtes Expressionsprodukt codieren, verwendet werden.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit neue erfindungsgemäße DNA-Sequenzen, die speziell in der Anthere einer Pflanze exprimiert werden.
  • In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung eine isolierte Nucleotidsequenz im Wesentlichen aus einer Anthere-spezifischen cDNA-Sequenz. Die cDNA-Sequenz kann durch differentielles Screenen von cDNA-Bibliotheken und Auswählen der cDNA-Klone, die gemäß Beobachtung in einer hochspezifischen Weise in einem Antheregewebe exprimiert werden, erhalten werden. Die cDNA-Klone gemäß der vorliegenden Erfindung können die DNA-Sequenz SEQ. ID Nr. 3 besitzen.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung eine isolierte Genom-DNA-Sequenz mit der Bezeichnung Ant43D, die im Wesentlichen aus einer DNA-Sequenz besteht, die einem Anthere-spezifischen cDNA-Klon entspricht und somit mit der genannten Anthere-spezifischen cDNA zu hybridisieren vermag. Die erfindungsgemäße Genom-DNA-Sequenz kann somit vorzugsweise durch Hybridisieren einer Genombibliothek mit der Anthere-spezifischen cDNA-Sequenz, die als Sonde verwendet wird, erhalten werden. Die erfindungsgemäße Genom-DNA-Sequenz kann die DNA-Sequenz SEQ. ID Nr. 18 aufweisen oder durch Hybridisieren mit einer cDNA mit der DNA-Sequenz SEQ. ID Nr. 3 erhalten werden.
  • Das Genom cDNA-Klon wird vorzugsweise als Quelle zur Isolierung von DNA-Sequenzen verwendet, die als Promotoren einer Anthere-spezifischen Transkription von assoziierten exprimierbaren und vorzugsweise codierenden DNA-Sequenzen in rekombinanten oder chimären DNA-Konstrukten fungieren.
  • Es ist selbstverständlich, dass die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen, sobald sie identifiziert worden sind, jedes Mal nicht neu aus einer geeigneten Quelle isoliert werden müssen, sondern selbstverständlich sehr einfach zu jeder Zeit mit Hilfe bekannter chemischer Verfahren synthetisiert werden können. Geeignete Verfahren zur Synthese kurzer DNA-Oligonucleotide, beispielsweise die Phosphotriester- oder Phosphitmethode, sind dem Fachmann auf dein einschlägigen Fachgebiet bekannt. Heutzutage ist der Großteil der Oligonucleotidsynthesen mechanisiert und automatisiert, sodass kurze DNA-Fragmente in kurzer Zeitdauer hergestellt werden können.
  • Durch Deletion, Insertion oder Substitution eines oder mehrerer Basenpaare in den oben genannten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen können folglich sehr leicht Varianten oder Mutanten der Sequenzen hergestellt und bezüglich ihrer Eignung als Anthere-spezifische Promotorsequenz untersucht werden.
  • Ein speziell geeignetes Verfahren der Herstellung von spezifischen Mutanten ist die so genannte Oligonucleotid-vermittelte Mutagenese. Bei diesem Verfahren werden kurze Oligonucleotidfragmente synthetisiert, die sich, auch wenn sie im Wesentlichen zu der Sequenz vom Wildtyp homolog sind, davon in einzelnen Nucleotiden unterscheiden. Die genannten Unterschiede können Insertionen, Deletionen, Inversionen oder eine Substitution eines oder mehrerer Nucleotide sein und sie können eine Kombination der oben genannten Verfahren sein. Diese mutierten Fragmente ersetzen dann die homologen Gegenstücke in dem Gen vom Wildtyp gemäß den allgemein bekannten Verfahren. Das Endkonstrukt kann anschließend wie oben beschrieben in einen geeigneten Pflanzenexpressionsvektor kloniert werden und in eine Pflanze transformiert werden.
  • Die Mutation bestimmter DNA-Fragmente kann jedoch auch vorzugsweise unter Verwendung der Polymerasekettenreaktionen (PCR) durchgeführt werden. Bei diesem in vitro Prozess werden chemisch synthetisierte Oligonucleotide, die im Allgemein von den peripheren Regionen des zu mutierenden DNA-Fragments herstammen und strangspezifisch sind. Unter geeigneten Bedingungen erfolgt eine Hybridisierung der Oligonucleotide mit den komplementären Regionen auf den DNA-Einzelsträngen, die durch Denaturieren produziert werden. Die auf diese Weise gebildeten Doppelstrangregionen werden als Primer für die nachfolgende Polymerasereaktion verwendet.
  • Bei diesem Verfahren können neben DNA-Polymerasen aus E. coli speziell wärmestabile Polymerasen aus thermophilen Bakterien, wie Thermus aquaticus, verwendet werden.
  • In einer weiteren Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung isolierte rekombinante oder chimäre DNA-Sequenzen, in denen eine aus der erfindungsgemäßen Anthere-spezifischen Genom-DNA-Sequenz erhältliche Promotorregion operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist, die vorzugsweise für ein Protein codiert, von dem gewünscht wird, dass es in den Antherezellen exprimiert wird. Beispielsweise können die isolierten rekombinanten DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung in einer 5'- zu 3'-Richtung eine von einer Anthere-spezifischen Genom-DNA-Sequenz ID Nr. 3 erhaltene Promotorregion umfassen, die operativ mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die für ein Polypeptid codiert, das die Bildung lebensfähiger Pollen bei Expression in den Antherezellen unterbricht. Die erhaltene Pflanze vermag es nicht, lebensfähige Pollenzellen zu produzieren und ist somit männlich steril. Beispiele einer derartigen rekombinanten DNA-Sequenz umfassen chimäre Vektoren, in denen ein Anthere-spezifischer Promotor operativ mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist, die für eine Polypeptid codiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der Codiersequenz der DTA-, TURF-13-, Pectatlyase-, Ginrekombinase-, iaaL- oder cytA-Toxin-Gene besteht.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft somit des weiteren ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten DNA-Moleküls, das in einer 5'- zu 3'-Richtung eine erfindungsgemäße Anthere-spezifische Promotorregion umfasst, die operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
    • (a) Anfängliches Isolieren aus einer geeigneten Quelle oder Synthetisieren mit Hilfe bekannter Verfahren einer Promotorregion, die für die Anthere-spezifische Expression einer assoziierten exprimierbaren DNA-Sequenz verantwortlich ist, und
    • (b) operatives Verknüpfen der Anthere-spezifischen DNA-Sequenz in einer 5'- zu 3'-Richtung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz.
  • Um die Lage des durch die rekombinante DNA-Sequenz codierten Peptids in der Pflanzenzelle spezifisch zu steuern, kann die rekombinante DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung in einer 5'- zu 3'-Richtung eine Anthere-spezifische Promotorregion umfassen, die operativ mit einer Signalsequenz verknüpft ist, die operativ mit einer codierenden DNA-Sequenz verknüpft ist.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst Plasmide, die Anthere-spezifische Promotorsequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung, jedoch speziell rekombinante oder chimäre DNA-Sequenzen enthalten, in denen eine aus einer Anthere-spezifischen Genom-DNA-Sequenz erhältliche Promotorregion operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist, die vorzugsweise für ein Protein codiert, von dem gewünscht ist, dass es in den Antherezellen exprimiert wird. Diese Plasmide umfassen pCIB3178, ohne darauf begrenzt zu sein. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Promotorfragmente, die von den erfindungsgemäßen Plasmiden abgeleitet sein können, die jedoch noch diese Eigenschaften zeigen, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung essentiell sind, d. h. in der Lage sind, die Expression einer assoziierten DNA-Sequenz in einer Anthere-spezifischen Weise anzutreiben.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „abgeleitet von" einem Plasmid die physikalische Isolierung einer Nucleotidsequenz oder eines Fragments aus einem Plasmid sowie die physikalische Isolierung einer Nucleotidsequenz oder eines Fragments unter Verwendung einer zu einem der obigen Plasmide homologen Sonde oder einer unter Verwendung einiger oder aller der Nucleotidsequenzen der obigen Plasmide hergestellten synthetischen Nucleotidsequenz.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst transgene Pflanzen und die sexuelle und/oder asexuelle Nachkommenschaft hiervon, die mit einer rekombinanten oder chimären DNA-Sequenz transformiert wurden, die eine Anthere-spezifische Promotorsequenz gemäß der vorliegenden Erfindung und optional eine Signalsequenz umfasst, die operativ in einer 5'- zu 3'-Orientierung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz, jedoch vorzugsweise einer codierenden DNA-Sequenz verknüpft ist. Derartige transgene Pflanzen exprimieren das durch die chimäre DNA-Sequenz codierte Polypeptid lediglich in der Anthere der Pflanze. Wenn das codierte Polypeptid ein Polypeptid ist, das die Bildung lebensfähiger Pollen bei Expression in den Antherezellen unterbricht, vermag die transgene Pflanze keine lebensfähigen Pollenzellen zu produzieren und ist somit männlich steril. Beispielsweise können derartige transgene Pflanzen für DTA, TURF13, Pectatlyase, Ginrekombinase, iaaL oder cytA-Toxin codieren.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung männlicher steriler Pflanzen, die mit einer der obigen rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen transformiert sind.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst ferner ein Verfahren zur Herstellung eines transformierten Pflanzenmaterials einschließlich ganzer Pflanzen, das bzw. die ein rekombinantes DNA-Molekül umfasst (umfassen), das in einer 5'- zu 3'-Richtung eine Anthere-spezifische Promotorregion gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, die operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist, wobei das Verfahren im Wesentlichen die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) Anfängliches Isolieren aus einer geeigneten Quelle oder Synthetisieren mit Hilfe bekannter Verfahren einer Promotorregion, die für die Anthere-spezifische Expression einer assoziierten exprimierbaren DNA-Sequenz verantwortlich ist;
    • (b) operatives Verknüpfen der Anthere-spezifischen DNA-Sequenz in einer 5'- zu 3'-Richtung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz;
    • (c) Klonieren des Endkonstrukts in einen Pflanzenexpressionsfaktor unter der Steuerung von Expressionssignalen, die in Pflanzen aktiv sind;
    • (d) Transformieren des Expressionvektors in Pflanzenmaterial mit Hilfe bekannter Verfahren und Exprimieren desselben darin und optional
    • (e) Regenerieren des gemäß Stufe (d) transformierten Pflanzenmaterials zu einer ganzen und vorzugsweise phaenotypisch normalen Pflanze.
  • Definitionen:
  • „Anthere-spezifisch" wird verwendet, um cDNAs, genomische DNAs, Messenger-RNA-s, Promotor-DNA-Sequenzen und Gene, die mit Antheregewebe assoziiert sind, zu beschreiben. Im Falle von cDNAs, genomischen DNAs und Messenger-RNAs beschreibt „Anthere-spezifisch" die Tatsache, dass beim Testen von Northern-Blot-Hybridisierung die zu der cDNA-, genomischen DNA- oder mRNA-Sequenz entsprechende mRNA in einem Antheregewebe in Konzentrationen vorhanden ist, die mindestens das etwa 100fache der in anderen Geweben beobachteten Konzentrationen entsprechen. Im Falle von Promotor-DNA-Sequenzen beschreibt „Anthere-spezifisch" eine Regulatorsequenz, die die Transkription von assoziierten codierenden Sequenzen so steuert, dass die entsprechende Messenger-RNA in Antheregewebe in Konzentrationen vorhanden ist, die mindestens das etwa 100fache der in anderen Geweben beobachteten Konzentrationen betragen. Im Falle eines Gens beschreibt „Anthere-spezifisch" ein Gen, das in einer derartigen Weise exprimiert wird, sodass das Genprodukt in Antheregewebe in Konzentrationen vorhanden ist, die mindestens das etwa 100fache der in anderen Geweben beobachteten Konzentrationen betragen. Da Anthere- und Pollengewebe beide an der männlichen sexuellen Funktion einer Pflanze beteiligt sind, kann eine DNA-Sequenz oder ein Gen für die Zwecke der vorliegenden Erfindung als „Anthere-spezifisch" angesehen werden, wenn sie bzw. es speziell in Pollen sowie in Antheregeweben exprimiert wird.
  • „Rekombinant" und „chimär" werden jeweils verwendet, um anzugeben, dass eine DNA-Sequenz, ein Vektor oder ein Gen aus mehr als einer DNA-Sequenz verschiedenen Ursprungs, die miteinander unter Bildung einer DNA-Sequenz, eines Vektors oder eines Gens, das natürlich nicht vorkommt, verschmolzen oder legiert sind, besteht. Beispielsweise wird die Ligation einer Promotor-DNA-Sequenz aus einem Anthere-spezifischen Gen mit der codierenden DNA-Sequenz eines unterschiedlichen Gens heterologen Ursprungs als „rekombinant" oder „chimär" bezeichnet.
  • In der folgenden Beschreibung wird eine Reihe von Ausdrücken verwendet, die in der rekombinanten DNA-Technologie und in der Pflanzengenetik üblich sind. Um ein klares und gleichmäßiges Verständnis der Beschreibung und der Patentansprüche und auch des Umfangs, der diesen Ausdrücken zuzuerkennen ist, zu gewährleisten, sind die folgenden Definitionen angegeben.
  • Pflanzenmaterial: Teile von Pflanzen, die in Kultur lebensfähig sind oder die als solche lebensfähig sind, beispielsweise Protoplasten, Zellen, Callus, Gewebe, Embryos, Pflanzenorgane, Knospen, Samen usw., sowie auch ganze Pflanzen.
  • Pflanzenzellen: Strukturelle und physiologische Einheit der Pflanze, die einen Protoplasten und eine Zellwand umfasst. Die Pflanzenzelle kann in Form einer isolierten einzelnen Zelle oder als Teil einer höheren organisierten Einheit vorliegen, beispielsweise als Pflanzengewebe, Pflanzenorgan oder ganze Pflanze.
  • Protoplast: „Nackte" Pflanzenzelle, die keine Zellwand aufweist und aus Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben isoliert wurde und das Potential besitzt, zu einem Zellklon oder zu einer ganzen Pflanze zu regenerieren.
  • Pflanzengewebe: Gruppe von Pflanzenzellen, die in Form einer strukturellen und funktionellen Einheit organisiert sind.
  • Pflanzenorgan: Strukturelle und funktionelle Einheit, die mehrere Gewebe, beispielsweise Wurzel, Stamm, Blatt oder Embryo, umfasst.
  • Heterologe(s) Gene) oder DNA: Eine DNA-Sequenz, die für ein spezielles Produkt oder Produkte codiert oder eine biologische Funktion erfüllt und die von einer Spezies herrührt, die von der verschieden ist, in die das Gen insertiert werden soll. Die DNA-Sequenz wird auch als Fremdgen oder Fremd-DNA bezeichnet.
  • Homologe(s) Gen(e) oder DNA: Eine DNA-Sequenz, die für ein spezielles Produkt oder Produkte codiert oder eine biologische Funktion erfüllt und von derselben Spezies herrührt wie die, in die das Gen insertiert werden soll.
  • Synthetische(s) Gen(e) oder DNA: Eine DNA-Sequenz, die für ein spezielles Produkt oder Produkte codiert oder eine biologische Funktion erfüllt und durch synthetische Maßnahmen produziert wird.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Anthere-spezifische Nucleotidsequenzen, die von dem Genomklon Ant43D herrühren, speziell rekombinanten oder chimäre DNA-Sequenzen, die in viel höheren Mengen in der Anthere einer Pflanze als in einem anderen Gewebe exprimiert werden. Die rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen umfassen eine aus der Anthere-spezifischen Genom-DNA-Sequenz erhältliche Promotorregion, die operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist, die vorzugsweise für ein Protein codiert, von dem gewünscht wird, dass es in den Antherezellen exprimiert wird.
  • In einer speziell bevorzugten Ausführungsform codiert die codierende DNA-Sequenz für ein Polypeptid, das bei Expression in den Antherezellen die Bildung von lebensfähigen Pollen unterbricht. Bevorzugt als die codie rende DNA-Sequenz sind Sequenzen, die für ein Polypeptid codieren, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DTA, TURF13, Pectatlyase, Ginrekombinase, iaaL und cytA-Toxin besteht.
  • Die in dein erfindungsgemäßen rekombinanten oder chimären Konstrukt zu verwendenden Anthere-spezifischen Promotor-DNA-Sequenzen werden vorzugsweise aus genomischen Klonen isoliert und in einer 5'- zu 3'-Orientierung an exprimierbare DNA-Sequenzen legiert, die vorzugsweise für ein gewünschtes Proteinprodukt codieren, um chimäre Vektoren bereitzustellen, die speziell in der Anthere einer Pflanze exprimiert werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Anthere-spezifische cDNA-Klon Ant43D, das der Sequenz SEQ. ID Nr. 3 entspricht.
  • Alle weiteren nachfolgend und in den Beispielen beschriebenen cDNA- und genomischen Sequenzen dienen lediglich Beschreibungszwecken.
  • Somit können des weiteren Anthere-spezifische genomische DNA-Sequenzen entsprechend den Anthere-spezifischen cDNA-Klonen SEQ. ID Nr. 1, 5, 7, 9, 11, 13, 14 und 20 isoliert werden.
  • Des weiteren können Anthere-spezifische genomische Klone durch Verwendung von Anthere-spezifischen cDNA-Klonen als Sonden zum Extrahieren der entsprechenden genomischen DNA-Klone erhalten werden. Entsprechende genomische Klone sind solche, die transkribiert sind, um eine Messenger-RNA zu bilden, die zu einer gegebenen cDNA komplementär ist und in eine gegebene cDNA transkribiert wird. Ein Beispiel für ein derartiges genomisches Klon ist das isolierte Anthere-spezifische genomische DNA-Klon Ant32, dessen Sequenz als SEQ. ID Nr. 16 angegeben ist.
  • Mehrere cDNA-Sequenzen sind beschrieben, die als Sonden verwendet werden können, um Anthere-spezifische genomische DNA-Sequenzen zu isolieren. Beispiele sind die isolierten Anthere-spezifischen cDNA-Klone Ant32, Ant9, Ant52, Ant59, Ant66, Ant67, Ant68 und Ant43C, entsprechend den Sequenzen SEQ. ID Nr. 1, SEQ. ID Nr. 5, SEQ. ID Nr. 7, SEQ. ID Nr. 9, SEQ. ID Nr. 11, SEQ. ID Nr. 13, SEQ. ID Nr. 14 bzw. SEQ. ID Nr. 20.
  • Die Anthere-spezifischen cDNA-Sequenzen können durch Herstellen von cDNA-Bibliotheken aus Antheregewebe und Blattgewebe erhalten werden. Einzelsträngige DNA aus dein Blatt wird photobiotinyliert und an Anthere-DNA hybridisiert. Photobiotinylierte DNA wird entfernt, wobei eine bezüglich Anthere-spezifischen cDNA-Sequenzen angereicherte Bibliothek verbleibt (Beispiel 3). Anthere-spezifische cDNAs werden durch differentielles Screenen identifiziert (Beispiel 4). Die Anthere-spezifischen cDNAs werden kreuzhybridisiert, um einmalige cDNAs zu identifizieren (Beispiel 4). Eine Anthere-spezifische Expression wird durch RNA-Blot-Hybridisierung mit verschiedenen Pflanzengeweben und in situ Hybridisierung verifiziert (Beispiele 5 und 8). Eine Entwicklungsexpression, Sequenzen und die Genkopiezahl der Anthere-spezifischen cDNA-Klone wird auch bestimmt (Beispiele 6 und 7 und 9).
  • Die cDNA-Sequenzen können verwendet werden, um genomische DNA-Sequenzen zu isolieren. Wo eine partielle cDNA erhalten wurde, wurde die partielle cDNA als Sonde verwendet, um die Anthere-cDNA-Bibliothek zu screenen, um ein cDNA-Klon vollständiger Länge zu isolieren. Hybridisierende Klone werden gereinigt, restriktionskartiert und sequenziert. Ein Klon vollständiger Länge besitzt nahezu Message-Größe und weist einen vollständigen offenen Leserahmen auf. Zur Isolierung eines genomischen Klons wird eine Anthere-cDNA vollständiger Länge als Sonde verwendet, um eine genomische Bibliothek zu screenen. Durch Restriktionskartierung und Hybridisierung an die Anthere-cDNA wird die Codierregion des genomischen Klons identifiziert. Der Bereich stromauf des Codierbereichs des Klons ist die Anthere-Promotorregion. Die Anthere-spezifische Promotorregion kann durch Deletionsanalyse genauer kartiert werden. 5'-Deletionen eines Anthere-Promotors werden durch Einführung von Restriktionsstellen durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotidprimern mit Restriktionsstellen an den 5'- Enden und Anthere-Promotorsequenzen an den 3'-Enden hergestellt. Die PCR-Produkte werden verdaut, gereinigt und in pBI101 (Clontech) kloniert. Die Deletionsmutanten enthalten die 5' nicht-translatierte Leadersequenz, die an die Translationsstartstelle des GUS-Gens fusioniert ist. Interne und 3'-Deletionen der Anthere-Promotoren werden durch PCR in ähnlicher Weise hergestellt. Die PCR-Fragmente werden an einen GUS-Vektor, der den CAMV 35S Minimal-Promotor (–46 bis +1, Benfey et al., 1990) enthält, fusioniert. Transgene Pflanzen werden mit dem GUS-Florometrie- und histochemischen Assay getestet.
  • Die Anthere-spezifische Promotorregion kann geeignet zur Herstellung rekombinanter oder chimärer DNA-Konstrukte, die eine exprimierbare DNA-Sequenz, jedoch vorzugsweise eine codierende DNA-Sequenz, die speziell in der Anthere einer Pflanze exprimiert wird, umfassen, verwendet werden.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt somit des weiteren rekombinante DNA-Sequenzen, die in einer 5'- zu 3'Richtung eine von einer Anthere-spezifischen genomischen DNA-Sequenz ID Nr. 3 erhaltene Promotorregion umfassen, die operativ mit einer codierenden DNA-Sequenz verknüpft ist. Die rekombinanten DNA-Sequenzen führen zu einer Anthere-spezifischen Expression der assoziierten exprimierbaren DNA, die vorzugsweise eine codierende DNA-Sequenz ist, die für ein Strukturgen codiert.
  • Die erfindungsgemäße codierende DNA-Sequenz kann eine beliebige DNA-Sequenz mit Codierung für ein gewünschtes Polypeptid sein. Bevorzugt innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise alle die Strukturgene, die zu einer Schutzwirkung in den transformierten Pflanzenzellen und auch in den sich daraus entwickelnden Geweben und speziell in den Pflanzen führen, beispielsweise zu einem erhöhten Schutz gegenüber Pathogenen (beispielsweise phytopathogenen Pilzen, Bakterien, Viren usw.), einer erhöhten Beständigkeit gegenüber Chemikalien [beispielsweise gegenüber Herbiziden (z. B. Triazinen, Sulfonylharnstoffen, Imidazolinonen, Triazolpyrimidinen, Bialaphos, Glyphosat usw.), Insektiziden und anderen Bioziden], zu einer erhöhten Beständigkeit gegenüber widrigen Umweltfaktoren (beispielsweise Wärme, Kälte, Wind, widrigen Bodenbedingungen, Feuchtigkeit, Trockenheit usw.).
  • Des weiteren können die innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung zu verwendenden codierenden DNA-Sequenzen solche sein, die zur Produktion von gewünschten und geeigneten Verbindungen in der Pflanzenzelle führen.
  • Gene, die auch innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen beispielsweise die, die zu einer erhöhten Bildung von Reservesubstanzen oder gelagerten Substanzen in Blättern, Samen, Knospen, Wurzeln, Stämmen usw. oder in den Proteinkörpern von Samen führen. Die wünschenswerten Substanzen, die durch transgene Pflanzen hergestellt werden können, umfassen beispielsweise Proteine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Vitamine, Alkaloide, Flavine, Duftstoffe, Färbestoffe, Fette usw.
  • Mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz assoziiert können auch Strukturgene sein, die für pharmazeutisch akzeptable aktive Substanzen, beispielsweise Hormone, Immunomodulatoren und andere physiologisch aktive Substanzen, codieren.
  • Speziell bevorzugt zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind jedoch codierende DNA-Sequenzen, die für die Produktion eines Polypeptids codieren, das bei Expression in Antheregewebe zu der Unfähigkeit der Pflanze führt, lebensfähige Pollen zu produzieren. Beispiele für derartige codierende DNA-Sequenzen umfassen die Gene, die in den folgenden Literaturstellen beschrieben sind, deren Offenbarungen hiermit durch in Bezugnahme in der dort angegebenen vollständigen Weise aufgenommen sind:
    • a) Diphtherietoxin-A-Kettengen (DTA), das eine Proteinsynthese hemmt, Greenfield et al., 1983, Palmiter et al., 1987.
    • b) Pectatlyasegen pelE von Erwinia chrzsanthemi EC16, das Pektin abbaut und eine Zelllyse bedingt. Keen et al., 1986.
    • c) T-urf13 (TURF-13)-Gen aus cms-T-Maismitochondriengenomen; dieses Gen codiert für ein Polypeptid mit der Bezeichnung URF13, das Mitochondrien oder Plasmamembranen spaltet. Braun et al., 1990, Dewey et al., 1987 und Dewey et al., 1986.
    • d) Ginrekombinasegen aus Phagen-Mu-Gen, das für eine stellen-spezifische DNA-Rekombinase codiert, die Genomumlagerungen und einen Verlust von Zelllebensfähigkeit bei Expression in Zellen von Pflanzen bedingt. Maeser et al., 1991.
    • e) Indolessigsäurelysinsynthetasegen (iaaL) von Pseudomonas syringae, das für ein Enzym codiert, das Lysin zu Indolessigsäure (IAA) konjugiert. Bei Expression in den Zellen von Pflanzen bedingt es eine veränderte Entwicklung infolge der Entfernung von IAA aus der Zelle mittels Konjugation. Romano et al., 1991, Spena et al., 1991, Roberto et al., 1990.
    • f) CytA-Toxin-Gen aus Bacillus thuringiensis Israeliensis, das für ein Protein codiert, das moskitozid und hämolytisch ist. Bei Expression in Pflanzenzellen bedingt es den Tod der Zelle infolge Spaltung der Zellmembran. McLean et al., 1987, Ellar et. al., US 4 918 006 A (1990).
  • Die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen rekombinanten DNA-Sequenzen können des weiteren in einer 5'- zu 3'-Richtung eine aus einer Anthere-spezifischen genomischen DNA-Sequenz ID Nr. 3 erhaltene Promotorregion umfassen, die operativ mit einer Signalsequenz verknüpft ist, die operativ mit einer codierenden DNA-Sequenz verknüpft ist. Die Signalsequenz ist für den spezialisierten Transport des assoziierten Peptids in der Pflanzenzelle verantwortlich.
  • Die Signalsequenz kann eine beliebige DNA-Sequenz sein, die den Transport eines assoziierten Polypeptids in ein oder mehrere der zellulären Kompartments steuert. Die Signalsequenz ist vorzugsweise eine Sequenz, die in ein Signalpeptid translatiert wird, das aus dem Peptid abgetrennt wird, nachdem der Durchtritt des Peptids vollständig ist. Signalsequenzen eignen sich zur Steuerung des Polypeptidprodukts der codierenden DNA-Sequenz zu einem gewünschten Ort in der Zelle, beispielsweise den Mitochondrien oder dein endoplasmatischen Reticulum oder zur Steuerung eines extrazellulären Transports außerhalb der Zelle. Zu den erfindungsgemäß geeigneten Signalsequenzen gehören beispielsweise die Signalsequenz aus dein Patogenese-related Gen (PR-1) von Tabak, das bei Cornellisen et al., 1986, beschrieben ist, die Hefemitochondrien-Präsequenz, Schmitz et al., 1989, die Signalsequenz aus Pflanzenmitochondrien Rieske-Eisen-Schwefel-Protein, Huang et al., 1991, Mitochondrien- und Chloroblasten-Target-Peptide, von Heijne et al., 1989. Die Identifizierung anderer Leader-Sequenzen ist aus dein einschlägigen Fachgebiet bekannt. Vgl Della-Cioppa et al., 1987, Schekman, 1985.
  • Die verschiedenen Bereiche der Sequenz können miteinander durch per se bekannte Verfahren zur Bildung einer vollständigen codierenden DNA-Sequenz verknüpft werden. Geeignete Verfahren umfassen beispielsweise die in vitro Rekombination von DNA-Sequenzen mit homologen Bereichen und die in vitro Verknüpfung von Restriktionsfragmenten.
  • Als Klonierungsvektoren werden im Allgemeinen Plasmid- oder Virus- (Bakteriophagen) Vektoren mit Replikations- und Steuerungssequenzen, die von Spezies herrühren, die mit der Wirtzelle kompatibel sind, verwendet.
  • Der Klonierungsvektor trägt im Allgemeinen einen Replikationsursprung, insbesondere einen Replikationsursprung, der in E. coli, in Agrobacterium oder in beiden zu funktionieren vermag, und darüber hinaus spezifische Gene, die zu phaenotypischen Auswahlmerkmalen in der transformierten Wirtzelle, insbesondere zu einer Resistenz gegenüber Antibiotika oder gegenüber spezifischen Herbiziden führen. Die transformierten Vektoren können auf der Basis dieser phaenotypischen Macker nach Transformation einer Wirtzelle ausgewählt werden.
  • Auswählbare phaenotypische Marken, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen beispielsweise eine Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin, Hygromycin, Kanamycin, Methotrexat, G418 und Neomycin, diese Liste, die als Beispiel angegeben ist, soll jedoch den Gegenstand der vorliegenden Erfindung nicht einschränken.
  • Geeignete Wirtzellen im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Prokarzyonten, einschließlich Bakterienwirten, z. B. A. tumefaciens, E. coli, S. typhimurium und Serratia marcescens, sowie ferner Cyanobakterien. Eukaryontische Wirte, wie Hefen, Mycelium-bildende Pilze und Pflanzenzellen, können auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
  • Das Splicen der erfindungsgemäßen Hybridgenkonstruktion in einen geeigneten Klonierungsvektor wird unter Verwendung von Standardverfahren, beispielsweise den bei Maniatis et al. (1982) oder Sambrook et al. (1989) beschriebenen, durchgeführt.
  • Die Klonierungsvektoren und die mit diesen Vektoren transformierte Wirtzelle werden im Allgemeinen verwendet, um die Zahl der Kopien der darin klonierten Konstrukte zu erhöhen. Mit einer erhöhten Zahl von Kopien ist es möglich, den die Hybridgenkonstruktion tragenden Vektor zu isolieren und und beispielsweise zur Insertion der chimären Gensequenz in eine Pflanzenzelle herzustellen.
  • In einer weiteren Verfahrensstufe werden diese Plasmide zur Insertion der Strukturgene, die für ein gewünschtes Genkonstrukt codieren, oder nicht codierender DNA-Sequenzen mit einer Regulatorfunktion in eine Pflanzenzelle und optional zur Integration derselben in das Pflanzengenom verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt folglich ferner die Produktion von Empfängerpflanzenzellen, die das genannte Strukturgen oder andere wünschenswerte Gene oder Genfragmente oder andere geeignete DNA-Sequenzen, die in ihr Genom eingebaut sind, umfassen.
  • Eine Zahl von sehr wirksamen Verfahren zur Einführung von DNA in Pflanzenzellen ist entstanden, die auf der Verwendung von Gentransfervektoren oder auf direkten Gentransferprozessen basieren.
  • Ein mögliches Verfahren umfasst beispielsweise das In-Kontakt-Bringen von Pflanzenzellen mit Viren oder mit Agrobacterium. Dies kann durch Infizieren von sensitiven Pflanzenzellen oder durch Cokultivierung von Protoplasten, die von Pflanzenzellen abgeleitet sind, erfolgen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann auch Cauliflower-Mosaik-Virus (CaMV) als Vektor zur Insertion der erfindungsgemäßen chimären Genkonstruktion in eine Pflanze verwendet werden.
  • Ein weiteres Verfahren der Insertion der erfindungsgemäßen chimären Genkonstruktion in eine Zelle verwendet die Infektion der Pflanzenzelle mit Agrobacterium tumefaciens und/oder Agrobacterium rhizogenes, das mit der Genkonstruktion transformiert wurde. Die transgenen Pflanzenzellen werden anschließend unter geeigneten Kulturbedingungen, die dein Fachmann auf dein einschlägigen Fachgebiet bekannt sind, kultiviert, sodass sie Schösslinge und Wurzeln bilden und schließlich ganze Pflanzen gebildet werden.
  • Unter Verwendung neu entwickelter Transformationstechniken wurde es im Prinzip auch möglich, in vitro Pflanzenspezies, die keine natürlichen Wirtpflanzen für Agrobacterium sind, zu transformieren (Grimsley NH et al. (1987)). Beispielsweise sind einkeimblättrige Pflanzen, insbesondere die Getreidespezies und verschiedene Gräser, nicht natürliche Wirte für Agrobacterium.
  • Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die so genannte Blattscheibentransformation unter Verwendung von Agrobacterium (Horsch et al. (1985)). Sterile Blattscheiben aus einer geeigneten Targetpflanze werden mit Agrobacteriumzellen, die eine der erfindungsgemäßen chimären Genkonstruktionen umfassen, inkubiert und anschließend werden sie in oder auf ein geeignetes Nährmedium übertragen. Speziell geeignete und folglich im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt sind LS-Medien, die durch die Zugabe von Agar verfestigt und mit einem oder mehreren der üblicherweise verwendeten Pflanzenwachstumsregulatoren, insbesondere denjenigen, die aus der Gruppe der Auxine ausgewählt sind, die aus a-Naphthylessigsäure, Picloram, 2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure, 2,4-Dichlorpehenoxyessigsäure, Indol-3-buttersäure, Indol-3-milchsäure, Indol-3-bernsteinsäure, Indol-3-essigsäure und p-Chlorphenoxyessigsäure besteht, und aus der Gruppe der Cytokine ausgewählt sind, die aus Kinetin, 6-Benzyladenin, 2-Isopentenyladenin und Zeatin besteht, angereichert sind. Die bevorzugte Konzentration von Auxinen und Cytokinen liegt in einem Bereich von 0,1 mg/l bis 10 mg/l.
  • Nach einer Inkubation für mehrere Tage, jedoch vorzugsweise nach Inkubation für 2 bis 3 Tage, bei einer Temperatur von 20°C bis 40°C, vorzugsweise von 23°C bis 35°C und spezieller bei 25°C, und in diffusem Licht werden die Blattscheiben auf ein geeignetes Medium zur Schösslinginduktion überführt. Besonders bevorzugt für die Auswahl von Transformanten ist ein LS-Medium, das kein Auxin, jedoch statt dessen Cytokinin enthält, und dem eine selektive Substanz zugegeben wurde. Die Kulturen werden im Licht gehalten und in geeigneten Intervallen in frisches Medium überführt, jedoch vorzugsweise in Intervallen von einer Woche. Sich entwickelnde grüne Schösslinge werden herausgeschnitten und weiter in einem Medium kultiviert, das induziert, dass die Schösslinge Wurzeln bilden. Speziell bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist ein LS-Medium, das kein Auxin oder Cytokinin enthält, dein jedoch eine selektive Substanz zur Selektion der Transformanten zugegeben wurde.
  • Neben einer Agrobacterium-vermittelten Transformation ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, direkte Transformationsverfahren zu Insertionen der erfindungsgemäßen Genkonstruktionen in Pflanzenmaterial zu verwenden.
  • Beispielsweise kann das in einem Vektor enthaltene genetische Material direkt in eine Pflanzenzelle, beispielsweise unter Verwendung von rein physikalischen Verfahren, beispielsweise durch Mikroinjektion unter Verwendung von fein gezogenen Mikropipetten (Neuhaus et al. (1987)), oder durch Bombardieren der Zellen mit Mikroprojektilen, die mit der transformierenden DNA beschichtet sind („Microprojectile Bombardment", Wang Y-C et al. (1988)) insertiert werden.
  • Weitere mögliche Verfahren zum direkten Transfer von genetischem Material in eine Pflanzenzelle umfassen die Behandlung von Protoplasten unter Verwendung von Verfahren, die die Plasmamembran modifizieren, beispielsweise die Behandlung mit Polyethylenglycol. eine Wärmeschockbehandlung oder eine Elektroporation oder eine Kombination dieser Verfahren (Shillito et al. (1985)).
  • Ein weiteres Verfahren zur direkten Einführung von genetischem Material in Pflanzenzellen, das auf rein chemischen Verfahren basiert und ermöglicht, dass die Transformation sehr wirksam und rasch durchgeführt wird, ist bei I. Negrutiu et al. (1987) und bei G. Goodall et al, beschrieben.
  • Ferner geeignet für die Transformation von Pflanzenmaterial ist ein direkter Gentransfer unter Verwendung einer Cotransformation (R. J. Schocher et al. (1986)).
  • Die Liste von möglichen Transformationsverfahren, die oben als Beispiel angegeben ist, beansprucht nicht, vollständig zu sein und soll den Gegenstand der vorliegenden Erfindung in keinster Weise einschränken.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst folglich auch transgenes Pflanzenmaterial, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Protoplasten, Zellen, Calli, Geweben, Organen, Samen, Embryos, Ovuli, Zygoten usw. und insbesondere ganzen und vorzugsweise männlichen sterilen Pflanzen, die mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren transformiert wurden, und die erfindungsgemäße rekombinante DNA in exprimierbarer Form umfassen, besteht sowie Verfahren zur Herstellung des genannten transgenen Pflanzenmaterials.
  • Das Verfahren zur Herstellung von transformiertem Pflanzenmaterial einschließlich ganzer Pflanzen, die ein Expressionsprodukt umfassen, das in einer Anthere-spezifischen Weise exprimiert wird, umfasst im Wesentli chen die folgenden Stufen:
    • (a) Anfängliches Isolieren aus einer geeigneten Quelle oder Synthetisieren mit Hilfe bekannter Verfahren einer DNA-Sequenz, die für die Anthere-spezifische Expression einer assoziierten exprimierbaren DNA-Sequenz verantwortlich ist;
    • (b) operatives Verknüpfen der Anthere-spezifischen DNA-Sequenz in einer 5'- zu 3'-Richtung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz;
    • (c) Klonieren des Endkonstrukts in einen Pflanzenexpressionsvektor unter der Steuerung von in Pflanzen aktiven Expressionssignalen;
    • (d) Transformieren des Expressionsvektors in Pflanzenmaterial mit Hilfe bekannter Verfahren und Exprimieren desselben darin und optional
    • (e) Regenerieren des gemäß Stufe (d) transformierten Pflanzenmaterials zu einer ganzen und vorzugsweise phänotypisch normalen Pflanze.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst somit auch transgene Pflanzen und die sexuellen und/oder asexuellen Nachkommen hiervon, die mit einer erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Sequenz, die den Promotorbereich von einer Anthere-spezifischen genomischen DNA-Sequenz umfasst, transformiert wurden.
  • Der Ausdruck „asexuelle oder sexuelle Nachkommen von transgenen Pflanzen" umfasst gemäß erfindungsgemäßer Definition alle Mutanten und Varianten, die mit Hilfe bekannter Verfahren erhältlich sind, beispielsweise durch Zellfusion oder Mutantenselektion und die noch die charakterisischen Eigenschaften der anfänglich transformierten Pflanze zeigen, zusammen mit allen Kreuzungs- und Fusionsprodukten des transformierten Pflanzenmaterials.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft die Proliferation von Material von transgenen Pflanzen gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Proliferationsmaterial von transgenen Pflanzen wird erfindungsgemäß als beliebiges Pflanzenmaterial definiert, das sexuell oder asexuell in vivo oder in vitro vermehrt werden kann. Speziell bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Protoplasten, Zellen, Calli, Gewebe, Organe, Samen, Embryos, Eizellen, Zygoten zusammen mit einem beliebigen von transgenen Pflanzen erhaltenen anderen Vermehrungsmaterial.
  • Beschreibung der Sequenzen
  • Die Sequenz 1 ist eine Nucleotidsequenz eines Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant32.
  • Die Sequenz 2 ist die Aminosäuresequenz des durch die Ant32-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 1 codierten Polypeptids.
  • Die Sequenz 3 ist die Nucleotidsequenz des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant43D.
  • Die Sequenz 4 ist die Aminosäuresequenz des durch die Ant43D-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 3 codierten Polypeptids.
  • Die Sequenz 5 ist die Nucleotidsequenz des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant9.
  • Die Sequenz 6 ist die Aminosequenz des durch die Ant9-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 5 codierten Polypeptids.
  • Die Sequenz 7 ist die die Nucleotidsequenz des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant52.
  • Die Sequenz 8 ist die Aminosäuresequenz des durch die Ant52-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 7 codierten Polypeptids.
  • Die Sequenz 9 ist die Nucleotidsequenz des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant59.
  • Die Sequenz 10 ist die Aminosäuresequenz des durch die Ant59-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 9 codierten Polypeptids.
  • Die Sequenz 11 ist die Nucleotidsequenz des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant66.
  • Die Sequenz 12 ist die Aminosäuresequenz des durch die Ant66-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 11 codierten Polypeptids.
  • Die Sequenz 13 ist die Nucleotidsequenz des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant67.
  • Die Sequenz 14 ist die Nucleotidsequenz des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant68.
  • Die Sequenz 15 ist die Aminosäuresequenz des durch die Ant68-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 14 codierten Polypeptids.
  • Die Sequenz 16 ist die Nucleotidsequenz des Ant32-Genomklons. Diese Sequenz zeigt die Nucleotidsequenz des Ant32-Gens einschließlich 2,0 kb der 5'-flankierenden Sequenz. Die TATA-Box findet sich bei den Basen 1971 bis 1975. Die vermutliche Transkriptionsstartstelle findet sich an der Base 2009. Die Basen 2009 bis 2075 umfassen die nicht translatierte Leader-Sequenz. Das ATG-Translationsstartcodon findet sich an den Basen 2076 bis 2078. Keine Introns sind vorhanden. Das TGA-Stopp-Codon findet sich an den Basen 3420 bis 3422.
  • Die Sequenz 17 ist die Aminosäuresequenz des durch die Ant32-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 16 codierten Polypeptids.
  • Die Sequenz 18 ist die Nucleotidsequenz des Ant43D-Genomklons. Diese Sequenz zeigt die Nucleotidsequenz des Ant43D-Gens einschließlich etwa 1,2 kb der 5'-flankierenden Sequenz. Die vermutliche Transkriptionsstartstelle findet sich an der Base 1167. Eine ungewöhnlich lange TATA-Box findet sich an den Basen 1089 bis 1147. Die Sequenz „TA" wird 29mal wiederholt. Der nicht-trunslatierte Leader findet sich zwischen den Basen 1167 und 1229. Das Translationsstartcodon befindet sich an den Basen 1230 bis 1232. Translatierte Sequenzen sind in Grossbuchstaben gezeigt. Ein Intron befindet sich an den Basen 1571 bis 1668.
  • Die Sequenz 19 ist die Aminosäuresequenz des durch die Ant43D-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 18 codierten Polypeptids.
  • Die Sequenz 20 ist die Nucleotidsequenz des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant43C.
  • Die Sequenz 21 ist die Aminosäuresequenz des durch die Ant43C-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 20 codierten Polypeptids
  • Beschreibung der Figuren
  • 1: Restriktionskarte des Ant32-Genomklons pCIB950. Der Pfeil zeigt die Stelle des Ant32-Gens sowie seine 5'- zu 3'-Orientierung im Genomsubklon pCIB950. Der Promotorbereich erstreckt sich von der stromauf PstI-Stelle zu dem Codierbereich.
  • 2: Restriktionskarte des Ant43D-Genomklons pCIB952. Der Pfeil zeigt die Stelle des Ant43D-Gens sowie seine 5'- zu 3'-Orientierung im Genomsubklon pCIB952. Die Promotorregion erstreckt sich von der stromauf EcoRI-Stelle zu dem Codierbereich.
  • 3: Stellen-spezifische Mutagenese via PCR führt zur Insertion einer XbaI-Stelle vor dem Translationsstart von Ant32 (3A) und Ant43D (3B).
  • In 3A zeigt die Zeichnung am oberen linken Ende das 3'-Ende des den Promotor enthaltenden PstI-SacI-Ant32-Genomsubklons. Darunter befindet sich die Sequenz an dem ATG, vor dem eine XbaI-Stelle gemäß Beschreibung in Beispiel 16 insertiert wurde.
  • In 3B zeigt die Zeichnung oben links das 3'-Ende des den Promotor enthaltenden EcoRI-Ant43D-Genomsubklons. Darunter befindet sich die Sequenz am ATG, vor dein eine XbaI-Stelle gemäß Beschreibung in Beispiel 18 insertiert wurde.
  • 4: Plasmidkarten der Ant32-GUS-Fusionen pCIB3132 (2,0 kb Promotor – 4A) and pCIB3132B (600 bp Promotor – 4B), pCIB3132 wurde bei der USDA Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, III. 61604, am 16. Juni 1992 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer. NRRL B-18977.
  • 5: Plasmidkarte der Ant32-DTA-Fusion pLC251
  • 6: Plasmidkarte der Ant43D-GUS-Fusion pCIB3178. pCIB3178 wurde bei der USDA NRRL am 16. Juni 1992 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer. NRRL B-18978.
  • 7: Plasmidkarte der Ant43D-DTA-Fusion pCIB3179.
  • Die folgenden Beispiele beschreiben weiter die Materialien und Methoden, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Sie dienen der Veranschaulichung und ihre Nennung soll die beanspruchte Erfindung in keinster Weise einschränken.
  • NICHT BESCHRÄNKENDE BEISPIELE
  • Allgemeine rekombinante DNA-Techniken
  • Da viele der erfindungsgemäß verwendeten rekombinanten DNA-Techniken eine Routinenmaßnahme für einen Fachmann auf dein einschlägigen Fachgebiet sind, ist es besser eine kurze Beschreibung dieser allgemein verwendeten Techniken zu geben, als sie jedes Mal, wenn sie verwendet werden, zu beschreiben. Sofern es keine gegenteilige spezielle Augabe gibt, sind alle diese Verfahren bei Maniatis et al. (1982) beschrieben.
  • A. Spaltung mit Restriktionsendonucleasen
  • Eine Reaktionscharge enthält typischerweise etwa 50 bis 500 μg/ml DNA in der durch den Hersteller empfohlenen Pufferlösung (New England Biolabs, Beverly, MA.). 2 bis 5 Einheiten Restriktionsendonucleasen werden für jedes μg DNA zugegeben und die Reaktionscharge wird 1 bis 3 h bei der durch den Hersteller empfohlenen Temperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Erwärmen während 10 min bei 65° oder durch Extraktion mit Phenol und anschließende Fällung der DNA mit Ethanol beendet. Diese Technik ist auch auf den Seiten 104 bis 106 der Literatur Maniatis et al. (1982) beschrieben.
  • B. Behandlung von DNA mit Polymerase zur Herstellung von stumpfen Enden
  • 50 bis 500 μg/ml DNA-Fragmente werden zu einer Reaktionscharge in den durch den Hersteller empfohlenen Puffer (New England Biolabs) zugegeben. Die Reaktionscharge enthält alle vier Desoxynucleotidtriphosphate in Konzentrationen von 0,2 mM. Die Reaktion erfolgt während einem Zeitraum von 30 min bei 15°C und wird anschließend durch Erwärmen während 10 min auf 65°C beendet. Für durch Spalten mit Restriktionsendonucleasen, die 5'-vorstehende Enden liefern, wie die EcoRI and BamHI, erhaltene Fragmente wird das große Fragment oder das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase verwendet. Für mittels Endonucleasen, die 3'-vorstehende Enden liefern, wie PstI und SacI, erhaltene Fragmente wird die T4 DNA Polymerase verwendet. Die Verwendung dieser beiden Enzyme ist auf den Seiten 113 bis 121 der Literatur von Maniatis et al (1982) beschrieben.
  • C. Agarosegelelektrophorese und Reinigung von DNA-Fragments aus Gelen
  • Die Agarosegelelektrophorese wird in einer horizontalen Vorrichtung gemäß Beschreibung auf den Seiten 150 bis 163 der Literatur Maniatis et al. durchgeführt. Der verwendete Puffer ist der dort beschriebene tris-Boratpuffer. Die DNA-Fragmente werden unter Verwendung von 0,5 μg/ml Ethidiumbromid. das entweder in dem Gel oder Behälterpuffer während der Electrophorese vorhanden ist oder nach Electrophorese zugegeben wird, angefärbt. Die DNA wird durch Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht sichtbar gemacht. Wenn die Fragmente aus dem Gel herausgetrennt werden sollen, wird eine Agarose verwendet, die bei niedriger Temperatur geliert und von Sigma Chemical, St Louis, Missouri, erhältlich ist. Nach der Elektrophorese wird das gewünschte Fragment herausgeschnitten, in ein Kunststofftestrohr gegeben, etwa 15 min auf 65°C erwärmt, dreimal mit Phenol extrahiert und zweimal mit Ethanol gefällt. Dieses Vorgehen unterscheidet sich leicht von dein bei Maniatis et al (1982), auf Seite 170 beschriebenen.
  • Als Alternative kann die DNA aus der Agarose mit Hilfe des Genecleankits (Bio 101 Inc., La Jolla, CA, USA) isoliert werden.
  • D. Zugabe von synthetischen Linkerfragmenten zu DNA-Enden.
  • Wenn es gewünscht ist, eine neue Endonucleasespaltungsstelle zu dein Ende eines DNA-Moleküls zu addieren, wird das Molekül optional zuerst mit einer DNA-Polymerase behandelt, um stumpfendige Enden herzustellen, wie in dem obigen Abschnitt beschrieben ist. Etwa 0,1 bis 1,0 μg dieses Fragments werden zu etwa 10 ng phosphorilierter Linker-DNA (erhalten von New England Biolabs) in einem Volumen von 20 bis 30 μl mit 2 μl T4 DNA-Ligase (von New England Biolabs) und 1 mM ATP in dem durch den Hersteller empfohlenen Puffer zugegeben. Nach einer Inkubation über Nascht bei 15°C wird die Reaktion durch 10minütiges Erwärmen auf 65°C beendet.
  • Die Reaktionscharge wird in einem für die Restriktionsendonuclease, die die synthetische Linkersequenz spaltet, geeigneten Puffer auf etwa 100 μl verdünnt. Etwa 50 bis 200 Einheiten dieser Endonuclease werden zugegeben. Das Gemisch wird 2 bis 6 h bei der geeigneten Temperatur inkubiert, anschließend wird das Fragment einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und wie oben beschrieben gereinigt. Das erhaltene Fragment besitzt anschließend Enden mit Abschlüssen, die durch Spalten mit der Restriktionsendonuclease produziert wurden. Diese Enden sind üblicherweise cohäsiv, sodass das erhaltene Fragment anschließend ohne Schwierigkeiten mit anderen Fragmenten mit denselben cohäsiven Enden verknüpft werden kann.
  • E. Entfernung der 5'-terminalen Phosphate von DNA-Fragmenten
  • Während den Plasmidklonierungstufen verringert die Behandlung des Vektorplasmids mit Phosphatase die Rezirkularisierung des Vektors (diskutiert auf Seite 13 der Literatur Maniatis et al.). Nach Spaltung der DNA mit der richtigen Restriktionsendonuclease wird eine Einheit von alkalischer Phosphatase von Kalbsdarm, die von Boehringer-Mannheim, Mannheim, erhalten wurde, zugeben. Die DNA wird 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend zweimal mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
  • F. Verknüpfung der DNA-Fragmente
  • Wenn Fragmente mit komplementären cohäsiven Enden miteinander verknüpft werden sollen, werden etwa 100 ng eines jeden Fragments in einem Reaktionsgemisch aus 20 bis 40 μl, das etwa 0,2 Einheiten T4 DNA Ligase (von New England Biolabs) in dein durch den Hersteller empfohlenen Puffer enthält, inkubiert. Die Inkubation wird 1 bis 20 h 15°C durchgeführt. Wenn DNA-Fragmente mit stumpfendigen Enden verknüpft werden sollen, werden sie wie oben inkubiert, mit der Ausnahme, dass die Menge der T4 DNA-Ligase auf 2 bis 4 Einheiten erhöht wird.
  • G. Transformation von DNA in E. coli
  • Der E. coli-Stamm HB101 wird für die meisten der Experimente verwendet. DNA wird unter Verwendung der Calciumchloridmethode (gemäß Beschreibung durch Maniatis et al. (1982), Seiten 250 und 251) in E. coli eingeführt.
  • H. Screenen von E. coli bezüglich Plasmiden
  • Nach der Transformation werden die erhaltenen Kolonien von E. coli bezüglich der Anwesenheit des gewünschten Plasmids mit Hilfe eines raschen Plasmidisolierungsverfahrens getestet. Zwei herkömmliche Prozesse sind auf den Seiten 366 bis 369 der Literatur Maniatis et al. (1982) beschrieben.
  • I. Isolierung von Plasmid-DNA in großem Maßstab
  • Verfahren zur Isolierung von Plasmiden aus E. coli in großem Maßstab sind auf den Seiten 88 bis 94 der Literatur Maniatis et al. (1982) beschrieben.
  • J. Klonierung in M13-Phagenvektoren
  • In der nachfolgenden Beschreibung gilt, dass die doppelsträngige Replikationsform der Phagen M13 Derivate für Routineprozesse, beispielsweise die Spaltung mit Restriktionendonucleasen, eine Verknüpfung usw., verwendet wird.
  • Sofern es keine spezielle gegenteilige Angabe gibt, können Enzyme von Boehringer, Biolabs (BRL) erhalten werden. Sie werden, sofern nicht anders angegeben, gemäß den Instruktionen der Hersteller verwendet.
  • K. Southern-Blot-Analyse
  • Die extrahierte DNA wird zuerst mit Restriktionsenzymen behandelt, anschließend einer Elektrophorese in einem 0,8% bis 1% Agarosegel unterzogen, auf eine Nitrocellulosemembran (Southern EM (1975)) überführt und mit der nachzuweisenden DNA, die zuvor einer Nick-Translation (DNA-spezifische Aktivitäten von 5 × 108 bis 10 × 108 cpm/μg) unterzogen wurde, hybridisiert. Die Filter werden dreimal 1 h jeweils mit einer wässrigen Lösung von 0,03 M Natriumcitrat und 0,3 M Natriumchlorid bei 65°C gewaschen. Die hybridisierte DNA wird durch Schwärzen eines Röntgenfilms über einen Zeitraum von 24 bis 48 h sichtbar gemacht.
  • Die nachfolgenden Beispiele, die nicht den cDNA-Klon Ant43D entsprechend SEQ. ID Nr. 3 betreffen, sind lediglich zu Beschreibungszwecken angegeben und bilden keinen Teil der vorliegenden Erfindung.
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Pflanzenmaterial und Wachstumshedingungen
  • Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum cv Xanthi) werden aus Samen in einem Gewächshaus unter einer Lichtregelung aus 16 h Licht und 8 h Dunkelheit gezüchtet.
  • Beispiel 2: Anthere- und Blätter-RNA-Isolation
  • Gesamt-RNA wird aus Antheren von Pflanzenknospen mit einer Stempellänge von 0 bis 10 mm und aus 5 Wochen alten Keimlingen nach dein Phenol/SDS-Verfahren, das von Ausubel et al. (1987) beschrieben wurde, isoliert. PolyA + RNA wird aus Gesamt-RNA gemäß Beschreibung bei Maniatis et al. (1982) gereinigt.
  • Beispiel 3: Konstruktion von subtrahierten cDNA-Bibliotheken
  • Anthere- und Keimling-cDNA-Bibiliotheken werden unter Verwendung des Libraviam II Kits von Invitrogen (INVITROGEN CORP., 3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA; Katalog Nr. L1958-15) hergestellt. Doppelsträngige cDNA wird aus Anthere- und Blatt- polyA + RNA synthetisiert, BstXI Nichtpalindromlinker werden daran legiert und die cDNA wird in einen mit BstXI geschnittenen pTZ18R-B-Vektor (verfügbar von INVITROGENE CORP. (3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA) erhältlich ist) kloniert. Die Transformation erfolgt in E. coli DHIaF'-Zellen, die auch von INVTTROGENE CORP. bezogen werden können. Eine Subtraktions-cDNA-Bibliothek wird unter Verwendung des Substraktorkits von INVTTROGEN (INVITROGEN CORP., 3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA; Katalog Nr. K4320-01) hergestellt. Einzelsträngige DNA wird aus den Anthere- und Blatt-cDNA-Bibliotheken isoliert. Die einzelsträngige Blatt-DNA wird photobiotinyliert und an die einzelsträngige Anthere-DNA hybridisiert. Sowohl hybridisierte als auch nicht hybridisierte photobiotinylierte Sequen zen werden mit Streptavidin- und Phenolextraktion entfernt. Die verbleibende DNA wird mit Klenow in die doppelsträngige Form umgewandelt und in E. coli DH1aF'-Zellen transformiert.
  • Beispiel 4: Isolierung von Anthere-spezifischen cDNA-Klonen
  • Anthere-spezifische Klone werden durch differentielles Screenen der Antheresubstraktions-cDNA-Bibliothek identifiziert. 20.000 Klone werden auf Nitrocellulosefiltern replikaplattiert und differentiell gescreent, um Kolonien zu identifizieren, die an radioakiv markierte Erststrang-cDNA aus Anthere-polyA+ RNA, jedoch nicht an Erststrang-cDNA aus Keimling-polyA+ hybridisieren. Die in den Klonierungsvektor insertierten cDNAs werden mit einem Restriktionsenzym herausgeschnitten und die Inserte von insgesamt 70 cDNAs werden differentiell abermals durch Southern-Blot gescreent. Northern-Blots von Anthere-, Stempel- und Blatt-Gesamt-RNA werden mit den cDNAs sondiert, um die Gewebespezifität zu bestätigen. Alle Anthere-spezifischen cDNAs werden kreuzhybridisiert, um einmalige cDNAs zu identifizieren. Einmalige cDNA-Klone werden gereinigt und in einen Bluescript-Vektor subkloniert. Ein cDNA-Klon vollständiger Länge von Ant32 wird durch Screenen der Anthere-cDNA-Bibliothek mit einer 0,9 kb Teil-cDNA isoliert. Die beiden cDNAs sind auf Sequenzniveau 95% homolog und folglich eng verwandte Mitglieder dergleichen Genfamilie.
  • Beispiel 5: Verifizierung des Expressionsmusters durch RNA-Blot-Hybridisierung
  • Northern-Blots werden unter Verwendung von Nitrocellulosefiltern gemäß Beschreibung bei Maniatis (1982) durchgeführt. 20 μg von Anthere-, Stempel- und Blatt-Gesamt-RNA werden pro Spur aufgetragen. Vorhybridisierungen werden 4 h bei 68°C in 3X SSC, 5X Denhardt's, 20 mM Tris pH 7, 0,1% SDS, 2 mM EDTA und 1005 g/ml gescherter denaturierter Lachssperma-DNA durchgeführt. Hybridisierungen werden über Nach in 6X SSC, 5X Denhardt's, 0,1% SDS, 500 μg/ml Lachssperma-DNA, 8% Dextronsulfat and 50% Formamid, dem 5,5 × 106 cpm/ml Sonde zugesetzt wird, bei 42°C durchgeführt. Sonden werden unter Verwendung des Oligolabellingkits von PHARMACIA (PHARMACIA LKB BIOTECHNOLOGY, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ, Katalog Nr. 27-9250-01) gemäß den Instruktionen der Hersteller synthetisiert. Die Expression der cDNAs wird lediglich in Anthere-RNA beobachtet. Eine Expression in Pollen wird ebenfalls mit der Ant66-cDNA beobachtet.
  • PolyA + RNA wird aus Anthere-, Stempel-, Blatt-, Blumenblatt-, Stamm- und Wurzelgewebe isoliert. 15 g einer jeden zusammen mit 205 g Samen und Kelchblatt-Gesamt-DNA werden auf einem Northern-Blot laufen gelassen und mit den Ant32- und Ant43D-cDNAs sondiert. Eine Expression beider cDNAs wird lediglich in der Anthere-RNA beobachtet, was zeigt, dass die Ant32- und Ant43D-cDNAs straff reguliert und lediglich in Antheregewebe exprimiert werden.
  • Beispiel 6: Entwicklungsexpression von Anthere-spezifischen cDNA-Klonen
  • Gesamt-RNA wird aus Antheren aus 6 Stufen von Blumenknospenlängen isoliert. Slot-Blots werden mit den Anthere-spezifischen cDNAs sondiert, um eine Entwicklungsexpression zu bestimmen. Eine Slot-Hybridisierung erfolgt wie bei Maniatis (1982) unter Verwendung von 105 g RNA. Tabelle 1 enthält das Entwicklungsexpressionsprofil der cDNAs. Ant9, 32, 43C, 59 und 68 werden lediglich früh in der Anthereentwicklung exprimiert, während Ant43D, 52 und 67 während der gesamten Entwicklung exprimiert werden. Ant66 wird lediglich spät in der Entwicklung exprimiert.
  • Beispiel 7: Sequenzieren von Anthere-spezifischen cDNA-Klonen
  • DNA wird unter Verwendung der Didesoxykettenterminationsmethode von Sanger et al., 1977, unter Verwendung doppelsträngiger Plasmid-DNA als Matritze sequenziert. Die gesamte DNA-Sequenzanalyse wird auf einem Digital Vax 8530 Computer unter Verwendung der Software von der University of Wisconsin Computer Genetics Group, die im Handel von GENETICS COMPUTER GROUP, INC. (University Research Park 575 Schience Drive, Madison, WI) erhältlich ist, durchgeführt. Die Oligonucleotidprimer werden auf ein Synthesegerät von Applied Biosystems, Modell 380A, synthetisiert.
  • Tabelle 1 enthält einen Vergleich der Messagegröße zur Insertgröße der Anthere-spezifischen cDNAs. Die Ant32- und Ant43D-cDNAs besitzen nahezu die Größe, die für Kopien vollständiger Länge der mRNAs erwartet wird. Der Rest der cDNAs sind unvollständige Klone. Ant32, 43C, 43D, 52, 59, 66 und 68 codieren für einen einzelnen offenen Leserahmen. Die Ant32-cDNA ist ein Klon nahezu vollständiger Länge aus 1.542 Basen (SEQ. ID Nr. 1). Die Sequenz enthält einen großen offenen Leserahmen, der sich vom Nucleotid 66 bis 1.412 erstreckt und für ein komplettes Polypeptid aus 448 Aminosäuren codiert. Der offene Leserahmen wird durch 5'- and 3'-Nichtcodierbereiche aus 65 bzw. 130 Basen flankiert. Ein Polyadenylierungssignal AATAAA befindet sich an der Position 1.502.
  • Die Ant43D-cDNA ist ein Klon nahezu vollständiger Länge aus 552 Basen (SEQ. ID Nr. 3). Die Sequenz enthält einen vollständigen offenen Leserahmen aus 118 Aminosäuren, der sich von den Basen 41 bis 397 erstreckt. Der offene Leserahmen wird durch 40 Basen am 5'-Ende und 155 Basen am 3'-Ende flankiert. Ein Polyadenylierungssignal findet sich beginnend an der Position 437.
  • Ant43C ist eine unvollständige cDNA aus 437 Basen (SEQ. ID Nr. 20). Ein Teilpolypeptid aus 90 Aminosäuren wird durch die Nucleotide 167 to 436 codiert. Die Ant43C-cDNA und die Ant43D-cDNA sind auf Sequenzniveau zu 90% homolog.
  • Ant52, ein unvollständiges cDNA-Klon aus 96 Basen (SEQ. ID Nr. 7) enthält einen offenen Leserahmen aus 31 Aminosäuren.
  • Ant59 ist ein unvollständiges cDNA-Klon aus 1.201 Basen (SEQ. ID N5. 9). Ein offener Leserahmen, der sich von dem Nucleotid 1 bis 1.119 erstreckt, codiert für ein Teilpolypeptid aus 372 Aminosäuren. Der offene Leserahmen wird durch einen 3'-Nichtcodierbereich aus 82 Basen flankiert.
  • Ant66 ist ein unvollständiges cDNA-Klon aus 952 Basen (SEQ. ID Nr. 11). Ein Teilpolypeptid aus 236 Aminosäuren wird durch die Nucleotide 1 bis 711 codiert. Der offene Leserahmen wird durch einen 3'-Bereich aus 241 Basen flankiert. Die Sequenz enthält einen polyA-Schwanz aus 15 Basen.
  • Ant68 ist ein unvollständiges cDNA-Klon aus 445 Basen (SEQ. ID Nr. 20). Ein offener Leserahmen aus 148 Aminosäuren wird durch die Sequenz codiert.
  • Ant67 ist ein unvollständiges cDNA-Klon aus 305 Basen (SEQ. ID Nr. 13). Es ist unbekannt, welcher Strang der Sinnstrang ist, da ein einzelner großer offener Leserahmen nicht gefunden wurde. Dieses Klon enthält das 3'-Ende eines offenen Leserahmens und einen 3'-Flankierbereich in Translationen beider Stränge.
  • Ant9 ist eine unvollständige chimäre cDNA aus 612 Basen (SEQ. ID Nr. 5). Northern-Blots aus Anthere-, Stempel- und Blattgewebe werden mit 5'- und 3-Regionen der chimären cDNA sondiert, um die Anthere-spezifische Region des cDNA-Klons zu bestimmen. Mit den Basen 1 bis 325 sondierte Northerns hybridisieren an Anthere-, Stempel- und Blattgewebe. Diese Region der cDNA codiert für einen offenen Leserahmen. Mit den Basen 326 bis 612 sondierte Northerns hybridisieren ausschließlich an Antheregewebe. Diese Region wird als die Anthere-spezifische Region der chimären cDNA identifiziert. Ein Teilpolypeptid aus 32 Aminosäuren wird durch die Nucleotide 344 bis 442 codiert. Ein Polyadenylierungssignal startet an der Position 461.
  • Jede abgeleitete Aminosäuresequenz wird mit Sequenzen in einer GenBank Gensequenzdatenbank, einer Computerdatenbasis von DNA-Sequenzen, verglichen. Die Ant66-cDNA besaß eine 74%ige Gesamtaminosäureidentität mit einer Plasmamembranproton ATPase (H+-ATPase) von Arabadopsis thaliana (Harper et al., 1989). Die Ant68-cDNA codiert für ein glycinreiches Protein.
  • Beispiel 8: Verifizierung des Ant32-Expressionsmusters durch In-Situ-Hybridisierung
  • In situ Hybridisierungsstudien mit in Paraffin eingebetteten Anthereabschnitten aus 12 mm langen Blumenknospen werden gemäß Beschreibung bei Perez-Grau et al., 1989, durchgeführt. 35S-RNA-Sonden, die für in situ Hybridisierungen verwendet werden, werden unter Verwendung eines RNA-Transkriptionskits von STRATAGENE (STRATAGENE CLONING SYSTEMS, 11099 North Torrey Pines Rd., La Jolla, CA; Katalog Nr. 200340) synthetisiert. Querschnitte und Längsschnitte werden mit Ant32-Antisense- und Sinn-RNA-Sonden sondiert. Die Expression wird in der Tapetumzellschicht der Anthere mit der Antisense-Sonde lokalisiert.
  • Beispiel 9: Genkopiezahl
  • Zur Bestimmung, wie viele Gene in dem Tabakgenom mit den Anthere-spezifischen Genen hybridisieren, wurde Xanthi Genom DNA mit XbaI, HindIII, EcoRI und BamHI verdaut. Southern-Blots werden mit den cDNA-Klonen sondiert. Die mit Ant32, 43, 52, 59 und 67 sondierten Blots wiesen 2 Banden auf, die in jedem Verdau hzbridisieren, was anzeigt, dass diese cDNAs Einzelkopiegene oder Mitglieder kleiner Genfamilien sind. Mehr Banden pro Verdau, die in den Blots hybridiserten, wurden mit Ant9, 66 and 68 sondiert, was darauf hindeutet, dass diese cDNAs Mitglieder größerer Genfamilien sind.
  • Beispiel 10: Southern-Blots
  • Southern-Blots werden mit Nitrocellulose gemäß Beschreibung bei Maniatis (1982) durchgeführt. Vorhybridisierungen finden in 6X SSC, 10X Denhardt's. 0,2% SDS und 75 μg/ml Lachssperma-DNA 4 bis 6 h bei 68°C statt. Hybridisierungen erfolgen bei 68°C in 6X SSC, 5X Denhardt's, 0,5% SDS und 125 μg/ml Lachssperma-DNA, der 1 × 106 cpm/ml DNA-Sonde zugegeben wird. Waschungen finden gemäß Beschreibung bei Maniatis (1982) statt. Genom Southern-Blots werden mit Duralon-UV-Membranen (Stratagene) durchgeführt und die Hybridisierungsbedingungen sind die gemäß Weisungen der Hersteller.
  • Beispiel 11: Konstruktion von Tabakgenom DNA Bibliotheken
  • Tabak-DNA wird aus Blättern unter Verwendung des Verfahrens von Shure et al. (1983) isoliert. Sau3AI-Teilverdaus von Xanthigenom-DNA werden in die BamHI-Stelle von Lamda DashII-Vektor von Stratagene kloniert und die Bibliothek amplifiziert. Weitere Genombibliothek wird unter Verwendung des LambdaGEM-11 XhoI Halbstellenarmeklonierungssystems von PROMEGA (PROMEGA, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI; Katalog Nr. B1960) hergestellt. Teilweise filled-in, mit Sau3AI verdaute Genom-DNA wird in teilweise filled-in XhoI LambdaGEM-11-Arme kloniert.
  • Beispiel 12: Isolierung und Sequenzierung des Ant32-Genomklons
  • Die amplifizierte Stratagene-Genombibliothek wird mit ant32 als Sonde gescreent, wobei 4 hybridisierte Plaques erhalten werden. Alle 4 Klone werden gereinigt und Restriktionskartiert. Bei Sondieren mit ant32 wird ein EcoRI-Fragment aus jedem Klon hybridisiert. Die EcoRI-Fragmente werden in Plasmid-pBS SK+, das von STRATAGENE CLONING SYSTEMS (11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA) erhältlich ist, subkloniert. Ein Subklonieren und Kartieren der EcoRI-Fragmente aus den 4 Klonen zeigte, dass 2 identisch sind. 1 enthält die Karte des EcoRI-Subklons pCIB950. Fragmente von pCIB950 werden anschließend zum Sequenzieren subkloniert. 2,0 kb des Promotors, der gesamte Codierbereich und 0,28 kb des 3' nicht translatierten Bereichs werden sequenziert. Das 2,0 kb Promotorfragment von ant32 ist funktional. Gemäß Darstellung in Beispiel 16 reicht ein 0,6 kb Fragment von ant 32 aus, um eine Anthere-spezifische Aktivität zu verleihen.
  • Beispiel 13: Isolierung und Sequenzierung des Ant43D-Genomklons
  • Die LambdaGEM-11-Primärbibliothek wird mit Ant43D als Sonde gescreent. Hybridisierende Plaques werden mittels PCR abermals gescreent, um zwischen Ant43D and Ant43C, einer eng verwandten cDNA, zu unterscheiden. PCR-Fragmente, die aus den Plaques erzeugt wurden, werden verdaut, um zwischen den beiden cDNAs entsprechenden Genomen zu unterscheiden. Die beiden Genomklone entsprechen Ant43D und sie werden gereinigt und kartiert. Eine 6,6 kb SacI-Bande von beiden hybridisiert an eine Ant43D-Sonde. Ein Subklonieren und Kartieren beider SacI-Banden zeigt, dass sie identisch sind. 2 enthält die Karte des SacI-Subklons pCIB952. Fragmente von pCIB952 werden subkloniert und sequenziert. 1,2 kb des Promotors, der gesamte Codierbereich einschließlich einem Intron und 0,22 kb des 3' nicht translatierten Bereichs werden sequenziert. Das 1,2 kb Promotorfragment enthält den gesamten Ant43D-Promotor.
  • Beispiel 14: Primer-Extension
  • Der Primer wird unter Verwendung von [λ-32P]-ATP (6000 Ci/mmol, Amersham) und T4 Polynucleotidkinase endmarkiert. 20 μg Anthere-Gesamt-RNA werden mit 0.01 pmol Primer in 20 μl reversen Transkriptasepuffer (50 mM Tris pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2) gemischt. Das Gemisch wird 10 min auf 80°C erwärmt, durch langsames Abkühlen auf 40°C annealed und über Nacht bei 40°C hybridisiert. Jede 20 μl Reaktionsmischung wird mit 30 μl 5 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 1 mM von jedem aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP in reversem Transkriptasepuffer, der 200 Einheiten RNAsin (Promega) und 400 Einheiten MMLV reverse Transkriptase (BRL) enthält, versetzt. Die Primer-Extension erfolgt 60 min bei 40°C. Das DNA/RNA-Hybrid wird einmal mit Phenol : Chloroform extrahiert und in Gegenwart von Träger-DNA mittels Ethanol gefällt. Das Pellet wird in sequenzierendem Ladefarbstoff gelöst und auf einem 6% Acrylamidharnstoffsequenziergel analysiert.
  • Die für die Primer-Extensionsexperimente verwendeten Primer sind die folgenden:
    für Ant32 → – AT 101MO3 – 5'-GGC TTC ACT ACC CAG TGG TG-3'
    für Ant43D → – AT 125MO3 – 5'-CAA CGC GCC CTT CTT TGA AA-3'
  • Beispiel 15: Kartieren der Transkript-Startstelle durch Primer-Extension
  • Der Start der Transkription der Ant32-cDNA und der Ant43D-cDNA werden unter Verwendung von Primer-Extension kartiert. Das größte Primer-Extensionsprodukt fällt innerhalb einiger Basenpaare des Endes der Ant32-cDNA. Das größte Primer-Extensionsprodukt fällt 23 Basenpaare stromauf des Endes der Ant43D-cDNA.
  • Beispiel 16: Fusionen der Ant32-Promotorsequenz an das GUS-Gen
  • Der 2,0 kb 5'-Flankierungsbereich von pCIB950, das den Ant32-Promotor enthält, wird an das Bakterienreportergen für Glucuronidase (GUS) fusioniert, um den Promotor des Anthere-spezifischen Gens in transgenen Pflanzen zu charakterisieren. Eine XbaI-Stelle wird vor das ATG mittels PCR wie folgt insertiert:
  • Ein 350 Basenpaare XhoI-XbaI-Fragment (oben rechts in der 3A) wird unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion- (PCR) Technologie (vgl. Mullis et al., 1987; Erlich 1989) synthetisiert, um die Ant32-Promotorsequenz von 55 by vor der einmaligen XhoI-Stelle zu zwei Basenpaaren vor dein ATG zu kopieren. Einer der PCR-Primer insertiert eine XbaI-Stelle zwei Basenpaare vor dein ATG. Ein die vollständige Länge aufweisender Ant32-Promotor aus dem PstI-XhoI-Fragment aus dein ursprünglichen Klon und der XhoI-XbaI-PCR-Kassette wird in einer Dreiwegligation in die PstI-XbaI-Stelle des Bluescript-Vektors pBluescript SK (Stratagene) wieder vereinigt. Dieser Promotorklon kann für Transkriptionsfusionen an Codiersequenzen verwendet werden.
  • Der erhaltene Promotor wird als SalI – XbaI-Fragment ausgeschnitten und an das GUS-Gen in pBI101 (Clontech) fusioniert. Eine 600 Basenpaare Ant32-Promotor – GUS-Fusion wird durch Deletieren eines 1,4 kb Hind-III-Fragments aus dein Bluescript-Promotorklon konstruiert. Der deletierte Promotor wird als SalI – XbaI-Fragment ausgeschnitten und an das GUS-Gen in pBI101 fusioniert. Die 2,0 kb Promotor-GUS-Fusion wird als pCIB3132 bezeichnet und die 0,6 kb Promotor-GUS-Fusion wird als pCIB3132B bezeichnet. Das 0,6 kb Promotorfragment von Ant32 reicht aus, um eine Anthere-spezifische Aktivität zu verleihen.
  • Beispiel 17: Fusion der Ant32-Promotorsequenz an das DTA-Gen
  • Ein chimäres Gen wird unter Verwendung einer 5' Ant32-Promotorsequenz und der Diphtherietoxin-A-Kette (DTA)-Codiersequenz (Palmiter et al., 1987) konstruiert. Die GUS-Codiersequenz wird aus pCIB3132B mit SmaI and SacI ausgeschnitten, die SacI-Stelle gefüllt und das Plasmid wieder zurück untereinander legiert (pLC250). Die DTA-Codiersequenz wird als Bg1II-Fragment, das aus dein Plasmid p72 (Palmiter et al., 1987) ausgeschnitten wurde, in die BamHI-Stelle von pLC250 unter Erhalt von pLC251 legiert. Die DTA-Codiersequenz wird in entgegengesetzter Orientierung in pLC25 fusioniert.
  • Beispiel 18: Fusion der Ant43D-Promotorsequenz an das GUS-Gen
  • Die 1,2 kb 5'-Flankierregion des Ant43D-Gens wird an GUS fusioniert. Eine XbaI-Stelle wird vor dem ATG durch PCR wie folgt insertiert:
  • Ein 210 Basenpaare EarI-XbaI-Fragment (oben rechts in 3B) wird mit PCR synthetisiert, um den Ant43D-Promotor aus 39 Basenpaaren vor der EarI-Stelle an 22 Basenpaare vor dein ATG zu kopieren. Einer der PCR-Primer insertiert eine XbaI-Stelle 22 Basenpaare vor dein ATG. Ein eine vollständige Länge aufweisender Ant43D-Promotor aus dein EcoRI-EarI-Fragment aus dem ursprünglichen Klon und der EarI-XbaI-PCR-Kassette wird in einer Dreiwegligation in die EcoRI-XbaI-Stellen von Bluescript wieder zusammen gefügt. Dieser Promotorklon kann für Transkriptionsfusionen an Codiersequenzen verwendet werden.
  • Der erhaltene Promotor wird als HindIII-XbaI-Fragment ausgeschnitten und an das GUS-Gen in PBI101 (pCIB3178) fusioniert. 3B zeigt wie die 1,2 kb Flankierregion des Ant43D-Gens erhalten wird. Das 1,2 kb Promotorfragment reicht aus, um eine Anthere-spezifische Aktivität zu verleihen.
  • Beispiel 19: Fusion der Ant43D-Promotorsequenz an das DTA-Gen
  • Der 1,2 kb Ant32-Promotor wird aus pLC251 mit HindIII-XbaI ausgeschnitten und durch ein HindIII-XbaI-Ant43D-Promotorfragment ersetzt. Das erhaltene Plasmid wird als pCIB3179 bezeichnet.
  • Die DTA-Codiersequenz wird in entgegengesetzter Orientierung in pCIB3188 fusioniert. Der Ant32-Promotor wird mit HindIII und XbaI aus pLC252 ausgeschnitten und durch den Ant43D-Promotor ersetzt.
  • Beispiel 20: Produktion von transgenen Pflanzen
  • Tabakblattscheiben werden mit dein Ant32-GUS (pCIB3132 (2 kb Promotor) and pCIB3132B (0,6 kb Promotor)), Ant32-DTA (pLC251 und Antisense-Kontrolle (pLC252)), Ant43D-GUS (pCIB3178) und Ant43D-DTA (pCIB3179 und der Antisense-Kontrolle (pCIB3188)) -Konstruktionen und reifen transformierten Fflanzen, die wie bei Horsch et al. (1985) ausgewählt wurden, transformiert. Die Gegenwart von transformierender DNA wird mittels PCR bestätigt.
  • Beispiel 21: GUS-Analyse einer Ant32-Transgenexpression
  • Transformanten werden durch den GUS histochemischen Test gemäß Koltunow et al. (1990) und fluorimetrisch gemäß Jefferson (1987) getestet. Bei dein histochemischen Test wird die GUS-Expression in der Tapetumzellschicht der Antheren von Blumenknospen einer Länge von 10 bis 20 mm beobachtet. Eine Expression wird ferner in Pollen in einem geringeren Ausmaß beobachtet. Anthere-, Stempel-, Pollen-, Blatt- und Stammungewebe werden fluorimetrisch getestet und die GUS-Aktivität ist auf Anthere- und Pollengewebe begrenzt.
  • Beispiel 22: Analyse von Ant32-DTA transgenen Pflanzen
  • Die Blumenmorphologie von 13 transgenen Pflanzen, die pLC251 enthalten, und 15 Pflanzen von pLC252 wird beobachtet. Die pLC251 enthaltenden Pflanzen wiesen alle braune welke Anthere und keine herunter gefallenen Pollen aus. Im Gegensatz dazu besaßen die transgenen pLC252-Pflanzen normale Anthere und herunter gefallene Pollen. Selbstbefruchtungen und Rückkreuzungen werden bei allen Pflanzen durchgeführt. In den pLC251-Pflanzen werden keine Selbstbestäubungen erhalten, jedoch Samen aus Rückkreuzungen. Die Fertilität in Selbstbefruchtungen und Rückkreuzbestäubungen ist für pLC252-Pflanzen normal.
  • Anthere von 14 bis 16 mm langen und 25 bis 30 mm langen Blumenknospen werden fixiert, in Paraffin eingebettet und Bereiche werden mit Toluidinblau angefärbt. Das Tapetum und der Pollensack werden in pLC251-Pflanzen zerstört, während pLC252-Pflanzen eine normale Morphologie aufwiesen.
  • Beispiel 23: GUS-Analyse von einer Ant43D transgenen Expression
  • Transformanten werden mittels GUS histochemischen Assays und fluorimetrischen Assays getestet. In dem histochemischen Assay wird eine GUS-Expression in der Tapetumzellschicht von Antheren von Knospen einer Länge von 14 bis 16 mm, in Mikrosporen und erhöht in Bindegewebe und Wandgewebe der Anthere beobachtet. Anthere-, Pollen-, Stempel-, Blatt-, Kelchblatt-, Stamm- und Wurzelgewebe werden fluorimetrisch getestet. Die GUS-Aktivität ist auf Anthere- und Pollengewebe beschränkt.
  • Beispiel 24: Analyse von Ant43D-DTA transgenen Pflanzen
  • Die Blumenmorphologie von 8 pCIB3179-Pflanzen und 8 Pflanzen des Kontroll-pCIB3188 (DTA in Antisense-Orientierung) wird beobachtet. Die pCIB3179 transgenen Pflanzen wiesen alle nicht funktionelle Anthere auf, da keine Pollen herunter gefallen waren. Die Anthereregröße unter unterschiedlichen Pflanzen reichte von normal bis geschrumpft, die Antherefarbe von grün bis braun und die Anthere von aufplatzend bis nicht aufplatzend. Die Kontroll-pCIB3188 transgenen Pflanzen wiesen normale Antheremorphologie und herunter gefallene Pollen auf. Selbstbefruchtungen und Rückkreuzungen werden bei den Pflanzen durchgeführt. In pCIB3179-Pflanzen werden Bestäubungen aus Rückkreuzungen erhalten, Selbstbestäubungen jedoch nicht. Die Fertilisation in pCIB3188-Pflanzen ist normal.
  • Anthere aus 8 bis 10 mm, 10 bis 12 mm, 14 bis 16 mm und 25 bis 30 mm langen Blumenknospen werden fixiert, in Paraffin eingebettet und Bereiche mit Toluidinblau angefärbt. Mikrosporen fehlen von pCIB3179-Pflanzen früh bei 8 bis 10 mm langen Knospen.
  • Hinterlegung
  • Die folgenden Hinterlegungen wurden bei der USDA Agricultural Research Service Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL), 1815 North University Street, Peoria, I11. 61604, gemäß den Erfordernissen des Budapester Vertrags durchgeführt:
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
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  • WO 89 10 396 A
  • WO 90 08 825 A
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Claims (26)

  1. Isolierte Nucleotidsequenz aus einer Anthere-spezifischen Genom-DNA-Sequenz bestehend aus SEQ. ID Nr. 18.
  2. Isolierte Genom-DNA-Sequenz mit der Fähigkeit zur Hybridisierung mit der Anthere-spezifischen DNA-Sequenz nach Anspruch 1 unter stringenten Bedingungen, die als Promotor einer Anthere-spezifischen Transkription assoziierter exprimierbarer und vorzugsweise codierender DNA-Sequenzen in rekombinanten oder chimären DNA-Konstrukten fungiert.
  3. Isolierte DNA-Sequenz nach Anspruch 2, wobei die Sequenz Base 1 bis Base 1229 oder Base 1 bis 1147 von SEQ. ID Nr. 18 umfasst.
  4. Rekombinante DNA-Sequenz, die in einer 5'- zu 3'-Richtung eine Promotorregion nach Anspruch 2 oder 3 in operativer Verknüpfung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz umfasst.
  5. Rekombinante DNA-Sequenz, die in einer 5'- zu 3'-Richtung eine Promotorregion nach Anspruch 2 oder 3 in operativer Verknüpfung mit einer Signalsequenz umfasst, die operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist.
  6. Rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 4 oder 5, wobei die exprimierbare DNA-Sequenz eine codierende Sequenz ist.
  7. Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 6, wobei die codierende DNA-Sequenz für ein Polypeptid codiert, das die Bildung lebensfähiger Pollen bei Expression in den Antherezellen unterbricht.
  8. Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 7, wobei die codierende DNA-Sequenz für ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DTA, TURF-13, Pectatlyase, Ginrekombinase, iiaL und cytA-Toxin besteht.
  9. Plasmid, das ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 8 umfasst.
  10. Plasmid nach Anspruch 9, das das Plasmid pCIB3178 ist, das unter der Hinterlegungsnummer NRRL B-18978 hinterlegt ist.
  11. Promotorfragment mit der Fähigkeit zur Hybridisierung mit dem Plasmid nach Anspruch 10 unter stringenten Bedingungen, das als Promotor einer Anthere-spezifischen Transkription von assoziierten exprimierbaren und vorzugsweise codierenden DNA-Sequenzen in rekombinanten oder chimären DNA-Konstrukten fungiert.
  12. Rekombinante DNA-Sequenz, die in einer 5'- zu 3'-Richtung das Promotorfragment nach Anspruch 11 in operativer Verknüpfung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz umfasst.
  13. Rekombinante DNA-Sequenz, die in einer 5'- zu 3'-Richtung das Promotorfragment nach Anspruch 11 in operativer Verknüpfung mit einer Signalsequenz umfasst, die operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist.
  14. Rekombinante DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 12 oder 13, wobei die exprimierbare DNA-Sequenz eine codierende Sequenz ist.
  15. Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 14, wobei die codierende DNA-Sequenz für ein Polypeptid codiert, das die Bildung von lebensfähigen Pollen bei Expression in den Antherezellen unterbricht.
  16. Rekombinante DNA-Sequenz nach Anspruch 15, wobei die codierende DNA-Sequenz für ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DTA, TURF-13, Pectatlyase, Ginrekombinase, iiaL und cytA-Toxin besteht.
  17. Wirtzelle, die ein rekombinantes DNA-Molekül nach einem der Ansprüche 4 bis 8 oder 12 bis 16 umfasst.
  18. Wirtzelle nach Anspruch 17, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ein Bakterium ist.
  19. Wirtzelle nach Anspruch 17, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Pflanzenzelle ist.
  20. Transgene Pflanze und die sexuellen und/oder asexuellen Nachkommen hiervon, die mit der rekombinanten DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 4 bis 6 transformiert wurde.
  21. Transgene Pflanze und die sexuellen und/oder asexuellen Nachkommen hiervon, die mit der rekombinanten DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 12 bis 14 transformiert wurde.
  22. Transgene männlich sterile Pflanze, die mit der rekombinanten DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 7 oder 8 transformiert wurde.
  23. Transgene männlich sterile Pflanze, die mit der rekombinanten DNA-Sequenz nach einem der Ansprüche 15 oder 16 transformiert wurde.
  24. Verfahren zur Herstellung eines rekombinaten DNA-Moleküls, das in einer 5'- zu 3'-Richtung eine Anthere-spezifische Promotorregion nach Anspruch 2 oder 3 in operativer Verknüpfung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz umfasst, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst: (a) anfängliches Isolieren aus einer geeigneten Quelle oder Synthetisieren mit Hilfe bekannter Verfahren einer Promotorregion, die für die Anthere-spezifische Expression einer assoziierten exprimierbaren DNA-Sequenz verantwortlich ist, und (b) operatives Verknüpfen der Anthere-spezifischen DNA-Sequenz in einer 5'- zu 3'-Richtung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz.
  25. Verfahren zur Herstellung von transformierten Pflanzenmaterial einschließlich ganzer Pflanzen, das bzw. die ein rekombinantes DNA-Molekül umfasst bzw. umfassen, das in einer 5'- zu 3'-Richtung eine Anthere-spezifische Promotorregion nach Anspruch 2 oder 3 in operativer Verknüpfung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz umfasst, wobei das Verfahren im Wesentlichen die folgenden Stufen umfasst: (a) anfängliches Isolieren aus einer geeigneten Quelle oder Synthetisieren nach bekannten Verfahren einer Promotorregion, die für die Anthere-spezifische Expression einer assoziierten exprimierbaren DNA-Sequenz verantwortlich ist, (b) operatives Verknüpfen der Anthere-spezifischen DNA-Sequenz in einer 5'- zu 3'-Richtung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz, (c) Klonieren des Endkonstrukts in einen Pflanzenexpressionsvektor unter der Steuerung von Expressionssignalen, die in Pflanzen aktiv sind, (d) Transformieren des Expressionsvektors in Pflanzenmaterial mit Hilfe bekannter Verfahren und Exprimieren desselben darin und optional (e) Regenerieren des gemäß Stufe (d) transformierten Pflanzenmaterials zu einer ganzen und vorzugsweise phaenotypisch normalen Pflanze.
  26. Isolierte Nucleotidsequenz aus der Anthere-spezifischen cDNA-Sequenz, die in SEQ. ID Nr. 3 angegeben ist, wobei die cDNA-Sequenz aus der Anthere-spezifischen Genomsequenz nach Anspruch 1 erhalten wurde.
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