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Die vorliegende Erfindung liegt auf
dem Gebiet Pflanzengenmanipulation. Sie betrifft hauptsächlich neue
DNA-Sequenzen, die von dem Ant43D-Genomklon abgeleitet sind und
die als Promotoren einer Anthere-spezifischen
Transkription von assoziierten exprimierbaren und vorzugsweise codierenden
DNA-Sequenzen in rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen fungieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner rekombinante oder chimäre DNA-Sequenzen,
die die Promotoren gemäß der vorliegenden
Erfindung enthalten und die speziell in der Anthere einer Pflanze
exprimiert werden. Die genannten rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen
können
zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, jedoch speziell von transgenen
männlich sterilen
Pflanzen, verwendet werden. Die vorliegende Erfindung beschreibt
ferner Anthere-spezifische cDNA-Sequenzen und genomische DNA-Sequenzen, die geeigneterweise
bei der Isolierung der Anthere-spezifischen Promotorsequenzen gemäß der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können.
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Die Erzeugung von männlichen
sterilen Pflanzen ist von ökonomischen
Interesse bei der Produktion von Hybridsamen. Männliche Sterilität verhindert
eine Selbstbestäubung,
die andernfalls in vielen Pflanzenspezies auftritt und eine Züchtung und
Hybridsamenproduktion behindert.
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Eine Transkription von zahlreichen
Pflanzengenen wird in temporaler und räumlicher Weise gesteuert. Die
Regulation der Genaktivität
wird durch die Wechselwirkung von trans-wirkenden Faktoren und cis-Regulatorelementen
in der Promotorregion eines Gens vermittelt.
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Von speziellem Interesse sind Gene.
die hauptsächlich
oder ausschließlich
in dein Sexualgewebe der Pflanze, wie beispielsweise dem Anthere-
oder Pollengewebe exprimiert werden. Derartige Gene können zur Expression
von Polypeptiden verwendet werden, die nicht natürlicherweise in der Anthere
oder den Pollen produziert werden. Beispielsweise kann die Promotorregion
aus einem Anthere-spezifischen Gen zur Expression eines Polypeptids
verwendet werden, das die Bildung von lebensfähigen Pollen bei Expression
in den Antherezellen unterbricht, was zu einer männlichen sterilen Pflanze führt.
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Die europäische Patentamneldung
EP 0 420 819 A1 beschreibt
die Verwendung eines Wun1-Gens zur Herstellung von männlichen
sterilen Pflanzen.
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Die
US 5 086 169 A beschreibt die Isolierung der
Promotorregion aus dein Zml3-Klon eines Pollen-spezifischen Gens von Mais und seine
Verwendung zur Expression von Genen in Pollen.
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Die internationale Patentamneldung
WO 89 10 396 A beschreibt die Verwendung männlicher steriler DNAs und
Anthere-spezifischer cDNAs TA13, TA26 und TA29. Die Entwicklungsexpressionsprofile
von TA 13 und TA29 passten mit den durch die Anmelder isolierten
beiden cDNA-Klone ANT5 bzw. ANT45 zusammen.
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Die internationale Patentanmeldung
WO 90 08 825 A beschreibt drei Gensequenzen pMS10, pMS14 und pMS18
und ihre Verwendung in rekombinanten DNA-Sequenzen mit dem GUS-Reportergen.
Kein Anzeichen einer Expression ist angegeben.
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Die internationale Patentamneldung
WO 90 08 831 A beschreibt ein Unterbrechergen, das als das Säugetierentkopplungsprotein
(UCP) -Gen bekannt ist, das die Atmung in Zellen hemmt.
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Die internationale Patentanmeldung
WO 90 08 828 beschreibt molekulare Methoden einer Hybridsamenproduktion,
bei denen rekombinante DNA-Moleküle
unter Verwendung von Pollen-spezifischen Promotoren zur Steuerung
der Produktion von fertilen Pollen in Pflanzen verwendet werden.
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Es ist folglich die Hauptaufgabe
der vorliegenden Erfindung, DNA-Sequenzen, die von dem Ant43D-Genomklon abgeleitet
sind und die die Anthere-spezifiscle Expression von Genen in Pflanzen
zu steuern vermögen,
bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung
ist es, rekombinante oder chimäre
DNA-Sequenzen, die
die erfindungsgemäßen Promotoren
enthalten, und die speziell in der Anthere einer Pflanze exprimiert
werden, sowie Vektoren, die die rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen
umfassen, bereitzustellen. Die genannten DNA-Sequenzen oder Vektoren
können
zur Erzeugung von transgenen Pflanzen, jedoch speziell von transgenen
männlich
sterilen Pflanzen, verwendet werden.
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Das Anthere-spezifische Genomklon
Ant43D kann geeigneterweise zur Herstellung von Anthere-spezifischen Promotor-DNA-Sequenzen
und zur Ligation der Promotorsequenzen in einer operablen Weise
an exprimierbare DNA-Sequenzen, die für ein gewünschtes Expressionsprodukt
codieren, verwendet werden.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung
sind somit neue erfindungsgemäße DNA-Sequenzen,
die speziell in der Anthere einer Pflanze exprimiert werden.
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In einer Ausführungsform umfasst die vorliegende
Erfindung eine isolierte Nucleotidsequenz im Wesentlichen aus einer
Anthere-spezifischen cDNA-Sequenz. Die cDNA-Sequenz kann durch differentielles Screenen
von cDNA-Bibliotheken und Auswählen
der cDNA-Klone, die gemäß Beobachtung
in einer hochspezifischen Weise in einem Antheregewebe exprimiert
werden, erhalten werden. Die cDNA-Klone gemäß der vorliegenden Erfindung
können
die DNA-Sequenz SEQ. ID Nr. 3 besitzen.
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In einer weiteren Ausführungsform
umfasst die vorliegende Erfindung eine isolierte Genom-DNA-Sequenz
mit der Bezeichnung Ant43D, die im Wesentlichen aus einer DNA-Sequenz
besteht, die einem Anthere-spezifischen cDNA-Klon entspricht und
somit mit der genannten Anthere-spezifischen cDNA zu hybridisieren
vermag. Die erfindungsgemäße Genom-DNA-Sequenz
kann somit vorzugsweise durch Hybridisieren einer Genombibliothek
mit der Anthere-spezifischen cDNA-Sequenz, die als Sonde verwendet
wird, erhalten werden. Die erfindungsgemäße Genom-DNA-Sequenz kann die
DNA-Sequenz SEQ. ID Nr. 18 aufweisen oder durch Hybridisieren mit
einer cDNA mit der DNA-Sequenz SEQ. ID Nr. 3 erhalten werden.
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Das Genom cDNA-Klon wird vorzugsweise
als Quelle zur Isolierung von DNA-Sequenzen verwendet, die als Promotoren
einer Anthere-spezifischen Transkription von assoziierten exprimierbaren
und vorzugsweise codierenden DNA-Sequenzen in rekombinanten oder
chimären
DNA-Konstrukten fungieren.
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Es ist selbstverständlich,
dass die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen,
sobald sie identifiziert worden sind, jedes Mal nicht neu aus einer
geeigneten Quelle isoliert werden müssen, sondern selbstverständlich sehr
einfach zu jeder Zeit mit Hilfe bekannter chemischer Verfahren synthetisiert
werden können.
Geeignete Verfahren zur Synthese kurzer DNA-Oligonucleotide, beispielsweise
die Phosphotriester- oder Phosphitmethode, sind dem Fachmann auf
dein einschlägigen
Fachgebiet bekannt. Heutzutage ist der Großteil der Oligonucleotidsynthesen
mechanisiert und automatisiert, sodass kurze DNA-Fragmente in kurzer
Zeitdauer hergestellt werden können.
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Durch Deletion, Insertion oder Substitution
eines oder mehrerer Basenpaare in den oben genannten erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen
können
folglich sehr leicht Varianten oder Mutanten der Sequenzen hergestellt
und bezüglich
ihrer Eignung als Anthere-spezifische Promotorsequenz untersucht
werden.
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Ein speziell geeignetes Verfahren
der Herstellung von spezifischen Mutanten ist die so genannte Oligonucleotid-vermittelte
Mutagenese. Bei diesem Verfahren werden kurze Oligonucleotidfragmente
synthetisiert, die sich, auch wenn sie im Wesentlichen zu der Sequenz
vom Wildtyp homolog sind, davon in einzelnen Nucleotiden unterscheiden.
Die genannten Unterschiede können
Insertionen, Deletionen, Inversionen oder eine Substitution eines
oder mehrerer Nucleotide sein und sie können eine Kombination der oben
genannten Verfahren sein. Diese mutierten Fragmente ersetzen dann
die homologen Gegenstücke
in dem Gen vom Wildtyp gemäß den allgemein
bekannten Verfahren. Das Endkonstrukt kann anschließend wie
oben beschrieben in einen geeigneten Pflanzenexpressionsvektor kloniert
werden und in eine Pflanze transformiert werden.
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Die Mutation bestimmter DNA-Fragmente
kann jedoch auch vorzugsweise unter Verwendung der Polymerasekettenreaktionen
(PCR) durchgeführt
werden. Bei diesem in vitro Prozess werden chemisch synthetisierte
Oligonucleotide, die im Allgemein von den peripheren Regionen des
zu mutierenden DNA-Fragments herstammen und strangspezifisch sind.
Unter geeigneten Bedingungen erfolgt eine Hybridisierung der Oligonucleotide
mit den komplementären
Regionen auf den DNA-Einzelsträngen,
die durch Denaturieren produziert werden. Die auf diese Weise gebildeten
Doppelstrangregionen werden als Primer für die nachfolgende Polymerasereaktion
verwendet.
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Bei diesem Verfahren können neben
DNA-Polymerasen aus E. coli speziell wärmestabile Polymerasen aus
thermophilen Bakterien, wie Thermus aquaticus, verwendet werden.
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In einer weiteren Ausführungsform
umfasst die vorliegende Erfindung isolierte rekombinante oder chimäre DNA-Sequenzen,
in denen eine aus der erfindungsgemäßen Anthere-spezifischen Genom-DNA-Sequenz
erhältliche
Promotorregion operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist,
die vorzugsweise für
ein Protein codiert, von dem gewünscht
wird, dass es in den Antherezellen exprimiert wird. Beispielsweise
können
die isolierten rekombinanten DNA-Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung
in einer 5'- zu 3'-Richtung eine von
einer Anthere-spezifischen Genom-DNA-Sequenz ID Nr. 3 erhaltene
Promotorregion umfassen, die operativ mit einer DNA-Sequenz verknüpft ist,
die für
ein Polypeptid codiert, das die Bildung lebensfähiger Pollen bei Expression
in den Antherezellen unterbricht. Die erhaltene Pflanze vermag es
nicht, lebensfähige
Pollenzellen zu produzieren und ist somit männlich steril. Beispiele einer
derartigen rekombinanten DNA-Sequenz umfassen chimäre Vektoren,
in denen ein Anthere-spezifischer Promotor operativ mit einer DNA-Sequenz
verknüpft
ist, die für
eine Polypeptid codiert ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus der Codiersequenz der DTA-, TURF-13-, Pectatlyase-, Ginrekombinase-,
iaaL- oder cytA-Toxin-Gene besteht.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
somit des weiteren ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten
DNA-Moleküls,
das in einer 5'-
zu 3'-Richtung eine
erfindungsgemäße Anthere-spezifische
Promotorregion umfasst, die operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz
verknüpft
ist, wobei das Verfahren die folgenden Stufen umfasst:
- (a) Anfängliches
Isolieren aus einer geeigneten Quelle oder Synthetisieren mit Hilfe
bekannter Verfahren einer Promotorregion, die für die Anthere-spezifische Expression
einer assoziierten exprimierbaren DNA-Sequenz verantwortlich ist, und
- (b) operatives Verknüpfen
der Anthere-spezifischen DNA-Sequenz in einer 5'- zu 3'-Richtung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz.
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Um die Lage des durch die rekombinante
DNA-Sequenz codierten Peptids in der Pflanzenzelle spezifisch zu
steuern, kann die rekombinante DNA-Sequenz gemäß der vorliegenden Erfindung
in einer 5'- zu 3'-Richtung eine Anthere-spezifische
Promotorregion umfassen, die operativ mit einer Signalsequenz verknüpft ist,
die operativ mit einer codierenden DNA-Sequenz verknüpft ist.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung umfasst Plasmide, die Anthere-spezifische Promotorsequenzen
gemäß der vorliegenden
Erfindung, jedoch speziell rekombinante oder chimäre DNA-Sequenzen enthalten,
in denen eine aus einer Anthere-spezifischen Genom-DNA-Sequenz erhältliche
Promotorregion operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist,
die vorzugsweise für
ein Protein codiert, von dem gewünscht
ist, dass es in den Antherezellen exprimiert wird. Diese Plasmide
umfassen pCIB3178, ohne darauf begrenzt zu sein. Die vorliegende
Erfindung umfasst auch Promotorfragmente, die von den erfindungsgemäßen Plasmiden
abgeleitet sein können,
die jedoch noch diese Eigenschaften zeigen, die für die Durchführung der
vorliegenden Erfindung essentiell sind, d. h. in der Lage sind,
die Expression einer assoziierten DNA-Sequenz in einer Anthere-spezifischen
Weise anzutreiben.
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Für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezeichnet der Ausdruck „abgeleitet
von" einem Plasmid die
physikalische Isolierung einer Nucleotidsequenz oder eines Fragments
aus einem Plasmid sowie die physikalische Isolierung einer Nucleotidsequenz
oder eines Fragments unter Verwendung einer zu einem der obigen
Plasmide homologen Sonde oder einer unter Verwendung einiger oder
aller der Nucleotidsequenzen der obigen Plasmide hergestellten synthetischen
Nucleotidsequenz.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung umfasst transgene Pflanzen und die sexuelle und/oder asexuelle
Nachkommenschaft hiervon, die mit einer rekombinanten oder chimären DNA-Sequenz
transformiert wurden, die eine Anthere-spezifische Promotorsequenz
gemäß der vorliegenden
Erfindung und optional eine Signalsequenz umfasst, die operativ
in einer 5'- zu
3'-Orientierung
mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz, jedoch vorzugsweise einer
codierenden DNA-Sequenz verknüpft
ist. Derartige transgene Pflanzen exprimieren das durch die chimäre DNA-Sequenz
codierte Polypeptid lediglich in der Anthere der Pflanze. Wenn das
codierte Polypeptid ein Polypeptid ist, das die Bildung lebensfähiger Pollen
bei Expression in den Antherezellen unterbricht, vermag die transgene
Pflanze keine lebensfähigen
Pollenzellen zu produzieren und ist somit männlich steril. Beispielsweise
können
derartige transgene Pflanzen für
DTA, TURF13, Pectatlyase, Ginrekombinase, iaaL oder cytA-Toxin codieren.
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Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung ist somit die Bereitstellung männlicher steriler Pflanzen,
die mit einer der obigen rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen transformiert
sind.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
ferner ein Verfahren zur Herstellung eines transformierten Pflanzenmaterials
einschließlich
ganzer Pflanzen, das bzw. die ein rekombinantes DNA-Molekül umfasst
(umfassen), das in einer 5'-
zu 3'-Richtung eine
Anthere-spezifische Promotorregion gemäß der vorliegenden Erfindung
umfasst, die operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz verknüpft ist,
wobei das Verfahren im Wesentlichen die folgenden Schritte umfasst:
- (a) Anfängliches
Isolieren aus einer geeigneten Quelle oder Synthetisieren mit Hilfe
bekannter Verfahren einer Promotorregion, die für die Anthere-spezifische Expression
einer assoziierten exprimierbaren DNA-Sequenz verantwortlich ist;
- (b) operatives Verknüpfen
der Anthere-spezifischen DNA-Sequenz in einer 5'- zu 3'-Richtung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz;
- (c) Klonieren des Endkonstrukts in einen Pflanzenexpressionsfaktor
unter der Steuerung von Expressionssignalen, die in Pflanzen aktiv
sind;
- (d) Transformieren des Expressionvektors in Pflanzenmaterial
mit Hilfe bekannter Verfahren und Exprimieren desselben darin und
optional
- (e) Regenerieren des gemäß Stufe
(d) transformierten Pflanzenmaterials zu einer ganzen und vorzugsweise
phaenotypisch normalen Pflanze.
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Definitionen:
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„Anthere-spezifisch" wird verwendet,
um cDNAs, genomische DNAs, Messenger-RNA-s, Promotor-DNA-Sequenzen und Gene,
die mit Antheregewebe assoziiert sind, zu beschreiben. Im Falle
von cDNAs, genomischen DNAs und Messenger-RNAs beschreibt „Anthere-spezifisch" die Tatsache, dass
beim Testen von Northern-Blot-Hybridisierung
die zu der cDNA-, genomischen DNA- oder mRNA-Sequenz entsprechende mRNA
in einem Antheregewebe in Konzentrationen vorhanden ist, die mindestens
das etwa 100fache der in anderen Geweben beobachteten Konzentrationen
entsprechen. Im Falle von Promotor-DNA-Sequenzen beschreibt „Anthere-spezifisch" eine Regulatorsequenz,
die die Transkription von assoziierten codierenden Sequenzen so
steuert, dass die entsprechende Messenger-RNA in Antheregewebe in
Konzentrationen vorhanden ist, die mindestens das etwa 100fache
der in anderen Geweben beobachteten Konzentrationen betragen. Im
Falle eines Gens beschreibt „Anthere-spezifisch" ein Gen, das in
einer derartigen Weise exprimiert wird, sodass das Genprodukt in
Antheregewebe in Konzentrationen vorhanden ist, die mindestens das
etwa 100fache der in anderen Geweben beobachteten Konzentrationen
betragen. Da Anthere- und Pollengewebe beide an der männlichen
sexuellen Funktion einer Pflanze beteiligt sind, kann eine DNA-Sequenz
oder ein Gen für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung als „Anthere-spezifisch" angesehen werden,
wenn sie bzw. es speziell in Pollen sowie in Antheregeweben exprimiert
wird.
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„Rekombinant" und „chimär" werden jeweils verwendet,
um anzugeben, dass eine DNA-Sequenz, ein Vektor oder ein Gen aus
mehr als einer DNA-Sequenz verschiedenen Ursprungs, die miteinander
unter Bildung einer DNA-Sequenz, eines Vektors oder eines Gens,
das natürlich
nicht vorkommt, verschmolzen oder legiert sind, besteht. Beispielsweise
wird die Ligation einer Promotor-DNA-Sequenz aus einem Anthere-spezifischen
Gen mit der codierenden DNA-Sequenz eines unterschiedlichen Gens
heterologen Ursprungs als „rekombinant" oder „chimär" bezeichnet.
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In der folgenden Beschreibung wird
eine Reihe von Ausdrücken
verwendet, die in der rekombinanten DNA-Technologie und in der Pflanzengenetik üblich sind.
Um ein klares und gleichmäßiges Verständnis der Beschreibung
und der Patentansprüche
und auch des Umfangs, der diesen Ausdrücken zuzuerkennen ist, zu gewährleisten,
sind die folgenden Definitionen angegeben.
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Pflanzenmaterial: Teile von Pflanzen,
die in Kultur lebensfähig
sind oder die als solche lebensfähig sind,
beispielsweise Protoplasten, Zellen, Callus, Gewebe, Embryos, Pflanzenorgane,
Knospen, Samen usw., sowie auch ganze Pflanzen.
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Pflanzenzellen: Strukturelle und
physiologische Einheit der Pflanze, die einen Protoplasten und eine Zellwand
umfasst. Die Pflanzenzelle kann in Form einer isolierten einzelnen
Zelle oder als Teil einer höheren organisierten
Einheit vorliegen, beispielsweise als Pflanzengewebe, Pflanzenorgan
oder ganze Pflanze.
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Protoplast: „Nackte" Pflanzenzelle, die keine Zellwand aufweist
und aus Pflanzenzellen oder Pflanzengeweben isoliert wurde und das
Potential besitzt, zu einem Zellklon oder zu einer ganzen Pflanze
zu regenerieren.
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Pflanzengewebe: Gruppe von Pflanzenzellen,
die in Form einer strukturellen und funktionellen Einheit organisiert
sind.
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Pflanzenorgan: Strukturelle und funktionelle
Einheit, die mehrere Gewebe, beispielsweise Wurzel, Stamm, Blatt
oder Embryo, umfasst.
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Heterologe(s) Gene) oder DNA: Eine
DNA-Sequenz, die für
ein spezielles Produkt oder Produkte codiert oder eine biologische
Funktion erfüllt
und die von einer Spezies herrührt,
die von der verschieden ist, in die das Gen insertiert werden soll.
Die DNA-Sequenz wird auch als Fremdgen oder Fremd-DNA bezeichnet.
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Homologe(s) Gen(e) oder DNA: Eine
DNA-Sequenz, die für
ein spezielles Produkt oder Produkte codiert oder eine biologische
Funktion erfüllt
und von derselben Spezies herrührt
wie die, in die das Gen insertiert werden soll.
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Synthetische(s) Gen(e) oder DNA:
Eine DNA-Sequenz, die für
ein spezielles Produkt oder Produkte codiert oder eine biologische
Funktion erfüllt
und durch synthetische Maßnahmen
produziert wird.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
Anthere-spezifische Nucleotidsequenzen, die von dem Genomklon Ant43D
herrühren,
speziell rekombinanten oder chimäre
DNA-Sequenzen, die in viel höheren
Mengen in der Anthere einer Pflanze als in einem anderen Gewebe
exprimiert werden. Die rekombinanten oder chimären DNA-Sequenzen umfassen eine aus der Anthere-spezifischen
Genom-DNA-Sequenz erhältliche
Promotorregion, die operativ mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz
verknüpft
ist, die vorzugsweise für
ein Protein codiert, von dem gewünscht
wird, dass es in den Antherezellen exprimiert wird.
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In einer speziell bevorzugten Ausführungsform
codiert die codierende DNA-Sequenz für ein Polypeptid, das bei Expression
in den Antherezellen die Bildung von lebensfähigen Pollen unterbricht. Bevorzugt
als die codie rende DNA-Sequenz sind Sequenzen, die für ein Polypeptid
codieren, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus DTA, TURF13,
Pectatlyase, Ginrekombinase, iaaL und cytA-Toxin besteht.
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Die in dein erfindungsgemäßen rekombinanten
oder chimären
Konstrukt zu verwendenden Anthere-spezifischen Promotor-DNA-Sequenzen
werden vorzugsweise aus genomischen Klonen isoliert und in einer
5'- zu 3'-Orientierung an
exprimierbare DNA-Sequenzen legiert, die vorzugsweise für ein gewünschtes Proteinprodukt
codieren, um chimäre
Vektoren bereitzustellen, die speziell in der Anthere einer Pflanze
exprimiert werden.
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Die vorliegende Erfindung betrifft
das Anthere-spezifische cDNA-Klon Ant43D, das der Sequenz SEQ. ID
Nr. 3 entspricht.
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Alle weiteren nachfolgend und in
den Beispielen beschriebenen cDNA- und genomischen Sequenzen dienen
lediglich Beschreibungszwecken.
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Somit können des weiteren Anthere-spezifische
genomische DNA-Sequenzen entsprechend den Anthere-spezifischen cDNA-Klonen
SEQ. ID Nr. 1, 5, 7, 9, 11, 13, 14 und 20 isoliert werden.
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Des weiteren können Anthere-spezifische genomische
Klone durch Verwendung von Anthere-spezifischen cDNA-Klonen als
Sonden zum Extrahieren der entsprechenden genomischen DNA-Klone
erhalten werden. Entsprechende genomische Klone sind solche, die
transkribiert sind, um eine Messenger-RNA zu bilden, die zu einer
gegebenen cDNA komplementär
ist und in eine gegebene cDNA transkribiert wird. Ein Beispiel für ein derartiges
genomisches Klon ist das isolierte Anthere-spezifische genomische
DNA-Klon Ant32, dessen Sequenz als SEQ. ID Nr. 16 angegeben ist.
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Mehrere cDNA-Sequenzen sind beschrieben,
die als Sonden verwendet werden können, um Anthere-spezifische genomische
DNA-Sequenzen zu isolieren. Beispiele sind die isolierten Anthere-spezifischen cDNA-Klone Ant32, Ant9,
Ant52, Ant59, Ant66, Ant67, Ant68 und Ant43C, entsprechend den Sequenzen
SEQ. ID Nr. 1, SEQ. ID Nr. 5, SEQ. ID Nr. 7, SEQ. ID Nr. 9, SEQ.
ID Nr. 11, SEQ. ID Nr. 13, SEQ. ID Nr. 14 bzw. SEQ. ID Nr. 20.
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Die Anthere-spezifischen cDNA-Sequenzen
können
durch Herstellen von cDNA-Bibliotheken aus Antheregewebe und Blattgewebe
erhalten werden. Einzelsträngige
DNA aus dein Blatt wird photobiotinyliert und an Anthere-DNA hybridisiert.
Photobiotinylierte DNA wird entfernt, wobei eine bezüglich Anthere-spezifischen cDNA-Sequenzen
angereicherte Bibliothek verbleibt (Beispiel 3). Anthere-spezifische
cDNAs werden durch differentielles Screenen identifiziert (Beispiel
4). Die Anthere-spezifischen cDNAs werden kreuzhybridisiert, um einmalige
cDNAs zu identifizieren (Beispiel 4). Eine Anthere-spezifische Expression
wird durch RNA-Blot-Hybridisierung
mit verschiedenen Pflanzengeweben und in situ Hybridisierung verifiziert
(Beispiele 5 und 8). Eine Entwicklungsexpression, Sequenzen und
die Genkopiezahl der Anthere-spezifischen cDNA-Klone wird auch bestimmt
(Beispiele 6 und 7 und 9).
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Die cDNA-Sequenzen können verwendet
werden, um genomische DNA-Sequenzen zu isolieren. Wo eine partielle
cDNA erhalten wurde, wurde die partielle cDNA als Sonde verwendet,
um die Anthere-cDNA-Bibliothek zu screenen, um ein cDNA-Klon vollständiger Länge zu isolieren.
Hybridisierende Klone werden gereinigt, restriktionskartiert und
sequenziert. Ein Klon vollständiger
Länge besitzt
nahezu Message-Größe und weist
einen vollständigen
offenen Leserahmen auf. Zur Isolierung eines genomischen Klons wird
eine Anthere-cDNA vollständiger
Länge als
Sonde verwendet, um eine genomische Bibliothek zu screenen. Durch
Restriktionskartierung und Hybridisierung an die Anthere-cDNA wird
die Codierregion des genomischen Klons identifiziert. Der Bereich
stromauf des Codierbereichs des Klons ist die Anthere-Promotorregion.
Die Anthere-spezifische Promotorregion kann durch Deletionsanalyse
genauer kartiert werden. 5'-Deletionen
eines Anthere-Promotors werden durch Einführung von Restriktionsstellen
durch PCR unter Verwendung von Oligonucleotidprimern mit Restriktionsstellen
an den 5'- Enden und Anthere-Promotorsequenzen
an den 3'-Enden
hergestellt. Die PCR-Produkte werden verdaut, gereinigt und in pBI101
(Clontech) kloniert. Die Deletionsmutanten enthalten die 5' nicht-translatierte
Leadersequenz, die an die Translationsstartstelle des GUS-Gens fusioniert ist.
Interne und 3'-Deletionen
der Anthere-Promotoren werden durch PCR in ähnlicher Weise hergestellt.
Die PCR-Fragmente werden an einen GUS-Vektor, der den CAMV 35S Minimal-Promotor
(–46 bis
+1, Benfey et al., 1990) enthält,
fusioniert. Transgene Pflanzen werden mit dem GUS-Florometrie- und
histochemischen Assay getestet.
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Die Anthere-spezifische Promotorregion
kann geeignet zur Herstellung rekombinanter oder chimärer DNA-Konstrukte,
die eine exprimierbare DNA-Sequenz, jedoch vorzugsweise eine codierende
DNA-Sequenz, die speziell in der Anthere einer Pflanze exprimiert
wird, umfassen, verwendet werden.
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Die vorliegende Erfindung beschreibt
somit des weiteren rekombinante DNA-Sequenzen, die in einer 5'- zu 3'Richtung eine von einer Anthere-spezifischen
genomischen DNA-Sequenz ID Nr. 3 erhaltene Promotorregion umfassen,
die operativ mit einer codierenden DNA-Sequenz verknüpft ist.
Die rekombinanten DNA-Sequenzen führen zu einer Anthere-spezifischen
Expression der assoziierten exprimierbaren DNA, die vorzugsweise
eine codierende DNA-Sequenz ist, die für ein Strukturgen codiert.
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Die erfindungsgemäße codierende DNA-Sequenz kann
eine beliebige DNA-Sequenz mit Codierung für ein gewünschtes Polypeptid sein. Bevorzugt
innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung sind beispielsweise
alle die Strukturgene, die zu einer Schutzwirkung in den transformierten
Pflanzenzellen und auch in den sich daraus entwickelnden Geweben
und speziell in den Pflanzen führen,
beispielsweise zu einem erhöhten
Schutz gegenüber
Pathogenen (beispielsweise phytopathogenen Pilzen, Bakterien, Viren
usw.), einer erhöhten
Beständigkeit
gegenüber
Chemikalien [beispielsweise gegenüber Herbiziden (z. B. Triazinen,
Sulfonylharnstoffen, Imidazolinonen, Triazolpyrimidinen, Bialaphos,
Glyphosat usw.), Insektiziden und anderen Bioziden], zu einer erhöhten Beständigkeit
gegenüber
widrigen Umweltfaktoren (beispielsweise Wärme, Kälte, Wind, widrigen Bodenbedingungen,
Feuchtigkeit, Trockenheit usw.).
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Des weiteren können die innerhalb des Umfangs
der vorliegenden Erfindung zu verwendenden codierenden DNA-Sequenzen
solche sein, die zur Produktion von gewünschten und geeigneten Verbindungen
in der Pflanzenzelle führen.
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Gene, die auch innerhalb des Umfangs
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen beispielsweise
die, die zu einer erhöhten
Bildung von Reservesubstanzen oder gelagerten Substanzen in Blättern, Samen,
Knospen, Wurzeln, Stämmen
usw. oder in den Proteinkörpern
von Samen führen.
Die wünschenswerten
Substanzen, die durch transgene Pflanzen hergestellt werden können, umfassen
beispielsweise Proteine, Kohlenhydrate, Aminosäuren, Vitamine, Alkaloide,
Flavine, Duftstoffe, Färbestoffe,
Fette usw.
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Mit der erfindungsgemäßen DNA-Sequenz
assoziiert können
auch Strukturgene sein, die für
pharmazeutisch akzeptable aktive Substanzen, beispielsweise Hormone,
Immunomodulatoren und andere physiologisch aktive Substanzen, codieren.
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Speziell bevorzugt zur Verwendung
gemäß der vorliegenden
Erfindung sind jedoch codierende DNA-Sequenzen, die für die Produktion eines Polypeptids
codieren, das bei Expression in Antheregewebe zu der Unfähigkeit
der Pflanze führt,
lebensfähige
Pollen zu produzieren. Beispiele für derartige codierende DNA-Sequenzen
umfassen die Gene, die in den folgenden Literaturstellen beschrieben
sind, deren Offenbarungen hiermit durch in Bezugnahme in der dort
angegebenen vollständigen
Weise aufgenommen sind:
- a) Diphtherietoxin-A-Kettengen
(DTA), das eine Proteinsynthese hemmt, Greenfield et al., 1983,
Palmiter et al., 1987.
- b) Pectatlyasegen pelE von Erwinia chrzsanthemi EC16, das Pektin
abbaut und eine Zelllyse bedingt. Keen et al., 1986.
- c) T-urf13 (TURF-13)-Gen aus cms-T-Maismitochondriengenomen;
dieses Gen codiert für
ein Polypeptid mit der Bezeichnung URF13, das Mitochondrien oder
Plasmamembranen spaltet. Braun et al., 1990, Dewey et al., 1987
und Dewey et al., 1986.
- d) Ginrekombinasegen aus Phagen-Mu-Gen, das für eine stellen-spezifische
DNA-Rekombinase codiert, die Genomumlagerungen und einen Verlust
von Zelllebensfähigkeit
bei Expression in Zellen von Pflanzen bedingt. Maeser et al., 1991.
- e) Indolessigsäurelysinsynthetasegen
(iaaL) von Pseudomonas syringae, das für ein Enzym codiert, das Lysin
zu Indolessigsäure
(IAA) konjugiert. Bei Expression in den Zellen von Pflanzen bedingt
es eine veränderte
Entwicklung infolge der Entfernung von IAA aus der Zelle mittels
Konjugation. Romano et al., 1991, Spena et al., 1991, Roberto et
al., 1990.
- f) CytA-Toxin-Gen aus Bacillus thuringiensis Israeliensis, das
für ein
Protein codiert, das moskitozid und hämolytisch ist. Bei Expression
in Pflanzenzellen bedingt es den Tod der Zelle infolge Spaltung
der Zellmembran. McLean et al., 1987, Ellar et. al., US 4 918 006 A (1990).
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Die in der vorliegenden Erfindung
beschriebenen rekombinanten DNA-Sequenzen können des weiteren in einer
5'- zu 3'-Richtung eine aus
einer Anthere-spezifischen genomischen DNA-Sequenz ID Nr. 3 erhaltene
Promotorregion umfassen, die operativ mit einer Signalsequenz verknüpft ist,
die operativ mit einer codierenden DNA-Sequenz verknüpft ist. Die Signalsequenz
ist für
den spezialisierten Transport des assoziierten Peptids in der Pflanzenzelle
verantwortlich.
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Die Signalsequenz kann eine beliebige
DNA-Sequenz sein, die den Transport eines assoziierten Polypeptids
in ein oder mehrere der zellulären
Kompartments steuert. Die Signalsequenz ist vorzugsweise eine Sequenz,
die in ein Signalpeptid translatiert wird, das aus dem Peptid abgetrennt
wird, nachdem der Durchtritt des Peptids vollständig ist. Signalsequenzen eignen
sich zur Steuerung des Polypeptidprodukts der codierenden DNA-Sequenz
zu einem gewünschten
Ort in der Zelle, beispielsweise den Mitochondrien oder dein endoplasmatischen
Reticulum oder zur Steuerung eines extrazellulären Transports außerhalb
der Zelle. Zu den erfindungsgemäß geeigneten
Signalsequenzen gehören
beispielsweise die Signalsequenz aus dein Patogenese-related Gen
(PR-1) von Tabak, das bei Cornellisen et al., 1986, beschrieben
ist, die Hefemitochondrien-Präsequenz,
Schmitz et al., 1989, die Signalsequenz aus Pflanzenmitochondrien
Rieske-Eisen-Schwefel-Protein, Huang et al., 1991, Mitochondrien-
und Chloroblasten-Target-Peptide,
von Heijne et al., 1989. Die Identifizierung anderer Leader-Sequenzen
ist aus dein einschlägigen
Fachgebiet bekannt. Vgl Della-Cioppa et al., 1987, Schekman, 1985.
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Die verschiedenen Bereiche der Sequenz
können
miteinander durch per se bekannte Verfahren zur Bildung einer vollständigen codierenden
DNA-Sequenz verknüpft
werden. Geeignete Verfahren umfassen beispielsweise die in vitro
Rekombination von DNA-Sequenzen mit homologen Bereichen und die
in vitro Verknüpfung
von Restriktionsfragmenten.
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Als Klonierungsvektoren werden im
Allgemeinen Plasmid- oder Virus- (Bakteriophagen) Vektoren mit Replikations-
und Steuerungssequenzen, die von Spezies herrühren, die mit der Wirtzelle
kompatibel sind, verwendet.
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Der Klonierungsvektor trägt im Allgemeinen
einen Replikationsursprung, insbesondere einen Replikationsursprung,
der in E. coli, in Agrobacterium oder in beiden zu funktionieren
vermag, und darüber
hinaus spezifische Gene, die zu phaenotypischen Auswahlmerkmalen
in der transformierten Wirtzelle, insbesondere zu einer Resistenz gegenüber Antibiotika
oder gegenüber
spezifischen Herbiziden führen.
Die transformierten Vektoren können
auf der Basis dieser phaenotypischen Macker nach Transformation
einer Wirtzelle ausgewählt
werden.
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Auswählbare phaenotypische Marken,
die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen
beispielsweise eine Resistenz gegenüber Ampicillin, Tetracyclin,
Hygromycin, Kanamycin, Methotrexat, G418 und Neomycin, diese Liste,
die als Beispiel angegeben ist, soll jedoch den Gegenstand der vorliegenden
Erfindung nicht einschränken.
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Geeignete Wirtzellen im Rahmen der
vorliegenden Erfindung sind Prokarzyonten, einschließlich Bakterienwirten,
z. B. A. tumefaciens, E. coli, S. typhimurium und Serratia marcescens,
sowie ferner Cyanobakterien. Eukaryontische Wirte, wie Hefen, Mycelium-bildende
Pilze und Pflanzenzellen, können
auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
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Das Splicen der erfindungsgemäßen Hybridgenkonstruktion
in einen geeigneten Klonierungsvektor wird unter Verwendung von
Standardverfahren, beispielsweise den bei Maniatis et al. (1982)
oder Sambrook et al. (1989) beschriebenen, durchgeführt.
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Die Klonierungsvektoren und die mit
diesen Vektoren transformierte Wirtzelle werden im Allgemeinen verwendet,
um die Zahl der Kopien der darin klonierten Konstrukte zu erhöhen. Mit
einer erhöhten
Zahl von Kopien ist es möglich,
den die Hybridgenkonstruktion tragenden Vektor zu isolieren und
und beispielsweise zur Insertion der chimären Gensequenz in eine Pflanzenzelle
herzustellen.
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In einer weiteren Verfahrensstufe
werden diese Plasmide zur Insertion der Strukturgene, die für ein gewünschtes
Genkonstrukt codieren, oder nicht codierender DNA-Sequenzen mit
einer Regulatorfunktion in eine Pflanzenzelle und optional zur Integration
derselben in das Pflanzengenom verwendet.
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Die vorliegende Erfindung beschreibt
folglich ferner die Produktion von Empfängerpflanzenzellen, die das
genannte Strukturgen oder andere wünschenswerte Gene oder Genfragmente
oder andere geeignete DNA-Sequenzen,
die in ihr Genom eingebaut sind, umfassen.
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Eine Zahl von sehr wirksamen Verfahren
zur Einführung
von DNA in Pflanzenzellen ist entstanden, die auf der Verwendung
von Gentransfervektoren oder auf direkten Gentransferprozessen basieren.
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Ein mögliches Verfahren umfasst beispielsweise
das In-Kontakt-Bringen von Pflanzenzellen mit Viren oder mit Agrobacterium.
Dies kann durch Infizieren von sensitiven Pflanzenzellen oder durch
Cokultivierung von Protoplasten, die von Pflanzenzellen abgeleitet
sind, erfolgen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann auch Cauliflower-Mosaik-Virus
(CaMV) als Vektor zur Insertion der erfindungsgemäßen chimären Genkonstruktion
in eine Pflanze verwendet werden.
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Ein weiteres Verfahren der Insertion
der erfindungsgemäßen chimären Genkonstruktion
in eine Zelle verwendet die Infektion der Pflanzenzelle mit Agrobacterium
tumefaciens und/oder Agrobacterium rhizogenes, das mit der Genkonstruktion
transformiert wurde. Die transgenen Pflanzenzellen werden anschließend unter geeigneten
Kulturbedingungen, die dein Fachmann auf dein einschlägigen Fachgebiet
bekannt sind, kultiviert, sodass sie Schösslinge und Wurzeln bilden
und schließlich
ganze Pflanzen gebildet werden.
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Unter Verwendung neu entwickelter
Transformationstechniken wurde es im Prinzip auch möglich, in vitro
Pflanzenspezies, die keine natürlichen
Wirtpflanzen für
Agrobacterium sind, zu transformieren (Grimsley NH et al. (1987)).
Beispielsweise sind einkeimblättrige
Pflanzen, insbesondere die Getreidespezies und verschiedene Gräser, nicht
natürliche
Wirte für
Agrobacterium.
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Bevorzugt im Rahmen der vorliegenden
Erfindung ist die so genannte Blattscheibentransformation unter
Verwendung von Agrobacterium (Horsch et al. (1985)). Sterile Blattscheiben
aus einer geeigneten Targetpflanze werden mit Agrobacteriumzellen,
die eine der erfindungsgemäßen chimären Genkonstruktionen
umfassen, inkubiert und anschließend werden sie in oder auf
ein geeignetes Nährmedium übertragen.
Speziell geeignete und folglich im Rahmen der vorliegenden Erfindung
bevorzugt sind LS-Medien, die durch die Zugabe von Agar verfestigt
und mit einem oder mehreren der üblicherweise
verwendeten Pflanzenwachstumsregulatoren, insbesondere denjenigen,
die aus der Gruppe der Auxine ausgewählt sind, die aus a-Naphthylessigsäure, Picloram,
2,4,5-Trichlorphenoxyessigsäure,
2,4-Dichlorpehenoxyessigsäure,
Indol-3-buttersäure,
Indol-3-milchsäure,
Indol-3-bernsteinsäure,
Indol-3-essigsäure und
p-Chlorphenoxyessigsäure
besteht, und aus der Gruppe der Cytokine ausgewählt sind, die aus Kinetin,
6-Benzyladenin, 2-Isopentenyladenin und Zeatin besteht, angereichert
sind. Die bevorzugte Konzentration von Auxinen und Cytokinen liegt
in einem Bereich von 0,1 mg/l bis 10 mg/l.
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Nach einer Inkubation für mehrere
Tage, jedoch vorzugsweise nach Inkubation für 2 bis 3 Tage, bei einer Temperatur
von 20°C
bis 40°C,
vorzugsweise von 23°C
bis 35°C
und spezieller bei 25°C,
und in diffusem Licht werden die Blattscheiben auf ein geeignetes
Medium zur Schösslinginduktion überführt. Besonders
bevorzugt für
die Auswahl von Transformanten ist ein LS-Medium, das kein Auxin,
jedoch statt dessen Cytokinin enthält, und dem eine selektive
Substanz zugegeben wurde. Die Kulturen werden im Licht gehalten
und in geeigneten Intervallen in frisches Medium überführt, jedoch
vorzugsweise in Intervallen von einer Woche. Sich entwickelnde grüne Schösslinge
werden herausgeschnitten und weiter in einem Medium kultiviert,
das induziert, dass die Schösslinge
Wurzeln bilden. Speziell bevorzugt im Rahmen der vorliegenden Erfindung
ist ein LS-Medium, das kein Auxin oder Cytokinin enthält, dein
jedoch eine selektive Substanz zur Selektion der Transformanten
zugegeben wurde.
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Neben einer Agrobacterium-vermittelten
Transformation ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung möglich, direkte
Transformationsverfahren zu Insertionen der erfindungsgemäßen Genkonstruktionen
in Pflanzenmaterial zu verwenden.
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Beispielsweise kann das in einem
Vektor enthaltene genetische Material direkt in eine Pflanzenzelle, beispielsweise
unter Verwendung von rein physikalischen Verfahren, beispielsweise
durch Mikroinjektion unter Verwendung von fein gezogenen Mikropipetten
(Neuhaus et al. (1987)), oder durch Bombardieren der Zellen mit
Mikroprojektilen, die mit der transformierenden DNA beschichtet
sind („Microprojectile
Bombardment", Wang
Y-C et al. (1988)) insertiert werden.
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Weitere mögliche Verfahren zum direkten
Transfer von genetischem Material in eine Pflanzenzelle umfassen
die Behandlung von Protoplasten unter Verwendung von Verfahren,
die die Plasmamembran modifizieren, beispielsweise die Behandlung
mit Polyethylenglycol. eine Wärmeschockbehandlung
oder eine Elektroporation oder eine Kombination dieser Verfahren
(Shillito et al. (1985)).
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Ein weiteres Verfahren zur direkten
Einführung
von genetischem Material in Pflanzenzellen, das auf rein chemischen
Verfahren basiert und ermöglicht,
dass die Transformation sehr wirksam und rasch durchgeführt wird,
ist bei I. Negrutiu et al. (1987) und bei G. Goodall et al, beschrieben.
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Ferner geeignet für die Transformation von Pflanzenmaterial
ist ein direkter Gentransfer unter Verwendung einer Cotransformation
(R. J. Schocher et al. (1986)).
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Die Liste von möglichen Transformationsverfahren,
die oben als Beispiel angegeben ist, beansprucht nicht, vollständig zu
sein und soll den Gegenstand der vorliegenden Erfindung in keinster
Weise einschränken.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
folglich auch transgenes Pflanzenmaterial, das aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus Protoplasten, Zellen, Calli, Geweben, Organen, Samen, Embryos,
Ovuli, Zygoten usw. und insbesondere ganzen und vorzugsweise männlichen
sterilen Pflanzen, die mit Hilfe der oben beschriebenen Verfahren
transformiert wurden, und die erfindungsgemäße rekombinante DNA in exprimierbarer
Form umfassen, besteht sowie Verfahren zur Herstellung des genannten
transgenen Pflanzenmaterials.
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Das Verfahren zur Herstellung von
transformiertem Pflanzenmaterial einschließlich ganzer Pflanzen, die
ein Expressionsprodukt umfassen, das in einer Anthere-spezifischen
Weise exprimiert wird, umfasst im Wesentli chen die folgenden Stufen:
- (a) Anfängliches
Isolieren aus einer geeigneten Quelle oder Synthetisieren mit Hilfe
bekannter Verfahren einer DNA-Sequenz, die für die Anthere-spezifische Expression
einer assoziierten exprimierbaren DNA-Sequenz verantwortlich ist;
- (b) operatives Verknüpfen
der Anthere-spezifischen DNA-Sequenz in einer 5'- zu 3'-Richtung mit einer exprimierbaren DNA-Sequenz;
- (c) Klonieren des Endkonstrukts in einen Pflanzenexpressionsvektor
unter der Steuerung von in Pflanzen aktiven Expressionssignalen;
- (d) Transformieren des Expressionsvektors in Pflanzenmaterial
mit Hilfe bekannter Verfahren und Exprimieren desselben darin und
optional
- (e) Regenerieren des gemäß Stufe
(d) transformierten Pflanzenmaterials zu einer ganzen und vorzugsweise
phänotypisch
normalen Pflanze.
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Die vorliegende Erfindung umfasst
somit auch transgene Pflanzen und die sexuellen und/oder asexuellen
Nachkommen hiervon, die mit einer erfindungsgemäßen rekombinanten DNA-Sequenz,
die den Promotorbereich von einer Anthere-spezifischen genomischen
DNA-Sequenz umfasst, transformiert wurden.
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Der Ausdruck „asexuelle oder sexuelle Nachkommen
von transgenen Pflanzen" umfasst
gemäß erfindungsgemäßer Definition
alle Mutanten und Varianten, die mit Hilfe bekannter Verfahren erhältlich sind,
beispielsweise durch Zellfusion oder Mutantenselektion und die noch
die charakterisischen Eigenschaften der anfänglich transformierten Pflanze
zeigen, zusammen mit allen Kreuzungs- und Fusionsprodukten des transformierten
Pflanzenmaterials.
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Eine weitere Aufgabe der vorliegenden
Erfindung betrifft die Proliferation von Material von transgenen Pflanzen
gemäß der vorliegenden
Erfindung. Das Proliferationsmaterial von transgenen Pflanzen wird
erfindungsgemäß als beliebiges
Pflanzenmaterial definiert, das sexuell oder asexuell in vivo oder
in vitro vermehrt werden kann. Speziell bevorzugt im Rahmen der
vorliegenden Erfindung sind Protoplasten, Zellen, Calli, Gewebe,
Organe, Samen, Embryos, Eizellen, Zygoten zusammen mit einem beliebigen
von transgenen Pflanzen erhaltenen anderen Vermehrungsmaterial.
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Beschreibung
der Sequenzen
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Die Sequenz 1 ist eine Nucleotidsequenz
eines Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant32.
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Die Sequenz 2 ist die Aminosäuresequenz
des durch die Ant32-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 1 codierten
Polypeptids.
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Die Sequenz 3 ist die Nucleotidsequenz
des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant43D.
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Die Sequenz 4 ist die Aminosäuresequenz
des durch die Ant43D-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 3 codierten
Polypeptids.
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Die Sequenz 5 ist die Nucleotidsequenz
des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant9.
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Die Sequenz 6 ist die Aminosequenz
des durch die Ant9-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 5 codierten
Polypeptids.
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Die Sequenz 7 ist die die Nucleotidsequenz
des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant52.
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Die Sequenz 8 ist die Aminosäuresequenz
des durch die Ant52-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 7 codierten
Polypeptids.
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Die Sequenz 9 ist die Nucleotidsequenz
des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant59.
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Die Sequenz 10 ist die Aminosäuresequenz
des durch die Ant59-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 9 codierten
Polypeptids.
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Die Sequenz 11 ist die Nucleotidsequenz
des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant66.
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Die Sequenz 12 ist die Aminosäuresequenz
des durch die Ant66-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 11 codierten
Polypeptids.
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Die Sequenz 13 ist die Nucleotidsequenz
des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant67.
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Die Sequenz 14 ist die Nucleotidsequenz
des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant68.
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Die Sequenz 15 ist die Aminosäuresequenz
des durch die Ant68-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 14 codierten
Polypeptids.
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Die Sequenz 16 ist die Nucleotidsequenz
des Ant32-Genomklons. Diese Sequenz zeigt die Nucleotidsequenz des
Ant32-Gens einschließlich
2,0 kb der 5'-flankierenden
Sequenz. Die TATA-Box findet sich bei den Basen 1971 bis 1975. Die
vermutliche Transkriptionsstartstelle findet sich an der Base 2009.
Die Basen 2009 bis 2075 umfassen die nicht translatierte Leader-Sequenz.
Das ATG-Translationsstartcodon findet sich an den Basen 2076 bis
2078. Keine Introns sind vorhanden. Das TGA-Stopp-Codon findet sich
an den Basen 3420 bis 3422.
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Die Sequenz 17 ist die Aminosäuresequenz
des durch die Ant32-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 16 codierten
Polypeptids.
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Die Sequenz 18 ist die Nucleotidsequenz
des Ant43D-Genomklons. Diese Sequenz zeigt die Nucleotidsequenz
des Ant43D-Gens einschließlich
etwa 1,2 kb der 5'-flankierenden
Sequenz. Die vermutliche Transkriptionsstartstelle findet sich an
der Base 1167. Eine ungewöhnlich
lange TATA-Box findet sich an den Basen 1089 bis 1147. Die Sequenz „TA" wird 29mal wiederholt.
Der nicht-trunslatierte Leader findet sich zwischen den Basen 1167
und 1229. Das Translationsstartcodon befindet sich an den Basen
1230 bis 1232. Translatierte Sequenzen sind in Grossbuchstaben gezeigt.
Ein Intron befindet sich an den Basen 1571 bis 1668.
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Die Sequenz 19 ist die Aminosäuresequenz
des durch die Ant43D-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 18 codierten
Polypeptids.
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Die Sequenz 20 ist die Nucleotidsequenz
des Anthere-spezifischen cDNA-Klons Ant43C.
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Die Sequenz 21 ist die Aminosäuresequenz
des durch die Ant43C-Nucleotidsequenz mit der Sequenz 20 codierten
Polypeptids
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Beschreibung der Figuren
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1:
Restriktionskarte des Ant32-Genomklons pCIB950. Der Pfeil zeigt
die Stelle des Ant32-Gens sowie seine 5'- zu 3'-Orientierung im Genomsubklon pCIB950.
Der Promotorbereich erstreckt sich von der stromauf PstI-Stelle zu dem Codierbereich.
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2:
Restriktionskarte des Ant43D-Genomklons pCIB952. Der Pfeil zeigt
die Stelle des Ant43D-Gens sowie seine 5'- zu 3'-Orientierung im Genomsubklon pCIB952.
Die Promotorregion erstreckt sich von der stromauf EcoRI-Stelle
zu dem Codierbereich.
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3:
Stellen-spezifische Mutagenese via PCR führt zur Insertion einer XbaI-Stelle
vor dem Translationsstart von Ant32 (3A)
und Ant43D (3B).
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In 3A zeigt
die Zeichnung am oberen linken Ende das 3'-Ende des den Promotor enthaltenden PstI-SacI-Ant32-Genomsubklons.
Darunter befindet sich die Sequenz an dem ATG, vor dem eine XbaI-Stelle gemäß Beschreibung
in Beispiel 16 insertiert wurde.
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In 3B zeigt
die Zeichnung oben links das 3'-Ende
des den Promotor enthaltenden EcoRI-Ant43D-Genomsubklons. Darunter befindet sich
die Sequenz am ATG, vor dein eine XbaI-Stelle gemäß Beschreibung
in Beispiel 18 insertiert wurde.
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4:
Plasmidkarten der Ant32-GUS-Fusionen pCIB3132 (2,0 kb Promotor – 4A) and pCIB3132B (600 bp
Promotor – 4B), pCIB3132 wurde bei
der USDA Agricultural Research Service Culture Collection, Northern
Regional Research Center (NRRL), 1815 North University Street, Peoria,
III. 61604, am 16. Juni 1992 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer.
NRRL B-18977.
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5:
Plasmidkarte der Ant32-DTA-Fusion pLC251
-
6:
Plasmidkarte der Ant43D-GUS-Fusion pCIB3178. pCIB3178 wurde bei
der USDA NRRL am 16. Juni 1992 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer.
NRRL B-18978.
-
7:
Plasmidkarte der Ant43D-DTA-Fusion pCIB3179.
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Die folgenden Beispiele beschreiben
weiter die Materialien und Methoden, die bei der Durchführung der
vorliegenden Erfindung verwendet wurden. Sie dienen der Veranschaulichung
und ihre Nennung soll die beanspruchte Erfindung in keinster Weise
einschränken.
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NICHT BESCHRÄNKENDE BEISPIELE
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Allgemeine rekombinante
DNA-Techniken
-
Da viele der erfindungsgemäß verwendeten
rekombinanten DNA-Techniken eine Routinenmaßnahme für einen Fachmann auf dein einschlägigen Fachgebiet
sind, ist es besser eine kurze Beschreibung dieser allgemein verwendeten
Techniken zu geben, als sie jedes Mal, wenn sie verwendet werden,
zu beschreiben. Sofern es keine gegenteilige spezielle Augabe gibt,
sind alle diese Verfahren bei Maniatis et al. (1982) beschrieben.
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A. Spaltung mit Restriktionsendonucleasen
-
Eine Reaktionscharge enthält typischerweise
etwa 50 bis 500 μg/ml
DNA in der durch den Hersteller empfohlenen Pufferlösung (New
England Biolabs, Beverly, MA.). 2 bis 5 Einheiten Restriktionsendonucleasen werden
für jedes μg DNA zugegeben
und die Reaktionscharge wird 1 bis 3 h bei der durch den Hersteller
empfohlenen Temperatur inkubiert. Die Reaktion wird durch Erwärmen während 10
min bei 65° oder
durch Extraktion mit Phenol und anschließende Fällung der DNA mit Ethanol beendet.
Diese Technik ist auch auf den Seiten 104 bis 106 der Literatur
Maniatis et al. (1982) beschrieben.
-
B. Behandlung von DNA
mit Polymerase zur Herstellung von stumpfen Enden
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50 bis 500 μg/ml DNA-Fragmente werden zu
einer Reaktionscharge in den durch den Hersteller empfohlenen Puffer
(New England Biolabs) zugegeben. Die Reaktionscharge enthält alle
vier Desoxynucleotidtriphosphate in Konzentrationen von 0,2 mM.
Die Reaktion erfolgt während
einem Zeitraum von 30 min bei 15°C und
wird anschließend
durch Erwärmen
während
10 min auf 65°C
beendet. Für
durch Spalten mit Restriktionsendonucleasen, die 5'-vorstehende Enden
liefern, wie die EcoRI and BamHI, erhaltene Fragmente wird das große Fragment
oder das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase verwendet. Für mittels
Endonucleasen, die 3'-vorstehende
Enden liefern, wie PstI und SacI, erhaltene Fragmente wird die T4
DNA Polymerase verwendet. Die Verwendung dieser beiden Enzyme ist
auf den Seiten 113 bis 121 der Literatur von Maniatis et al (1982) beschrieben.
-
C. Agarosegelelektrophorese
und Reinigung von DNA-Fragments aus Gelen
-
Die Agarosegelelektrophorese wird
in einer horizontalen Vorrichtung gemäß Beschreibung auf den Seiten
150 bis 163 der Literatur Maniatis et al. durchgeführt. Der
verwendete Puffer ist der dort beschriebene tris-Boratpuffer. Die DNA-Fragmente werden
unter Verwendung von 0,5 μg/ml
Ethidiumbromid. das entweder in dem Gel oder Behälterpuffer während der
Electrophorese vorhanden ist oder nach Electrophorese zugegeben
wird, angefärbt.
Die DNA wird durch Bestrahlung mit langwelligem UV-Licht sichtbar
gemacht. Wenn die Fragmente aus dem Gel herausgetrennt werden sollen,
wird eine Agarose verwendet, die bei niedriger Temperatur geliert
und von Sigma Chemical, St Louis, Missouri, erhältlich ist. Nach der Elektrophorese
wird das gewünschte
Fragment herausgeschnitten, in ein Kunststofftestrohr gegeben, etwa
15 min auf 65°C
erwärmt, dreimal
mit Phenol extrahiert und zweimal mit Ethanol gefällt. Dieses
Vorgehen unterscheidet sich leicht von dein bei Maniatis et al (1982),
auf Seite 170 beschriebenen.
-
Als Alternative kann die DNA aus
der Agarose mit Hilfe des Genecleankits (Bio 101 Inc., La Jolla,
CA, USA) isoliert werden.
-
D. Zugabe von synthetischen
Linkerfragmenten zu DNA-Enden.
-
Wenn es gewünscht ist, eine neue Endonucleasespaltungsstelle
zu dein Ende eines DNA-Moleküls
zu addieren, wird das Molekül
optional zuerst mit einer DNA-Polymerase behandelt, um stumpfendige
Enden herzustellen, wie in dem obigen Abschnitt beschrieben ist.
Etwa 0,1 bis 1,0 μg
dieses Fragments werden zu etwa 10 ng phosphorilierter Linker-DNA
(erhalten von New England Biolabs) in einem Volumen von 20 bis 30 μl mit 2 μl T4 DNA-Ligase
(von New England Biolabs) und 1 mM ATP in dem durch den Hersteller
empfohlenen Puffer zugegeben. Nach einer Inkubation über Nascht
bei 15°C
wird die Reaktion durch 10minütiges
Erwärmen auf
65°C beendet.
-
Die Reaktionscharge wird in einem
für die
Restriktionsendonuclease, die die synthetische Linkersequenz spaltet,
geeigneten Puffer auf etwa 100 μl
verdünnt.
Etwa 50 bis 200 Einheiten dieser Endonuclease werden zugegeben.
Das Gemisch wird 2 bis 6 h bei der geeigneten Temperatur inkubiert,
anschließend
wird das Fragment einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und
wie oben beschrieben gereinigt. Das erhaltene Fragment besitzt anschließend Enden
mit Abschlüssen,
die durch Spalten mit der Restriktionsendonuclease produziert wurden.
Diese Enden sind üblicherweise
cohäsiv,
sodass das erhaltene Fragment anschließend ohne Schwierigkeiten mit
anderen Fragmenten mit denselben cohäsiven Enden verknüpft werden
kann.
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E. Entfernung der 5'-terminalen Phosphate
von DNA-Fragmenten
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Während
den Plasmidklonierungstufen verringert die Behandlung des Vektorplasmids
mit Phosphatase die Rezirkularisierung des Vektors (diskutiert auf
Seite 13 der Literatur Maniatis et al.). Nach Spaltung der DNA mit
der richtigen Restriktionsendonuclease wird eine Einheit von alkalischer
Phosphatase von Kalbsdarm, die von Boehringer-Mannheim, Mannheim,
erhalten wurde, zugeben. Die DNA wird 1 h bei 37°C inkubiert und anschließend zweimal
mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt.
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F. Verknüpfung der
DNA-Fragmente
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Wenn Fragmente mit komplementären cohäsiven Enden
miteinander verknüpft
werden sollen, werden etwa 100 ng eines jeden Fragments in einem
Reaktionsgemisch aus 20 bis 40 μl,
das etwa 0,2 Einheiten T4 DNA Ligase (von New England Biolabs) in
dein durch den Hersteller empfohlenen Puffer enthält, inkubiert.
Die Inkubation wird 1 bis 20 h 15°C
durchgeführt.
Wenn DNA-Fragmente mit stumpfendigen Enden verknüpft werden sollen, werden sie
wie oben inkubiert, mit der Ausnahme, dass die Menge der T4 DNA-Ligase
auf 2 bis 4 Einheiten erhöht
wird.
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G. Transformation von
DNA in E. coli
-
Der E. coli-Stamm HB101 wird für die meisten
der Experimente verwendet. DNA wird unter Verwendung der Calciumchloridmethode
(gemäß Beschreibung
durch Maniatis et al. (1982), Seiten 250 und 251) in E. coli eingeführt.
-
H. Screenen von E. coli
bezüglich
Plasmiden
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Nach der Transformation werden die
erhaltenen Kolonien von E. coli bezüglich der Anwesenheit des gewünschten
Plasmids mit Hilfe eines raschen Plasmidisolierungsverfahrens getestet.
Zwei herkömmliche Prozesse
sind auf den Seiten 366 bis 369 der Literatur Maniatis et al. (1982)
beschrieben.
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I. Isolierung von Plasmid-DNA
in großem
Maßstab
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Verfahren zur Isolierung von Plasmiden
aus E. coli in großem
Maßstab
sind auf den Seiten 88 bis 94 der Literatur Maniatis et al. (1982)
beschrieben.
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J. Klonierung in M13-Phagenvektoren
-
In der nachfolgenden Beschreibung
gilt, dass die doppelsträngige
Replikationsform der Phagen M13 Derivate für Routineprozesse, beispielsweise
die Spaltung mit Restriktionendonucleasen, eine Verknüpfung usw.,
verwendet wird.
-
Sofern es keine spezielle gegenteilige
Angabe gibt, können
Enzyme von Boehringer, Biolabs (BRL) erhalten werden. Sie werden,
sofern nicht anders angegeben, gemäß den Instruktionen der Hersteller
verwendet.
-
K. Southern-Blot-Analyse
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Die extrahierte DNA wird zuerst mit
Restriktionsenzymen behandelt, anschließend einer Elektrophorese in
einem 0,8% bis 1% Agarosegel unterzogen, auf eine Nitrocellulosemembran
(Southern EM (1975)) überführt und
mit der nachzuweisenden DNA, die zuvor einer Nick-Translation (DNA-spezifische
Aktivitäten von
5 × 108 bis 10 × 108 cpm/μg) unterzogen
wurde, hybridisiert. Die Filter werden dreimal 1 h jeweils mit einer wässrigen
Lösung
von 0,03 M Natriumcitrat und 0,3 M Natriumchlorid bei 65°C gewaschen.
Die hybridisierte DNA wird durch Schwärzen eines Röntgenfilms über einen
Zeitraum von 24 bis 48 h sichtbar gemacht.
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Die nachfolgenden Beispiele, die
nicht den cDNA-Klon Ant43D entsprechend SEQ. ID Nr. 3 betreffen, sind
lediglich zu Beschreibungszwecken angegeben und bilden keinen Teil
der vorliegenden Erfindung.
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Beispiele
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Beispiel 1: Pflanzenmaterial
und Wachstumshedingungen
-
Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum
cv Xanthi) werden aus Samen in einem Gewächshaus unter einer Lichtregelung
aus 16 h Licht und 8 h Dunkelheit gezüchtet.
-
Beispiel 2: Anthere- und
Blätter-RNA-Isolation
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Gesamt-RNA wird aus Antheren von
Pflanzenknospen mit einer Stempellänge von 0 bis 10 mm und aus
5 Wochen alten Keimlingen nach dein Phenol/SDS-Verfahren, das von
Ausubel et al. (1987) beschrieben wurde, isoliert. PolyA + RNA wird
aus Gesamt-RNA gemäß Beschreibung
bei Maniatis et al. (1982) gereinigt.
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Beispiel 3: Konstruktion
von subtrahierten cDNA-Bibliotheken
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Anthere- und Keimling-cDNA-Bibiliotheken
werden unter Verwendung des Libraviam II Kits von Invitrogen (INVITROGEN
CORP., 3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA; Katalog Nr. L1958-15)
hergestellt. Doppelsträngige
cDNA wird aus Anthere- und Blatt- polyA + RNA synthetisiert, BstXI
Nichtpalindromlinker werden daran legiert und die cDNA wird in einen
mit BstXI geschnittenen pTZ18R-B-Vektor (verfügbar von INVITROGENE CORP.
(3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA) erhältlich ist) kloniert. Die Transformation
erfolgt in E. coli DHIaF'-Zellen,
die auch von INVTTROGENE CORP. bezogen werden können. Eine Subtraktions-cDNA-Bibliothek wird
unter Verwendung des Substraktorkits von INVTTROGEN (INVITROGEN
CORP., 3985B Sorrento Valley Blvd., San Diego, CA; Katalog Nr. K4320-01)
hergestellt. Einzelsträngige
DNA wird aus den Anthere- und Blatt-cDNA-Bibliotheken isoliert.
Die einzelsträngige
Blatt-DNA wird photobiotinyliert und an die einzelsträngige Anthere-DNA
hybridisiert. Sowohl hybridisierte als auch nicht hybridisierte
photobiotinylierte Sequen zen werden mit Streptavidin- und Phenolextraktion
entfernt. Die verbleibende DNA wird mit Klenow in die doppelsträngige Form
umgewandelt und in E. coli DH1aF'-Zellen
transformiert.
-
Beispiel 4: Isolierung
von Anthere-spezifischen cDNA-Klonen
-
Anthere-spezifische Klone werden
durch differentielles Screenen der Antheresubstraktions-cDNA-Bibliothek identifiziert.
20.000 Klone werden auf Nitrocellulosefiltern replikaplattiert und
differentiell gescreent, um Kolonien zu identifizieren, die an radioakiv
markierte Erststrang-cDNA aus Anthere-polyA+ RNA, jedoch nicht an
Erststrang-cDNA aus Keimling-polyA+ hybridisieren. Die in den Klonierungsvektor
insertierten cDNAs werden mit einem Restriktionsenzym herausgeschnitten
und die Inserte von insgesamt 70 cDNAs werden differentiell abermals
durch Southern-Blot gescreent. Northern-Blots von Anthere-, Stempel-
und Blatt-Gesamt-RNA werden mit den cDNAs sondiert, um die Gewebespezifität zu bestätigen. Alle
Anthere-spezifischen cDNAs werden kreuzhybridisiert, um einmalige
cDNAs zu identifizieren. Einmalige cDNA-Klone werden gereinigt und
in einen Bluescript-Vektor
subkloniert. Ein cDNA-Klon vollständiger Länge von Ant32 wird durch Screenen
der Anthere-cDNA-Bibliothek
mit einer 0,9 kb Teil-cDNA isoliert. Die beiden cDNAs sind auf Sequenzniveau
95% homolog und folglich eng verwandte Mitglieder dergleichen Genfamilie.
-
Beispiel 5: Verifizierung
des Expressionsmusters durch RNA-Blot-Hybridisierung
-
Northern-Blots werden unter Verwendung
von Nitrocellulosefiltern gemäß Beschreibung
bei Maniatis (1982) durchgeführt.
20 μg von
Anthere-, Stempel- und Blatt-Gesamt-RNA werden pro Spur aufgetragen.
Vorhybridisierungen werden 4 h bei 68°C in 3X SSC, 5X Denhardt's, 20 mM Tris pH
7, 0,1% SDS, 2 mM EDTA und 1005 g/ml gescherter denaturierter Lachssperma-DNA
durchgeführt.
Hybridisierungen werden über
Nach in 6X SSC, 5X Denhardt's,
0,1% SDS, 500 μg/ml
Lachssperma-DNA, 8% Dextronsulfat and 50% Formamid, dem 5,5 × 106 cpm/ml Sonde zugesetzt wird, bei 42°C durchgeführt. Sonden
werden unter Verwendung des Oligolabellingkits von PHARMACIA (PHARMACIA
LKB BIOTECHNOLOGY, 800 Centennial Avenue, Piscataway, NJ, Katalog
Nr. 27-9250-01) gemäß den Instruktionen
der Hersteller synthetisiert. Die Expression der cDNAs wird lediglich
in Anthere-RNA beobachtet. Eine Expression in Pollen wird ebenfalls
mit der Ant66-cDNA beobachtet.
-
PolyA + RNA wird aus Anthere-, Stempel-,
Blatt-, Blumenblatt-, Stamm- und Wurzelgewebe isoliert. 15 g einer
jeden zusammen mit 205 g Samen und Kelchblatt-Gesamt-DNA werden
auf einem Northern-Blot laufen gelassen und mit den Ant32- und Ant43D-cDNAs
sondiert. Eine Expression beider cDNAs wird lediglich in der Anthere-RNA
beobachtet, was zeigt, dass die Ant32- und Ant43D-cDNAs straff reguliert
und lediglich in Antheregewebe exprimiert werden.
-
Beispiel 6: Entwicklungsexpression
von Anthere-spezifischen cDNA-Klonen
-
Gesamt-RNA wird aus Antheren aus
6 Stufen von Blumenknospenlängen
isoliert. Slot-Blots werden mit den Anthere-spezifischen cDNAs sondiert,
um eine Entwicklungsexpression zu bestimmen. Eine Slot-Hybridisierung erfolgt
wie bei Maniatis (1982) unter Verwendung von 105 g RNA. Tabelle
1 enthält
das Entwicklungsexpressionsprofil der cDNAs. Ant9, 32, 43C, 59 und
68 werden lediglich früh
in der Anthereentwicklung exprimiert, während Ant43D, 52 und 67 während der
gesamten Entwicklung exprimiert werden. Ant66 wird lediglich spät in der
Entwicklung exprimiert.
-
Beispiel 7: Sequenzieren
von Anthere-spezifischen cDNA-Klonen
-
DNA wird unter Verwendung der Didesoxykettenterminationsmethode
von Sanger et al., 1977, unter Verwendung doppelsträngiger Plasmid-DNA
als Matritze sequenziert. Die gesamte DNA-Sequenzanalyse wird auf
einem Digital Vax 8530 Computer unter Verwendung der Software von
der University of Wisconsin Computer Genetics Group, die im Handel
von GENETICS COMPUTER GROUP, INC. (University Research Park 575 Schience
Drive, Madison, WI) erhältlich
ist, durchgeführt.
Die Oligonucleotidprimer werden auf ein Synthesegerät von Applied
Biosystems, Modell 380A, synthetisiert.
-
Tabelle 1 enthält einen Vergleich der Messagegröße zur Insertgröße der Anthere-spezifischen
cDNAs. Die Ant32- und Ant43D-cDNAs besitzen nahezu die Größe, die
für Kopien
vollständiger
Länge der
mRNAs erwartet wird. Der Rest der cDNAs sind unvollständige Klone.
Ant32, 43C, 43D, 52, 59, 66 und 68 codieren für einen einzelnen offenen Leserahmen.
Die Ant32-cDNA ist ein Klon nahezu vollständiger Länge aus 1.542 Basen (SEQ. ID
Nr. 1). Die Sequenz enthält
einen großen
offenen Leserahmen, der sich vom Nucleotid 66 bis 1.412 erstreckt
und für
ein komplettes Polypeptid aus 448 Aminosäuren codiert. Der offene Leserahmen
wird durch 5'- and
3'-Nichtcodierbereiche
aus 65 bzw. 130 Basen flankiert. Ein Polyadenylierungssignal AATAAA befindet
sich an der Position 1.502.
-
Die Ant43D-cDNA ist ein Klon nahezu
vollständiger
Länge aus
552 Basen (SEQ. ID Nr. 3). Die Sequenz enthält einen vollständigen offenen
Leserahmen aus 118 Aminosäuren,
der sich von den Basen 41 bis 397 erstreckt. Der offene Leserahmen
wird durch 40 Basen am 5'-Ende
und 155 Basen am 3'-Ende
flankiert. Ein Polyadenylierungssignal findet sich beginnend an
der Position 437.
-
Ant43C ist eine unvollständige cDNA
aus 437 Basen (SEQ. ID Nr. 20). Ein Teilpolypeptid aus 90 Aminosäuren wird
durch die Nucleotide 167 to 436 codiert. Die Ant43C-cDNA und die
Ant43D-cDNA sind auf Sequenzniveau zu 90% homolog.
-
Ant52, ein unvollständiges cDNA-Klon
aus 96 Basen (SEQ. ID Nr. 7) enthält einen offenen Leserahmen
aus 31 Aminosäuren.
-
Ant59 ist ein unvollständiges cDNA-Klon
aus 1.201 Basen (SEQ. ID N5. 9). Ein offener Leserahmen, der sich
von dem Nucleotid 1 bis 1.119 erstreckt, codiert für ein Teilpolypeptid
aus 372 Aminosäuren.
Der offene Leserahmen wird durch einen 3'-Nichtcodierbereich aus 82 Basen flankiert.
-
Ant66 ist ein unvollständiges cDNA-Klon
aus 952 Basen (SEQ. ID Nr. 11). Ein Teilpolypeptid aus 236 Aminosäuren wird
durch die Nucleotide 1 bis 711 codiert. Der offene Leserahmen wird
durch einen 3'-Bereich aus
241 Basen flankiert. Die Sequenz enthält einen polyA-Schwanz aus
15 Basen.
-
Ant68 ist ein unvollständiges cDNA-Klon
aus 445 Basen (SEQ. ID Nr. 20). Ein offener Leserahmen aus 148 Aminosäuren wird
durch die Sequenz codiert.
-
Ant67 ist ein unvollständiges cDNA-Klon
aus 305 Basen (SEQ. ID Nr. 13). Es ist unbekannt, welcher Strang
der Sinnstrang ist, da ein einzelner großer offener Leserahmen nicht
gefunden wurde. Dieses Klon enthält
das 3'-Ende eines
offenen Leserahmens und einen 3'-Flankierbereich
in Translationen beider Stränge.
-
Ant9 ist eine unvollständige chimäre cDNA
aus 612 Basen (SEQ. ID Nr. 5). Northern-Blots aus Anthere-, Stempel-
und Blattgewebe werden mit 5'-
und 3-Regionen der chimären
cDNA sondiert, um die Anthere-spezifische Region des cDNA-Klons
zu bestimmen. Mit den Basen 1 bis 325 sondierte Northerns hybridisieren
an Anthere-, Stempel- und Blattgewebe. Diese Region der cDNA codiert
für einen
offenen Leserahmen. Mit den Basen 326 bis 612 sondierte Northerns
hybridisieren ausschließlich
an Antheregewebe. Diese Region wird als die Anthere-spezifische Region
der chimären
cDNA identifiziert. Ein Teilpolypeptid aus 32 Aminosäuren wird
durch die Nucleotide 344 bis 442 codiert. Ein Polyadenylierungssignal
startet an der Position 461.
-
Jede abgeleitete Aminosäuresequenz
wird mit Sequenzen in einer GenBank Gensequenzdatenbank, einer Computerdatenbasis
von DNA-Sequenzen, verglichen. Die Ant66-cDNA besaß eine 74%ige
Gesamtaminosäureidentität mit einer
Plasmamembranproton ATPase (H+-ATPase) von Arabadopsis thaliana
(Harper et al., 1989). Die Ant68-cDNA codiert für ein glycinreiches Protein.
-
Beispiel 8: Verifizierung
des Ant32-Expressionsmusters durch In-Situ-Hybridisierung
-
In situ Hybridisierungsstudien mit
in Paraffin eingebetteten Anthereabschnitten aus 12 mm langen Blumenknospen
werden gemäß Beschreibung
bei Perez-Grau et al., 1989, durchgeführt. 35S-RNA-Sonden,
die für
in situ Hybridisierungen verwendet werden, werden unter Verwendung
eines RNA-Transkriptionskits von STRATAGENE (STRATAGENE CLONING
SYSTEMS, 11099 North Torrey Pines Rd., La Jolla, CA; Katalog Nr. 200340)
synthetisiert. Querschnitte und Längsschnitte werden mit Ant32-Antisense-
und Sinn-RNA-Sonden sondiert. Die Expression wird in der Tapetumzellschicht
der Anthere mit der Antisense-Sonde lokalisiert.
-
Beispiel 9: Genkopiezahl
-
Zur Bestimmung, wie viele Gene in
dem Tabakgenom mit den Anthere-spezifischen Genen hybridisieren,
wurde Xanthi Genom DNA mit XbaI, HindIII, EcoRI und BamHI verdaut.
Southern-Blots werden mit den cDNA-Klonen sondiert. Die mit Ant32, 43,
52, 59 und 67 sondierten Blots wiesen 2 Banden auf, die in jedem Verdau
hzbridisieren, was anzeigt, dass diese cDNAs Einzelkopiegene oder
Mitglieder kleiner Genfamilien sind. Mehr Banden pro Verdau, die
in den Blots hybridiserten, wurden mit Ant9, 66 and 68 sondiert,
was darauf hindeutet, dass diese cDNAs Mitglieder größerer Genfamilien
sind.
-
Beispiel 10: Southern-Blots
-
Southern-Blots werden mit Nitrocellulose
gemäß Beschreibung
bei Maniatis (1982) durchgeführt.
Vorhybridisierungen finden in 6X SSC, 10X Denhardt's. 0,2% SDS und 75 μg/ml Lachssperma-DNA
4 bis 6 h bei 68°C
statt. Hybridisierungen erfolgen bei 68°C in 6X SSC, 5X Denhardt's, 0,5% SDS und 125 μg/ml Lachssperma-DNA, der 1 × 106 cpm/ml DNA-Sonde zugegeben wird. Waschungen
finden gemäß Beschreibung
bei Maniatis (1982) statt. Genom Southern-Blots werden mit Duralon-UV-Membranen
(Stratagene) durchgeführt und
die Hybridisierungsbedingungen sind die gemäß Weisungen der Hersteller.
-
Beispiel 11: Konstruktion
von Tabakgenom DNA Bibliotheken
-
Tabak-DNA wird aus Blättern unter
Verwendung des Verfahrens von Shure et al. (1983) isoliert. Sau3AI-Teilverdaus von Xanthigenom-DNA
werden in die BamHI-Stelle von Lamda DashII-Vektor von Stratagene
kloniert und die Bibliothek amplifiziert. Weitere Genombibliothek
wird unter Verwendung des LambdaGEM-11 XhoI Halbstellenarmeklonierungssystems
von PROMEGA (PROMEGA, 2800 Woods Hollow Road, Madison, WI; Katalog
Nr. B1960) hergestellt. Teilweise filled-in, mit Sau3AI verdaute
Genom-DNA wird in teilweise filled-in XhoI LambdaGEM-11-Arme kloniert.
-
Beispiel 12: Isolierung
und Sequenzierung des Ant32-Genomklons
-
Die amplifizierte Stratagene-Genombibliothek
wird mit ant32 als Sonde gescreent, wobei 4 hybridisierte Plaques
erhalten werden. Alle 4 Klone werden gereinigt und Restriktionskartiert.
Bei Sondieren mit ant32 wird ein EcoRI-Fragment aus jedem Klon hybridisiert.
Die EcoRI-Fragmente werden in Plasmid-pBS SK+,
das von STRATAGENE CLONING SYSTEMS (11099 North Torrey Pines Road,
La Jolla, CA) erhältlich
ist, subkloniert. Ein Subklonieren und Kartieren der EcoRI-Fragmente
aus den 4 Klonen zeigte, dass 2 identisch sind. 1 enthält die Karte des EcoRI-Subklons
pCIB950. Fragmente von pCIB950 werden anschließend zum Sequenzieren subkloniert.
2,0 kb des Promotors, der gesamte Codierbereich und 0,28 kb des
3' nicht translatierten
Bereichs werden sequenziert. Das 2,0 kb Promotorfragment von ant32
ist funktional. Gemäß Darstellung in
Beispiel 16 reicht ein 0,6 kb Fragment von ant 32 aus, um eine Anthere-spezifische
Aktivität
zu verleihen.
-
Beispiel 13: Isolierung
und Sequenzierung des Ant43D-Genomklons
-
Die LambdaGEM-11-Primärbibliothek
wird mit Ant43D als Sonde gescreent. Hybridisierende Plaques werden
mittels PCR abermals gescreent, um zwischen Ant43D and Ant43C, einer
eng verwandten cDNA, zu unterscheiden. PCR-Fragmente, die aus den
Plaques erzeugt wurden, werden verdaut, um zwischen den beiden cDNAs
entsprechenden Genomen zu unterscheiden. Die beiden Genomklone entsprechen
Ant43D und sie werden gereinigt und kartiert. Eine 6,6 kb SacI-Bande
von beiden hybridisiert an eine Ant43D-Sonde. Ein Subklonieren und
Kartieren beider SacI-Banden zeigt, dass sie identisch sind. 2 enthält die Karte des SacI-Subklons
pCIB952. Fragmente von pCIB952 werden subkloniert und sequenziert.
1,2 kb des Promotors, der gesamte Codierbereich einschließlich einem
Intron und 0,22 kb des 3' nicht
translatierten Bereichs werden sequenziert. Das 1,2 kb Promotorfragment
enthält
den gesamten Ant43D-Promotor.
-
Beispiel 14: Primer-Extension
-
Der Primer wird unter Verwendung
von [λ-32P]-ATP (6000 Ci/mmol, Amersham) und T4
Polynucleotidkinase endmarkiert. 20 μg Anthere-Gesamt-RNA werden
mit 0.01 pmol Primer in 20 μl
reversen Transkriptasepuffer (50 mM Tris pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM
MgCl2) gemischt. Das Gemisch wird 10 min
auf 80°C
erwärmt, durch
langsames Abkühlen
auf 40°C
annealed und über
Nacht bei 40°C
hybridisiert. Jede 20 μl
Reaktionsmischung wird mit 30 μl
5 mM DTT, 0,1 mg/ml BSA, 1 mM von jedem aus dATP, dCTP, dGTP und
dTTP in reversem Transkriptasepuffer, der 200 Einheiten RNAsin (Promega)
und 400 Einheiten MMLV reverse Transkriptase (BRL) enthält, versetzt.
Die Primer-Extension erfolgt 60 min bei 40°C. Das DNA/RNA-Hybrid wird einmal mit
Phenol : Chloroform extrahiert und in Gegenwart von Träger-DNA
mittels Ethanol gefällt.
Das Pellet wird in sequenzierendem Ladefarbstoff gelöst und auf
einem 6% Acrylamidharnstoffsequenziergel analysiert.
-
Die für die Primer-Extensionsexperimente
verwendeten Primer sind die folgenden:
für Ant32 → – AT 101MO3 – 5'-GGC TTC ACT ACC
CAG TGG TG-3'
für Ant43D → – AT 125MO3 – 5'-CAA CGC GCC CTT
CTT TGA AA-3'
-
Beispiel 15: Kartieren
der Transkript-Startstelle durch Primer-Extension
-
Der Start der Transkription der Ant32-cDNA
und der Ant43D-cDNA werden unter Verwendung von Primer-Extension
kartiert. Das größte Primer-Extensionsprodukt
fällt innerhalb
einiger Basenpaare des Endes der Ant32-cDNA. Das größte Primer-Extensionsprodukt
fällt 23
Basenpaare stromauf des Endes der Ant43D-cDNA.
-
Beispiel 16: Fusionen
der Ant32-Promotorsequenz an das GUS-Gen
-
Der 2,0 kb 5'-Flankierungsbereich von pCIB950, das
den Ant32-Promotor enthält,
wird an das Bakterienreportergen für Glucuronidase (GUS) fusioniert,
um den Promotor des Anthere-spezifischen Gens in transgenen Pflanzen
zu charakterisieren. Eine XbaI-Stelle wird vor das ATG mittels PCR
wie folgt insertiert:
-
Ein 350 Basenpaare XhoI-XbaI-Fragment
(oben rechts in der 3A)
wird unter Verwendung einer Polymerasekettenreaktion- (PCR) Technologie
(vgl. Mullis et al., 1987; Erlich 1989) synthetisiert, um die Ant32-Promotorsequenz von
55 by vor der einmaligen XhoI-Stelle zu zwei Basenpaaren vor dein
ATG zu kopieren. Einer der PCR-Primer insertiert eine XbaI-Stelle
zwei Basenpaare vor dein ATG. Ein die vollständige Länge aufweisender Ant32-Promotor
aus dem PstI-XhoI-Fragment aus dein ursprünglichen Klon und der XhoI-XbaI-PCR-Kassette
wird in einer Dreiwegligation in die PstI-XbaI-Stelle des Bluescript-Vektors
pBluescript SK (Stratagene) wieder vereinigt. Dieser Promotorklon
kann für
Transkriptionsfusionen an Codiersequenzen verwendet werden.
-
Der erhaltene Promotor wird als SalI – XbaI-Fragment
ausgeschnitten und an das GUS-Gen in pBI101 (Clontech) fusioniert.
Eine 600 Basenpaare Ant32-Promotor – GUS-Fusion wird durch Deletieren
eines 1,4 kb Hind-III-Fragments
aus dein Bluescript-Promotorklon konstruiert. Der deletierte Promotor
wird als SalI – XbaI-Fragment
ausgeschnitten und an das GUS-Gen in pBI101 fusioniert. Die 2,0
kb Promotor-GUS-Fusion wird als pCIB3132 bezeichnet und die 0,6
kb Promotor-GUS-Fusion wird als pCIB3132B bezeichnet. Das 0,6 kb
Promotorfragment von Ant32 reicht aus, um eine Anthere-spezifische
Aktivität
zu verleihen.
-
Beispiel 17: Fusion der
Ant32-Promotorsequenz an das DTA-Gen
-
Ein chimäres Gen wird unter Verwendung
einer 5' Ant32-Promotorsequenz
und der Diphtherietoxin-A-Kette (DTA)-Codiersequenz (Palmiter et
al., 1987) konstruiert. Die GUS-Codiersequenz wird aus pCIB3132B
mit SmaI and SacI ausgeschnitten, die SacI-Stelle gefüllt und
das Plasmid wieder zurück
untereinander legiert (pLC250). Die DTA-Codiersequenz wird als Bg1II-Fragment,
das aus dein Plasmid p72 (Palmiter et al., 1987) ausgeschnitten
wurde, in die BamHI-Stelle von pLC250 unter Erhalt von pLC251 legiert.
Die DTA-Codiersequenz wird in entgegengesetzter Orientierung in
pLC25 fusioniert.
-
Beispiel 18: Fusion der
Ant43D-Promotorsequenz an das GUS-Gen
-
Die 1,2 kb 5'-Flankierregion des Ant43D-Gens wird
an GUS fusioniert. Eine XbaI-Stelle wird vor dem ATG durch PCR wie
folgt insertiert:
-
Ein 210 Basenpaare EarI-XbaI-Fragment
(oben rechts in 3B)
wird mit PCR synthetisiert, um den Ant43D-Promotor aus 39 Basenpaaren
vor der EarI-Stelle an 22 Basenpaare vor dein ATG zu kopieren. Einer der
PCR-Primer insertiert eine XbaI-Stelle 22 Basenpaare vor dein ATG.
Ein eine vollständige
Länge aufweisender
Ant43D-Promotor aus dein EcoRI-EarI-Fragment aus dem ursprünglichen
Klon und der EarI-XbaI-PCR-Kassette wird in einer Dreiwegligation
in die EcoRI-XbaI-Stellen von Bluescript wieder zusammen gefügt. Dieser
Promotorklon kann für
Transkriptionsfusionen an Codiersequenzen verwendet werden.
-
Der erhaltene Promotor wird als HindIII-XbaI-Fragment
ausgeschnitten und an das GUS-Gen in PBI101 (pCIB3178) fusioniert. 3B zeigt wie die 1,2 kb
Flankierregion des Ant43D-Gens erhalten wird. Das 1,2 kb Promotorfragment
reicht aus, um eine Anthere-spezifische Aktivität zu verleihen.
-
Beispiel 19: Fusion der
Ant43D-Promotorsequenz an das DTA-Gen
-
Der 1,2 kb Ant32-Promotor wird aus
pLC251 mit HindIII-XbaI ausgeschnitten und durch ein HindIII-XbaI-Ant43D-Promotorfragment
ersetzt. Das erhaltene Plasmid wird als pCIB3179 bezeichnet.
-
Die DTA-Codiersequenz wird in entgegengesetzter
Orientierung in pCIB3188 fusioniert. Der Ant32-Promotor wird mit HindIII und XbaI aus
pLC252 ausgeschnitten und durch den Ant43D-Promotor ersetzt.
-
Beispiel 20: Produktion
von transgenen Pflanzen
-
Tabakblattscheiben werden mit dein
Ant32-GUS (pCIB3132 (2 kb Promotor) and pCIB3132B (0,6 kb Promotor)),
Ant32-DTA (pLC251 und Antisense-Kontrolle (pLC252)), Ant43D-GUS
(pCIB3178) und Ant43D-DTA
(pCIB3179 und der Antisense-Kontrolle (pCIB3188)) -Konstruktionen
und reifen transformierten Fflanzen, die wie bei Horsch et al. (1985)
ausgewählt
wurden, transformiert. Die Gegenwart von transformierender DNA wird
mittels PCR bestätigt.
-
Beispiel 21: GUS-Analyse
einer Ant32-Transgenexpression
-
Transformanten werden durch den GUS
histochemischen Test gemäß Koltunow
et al. (1990) und fluorimetrisch gemäß Jefferson (1987) getestet.
Bei dein histochemischen Test wird die GUS-Expression in der Tapetumzellschicht
der Antheren von Blumenknospen einer Länge von 10 bis 20 mm beobachtet.
Eine Expression wird ferner in Pollen in einem geringeren Ausmaß beobachtet.
Anthere-, Stempel-, Pollen-, Blatt- und Stammungewebe werden fluorimetrisch
getestet und die GUS-Aktivität
ist auf Anthere- und Pollengewebe begrenzt.
-
Beispiel 22: Analyse von
Ant32-DTA transgenen Pflanzen
-
Die Blumenmorphologie von 13 transgenen
Pflanzen, die pLC251 enthalten, und 15 Pflanzen von pLC252 wird
beobachtet. Die pLC251 enthaltenden Pflanzen wiesen alle braune
welke Anthere und keine herunter gefallenen Pollen aus. Im Gegensatz
dazu besaßen
die transgenen pLC252-Pflanzen normale Anthere und herunter gefallene
Pollen. Selbstbefruchtungen und Rückkreuzungen werden bei allen
Pflanzen durchgeführt.
In den pLC251-Pflanzen
werden keine Selbstbestäubungen
erhalten, jedoch Samen aus Rückkreuzungen.
Die Fertilität
in Selbstbefruchtungen und Rückkreuzbestäubungen
ist für
pLC252-Pflanzen normal.
-
Anthere von 14 bis 16 mm langen und
25 bis 30 mm langen Blumenknospen werden fixiert, in Paraffin eingebettet
und Bereiche werden mit Toluidinblau angefärbt. Das Tapetum und der Pollensack
werden in pLC251-Pflanzen
zerstört,
während
pLC252-Pflanzen eine normale Morphologie aufwiesen.
-
Beispiel 23: GUS-Analyse
von einer Ant43D transgenen Expression
-
Transformanten werden mittels GUS
histochemischen Assays und fluorimetrischen Assays getestet. In
dem histochemischen Assay wird eine GUS-Expression in der Tapetumzellschicht
von Antheren von Knospen einer Länge
von 14 bis 16 mm, in Mikrosporen und erhöht in Bindegewebe und Wandgewebe
der Anthere beobachtet. Anthere-, Pollen-, Stempel-, Blatt-, Kelchblatt-,
Stamm- und Wurzelgewebe werden fluorimetrisch getestet. Die GUS-Aktivität ist auf
Anthere- und Pollengewebe beschränkt.
-
Beispiel 24: Analyse von
Ant43D-DTA transgenen Pflanzen
-
Die Blumenmorphologie von 8 pCIB3179-Pflanzen
und 8 Pflanzen des Kontroll-pCIB3188 (DTA in Antisense-Orientierung)
wird beobachtet. Die pCIB3179 transgenen Pflanzen wiesen alle nicht
funktionelle Anthere auf, da keine Pollen herunter gefallen waren.
Die Anthereregröße unter
unterschiedlichen Pflanzen reichte von normal bis geschrumpft, die
Antherefarbe von grün
bis braun und die Anthere von aufplatzend bis nicht aufplatzend.
Die Kontroll-pCIB3188 transgenen Pflanzen wiesen normale Antheremorphologie
und herunter gefallene Pollen auf. Selbstbefruchtungen und Rückkreuzungen
werden bei den Pflanzen durchgeführt.
In pCIB3179-Pflanzen werden Bestäubungen
aus Rückkreuzungen
erhalten, Selbstbestäubungen
jedoch nicht. Die Fertilisation in pCIB3188-Pflanzen ist normal.
-
Anthere aus 8 bis 10 mm, 10 bis 12
mm, 14 bis 16 mm und 25 bis 30 mm langen Blumenknospen werden fixiert,
in Paraffin eingebettet und Bereiche mit Toluidinblau angefärbt. Mikrosporen
fehlen von pCIB3179-Pflanzen
früh bei
8 bis 10 mm langen Knospen.
-
Hinterlegung
-
Die folgenden Hinterlegungen wurden
bei der USDA Agricultural Research Service Culture Collection, Northern
Regional Research Center (NRRL), 1815 North University Street, Peoria,
I11. 61604, gemäß den Erfordernissen
des Budapester Vertrags durchgeführt:
-
-
-
Literaturliste
-
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Cornellisen et al., EMBO 5: 37–40, 1986
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Della-Cioppa et al., Plant Physiology
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