DE69333880T2 - Erhaltung von männlichen sterilen pflanzen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten männlich-steriler Pflanzenlinien, die für die Produktion von Hybridsaatgut einer Nutzpflanze verwendet werden können, Maintainerpflanzen, die in einem solchen Verfahren verwendet werden können, sowie Maintainergene, die zur Herstellung solcher Maintainerpflanzen verwendet werden können.
  • Technischer Hintergrund der Erfindung
  • Bei vielen, wenn nicht gar den meisten Pflanzenspezies ist die Entwicklung von Hybridkultivaren sehr erwünscht, und zwar wegen deren im Allgemeinen erhöhten Produktivität auf Grund von Heterosis: der höheren Leistungsfähigkeit von Hybridindividuen im Vergleich zu ihren Eltern (siehe beispielsweise Fehr (1987) „Principles of Cultivar Development, Volume 1: Theory and Technique", MacMillan Publishing Company, New York; Allard (1960) „Principles of Plant Breeding", John Wiley and Sons; Inc. New York).
  • Die Entwicklung von Hybridkultivaren verschiedener Pflanzenspezies hängt davon ab, eine fast vollständige Kreuzbestäubung zwischen Elternpflanzen erreichen zu können. Dies wird am einfachsten dadurch erreicht, dass man eine der Elternlinien männlich-steril macht (d.h. wobei Pollen entweder nicht vorhanden oder nicht funktionsfähig ist), und zwar beispielsweise durch manuelles Entfernen der Antheren der einen Elternpflanze oder indem man die eine Elternpflanze mit natürlich vorkommenden cytoplasmatischen oder nukleären Genen versieht, die die Entwicklung und/oder Funktion von Antheren und/oder Pollen verhindern, wobei klassische Züchtungstechniken verwendet werden (für eine Übersicht über die Genetik der männlichen Sterilität in Pflanzen, siehe Kaul (1988) „Male Sterility in Higher Plants", Springer Verlag, New York).
  • Bei Hybridpflanzen, bei denen der Samen das Ernteprodukt darstellt (z.B. Mais und Ölraps), muss in den meisten Fällen auch sichergestellt werden, dass die Fertilität der Hybridpflanzen vollständig wiederhergestellt wird. Bei Pflanzen, bei denen die männliche Sterilität unter genetischer Kontrolle steht, erfordert dies die Verwendung von Genen, die die männliche Fertilität wiederherstellen können. Somit hängt die Entwicklung von Hybridkultivaren hauptsächlich von der Verfügbarkeit geeigneter und wirksamer Sterilitäts- und Restorergene ab.
  • Bei den meisten Pflanzenspezies sind endogene nukleäre Loci bekannt, die die männliche Sterilität beeinflussende Genotypen enthalten, und im Allgemeinen müssen solche Loci für bestimmte rezessive Allele homozygot sein, um zu einem männlich-sterilen Phänotyp zu führen. Das Vorhandensein eines dominanten männlich-fertilen Allels an solchen Loci führt zur männlichen Fertilität.
  • Kürzlich konnte gezeigt werden, dass sich männliche Sterilität in einer Pflanze induzieren lässt, indem die Pflanze mit einem nukleären männlichen Sterilitätsgenotyp, der ein eine DNA-Sequenz (oder männliche Sterilitäts-DNA), die beispielsweise für ein cytotoxisches Produkt (wie z.B. eine RNase) codiert und unter der Kontrolle eines vorwiegend in ausgewähltem Gewebe der männlichen Fortpflanzungsorgane der Pflanze aktiven Promotors steht, umfassendes chimärisch-männliches Sterilitätsgen enthält, versehen wird. Diesbezüglich haben sich Tapetum-spezifische Promotoren, wie beispielsweise der Promotor des Gens TA29 aus Nicotiana tabacum, als für diesen Zweck besonders geeignet erwiesen (Mariani et al (1990) Nature 347:737; europäische Patentveröffentlichung („EP") 0,344,029). Indem das Kerngenom der Pflanze mit einem derartigen männlichen Sterilitätsgen versehen wird, wird ein künstlicher männlicher Sterilitätslocus geschaffen, der den zu einer männlich-sterilen Pflanze führenden künstlichen männlichen Sterilitätsgenotyp enthält.
  • Darüber hinaus konnte kürzlich gezeigt werden, dass sich die männliche Fertilität in einer solchen nukleären männlich-sterilen Pflanze mit einem eine weitere DNA-Sequenz (oder Fertilitätsrestorer-DNA), die beispielsweise für ein Protein codiert, das die Aktivität des cytotoxischen Produkts hemmt oder das cytotoxische Produkt auf andere Weise daran hindert, zumindest im ausgewählten Gewebe der männlichen Fortpflanzungsorgane der Pflanze aktiv zu sein, umfassenden chimärischen Fertilitätsrestorergen wiederherstellen lässt ( EP 0,412,911 ). So codiert beispielsweise das Barnase-Gen aus Bacillus amyloliquefaciens für eine RNase (Barnase), die durch ein Protein (Barstar), das von dem Barstar-Gen aus B. amyloliquefaciens codiert wird, gehemmt werden kann. Somit lässt sich das Barnase-Gen zur Konstruktion eines chimärisch-männlichen Sterilitätsgens verwenden, während das Barstar-Gen für die Konstruktion eines chimärischen Fertilitätsrestorergens verwendet werden kann. In Experimenten in unterschiedlichen Pflanzenspezies (z.B. Ölraps) konnte gezeigt werden, dass sich die männliche Fertilität männlich steriler Linien, in denen die männliche Sterilität ihre Ursache im Vorhandensein eines solchen chimärischen Barnase-Gens hatte, durch ein solches chimärisches Barstar-Gen vollständig wiederherstellen lässt ( EP 0,412,911 : Mariani et al (1991) Proceedings of the CCIRC Rapeseed congress, 9.–11. Juli 1991 Saskatoon, Saskatchewan, Kanada; Mariani et al. (1992) Nature 357:384). Durch Kopplung eines Markergens, wie beispielsweise eines dominanten Herbizidresistenzgens (z.B. des für die das herbizide Phosphinotrizin in eine nichttoxische Verbindung umwandelnde Phosphinotrizin-Acetyltransferase (PAT) codierende Gen bar [De Block et al. (1987) EMBO J. 6:2513]), an das chimärische männliche Sterilitäts- und/oder Fertilitätsrestorergen lassen sich Züchtungssysteme zur Selektion auf einheitliche Populationen männlich-steriler Pflanzen realisieren ( EP 0,344,029 ; EP 0,412,911 ).
  • Die Produktion von Hybridsaatgut eines jeden bestimmten Kultivats einer Pflanzenspezies erfordert 1) die Erhaltung kleiner Mengen an reinem Samen aus jeder Inzuchtelternpflanze und 2) die Präparation größerer Mengen an Samen jeder Inzuchtelternpflanze. Solche größeren Samenmengen würden normalerweise durch mehrere (üblicherweise 2) Samenmultiplikationsrunden gewonnen, wobei man von einer kleinen Menge an reinem Samen („Grundsamen") ausgeht, was in jeder Multiplikationsrunde zu einer größeren Menge an Samen der Inzuchtelternpflanze und schließlich zu einem Vorrat an Samen der Inzuchtelternpflanze („Elternsaat" oder „Stammsaat") führt, wobei die letztere Menge zur Auspflanzung ausreicht, so dass die gewünschten Mengen an Hybridsaatgut produziert werden. Dabei benötigt man natürlich bei jeder Saatmultiplikationsrunde größere Anbauflächen (Felder).
  • Um einen kleinen Vorrat an Saatgut von männlich-sterilen Pflanzen zu bewahren und zu vergrößern, war es notwendig, die männlich-sterilen Elternpflanzen mit normalen Pollen produzierenden Elternpflanzen zu kreuzen. Bei den Nachkommen einer solchen Kreuzung handelt es sich in allen Fällen um ein Gemisch aus männlich-sterilen und männlich-fertilen Pflanzen, wobei die letzteren von den ersteren abgetrennt werden müssen. Da männlich-sterile Pflanzen einen künstlichen männlichen Sterilitätslocus, wie oben beschrieben, enthalten, kann ein solches Abtrennen dadurch erleichtert werden, dass man das chimärisch-männliche Sterilitätsgen genetisch mit einem geeigneten Marker gen, wie beispielsweise dem Gen bar, das die leichte Identifizierung und Abtrennung der männlich-fertilen Pflanzen gestattet, verknüpft. In der EP 0,198,288 und zum Vergleich der US-Patentschrift 4,717,219 sind Verfahren zur Verknüpfung solcher Markergene (bei denen es sich um sichtbare Marker oder dominant-konditionale Marker handeln kann) mit männliche Sterilitätsgenotypen enthaltenden endogenen nuklearen Loci beschrieben.
  • Selbst wenn jedoch geeignete Markergene mit männlichen Sterilitätsgenotypen verknüpft sind, erfordert die Erhaltung männlich-steriler Elternpflanzen immer noch, dass eine beträchtliche Anzahl an Pflanzen von dem Feld entfernt werden muss. So führt beispielsweise in Systemen, bei denen ein mit einem chimerisch-männlichen Sterilitätsgen verknüpftes Herbizidresistenzgen (z.B. das Gen bar) verwendet wird, lediglich die Hälfte des Vorrats von den Elternpflanzen zu männlich-sterilen Pflanzen, womit das Entfernen der männlich-fertilen Pflanzen vor der Blüte durch Sprühen mit Herbiziden erforderlich ist. In einem gegebenen Feld wird durch das Entfernen männlich-fertiler Pflanzen der mögliche Ertrag an Hybridsaatgut beziehungsweise der mögliche Ertrag an männlich-sterilen Pflanzen bei jeder Samenmultiplikationsrunde zur Herstellung von Elternsamen effektiv reduziert. Dies ist bei vielen wichtigen Kulturpflanzenspezies wie beispielsweise Mais und Ölraps wirtschaftlich nicht attraktiv. Um die Anzahl an männlich-fertilen Pflanzen, die entfernt werden müssen, zu minimieren wurde nach männlich-fertilen Maintainerpflanzen gesucht, die bei einer Kreuzung mit einer männlich-sterilen Elternpflanze eine minimale, vorzugsweise keine, männlich-fertile Nachkommenschaft produzieren, wodurch die Notwendigkeit zur Entfernung solcher männlich-fertiler Nachkommen minimiert oder insgesamt vermieden wird. Zur Lösung eines analogen Problems wurden in den US-Patentschriften 3,710,511 und 3,861,079 Verfahrensweisen zur Produktion und Erhaltung einer homogenen Population männlich-steriler Pflanzen durch Verwendung spezifischer chromosomaler Abnormalitäten, deren Übertragung auf das Ei und das Sperma auf verschiedene Weise in den Pflanzen erfolgt, beschrieben.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird eine Zelle einer transgenen Pflanze („die Maintainerpflanze") bereitgestellt, in der das nukleäre Genom stabil integriert darin folgendes enthält: 1) an einem ersten Locus oder männlichen Sterilitätslocus, einen männlich-sterilen Genotyp in homozygotem Zustand; und 2) an einem zweiten Locus oder Maintainerlocus, ein Maintainergen in heterozygotem Zustand; wobei der männliche Sterilitätslocus und der Maintainerlocus vorzugsweise unverknüpft sind; und es sich bei dem Maintainergen um eine fremde DNA-Sequenz, vorzugsweise eine fremde chimärische DNA-Sequenz, handelt, die folgendes enthält:
    • a) ein Fertilitätsrestorergen, welches zumindest folgendes enthält:
    • i) eine Fertilitätsrestorer-DNA, welche ein/e Restorer-RNA und/oder -Protein oder Polypeptid codiert, die/das, wenn sie/es in einigen oder allen Zellen, vorzugsweise den Staubblattzellen, der Pflanze produziert oder überproduziert wird, die phänotypische Expression des nukleären männlich-sterilen Genotyps verhindert, der die Pflanze in Abwesenheit der Expression der Fertilitätsrestorer-DNA in den einigen oder allen Staubblattzellen männlich steril machen würde; und
    • ii) einen Restorer-Promotor, welcher geeignet ist, die Expression der Fertilitätsrestorer-DNA in zumindest den einigen oder allen Zellen, vorzugsweise den Staubblattzellen, der Pflanze zu steuern, so dass die phänotypische Expression des nukleären männlich-sterilen Genotyps verhindert wird, wobei sich die Fertilitätsrestorer-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des Restorer-Promotors befindet; und
    • b) ein Pollenletalitätsgen, das in den Mikrosporen und/oder Pollen der Pflanze selektiv zur Produktion von bestäubungsunfähigem Pollen exprimiert wird und welches zumindest folgendes beinhaltet:
    • iii) eine Pollenletalitäts-DNA, die für ein/e pollenletale/s RNA und/oder Protein oder Polypeptid codiert, welche/s, wenn sie/es in den Mikrosporen und/oder Pollen produziert oder überproduziert wird, deren Stoffwechsel, Funktionsfähigkeit und/oder Entwicklung erheblich beeinträchtigt, und
    • iv) einen pollenspezifischen Promotor, der geeignet ist, die Expression der Pollenletalitäts-DNA selektiv in den besagten Mikrosporen und/oder Pollen der Pflanze zu steuern, wobei sich die Pollenletalitäts-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter Kontrolle des Pollenpromotors befindet.
  • Die Zelle der Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung beinhaltet vorzugsweise ebenso, vor allem im Maintainerlocus, mindestens ein erstes Markierungsgen, welches zumindest folgendes beinhaltet:
    • v) eine erste Markierungs-DNA, die eine erste Markierungs-RNA, ein erstes Markierungs-Protein oder -Polypeptid codiert, welches, wenn es zumindest in einem ersten spezifischen Gewebe oder spezifischen Zellen der Pflanze enthalten ist, die Pflanze leicht von anderen Pflanzen unterscheidbar macht, die nicht die von der ersten Markierungs- DNA codierte erste Markierungs-RNA, das von der ersten Markierungs-DNA codierte erste Markierungs-Protein oder -Polypeptid zumindest in dem ersten spezifischen Gewebe oder spezifischen Zellen enthalten, und
    • vi) einen ersten Markierungs-Promotor, der geeignet ist, die Expression der ersten Markierungs-DNA zumindest in dem ersten spezifischen Gewebe oder spezifischen Zellen zu steuern, wobei sich die erste Markierungs-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des ersten Markierungs-Promotors befindet.
  • Der männlich-sterile Genotyp in der Zelle der Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung kann fremd oder endogen sein, doch handelt es sich dabei vorzugsweise um ein fremdes, vor allem chimärisches, Männliche-Sterilität-Gen, das folgendes enthält:
    • 1) eine Männliche-Sterilität-DNR, welche ein/e Sterilität-RNA, und/oder -Protein oder -Polypeptid codiert, die/das, wenn sie/es in einer Staubblattzelle der Pflanze in Abwesenheit der/des Restorer-RNA, -Proteins oder -Polypeptids produziert oder überproduziert wird, Stoffwechsel, Funktionsfähigkeit und/oder Entwicklung der Staubblattzelle erheblich beeinträchtigt, und
    • 2) einen Sterilitätspromotor, der geeignet ist, die Expression der Männliche-Sterilität-DNA selektiv in Staubblattzellen der Pflanze zu steuern, wobei sich die Männliche-Sterilität-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des Sterilitätspromotors befindet.
  • Der männlich-sterile Genotyp in der Maintainerpflanzenzelle der vorliegenden Erfindung umfaßt, vor allem im Männliche-Sterilität-Locus, mindestens ein zweites Markierungsgen, welches zumindest folgendes beinhaltet:
    • 3) eine zweite Markierungs-DNA, welche ein/e zweite/s Markierungs-RNA, und/oder -Protein oder -Polypeptid codiert, durch welche/s die Pflanze, wenn sie/es zumindest in dem zweiten spezifischen Gewebe oder in spezifischen Zellen der Pflanze vorkommt, leicht von anderen Pflanzen zu unterscheiden ist, die nicht die/das zweite Markierungs-RNA, -Protein oder -Polypeptid in mindestens dem zweiten spezifischen Gewebe oder in spezifischen Zellen enthalten, und
    • 4) einen zweiten Markierungs-Promotor, der geeignet ist, die Expression der zweiten Markierungs-DNA zumindest in dem zweiten spezifischen Gewebe oder in spezifischen Zellen zu leiten, wobei sich die zweite Markierungs-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des zweiten Markierungs-Promotors befindet.
  • Ebenso werden im Sinne der vorliegenden Erfindung die Maintainerpflanzen, die Samen solcher Pflanzen und Pflanzenzellkulturen bereitgestellt, die alle jeweils im Wesentlichen aus den Zellen der vorliegenden Erfindung bestehen.
  • Ferner werden im Sinne der vorliegenden Erfindung das Maintainergen sowie Plasmide, die das Maintainergen enthalten, ebenso wie bakterielle Wirtszellen (z.B. E. coli oder Agrobacterium), die solche Plasmide enthalten, bereitgestellt.
  • Ferner wird im Sinne der vorliegenden Erfindung noch ein Verfahren zur Herstellung, vorzugsweise Vergrößerung, einer homogenen Population männlich-steriler Pflanzen und deren Saatgut, welche ein nukleäres Männliche-Sterilität-Gen in homozygotem Zustand enthalten, bereitgestellt, wobei das Verfahren den Schritt, die männlich-sterilen Pflanzen mit den Maintainerpflanzen der vorliegenden Erfindung zu kreuzen, beinhaltet. Das Saatgut aus den entstandenen männlich-sterilen Pflanzen lässt sich ernten und zu männlich-sterilen Pflanzen anziehen. Durch Kreuzen der männlich-sterilen Pflanzen mit als Bestäuber verwendeten männlich-fertilen Pflanzen einer anderen Inzuchtelternlinie kann dann Hybridsaatgut produziert werden.
  • Ferner wird im Sinne der vorliegenden Erfindung auch noch ein Verfahren zur Herstellung, vorzugsweise Vergrößerung, einer Population der Maintainerpflanzen bereitgestellt, das den Schritt der Selbstung der Maintainerpflanzen beinhaltet.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Bei einer männlich-sterilen Pflanze der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Pflanze einer gegebenen Spezies mit einem nukleären männlich-sterilen Genotyp.
  • Bei einer Restorer-Pflanze der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Pflanze der gleichen Pflanzenspezies, die in ihrem nukleären Genom ein Fertilitätsrestorergen enthält, das zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität in Nachkommen, die sich aus einer Kreuzung zwischen der männlich-sterilen Pflanze und der Restorer-Pflanze erhalten lassen und die sowohl den männlich-sterilen Genotyp als auch das Fertilitätsrestorergen enthalten, fähig ist.
  • Bei einer wiederhergestellten Pflanze der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Pflanze der gleichen Spezies, die männlich-fertil ist und die in ihrem Kerngenom den männlich-sterilen Genotyp und das Fertilitätsrestorergen enthält.
  • Bei einer Elternpflanze oder einem Elternorganismus der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Pflanze, die sich zur Produktion von Hybridsaatgut einsetzen lässt. Dabei stellt die weibliche oder Samenelternpflanze denjenigen Elternteil dar, von dem das Hybridsaatgut geerntet wird. Im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei der weiblichen Elternpflanze immer um eine männlich-sterile Pflanze. Der männliche oder Pollenelternteil ist derjenige Elternteil, der zur Befruchtung des weiblichen Elternteils verwendet wird. In vielen Fällen handelt es sich bei dem männlichen Elternteil auch um eine Restorer-Pflanze.
  • Bei einer Linie handelt es sich um die Nachkommenschaft einer gegebenen individuellen Pflanze.
  • Bei dem männlich-sterilen Genotyp der vorliegenden Erfindung handelt es sich um den Genotyp von zumindest einem Locus, vorzugsweise nur einem Locus, im Kerngenom einer Pflanze (d.h. den Männliche-Sterilität-Locus), dessen Allelzusammensetzung zur männlichen Sterilität in der Pflanze führen kann. Dabei kann es sich um einen für die Pflanze endogenen männlich-sterilen Genotyp handeln, doch wird im allgemeinen bevorzugt, dass er für die Pflanze fremd ist. Als fremde männlich-sterile Genotypen sind solche bevorzugt, bei denen das für die männliche Sterilität verantwortliche Allel ein fremdes Männliche-Sterilität-Gen enthält, das folgendes beinhaltet:
    • 1) eine Männliche-Sterilität-DNA, welche ein/e Sterilität-RNA, und/oder -Protein oder -Polypeptid codiert, die/das, wenn sie/es in einer Staubblattzelle der Pflanze produziert oder überproduziert wird, Stoffwechsel, Funktionsfähigkeit und/oder Entwicklung der Staubblattzelle erheblich beeinträchtigt, und
    • 2) einen Sterilitätspromotor, der geeignet ist, die Expression der Männliche-Sterilität-DNA selektiv in Staubblattzellen der Pflanze zu steuern, wobei sich die Männliche-Sterilität-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des Sterilitätspromotors befindet.
  • Bei einem derartigen Männliche-Sterilität-Gen handelt es sich immer um ein dominantes Allel an einem fremden Männliche-Sterilität-Locus. Das rezessive Allel entspricht der Abwesenheit des Männliche-Sterilität-Gens im Kerngenom der Pflanze.
  • Bevorzugte fremde Männliche-Sterilität-DNAs und Sterilitätspromotoren, die sich bei den Männliche-Sterilität-Genen in weiblichen Elternpflanzen und Maintainerpflanzen der vorliegenden Erfindung verwenden lassen, sind in der EP 0,344,029 beschrieben. Eine besonders geeignete Männliche-Sterilität-DNA codiert für Barnase (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202:913). Als Sterilitätspromotoren besonders geeignet sind Tapetum-spezifische Promotoren, wie z.B.: der Promotor des Gens TA29 aus Nicotiana tabacum ( EP 0,344,029 ), der sich in Tabak, Ölraps, Salat, Zichorie, Mais und anderen Pflanzenspezies verwenden läßt; die Promotoren PT72, PT42 und PE1 aus Reis, deren Sequenzen in SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8 bzw. SEQ ID No. 9 des Sequenzprotokolls angegeben sind, und die sich in Reis und anderen Pflanzenspezies verwenden lassen (PCT-Anmeldung PCT/EP 92/00274); und der Promotor PCA55 aus Mais, dessen Sequenz in SEQ ID No. 10 angegeben ist und der sich in Mais und anderen Pflanzenspezies verwenden lässt (PCT-Anmeldung PCT/EP 92/00275).
  • Bei einem bevorzugten endogenen männlich-sterilen Genotyp handelt es sich um einen Genotyp, bei dem ein rezessives Allel („m") in homozygotem Zustand (m/m) an einem Männliche-Sterilität-Locus männliche Sterilität produziert. An einem Männliche-Sterilität-Locus würde ansonsten männliche Fertilität durch ein entsprechendes dominantes Allel („M") codiert werden. Ein derartiger männlich-steriler Genotyp ist bei vielen Pflanzenspezies bekannt (siehe Kaul (1988) supra; und Ausgaben von 1992 des Maize Genetics Cooperation Newsletter, veröffentlicht vom Department of Agronomy und U.S. Department of Agriculture, University Of Missouri, Columbia, Missouri, U.S.A.). Die den Allelen m und M entsprechenden DNA-Sequenzen im Kerngenom einer Pflanze lassen sich durch Gen-Tagging, d.h. durch Insertionsmutagenese unter Verwendung von Transposons, oder mittels T-DNA-Integration identifizieren (siehe z.B. Wienand und Seadler (1987) in „Plant DNA Infectious Agents", herausgegeben von T.H. Hohn und J. Schell, Springer Verlag, New York, S. 205; Shepherd (1988) in „Plant Molecular Biology: a Practical Approach", IRL Press, S. 187; Teeri et al (1986) EMBO J. 5:1755).
  • Fertilitätsrestorer-DNAs und Restorer-Promotoren, die sich in den Maintainergenen der vorliegenden Erfindung mit einem fremden männlich-sterilen Genotyp verwenden lassen, wurden in der EP 0,412,911 beschrieben. Diesbezüglich besonders geeignet sind Fertilitätsrestorergene, bei denen die Fertilitätsrestorer-DNA Barstar codiert (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202:913) und unter der Kontrolle Tapetum-spezifischer Promotoren, wie beispielsweise den oben als Sterilitätspromotoren beschrieben, steht. Insbesondere wird angenommen, dass eine für eine Mutante von Barstar codierende Fertilitätsrestorer-DNA, bei der der Zysteinrest an dessen Position 40 durch Serin ersetzt ist (Hartley (1989) TIBS 14:450), bei der Wiederherstellung der Fertilität in den wiederhergestellten Pflanzen einiger Spezies besser funktioniert.
  • Ist ein endogener männlich-steriler Genotyp für ein rezessives Allel homozygot, so ist es bevorzugt, daß es sich bei dem Fertilitätsrestorergen um das dominante Allel M dieses männlich-sterilen Genotyps, vorzugsweise unter der Kontrolle seines eigenen Promotors, handelt. Die einem solchen dominanten Allel entsprechende DNA, einschließlich ihres natürlichen Promotors, lässt sich aus dem Kenngenom der Pflanze mittels Gen-Tagging, wie oben beschrieben, isolieren.
  • Die Pollenletalität-DNAs, die in den Pollenletalitätsgenen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen, codieren vorzugsweise eine RNA und/oder ein Protein oder Polypeptid, die/das bei ihrer/seiner Expression in Mikrosporen oder Pollen deren Stoffwechsel, Funktionsfähigkeit und/oder Entwicklung erheblich beeinträchtigt. Diesbezüglich können die Pollenletalitäts-DNAs für RNAs, Proteine oder Polypeptide, wie sie beispielsweise von den in der EP 0,344,029 beschriebenen Männliche-Sterilität-DNAs codiert werden, codieren. Von besonderem Interesse sind Männliche-Sterilität-DNAs, die für Ribonukleasen ( EP 0,344,029 ), wie beispielsweise RNase T1 aus Aspergillus oryzae (Quaas et al. (1988) Eur. J. Biochem. 173:617) oder Barnase aus Bacillus amyloliquefaciens (Hartley (1988) J. Mol. Biol. 202:913), codieren.
  • Zur selektiven Expression der Pollenletalitäts-DNA in Mikrosporen oder Pollen der Maintainerpflanze ist es bevorzugt, daß es sich bei dem pollenspezifischen Promotor, der die Pollenletalitäts-DNA im Pollenletalitätsgen kontrolliert, um einen Promotor handelt, der zur selektiven Steuerung der Genexpression in den Mikrosporen und/oder Pollen der Pflanze fähig ist. Bei einem solchen pollenspezifischen Promotor kann es sich um einen endogenen Promotor oder einen fremden Promotor handeln, der aus dem Kerngenom oder aus dem Mitochondrien- oder Chloroplastengenomen einer Pflanzenzelle stammen kann, wobei jedoch in jedem Fall der pollenspezifische Promotor im Kerngenom der zu transformierenden Pflanze fremd ist. Vorzugsweise führt der pollenspezifische Promotor dazu, dass die Pollenletalität-DNA nur in den Mikrosporen und/oder Pollen, d.h. nach Meiose der Mikrosporozyten in den Antheren, exprimiert wird. Der pollenspezifische Promotor lässt sich auf allgemein bekannte Weise aus einer Pflanzenspezies, vorzugsweise der Pflanzenspezies, die männlich-steril gemacht werden soll, reaktionieren und isolieren, so dass der pollenspezifische Promotor die Expression der Pollenletalitäts-DNA selektiv in den Mikrosporen und/oder Pollen steuert, so dass dadurch die Mikrosporen und/oder Pollen, in denen das Pollenletalitätsgen exprimiert wird, abgetötet oder funktionsunfähig gemacht werden. Vorzugsweise wird der pollenspezifische Promotor auch so reaktioniert und isoliert, dass er bei der Verhinderung der Expression der Pollenletalitäts-DNA in anderen Geweben der Pflanze wirksam ist. So lässt sich beispielsweise ein geeigneter endogener pollenspezifischer Promotor in einer Pflanze, die männlich-steril gemacht werden soll, folgendermaßen identifizieren und isolieren:
    • 1. Suchen nach einer mRNA, die in der Pflanze lediglich während der Entwicklung ihrer Entwicklungssporen und/oder Pollen vorhanden ist;
    • 2. gegebenenfalls Isolieren der Mikrosporen- und/oder pollenspezifischen mRNA;
    • 3. Herstellen und Isolieren einer cDNA aus der Mikrosporen- und/oder pollenspezifischen mRNA;
    • 4. Verwenden dieser cDNA als Sonde zur Identifizierung von Bereichen in Pflanzengenomen, die für die entsprechende Mikrosporen- und/oder pollenspezifische DNA codierenden DNA enthalten, oder als Alternative Verwenden von inversen Polymerasekettenreaktionen zur geometrischen Amplifikation der DNA-Sequenzen, die stromaufwärts und stromabwärts einen gewählten Kernbereich der Sequenz der mikrosporen- und/oder pollenspezifischen cDNA entsprechenden genomischen DNA flankieren; und
    • 5. Identifizieren desjenigen Teils des Pflanzengenoms, der stromaufwärts (d.h. 5') von der für die mikrosporen- und/oder pollenspezifische mRNA codierenden DNA liegt und der den Promotor dieser DNA enthält.
  • Beispiele derartiger pollenspezifischer Promotoren sind allgemein bekannt (siehe MacCormick (1991) TIG 7:298). Diesbezüglich ist in Hamilton et al. (1989) Sex. Plant Reprod. 2:208 ein pollenspezifischer Klon („Zmg13") aus der Mais-Inzuchtlinie W-22 beschrieben, und die Verwendung der Promotorsequenzen des Klons zur Steuerung der pollenspezifischen Expression in Tabak wurde von Guerrero et al. (1990) Mol.Gen.Genet. 224:161) beschrieben. Weitere pollenspezifische Promotoren, von denen gleichfalls eine Eignung vermutet wird, sind: der Promotor des der von Weterings et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:1101 beschriebenen pollenspezifischen cDNA NTPc303 aus Nicotiana tabacum entsprechenden Gens; sowie der Promotor des der von Shen und Hsu (1992) Mol. Gen. Genet. 234:379 beschriebenen pollenspezifischen cDNA B54 aus Brassica napus entsprechenden Gens.
  • Falls die Fertilitätsrestorer-DNA im Fertilitätsrestorergen des Maintainergens auch gleichzeitig mit der Pollenletalitäts-DNA in Mikrosporen und/oder Pollen exprimiert wird (beispielsweise auf Grund der Aktivität des Restorerpromotors in Mikrosporen und/oder Pollen), so ist es bevorzugt, dass die Pollenletalitäts-DNA von der Männliche-Sterilität-DNA (deren Expression durch die Expression der Fertilitätsrestorer-DNA des Maintainergens verhindert werden soll) verschieden ist. Codiert beispielsweise die Männliche-Sterilität-DNA in den zu erhaltenden männlich-sterilen Pflanzen für Barnase, so sollte die Fertilitätsrestorer-DNA im Maintainergen für Barstar codieren. Somit sollte, falls der Restorer-Promotor im Maintainergen auch die Expression der Fertilitätsrestorer-DNA in Mikrosporen und/oder Pollen steuert, und zwar gleichzeitig mit der Expression der Pollenletalitäts-DNA, die Pollenletalitäts-DNA vorzugsweise nicht für Barnase, sondern eher beispielsweise für eine andere RNAse, wie z.B. RNAse T1, codieren.
  • Erste und zweite Markierungs-DNAs sowie erste und zweite Markierungspromotoren, die sich in den ersten und zweiten Markierungsgenen der vorliegenden Erfindung verwenden lassen, sind ebenso allgemein bekannt ( EP 0,344,029 ; EP 0,412,911 ). Diesbezüglich ist es bevorzugt, dass die erste und die zweite Markierungs-DNA verschieden sind, obwohl der erste und der zweite Markierungspromotor identisch sein können.
  • Bei dem Fertilitätsrestorergen, dem Männliche-Sterilität-Gen, dem Pollenletalitätsgen sowie dem ersten und dem zweiten Markierungsgen im Sinne der vorliegenden Erfindung handelt es sich im allgemeinen um fremde DNA-Sequenzen, vorzugsweise um fremde chimärische DNA-Sequenzen. Solche fremden DNA-Sequenzen werden vorzugsweise mit geeigneten 3'-Transkriptionsregulationssequenzen und Polyadenylationssignalen versehen, und zwar stromabwärts (d.h. 3') von ihrer jeweiligen Fertilitätsrestorer-DNA, Männliche-Sterilität-DNA, Pollenletalität-DNA und erster bzw. zweiter Markierungs-DNA. Diesbezüglich lassen sich entweder fremde oder endogene, zur Erzielung der Expression solcher DNA-Sequenzen geeignete Transkriptionsterminations- und Polyadenylationssignale verwenden. So können beispielsweise die fremden 3'-nichttranslatierten Enden von Genen, wie z.B. Gen 7 (Velten und Schell (1985) Nucl. Acids Res. 13:6998), dem Octopinsynthase-Gen (De Greve et al. (1982) J.Mol. Appl. Genet. 1:499; Giele et al. (1983) EMBO J. 3:835; Ingelbrecht et al. (1989) The Plant Cell 1:671), dem Nopalinsynthase-Gen des T-DNA-Bereichs des Ti-Plasmids aus Agrobacterium tumefaciens (De Picker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561), dem Chalconsynthase-Gen (Sommer und Seadler (1986) Mol. Gen. Genet. 202:429–434) sowie der CaMV-19S/35S-Transkriptionseinheit (Molten et al. (1990) The Plant Cell 2:1261–1272), verwendet werden.
  • Unter „fremd" wird im Hinblick auf ein Gen oder einen Genotyp der vorliegenden Erfindung verstanden, dass das Gen bzw. der Genotyp eine fremde DNA-Sequenz, wie beispielsweise eine Männliche-Sterilität-DNA, eine Fertilitätsrestorer-DNA, eine Pollenletalitäts-DNA oder eine Markierungs-DNA und/oder einen fremden Promotor, wie beispielsweise einen Sterilitätspromotor, einen Restorer-Promotor, einen pollenspezifischen Promotor, oder einen Markierungspromotor enthält. Unter „fremd" wird im Hinblick auf eine beliebige DNA-Sequenz, wie beispielsweise einer codierenden Sequenz oder einem Promotor, in einem Gen oder Genotyp der vorliegenden Erfindung verstanden, dass eine solche DNA sich nicht in der gleichen genomischen Umgebung in einer mit einer solchen DNA im Sinne der vorliegenden Erfindung transformierten Pflanzenzelle befindet, wie es eine solche DNA ist, wenn sie natürlicherweise in der Zelle der Pflanze, der Bakterien, des Tiers, des Pilzes, des Virus oder dergleichen, woraus eine solche DNA stammt, angetroffen wird. Dies bedeutet beispielsweise, dass eine fremde Fertilitätsrestorer-DNA, Männliche-Sterilität-DNA, Pollenletalitäts-DNA oder Markierungs-DNA: 1) eine nukleäre DNA in einer Ausgangspflanze; 2) für die transformierte Pflanzenzelle endogen (d.h. aus einer Ausgangspflanze mit dem gleichen Genotyp wie die zu transformierenden Pflanze); und 3) in der gleichen Transkriptionseinheit wie ihr eigener endogener Promotor und ihre eigenen 3'-terminalen Transkriptionsregulationssignale (aus der Ausgangspflanze) in dem fremden Gen oder Genotyp in der transformierten Pflanzenzelle; jedoch 4) sich an einer anderen Stelle als der, an der sie sich in der Ausgangspflanze befand, im Kerngenom der transformierten Pflanzenzelle befinden kann, so dass sie in der transformierten Pflanzenzelle nicht von den Genen, von denen sie natürlicherweise in der Ausgangspflanze umgeben ist, umgeben ist. Gleichfalls kann eine fremde Fertilitätsrestorer-DNA, Männliche-Sterilität-DNA, Pollenletalitäts-DNA oder Markierungs-DNA auch beispielsweise: 1) eine nukleäre DNA in einer Ausgangspflanze; und 2) für die transformierte Pflanzenzelle endogen sein; jedoch 3) sich in der gleichen Transkriptionseinheit wie ein anderer (d.h. nicht ihr eigener) endogener Promotor und/oder 3'-terminale Transkriptionsregulationssignale in einem fremden chimärischen Gen oder Genotyp der vorliegenden Erfindung in einer transformierten Pflanzenzelle befinden. Eine fremde Fertilitätsrestorer-DNA, Männliche-Sterilität-DNA, Pollenletalitäts-DNA oder Markierungs-DNA kann ebenso beispielsweise: 1) eine nukleäre DNA in einer Ausgangspflanze; und 2) für die transformierte Pflanzenzelle endogen sein; jedoch 3) sich in der gleichen Transkriptionseinheit wie ein heterologer Promotor und/oder 3'-terminale Transkriptionsregulationssignale in einem fremden chimärischen Gen oder Genotyp der vorliegenden Erfindung in einer transformierten Pflanzenzelle befinden. Ebenso kann eine fremde Fertilitätsrestorer-DNA, eine Männliche-Sterilität-DNA, Pollenletalitäts-DNA oder Markierungs-DNA beispielsweise für die transformierte Pflanzenzelle heterolog sein und sich in der gleichen Transkriptionseinheit wie ein endogener Promotor und/oder 3'-Transkriptionsregulationssignale (z.B. aus dem Kerngenom einer Pflanze mit dem gleichen Genotyp wie die zu transformierende Pflanze) in einer fremden chimärischen DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung in einer transformierten Pflanzenzelle befinden. Vorzugsweise ist die Fertilitätsrestorer-DNA, Männliche-Sterilität-DNA, Pollenletalitäts-DNA und Markierungs-DNA der vorliegenden Erfindung jeweils für die zu transformierende Pflanzenzelle heterolog.
  • Unter „heterolog" wird im Hinblick auf eine DNA, wie beispielsweise Fertilitätsrestorer-DNA, eine Männliche-Sterilität-DNA, eine Pollenletalitäts-DNA, eine Markierungs-DNA, einen Fertilitätsrestorer-Promotor, einen Sterilitätspromotor, einen pollenspezifischen Promotor oder einen Markierungspromotor oder irgendeiner anderen DNA-Sequenz in einem Gen oder einem Genotyp der vorliegenden Erfindung verstanden, dass eine solche DNA nicht natürlicherweise im Kerngenom von Zellen einer Pflanze mit dem gleichen Genotyp wie die zu transformierende Pflanze angetroffen wird. Zu heterologen DNAs gehören beispielsweise aus einer Pflanze mit dem gleichen Genotyp wie die zu transformierende Pflanze gewonnene Chloroplasten- und Mitochondrien-DNAs, doch handelt es sich bei bevorzugten Beispielen um Chloroplasten-, Mitochondrien- und nukleäre DNAs aus Pflanzen mit einem von der zu transformierenden Pflanze verschiedenen Genotyp, um DNAs aus Tier- und Bakteriengenomen sowie um chromosomale und Plasmid-DNAs aus Pilz-, Bakterien- und Virusgenomen.
  • Unter „chimärisch" wird im Hinblick auf eine fremde DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung verstanden, dass zumindest eine ihrer codierenden Sequenzen: 1) nicht natürlicherweise unter der Kontrolle des in der fremden DNA-Sequenz vorhandenen Promotors angetroffen wird; und/oder 2) nicht natürlicherweise im gleichen genetischen Locus wie zumindest eine ihrer assoziierten Markierungs-DNAs angetroffen wird. Zu den fremden chimärischen DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung gehören beispielsweise: eine Pollenletalitäts-DNA bakteriellen Ursprungs unter der Kontrolle eines pollenspezifischen Promotors pflanzlichen Ursprungs; sowie eine Pollenletalitäts-DNA pflanzlichen Ursprungs unter der Kontrolle eines pollenspezifischen Promotors pflanzlichen Ursprungs, die sich im gleichen genetischen Locus wie eine Markierungs-DNA bakteriellen Ursprungs befindet.
  • Unter „endogen" wird mit Bezug auf ein Gen oder einen Genotyp der vorliegenden Erfindung verstanden, dass es sich dabei nicht um ein fremdes Gen bzw. einen fremden Genotyp handelt.
  • Die fremden Gene und Genotypen der vorliegenden Erfindung, wie beispielsweise das Männliche-Sterilität-Gen und der männlich-sterile Genotyp, das Fertilitätsrestorergen und das Pollenletalitätsgen, können wie ihr anderer Genotyp beschrieben werden: mit Großbuchstaben wird das Vorhandensein der fremden Gene und Genotypen (des dominanten Allels) bezeichnet, während deren Abwesenheit (das rezessive Allel) mit kleinen Buchstaben bezeichnet wird. Daher bezeichnen in der vorliegenden erfindungsgemäßen Beschreibung „S" und „s" die Gegenwart bzw. Abwesenheit des Männliche-Sterilität-Gens, „R" und „r" die Gegenwart bzw. Abwesenheit des Fertilitätsrestorergens sowie „P" und „p" die Gegenwart bzw. Abwesenheit des Maintainergens.
  • Bei einem endogenen männlich-sterilen Genotyp der vorliegenden Erfindung bezeichnet „m" das rezessive Allel und „M" das dominante Allel. Somit würde das rezessive Allel m in homozygotem Zustand (m/m) an einem Männliche-Sterilität-Locus zur männlichen Sterilität führen, wobei das dominante Allel M bei seiner Gegenwart an einem Männliche-Sterilität-Locus entweder in homozygotem oder heterozygotem Zustand zur männlichen Fertilität führt.
  • Die Zelle einer Pflanze, insbesondere einer Pflanze, die mit Agrobacterium infiziert werden kann, wie beispielsweise die meisten dikotyledonen Pflanzen (z.B. Brassica napus), kann mit einem Vektor transformiert werden, bei dem es sich um ein „entwaffnetes" („disarmed") Ti-Plasmid handelt, das das Männliche- Sterilität-Gen und/oder das Fertilitätsrestorergen und/oder das Pollenletalitätsgen und/oder das Maintainergen und/oder das/die Markergen(e) der vorliegenden Erfindung enthält und von Agrobacterium getragen wird. Diese Transformation lässt sich unter Verwendung der beispielsweise in der EP 0,116,718 und EP 0,270,822 beschriebenen Verfahrensweisen durchführen. Bevorzugte Ti-Plasmidsektoren enthalten eine fremde DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung zwischen den Border-Sequenzen oder zumindest links von der rechten Bordersquenz der T-DNA des Ti-Plasmids lokalisiert. Natürlich lassen sich alle Arten von Vektoren zur Transformation der Pflanzenzelle verwenden, wobei Verfahrensweisen wie beispielsweise direkter Gentransfer (wie z.B. in der EP 0,233,247 beschrieben), pollenvermittelte Transformation (wie z.B. in der EP 0,270,356 , der PCT-Veröffentlichung WO 85/01856 und der US-Patentschrift 4,684,611 beschrieben), Pflanzen-RNA-Virus-vermittelte Transformation (wie z.B. in der EP 0,067,553 und der US-Patentschrift 4,407,956 beschrieben) und liposomenvermittelte Transformation (wie z.B. in der US-Patentschrift 4,536,475 beschrieben), verwendet werden. Zellen monokotyledoner Pflanzen, wie beispielsweise der Hauptgetreidepflanzen, einschließlich Mais, Weizen, Gerste und Roggen, lassen sich wie in der PCT-Anmeldung PCT/EP 91/02198 beschrieben transformieren. Falls es sich bei der zu transformierenden Pflanze um Mais handelt, können auch kürzlich entwickelte Methoden verwendet werden, wie beispielsweise die für bestimmte Maislinien von Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8:833, Gordon-Kamm et al. (1990) Bio/Technology 2:603 und Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426 beschriebenen Methoden. Falls es sich bei der zu transformierenden Pflanze um Reis handelt, können ebenso kürzlich entwickelte Methoden verwendet werden, wie beispielsweise die für bestimmte Reislinien von Shimamoto et al. (1989) Nature 338:274, Datta et al. (1990) Bio/Technology 8:736 und Hayashimoto et al. (1990) Plant Physiol. 93:857 beschriebene Methode.
  • Die so transformierte Zelle lässt sich zu einer reifen Pflanze regenerieren, und die erhaltene transformierte Pflanze kann im Rahmen eines herkömmlichen Züchtungsschemas zur Herstellung von mehr transformierten Pflanzen mit den gleichen Eigenschaften oder zur Einführung des Männliche-Sterilität-Gens, des Fertilitätsrestorergens, des Pollenletalitätsgens, der Markierungsgene und/oder des Maintainergens der vorliegenden Erfindung in anderen Varietäten der gleichen oder verwandter Pflanzenspezies verwendet werden. Aus solchen Pflanzen gewonnene Samen enthalten das/die Gen(e) der vorliegenden Erfindung als stabilgenomische Insertion.
  • Die Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung gehört zur gleichen Spezies wie eine männlich-sterile Pflanzenlinie und lässt sich zum Erhalt der männlich-sterilen Linie, d.h. zum Erhalten einer homogenen Population männlich-steriler Pflanzen sowie eines Vorrats von reinem Samen der weiblichen Elternpflanze verwenden. Dabei handelt es sich bei der Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung selbst um eine Pflanze, bei der die männliche Fertilität wiederhergestellt wurde und deren Genom sowohl einen männlich-sterilen Genotyp als auch im Maintainerlocus ein Fertilitätsrestorergen der vorliegenden Erfindung enthält.
  • Falls eine Pflanzenlinie mit einem homozygoten männlich-sterilen Genotyp (Am/m oder AS/S) verfügbar ist, so lässt sich eine Maintainerpflanze für die männlich-sterile Linie direkt durch Transformation einer männlich-sterilen Pflanze der Linie mit dem Maintainergen der vorliegenden Erfindung sowie anschließender Selektion derjenigen transgenen Pflanzen, bei denen es sich um Pflanzen mit wiederhergestellter männlicher Fertilität handelt und in denen das Maintainergen stabil in nukleärem Genom integriert ist, so dass der genetische Locus des männlich-sterilen Genotyps und der des Maintainergens nicht verknüpft sind und unabhängig voneinander segregieren, gewinnen.
  • Falls der männlich-sterile Genotyp für die Pflanzenlinie fremd ist, können alternative Strategien verfolgt werden. Beispielsweise lässt sich die Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung durch: Transformieren einer Pflanzenzelle der Pflanzenlinie (A) mit dem Maintainergen der vorliegenden Erfindung (P) und anschließender Regeneration einer transgenen Pflanze, deren Genom das Maintainergen stabil integriert enthält, aus der so transformierten Pflanze erhalten. Eine solche transgene Pflanze (AP/p) kann dann als weibliche Elternpflanze mit einer Pflanze AS/s,R/r der gleichen Linie, deren Genom in separaten Loci ein Männliche-Sterilität-Gen (S) sowie ein entsprechendes Fertilitätsrestorergen (R), die sich beide in heterozygotem Zustand befinden, enthält, der jedoch das Maintainergen fehlt, gekreuzt werden. Somit handelt es sich bei der Kreuzung im Grunde genommen um: AS/s,R/r,p/p (männlich) × As/s,r/r,P/p (weiblich), wobei die Nachkommen mit dem Genotyp AS/s,r/r,P/p (oder nachfolgend aus praktischen Gründen „AS/s,P/p") reaktioniert und geselbstet werden. Danach lässt sich ein Achtel der Nachkommen, die den gewünschten Genotyp (AS/S,P/p) für eine Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung aufweisen, selektionieren. Ein weiteres Achtel der Nachkommen mit dem Genotyp (AS/S,p/p) lassen sich als zu erhaltende männlich-sterile Pflanzen verwenden.
  • Die Isolierung von Pflanzen mit gewünschten Genotypen lässt sich mittels herkömmlicher Testkreuzungen erreichen (siehe z.B. Fehr (1987) supra), vorzugsweise mit Unterstützung durch Nachweis des Vorhandenseins bestimmter Gene auf dem DNA-Niveau, beispielsweise mittels Amplifikation von DNA-Fragmenten durch die Polymerasekettenreaktion, durch Southern-Blot-Analyse und/oder durch phänotypische Analyse auf das Vorhandensein und die Expression erster oder zweiter Markierungsgene der vorliegenden Erfindung.
  • Die Kreuzung einer männlich-sterilen Pflanze, die einen männlich-sterilen Genotyp in homozygotem Zustand (AS/S oder Am/m) enthält, mit einer Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung (AS/S,P/p bzw. Am/m,P/p) führt zu einer Population von Samen, die alle den männlich-sterilen Genotyp in homozygotem Zustand (AS/S bzw. Am/m) enthalten, da das Maintainergen nicht durch die Pollen übertragen wird. Diese Eigenschaft lässt sich beim Erhalten des Basissaatguts und bei der Multiplikation des Basissaatguts zur endgültigen Produktion des Elternsaatguts vorteilhaft einsetzen.
  • Die Maintainerpflanzen der vorliegenden Erfindung (AS/S,P/p oder Am/m,P/p) können selbst durch Selbstung erhalten werden. Die Nachkommen einer solchen Selbstung bestehen aus 50% männlich-fertilen Maintainerpflanzen (AS/S,P/p bzw. Am/m,P/p) und 50 % männlich-sterilen Pflanzen, die den männlich-sterilen Genotyp in homozygotem Zustand (AS/S bzw. Am/m) enthalten. Falls gewünscht können die männlich-sterilen Pflanzen entweder von Hand auf Grundlage des männlich-sterilen Phenotyps oder, falls das Maintainergen ein geeignetes erstes Markierungsgen umfasst, vorzugsweise eines ersten Markierungsgens, dessen Expression der Pflanze Herbizidresistenz verleiht, unter Verwendung der phänotypischen Expression des ersten Markierungsgens abgetrennt werden (beispielsweise indem die Nachkommen mit Herbizid behandelt werden, so dass männlich-sterile Pflanzen, denen das Herbizidresistenzgen fehlt, abgetötet werden, während Maintainerpflanzen mit dem Herbizidresistenzgen überleben).
  • Somit kann die Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung leicht zum Erhalten einer homogenen Population männlich-steriler Pflanzen verwendet werden. Diesbezüglich lässt sich das Basissaatgut einer weiblichen Elternpflanze einer gegebenen Pflanzenspezies mit einer entsprechenden männlichen Elternpflanze zur Produktion von Hybridsaatgut kreuzen. Ebenso kann die Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung wirtschaftlich eingesetzt werden, um das Basissaatgut einer weiblichen Elternpflanze einer gegebenen Pflanzenspezies zu multiplizieren, so dass dadurch ausreichende Mengen an weiblichem Elternsaatgut erhalten werden, die sich mit einer entsprechenden männlichen Elternpflanze zur Produktion gewünschter Mengen an Hybridsaatgut kreuzen lassen.
  • Eine männlich-sterile Linie, die durch die Verwendung der Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung erhalten und multipliziert wird, lässt sich zur Produktion von Hybridsaatgut einsetzen. Im Prinzip kann dabei die männlich-sterile Linie (AS/S) direkt mit einer anderen männlichen Elternlinie (BS/S) zur Produktion von Hybridsaatgut (ABS/s) kreuzen. Da jedoch alle Hybridpflanzen männlich-steril sind, findet keine Reproduktion statt und entsteht kein Samensatz. Dies stellt kein Problem dar, falls es sich bei dem Samen nicht um das geänderte Produkt handelt (z.B. bei Salat), doch dort, wo es sich bei dem Samen um das geänderte Produkt handelt (z.B. bei Mais und Ölraps), sollte die männliche Fertilität in den Hybridpflanzen zumindest teilweise wiederhergestellt werden. Dies lässt sich dadurch bewerkstelligen, dass man die männlich-sterile Linie mit einer männlich-fertilen Elternlinie (z.B. BR/R), bei der es sich ebenso um eine Restorerlinie handelt, d.h. die ebenso ein Fertilitätsrestorergen (R) enthält, kreuzt. Die produzierten Hybride (ABS/s,R/r) sind voll männlich-fertil. Als Alternative lässt sich die männlich-sterile Linie (AS/S) zunächst mit der männlich-fertilen Linie (AS/S) unmittelbar vor der Produktion des Hybridsaatguts kreuzen. Dies hat den Vorteil, dass sich dabei eine weitere Multiplikation der weiblichen Elternlinie ergibt. Die Nachkommen (AS/S) lassen sich dann mit einer geeigneten männlich-fertilen Elternlinie (Bs/s,r/r) kreuzen, so dass Hybridsaatgut produziert wird, das 50% männlich-fertil ist. Falls Hybridsaatgut mit 100 männlicher Fertilität gewünscht wird, können die Nachkommen mit einer geeigneten männlichen Restorer-Elternlinie (Bs/s,R/R) gekreuzt werden.
  • Im Falle einer männlich-sterilen Linie, bei der die männliche Sterilität durch einen endogenen männlich-sterilen Genotyp (Am/m) an einem Männliche-Sterilität-Locus verursacht wird, lässt sich Hybridsaatgut leicht produzieren, indem die männlich-sterile Linie (Am/m) mit einer Linie, die bezüglich des endogenen dominanten (Männliche-Fertilität) Allels an diesem Männliche-Sterilität-Locus homozygot ist (BM/M), gekreuzt wird. Alle Hybridnachkommen dieser Kreuzung weisen den Genotyp ABM/m auf und sind fertil.
  • Die Maintainerpflanzen der vorliegenden Erfindung lassen sich auch als Bestäuberpflanzen (d.h. männlich-fertile Pflanzen) in einer Kreuzung mit Wildtyppflanzen (As/s,p/p) der gleichen Inzuchtlinie einsetzen. Die Nachkommenschaft dieser Kreuzung ist in ihrer Gesamtheit männlich-steril und für den männlich-sterilen Genotyp heterozygot (AS/s,p/p). Die Nachkommenschaft lässt sich daher direkt zur Produktion von Hybridsaatgut durch Kreuzung mit einer Bestäuberpflanzenlinie B (Bs/s,p/p) verwenden. Dieses Schema benötigt lediglich eine männliche Sterilisierung der Wildtyppflanzen, in dem beispielsweise die Antheren von Hand entfernt werden (z.B. bei Mais) oder indem ein männliches Gametozid verwendet wird.
  • Durch Verwendung der Maintainerpflanzen der vorliegenden Erfindung zum Erhalten einer homogenen Population von Pflanzen, die in Bezug auf ein Männliche-Sterilität-Allel (gleichgültig, ob dominant oder rezessiv), das im Kerngenom codiert ist, homozygot sind, erwerben die Maintainerpflanzen natürlich viele der Eigenschaften von Pflanzen einer zytoplasmatischen männlich-sterilen Linie. Allerdings weisen derartige Pflanzen einen der Hauptnachteile zytoplasmatischer männlich-steriler Pflanzen nicht auf, nämlich die zytoplasmatische Gleichförmigkeit der verschiedenen männlich-sterilen Linien, die bei Mais zu ernsten Problemen geführt hat (siehe Craig (1977) In „Corn and Corn Improvement", G.F. Sprague, Hrsg., American Society of Agronomy, Inc., Publisher, S. 671).
  • So lässt sich das Maintainergen der vorliegenden Erfindung, wenn es in eine bestimmte Linie einer Pflanzenspezies eingeführt wurde, immer durch Rückkreuzung in eine beliebige andere Linie einführen; da jedoch das Maintainergen nur durch ein Ei übertragen werden kann, ist es immer mit dem Zytoplasma der Linie, in die es ursprünglich eingeführt wurde, assoziiert. Da allerdings eine Maintainerpflanzenlinie lediglich zum Erhalten einer männlich-sterilen Linie und nicht als weiblicher Elternteil zur Produktion von Hybridsaatgut verwendet wird, enthält das Hybridsaatgut immer das Zytoplasma der weiblichen Elternpflanze, wie gewünscht.
  • Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Falls nicht anders angegeben, wurden alle experimentellen Verfahrensweisen zur Manipulation rekombinanter DNA nach den in Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. USA beschriebenen Standardverfahren durchgeführt. Alle Polymerasekettenreaktionen („PCR") wurden unter üblichen Bedingungen unter Verwendung der VentTM-Polymerase (Kat.-Nr. 254L-Biolabs New England, Beverley, MA 01915, U.S.A.), isoliert aus Thermococcus litoralis (Neuner et al. (1990) Arch. Microbiol. 153:205–207), durchgeführt. Oligonukleotide wurden nach den von Kramer und Fritz (1968) Methods in Enzymology 154:350 beschriebenen Methoden konstruiert und nach der Phosphoramiditmethode (Beaucage und Caruthers (1981) Tetrahedron Letters 22:1859) an einem DNA-Synthesegerät 380A von Applied Biosystems B.V., Maarssen, Niederlande synthetisiert.
  • Die folgenden Bakterienstämme und Plasmide, die in den Beispielen verwendet wurden, sind erhältlich von der deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen („DMS"), Mascheroder Weg 1B, Braunschweig, Deutschland:
    Figure 00290001
  • In den Beispielen wird auf die folgende Figur sowie das Sequenzprotokoll Bezug genommen.
  • Figur
  • 1: Zehn-Schritt-Verfahren zur Gewinnung von erfindungsgemäßen Mais (z.B. H99)-Maintainerpflanzen
  • Sequenzprotokoll
    Figure 00290002
  • Figure 00300001
  • Beispiele
  • Beispiel 1: Isolierung des pollenspezifischen Promotors des Gens Zm13 aus Mais
  • Eine pollenspezifische cDNA aus der Inzuchtlinie W-22 von Zea mays mit der Bezeichnung „Zmc13" wurde von Hanson et al. (1989) The Plant Cell 1:173 isoliert und charakterisiert. Der entsprechende genomische Klon mit der Bezeichnung „Zmg13", der wesentliche Teile des 5'-flankierenden Bereichs enthält, wurde von Hamilton et al. (1989) Sex. Plant Reprod. 2:208 isoliert und charakterisiert (siehe auch Hamilton et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:211). Die vollständige Sequenz von Zmg13 ist in SEQ ID no. 1 gezeigt, und sein Promotorbereich ist im Folgenden mit „Zm13-Promotor" bezeichnet.
  • Ein entsprechender Promotorbereich aus der Mais-Inzuchtlinie H99 wurde wie folgt isoliert. Genomische DNA der Inzuchtlinie H99 wurde wie von Dellaporta et al. (1983) Plant Mol. Biol. Reports 1:19–21 beschrieben präpariert. Mit dem Genom als Substrat wurde ein 1471 bp großes Fragment mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide MDB80 und MDB82, deren Sequenzen in SEQ ID no. 4 bzw. SEQ ID no. 6 dargestellt sind, amplifiziert. Dabei entspricht MDB80 den Nukleotiden 8 bis 28 von Zmg13, während MDB82 zu den Nukleotiden 1458 bis 1478 von Zmg13 komplementär ist. Anschließend wurde das gereinigte amplifizierte 1471 bp große Fragment als Substrat zur Amplifikation eines 1422 bp großen Fragments mittels PCR unter Verwendung der Oligonukleotide MDB80 und MDB81 verwendet. MDB81 ist komplementär zu den Nukleotiden 1409 bis 1429 von Zmg13, und seine Sequenz ist in SEQ ID no. 5 dargestellt. Durch Verwendung von MDB81 wird in dem amplifizierten 1422 bp großen Fragment am ATG-Translationsstartcodon eine NcoI-Stelle erzeugt.
  • Das 1422 bp große Fragment wird dann in eine SmaI-Stelle von pGEM2 (Promega Corporation, Madison, Wisconsin 53711, U.S.A.) ligiert, woraus sich das Plasmid pMDB13 ergibt, und das Fragment wird sequenziert (Maxam und Gilbert (1980) Meth. Enzymol. 65:499). Der pollenspezifische Promotor des Gens Zm13 der Mais-Inzuchtlinie H99 wird aus pMDB13 als EcoRV-NcoI-Fragment gewonnen.
  • Der Zm13-Promotor wird ebenso kloniert und zwar wie folgt. Genomische DNA der Linie H99 von Zea mays wird wie oben beschrieben präpariert. Mit der genomischen DNA als Substrat werden die folgenden zwei Fragmente mittels PCR amplifiziert: 1) ein 875 bp großes Fragment wird unter Verwendung der Oligonukleotide MDB80 (SEQ ID no. 4) und ZM130LI2 (das zu den Nukleotiden 859 bis 882 von Zmg13 komplementär ist und dessen Sequenz in SEQ ID no. 11 angegeben ist); und 2) ein 661 bp großes Fragment wird unter Verwendung der Oligonukleotide Zm130LI1 (das den Nukleotiden 767 bis 791 von Zmg13 entspricht und dessen Sequenz in SEQ ID no. 12 angegeben ist) und Zm130LI5 (das teilweise zu den Nukleotiden 1397 bis 1423 von Zmg13 komplementär ist und dessen Sequenz in SEQ ID no. 13 angegeben ist) amplifiziert. Das 875 bp große Fragment, das dem stromaufwärts liegenden Bereich des Zm13-Promotors entspricht, wird in die Smal-Stelle von pGEM2 kloniert, wodurch sich das Plasmid pTS204 ergibt. Das 661 bp große Fragment, das dem stromabwärts liegenden Bereich des Zm13-Promotors entspricht, wird mit NcoI verdaut und in das mit EcoRV und NcoI verdaute Plasmid pJB66 (Botterman und Zabeau (1987) DNA 6:583) kloniert, wodurch sich das Plasmid pTS203 ergibt. Beide Fragmente überlappen teilweise und besitzen im Überlappungsbereich eine gemeinsame BstXI-Stelle. Die Ligation des 567 bp großen EcoRV-BstXI-Fragments von pTS204 und des 638 bp großen BstXI-NcoI-Fragments von pTS203 führt zu einem dem Zm13-Promotor entsprechenden 1205 bp großen Fragment. Dieses 1205 bp große Fragment, wie es von der Linie H99 kloniert wurde, wird sequenziert, wobei sich herausstellt, dass seine Sequenz identisch mit dem entsprechenden Fragment von Zmg13 aus der Linie W-22, wie es in der SEQ ID no. 1 angegeben ist, ist, außer in Position 276 (G in W-22 ist T in H99), 410 (G in) W-22 ist A in H99) und 1205–1206 (GC in W-22 ist GGC in H99, was somit einer Insertion von 1 Nukleotid entspricht), wobei die Nummerierung wie die in SEQ ID no. 1 ist.
  • Beispiel 2: Konstruktion von ein Maintainergen umfassenden Pflanzentransformationsvektoren, die für Barstar unter der Kontrolle des Promotors TA29 codierende DNA und für Barnase unter der Kontrolle des Zm13-Promotors codierende DNA enthalten.
  • Das 1205 bp große EcoRV-NcoI-Fragment von pMDB13 wird mit dem großen EcoRI-SmaI-Fragment von Plasmid pVE144 und dem 739 bp großen EcoRI-NcoI-Fragment von pVE108 ligiert, wodurch sich das Plasmid pGSJVRI ergibt. Bei dem Plasmid pVE144, dessen Sequenz in SEQ ID no. 2 gezeigt ist, handelt es sich um ein von dem Plasmid pUC18 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33:103) abgeleitetes Plasmid, das für Neomycin-Phosphotransferase (neo) unter der Kontrolle des 3553-Promotors ( EP 0,359,617 ) aus dem Blumenkohlmosaikvirus-Isolat CabbB-JI (Hull und Howell (1978) Virology 86:482) codierende DNA sowie für das Barstar (Hartley (1988) J.Mol.Biol. 202:913) unter der Kontrolle des Tapetum-spezifischen Promotors des Gens TA29 aus Nicotiana tabacum ( EP 0,344,029 ; Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:3403) codierenden DNA enthält. Bei dem Plasmid pVE108, dessen Sequenz in SEQ ID no. 3 gezeigt ist, handelt es sich um ein von pUC18 abgeleitetes Plasmid, das für Phosphinothricin-Acetyltransferase (bar) ( EP 0,242,236 ) unter der Kontrolle des 35S3-Promotors codierenden DNA sowie für Barnase (Hartley (1980) supra) unter der Kontrolle des TA29-Promotors codierende DNA enthält. Bei dem resultierenden Plasmid pGSJVRI (das anschließend in „pTS210" umbenannt wird) handelt es sich um ein von pUC18 abgeleitetes Plasmid, das ein Maintainergen der vorliegenden Erfindung enthält, welches folgendes beinhaltet: für Barnase codierende DNA als Pollenletalitäts-DNA, den Zm13-Promotor als pollenspezifischen Promotor, für Barstar codierende DNA als Fertilitätsrestorer-DNA, den TA29-Promotor als Restorer-Promotor, neo als erste Markierungs-DNA und den 35S3-Promotor als ersten Markierungspromotor.
  • Ebenso wird pTS210 gewonnen, und zwar wie folgt. Das 0,9 kb große BstXI-SacI-Fragment von pTS204 wird mit dem großen BstXI-SacI-Fragment von pTS203 ligiert, wodurch sich das Plasmid pTS206 ergibt. Das 1,47 kb große BglII-NcoI-Fragment von pTS206 wird dann mit den großen NcoI-BglII-Fragment von pVE108 ligiert, wodurch sich das Plasmid pTS207 ergibt. Schließlich wird das 1,9 kb große EcoRV-EcoRI-Fragment von pTS207 mit dem großen EcoRI-SmaI-Fragment von pVE144 ligiert, wodurch sich das Plasmid pTS210 ergibt.
  • Ebenso wird ein Plasmid pTS218, das sich von pTS210 dahingehend unterscheidet, dass es das bar-Gen als selektionierbares Markierungsgen trägt, gewonnen, und zwar wie folgt:
    • – ein mit bxx bezeichnetes 255 bp großes DNA-Fragment, das die Translationsstartstelle des Gens pTA29-barstar trägt, wird mittels PCR unter Verwendung von pVE144 als Matrize sowie den Oligonukleotiden BXOL2 (SEQ ID No. 14) und TA29SBXOL2 (SEQ ID No. 15) als Primer gewonnen.
    • – ein 492 bp großes DNA-Fragment wird durch PCR mit pVE108 und bxx als Matrize sowie den Oligonukleotiden PTA290L5 (SEQ ID No. 16) und BXOL2 als Primer hergestellt. Dieses 492 bp große Fragment wird mit AsnI und BspEI verdaut, und ein 274 bp großes Fragment wird auf einem Gel gereinigt und mit dem 6,28 kb großem Fragment von pVE144, das mit BspEI verdaut und mit AsnI teilverdaut wurde, ligiert. Das resultierende Plasmid wird mit pVEK144 bezeichnet und trägt das chimärische Gen PTA29-barstar-3'nos mit einem optimierten Translationsinitiationskontext.
    • – pVEK144 wird mit MunI und HindIII verdaut, und das 3,7 kbp große Fragment wird isoliert und mit dem 1,7 kbp großen MunI-HindIII-Fragment von pVE108 ligiert, wodurch sich das Plasmid pVE144 ergibt, das die chimärischen Gene PTA29-barstar-3'nos und P35S-bar-3'nos trägt.
    • – das EcoRI-HindIII-Fragment von pVEB144, das die beiden chimärischen Gene enthält, wird mit dem großen EcoRI-HindIII-Fragment von pUCNew2 ligiert, wodurch sich das Plasmid pVEC144 ergibt. pUCNew2 leitet sich von pUC19 ab, wie in der WO 92/13956 beschrieben.
    • – Schließlich wird das große EcoRI-SmaI-Fragment von pVEC144 mit dem 1,9 bp großen EcoRV-EcoRI-Fragment von pTS207 ligiert, wodurch sich das Plasmid pTS218 ergibt.
  • Das Plasmid pTS218 trägt drei chimärische Gene, d.h. PTA29-barstar-3'nos (mit optimiertem Translationsinitiationskontext), P35S-bar-3'nos und PZM13-barnase-3'nos. Das diese drei chimärischen Gene tragende EcoRI- HindIII-Fragment von pTS218 ist im Sequenzprotokoll als SEQ ID No. 17 dargestellt.
  • Alle Vektorkonstruktionsschritte, an denen Fragmente der Barnase-DNA beteiligt sind, wie beispielsweise pVE108, pVE144 und ptS210, werden im E.coli-Stamm MC1061 durchgeführt, der das cointegrierte Plasmid R702::pMc5BS enthält, welches wie folgt gewonnen wird. Das das (für einen Inhibitor der Barnase codierende) Gen barstar unter der Kontrolle des tac-Promotors (De Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21) enthaltende Plasmid pMc5BS wird konstruiert, indem das EcoRI-HindIII-Fragment von Plasmid pNT416 (Hartley (1988) supra) in die EcoRI- und HindIII-Stellen des Plasmids pMc5-8 (DSM 4566) kloniert und danach die mit dem Initiationscodon der phoA-Signalsequenz beginnende und mit dem letzten Nukleotid vor dem Translationsstartcodon des Barstar-codierenden Bereichs endende Sequenz mittels einer „Looping-out"-Mutagenese Verfahrensweise, wie sie allgemein von Sollazo et al. (1985) Gene 37:199 beschrieben ist, deletiert wird.
  • Das Plasmid R702 stammt aus Proteus mirabilis und lässt sich in E.coli replizieren (Villarroel et al. (1983) Mol. Gen. Genet. 189:390). Das Plasmid R702::pMc5BS wird durch Cointegration über eine illegitime Rekombination zwischen pMc5BS und R702, die von auf R702 vorhandenen transponierbaren Elementen vermittelt wird (Leemans (1982) „Technieken voor het gebruik van Ti-plasmieden van Agrobacterium tumefaciens als vetoren voor de genetic engineering van planten", Ph.D. Thesis Vrije Universiteit Brussel, Brüssel, Belgien) gewonnen und hinsichtlich der induzierten Expression von Barstar überprüft.
  • Die Verwendung von E.coli (R702::pMc5BS) gestattet die Konstruktion, den Erhalt, die Amplifikation und die Reinigung von Plasmiden, die die Barnase-DNA enthalten, wie beispielsweise pGSJVRI, ohne dass dabei irgendein letaler Effekt auf Grund der unbeabsichtigten Expression der Barnase-DNA auftritt. Allerdings werden, da der Zm13-Promotor nicht in E.coli exprimiert wird, alle Vektorkonstruktionsschritte, an denen dieser Promotor beteiligt ist, ebenso im E.coli-Stamm MC1061 durchgeführt.
  • Beispiel 3: Transformation von Mais mit dem Maintainergen aus Beispiel 2
  • Zygotische unreife Embryos von etwa 0,5 bis 1 mm werden aus sich entwickelndem Samen der Mais-Inzuchtlinie H99 isoliert. Die frisch isolierten Embryos werden enzymatisch 1–2 Minuten mit einer Enzymlösung II (0,3% Macerozym (Kinki Yakult, Nishinomiya, Japan) in CPW-Salzen (Powell & Chapman (1985) „Plant Cell Culture, A Practical Approach", R.A. Dixon Hrsg., Kapitel 3) mit 10% Mannit und 5 mM 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES), pH 5,6) behandelt. Nach einer Inkubation von 1–2 Minuten in dieser Enzymlösung werden die Embryos sorgfältig mit N6aph-Lösung (Makro- und Mikroelemente des Mediums N6 (Chu et al. (1975) Sci. Sin. Peking 18:659), supplementiert mit 6 mM Asparagin, 12 mM Prolin, 1 mg/l Thiamin-HCl, 0,5 mg/l Nikotinsäure, 100 mg/l Caseinhydrolysat, 100 mg/l Inositol, 30 g/l Saccharose und 54 g/l Mannit) gewaschen. Nach dem Waschen werden die Embryos im Mais-Elektroporationspuffer, EPM-KCl (80 mM KCl, 5 mM CaCl2, 10 mM HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) und 0,425 M Mannit, pH 7,2) inkubiert. Jeweils ungefähr 100 Embryos in 200 μl EPM-KCl werden in eine Elektroporationsküvette gegeben. Pro Küvette werden etwa 20 μg einer Plasmid-DNA, nämlich mit EcoRI linearisiertes pPGSJVR1 (aus Beispiel 2), zugegeben.
  • Nach einstündiger Inkubation der DNA mit den Explantaten werden die Küvetten in ein Eisbad überführt. Nach 10 Minuten Inkubation auf Eis wird die Elektroporation durchgeführt. Ein Puls mit einer Feldstärke von 375 V/cm wird von einem 900-μF-Kondensator abgegeben. Bei der Elektroporationsapparatur handelt es sich um eine Vorrichtung, wie sie von Dekeyser et al. (1990) The Plant Cell 2:591 beschrieben ist. Unmittelbar nach der Elektroporation wird frisches flüssiges N6aph-Substrat zu den Explantaten in der Küvette gegeben, wonach die Explantate weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert werden.
  • Anschließend werden die Embryos auf das Substrat Mahl VII (Makro- und Mikroelemente sowie Vitamine des Mediums N6, supplementiert mit 100 mg/l Caseinhydrolysat, 6 mM Prolin, 0,5 g/l MES, 1 mg/l 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) sowie 2a Saccharose, verfestigt mit 0,75 g/l MgCl2 und 1,6 g/l Phytagel (Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo. U.S.A.), pH 5,8) und mit 0,2 M Mannit supplementiert. Nach 3 Tagen werden die Embryos auf das gleiche Substrat, supplementiert mit 200 mg/l Kanamycin, übertragen. Nach ungefähr 14 Tagen werden die Embryos auf das Substrat Mahl VII ohne Mannit, supplementiert mit Kanamycin, übertragen. Die Embryos werden weiter ungefähr 2 Monate lang mit Subkultivierungsintervallen von etwa 3 Wochen auf diesem selektiven Substrat subkultiviert. Das induzierte embryogene Gewebe wird vorsichtig isoliert und auf MS-Medium (Murashige und Skoog (1962) Physiol. Plant 15:473), supplementiert mit 5 mg/l 6-Benzylaminopurin für die Linie H99, übertragen. Das embryogene Gewebe wird auf diesem Medium ungefähr 14 Tage lang gehalten und anschließend auf MS-Medium ohne Hormone und mit 6% Saccharose für die Linie H99 übertragen. Sich entwickelnde Schößlinge werden zur weiteren Entwicklung zu normalen Pflänzchen auf ½ MS-Medium mit 1,5% Saccharose übertragen. Diese Pflänzchen werden auf Erde übertragen und im Gewächshaus kultiviert.
  • Auf analoge Weise werden Maisembryos mit einem Fragment der pTS218-DNA, das das Maintainergen und das chimärische P35S-bar-3'nos enthält und das durch Verdauung des Plasmids mit EcoRI, XhoI und PstI sowie durch Aufreinigung des längsten Fragments erhalten wird, transformiert. Die Transformation und Pflanzenregeneration erfolgt wie in Beispiel 5 beschrieben.
  • Beispiel 4: Analyse der transgenen Maispflanzen aus Beispiel 3
  • Mit pGSJVRI transformierte Pflanzen aus Beispiel 3 werden auf das Vorhandensein des Maintainergens mittels PCR analysiert. Dabei wird DNA gemäß dem von Dellaporta et al. (1983) Plant Mol. Biol. Reporter 1:19 beschriebenen und an die Anwendung auf Gewebemengen von etwa 10 bis 20 mg angepassten Protokoll präpariert. Für jede Pflanze wird eine solche Menge an Gewebe in Extraktionspuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen mazeriert. Repräsentative Fragmente des Maintainergens werden unter Verwendung entsprechender Oligonukleotidsonden amplifiziert.
  • Die Aktivität des Expressionsprodukts des ersten Markierungsgens (d.h. Neomycin-phosphotransferase II (NPTII)) wird in den Pflanzen wie folgt getestet. Rohextrakte werden durch Zermahlen von Pflanzengewebe in Extraktionspuffer hergestellt (McDonnell et al. (1987) Plant Molecular Biol. Reporter 5:380). Anschließend werden die Extrakte einer nichtdenaturierenden Polyacrylamidgelelektrophorese gemäß der von Reiss et al. (1984) Gene 30:211 beschriebenen Verfahrensweise unterzogen. Danach wird die NPTII-Aktivität durch in-situ-Phosphorylierung von Kanamycin unter Verwendung von [gamma-32P]ATP als Substrat in einem Test analysiert (McDonnell et al. (1987) supra).
  • Diejenigen Pflanzen, die sich als positiv sowohl in der PCR als auch dem NPTII-Test erweisen, werden weiter mittels einer Southern-Hybridisierung analysiert. Dabei wird genomische DNA aus Pflanzengewebe gemäß dem von Dellaporta et al. (1983) supra beschriebenen Protokoll, das um eine Behandlung mit RNase zur Entfernung verbliebener RNA ergänzt ist, präpariert. Dabei wird eine nichttransformierte H99-Pflanze als Kontrolle verwendet. Proben der DNA werden mit entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut und einer horizontalen Agaroseelektrophorese unterzogen. Der Southern-Transfer auf Hybond N+ (Amersham International PLC, Amersham, Großbritannien)-Membranen mittels des Protokolls für „Alkali-Blotting von DNA" sowie die nachfolgende Hybridisierung werden wie vom Hersteller empfohlen (Amersham Hybond-N+-Broschüre) durchgeführt. Geeignete radioaktive Sonden werden mit dem Multi-Prime-DNA-Labellingkit (Amersham) gemäß dem vom Hersteller mitgelieferten Protokoll, das sich von veröffentlichten Verfahrensweisen ableitet (Feinberg und Vogelstein (1983) Anal. Biochem. 132:6) hergestellt. Die Bandenmuster zeigen, dass zumindest das Maintainergen in die genomische Pflanzen-DNA integriert ist.
  • Die PCR-Tests zeigen, dass das Maintainergen vorhanden ist. Die NPTII-Tests zeigen, dass die erste Markierungs-DNA exprimiert wird. Die reifen transformierten Pflanzen lassen sich dann phänotypisch analysieren, um zu sehen, ob die Barstar-DNA in Tapetumzellen exprimiert und das Barnase-Gen in Pollenzellen exprimiert wird. Die Expression von Barstar wird durch Northern-Blotting von Antheren-mRNA und durch Durchführen von Testkreuzungen zur Bestimmung der Wiederherstellung in der Nachkommenschaft bestimmt. Die Expression des Pollenletalitätsgens wird durch zytologische Untersuchung der Antheren bestimmt. Diesbezüglich wird lebensfähiger und nichtlebensfähiger reifer Pollen bestimmt, indem die Anfärbung von isoliertem Pollen nach 30 minütiger Inkubation bei 24°C im folgenden Reaktionsgemisch analysiert wird: 100 mM Phosphatpuffer pH 7,8, 100 mM Natriumsuccinat und 1 mM NitroBlue-Tetrazolium, mit anschließender optischer Inspektion der Formazanprezipitation bei lebensfähigem Pollen. Alternative Techniken zur Unterscheidung zwischen lebensfähigem und nichtlebensfähigem reifem Pollen sind beispielsweise die von Alexander (1969) Stain Technology 44:117 und von Heslop-Harrison und Heslop-Harrison (1970) Stain Technology 45:115 beschriebenen Techniken. Die Lebensfähigkeit der Mikrosporen wird bestimmt, indem Blütenknospen auf unterschiedlichen Entwicklungsstufen in Kunststoff eingebettet und einer histochemischen Anfärbung mit dem Succinatdehydrogenase-Test unterzogen werden, wobei beide Techniken wie von De Block und Debrouwer (1992) The Plant Journal 2:261 durchgeführt werden.
  • Schließlich wird die Nachkommenschaft der mit dem Pollenletalitätsgen transformierten Pflanze bestimmt. Keine der Nachkommen, die sich aus einer Kreuzung, bei der diese Pflanze als männliche Elternpflanze verwendet wird, ergeben, besitzen dieses Gen, während 50% der Nachkommen, die sich aus einer Kreuzung, bei der diese Pflanze als weibliche Elternpflanze verwendet wird, ergeben, das Gen besitzen.
  • Pflanzen aus Beispiel 3, die mit pTS218-DNA transformiert wurden, werden auf die gleiche Weise analysiert, außer dass das Expressionsprodukt des ersten Markierungsgens, d.h. Phosphinothricin-acetyltransferase, mittels eines wie in Beispiel 5 beschriebenen PAT-Tests getestet wird.
  • Beispiel 5: Herstellung männlich-steriler Maispflanzen
  • Zygotische Embryos der Mais-Inzuchtlinie H99 wurden wie in Beispiel 3 beschrieben isoliert, enzymatisch behandelt, gewaschen und in Elektroporationspuffer aufgetragen. Jeweils etwa 100 Embryos wurden in 200 μl EPM-RCl in die Elekroporationsküvette gegeben. Pro Küvette wurden etwa 20 μg einer Plasmid-DNA, nämlich mit HindIII linearisiertes pVE108, zugegeben. Bei pVE108 handelt es sich um ein 5620 bp großes Plasmid, das folgendes enthält: ein chimärisches Gen, das die bar-DNA umfasst ( EP 242236 ), für Phosphinothrizinacetyltransferase (PAT) codiert und Resistenz gegenüber einem Glutaminsynthetase-Inhibitorherbizid, wie beispielsweise Phosphinothrizin (PPT) verleiht, unter der Kontrolle des 35S3-Promotors; sowie ein weiteres chimärisches Gen, das die für Barnase (Hartley (1988) supra) codierende DNA unter Kontrolle des Tapetum-spezifischen Promotors des TA29-Gens ( EP 344029 ) aus N. tabacum umfasst. Die vollständige Sequenz des Plasmids pVE108 ist in SEQ ID no. 4 angegeben. Alle Vektorkonstruktionen, an denen DNA-Fragmente, die das Barnase-Gen umfassen, beteiligt sind, wurden im E.coli-Stamm MC1061, der das Plasmid R702::pMc5BS aus Beispiel 3 enthält, durchgeführt. Nach einer einstündigen Inkubation der DNA mit den Explantaten wurden die Küvetten in ein Eisbad überführt. Nach 10 minütiger Inkubation auf Eis wurde die Elektroporation wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Unmittelbar nach der Elektroporation wurden die Explantate in der Küvette mit frischem flüssigem N6aph-Substrat versetzt, wonach sie weitere 10 Minuten auf Eis inkubiert wurden.
  • Anschließend wurden die Embryos von einem Elektroporationsexperiment auf das Substrat Mahl VII, supplementiert mit 0,2 M Mannit und 2 mg/l PPT, übertragen. Nach ungefähr 14 Tagen wurden die Embryos auf das Substrat Mh1 VII (Substrat Mahl VII aus Beispiel 3, jedoch ohne Prolin und Caseinhydrolysat), supplementiert mit 2 mg/l PPT, jedoch ohne Mannit, übertragen. Nach ungefähr 4 Wochen wurden die Embryos einen weiteren Monat lang auf Substrat Mh1 VII supplementiert, mit 10 mg/l PPT subkultiviert. Das induzierte embryogene Gewebe wurde vorsichtig isoliert und auf MS-Medium, supplementiert mit 5 mg/l 6-Benzylaminopurin übertragen. Das embryogene Gewebe wurde auf diesem Medium ungefähr 14 Tage lang gehalten und anschließend auf MS-Medium ohne Hormone und Saccharose übertragen. Sich entwickelnde Schößlinge wurden auf ½ MS-Medium mit 1,5% Saccharose zur weiteren Entwicklung zu normalen Pflänzchen übertragen. Diese Pflänzchen überlebten ein in-vitro-Sprühen mit 2 l/ha entsprechenden Dosen von BASTAR (Hoechst AG, Frankfurt am Main, Deutschland). Diese Pflänzchen wurden dann in Erde übertragen und im Gewächshaus kultiviert, wobei zwei der transformierten Pflänzchen mit der Bezeichnung RZM35-1 und RZM35-18 weiter charakterisiert wurden.
  • Die Embryos von einem zweiten Elektroporationsexperiment wurden auf Substrat Mahl VII, supplementiert mit 2 mg/l PPT und 0,2 M Mannit, übertragen. Nach etwa 14 Tagen wurden die Embryos auf Substrat Mh1 VII, supplementiert mit 2 mg/l PPT, jedoch ohne Mannit, übertragen. Nach weiteren ungefähr 3 Wochen wurden die Embryos auf Substrat Mh1 VII, supplementiert mit 10 mg/l PPT, jedoch ohne Mannit, übertragen. Nach weiteren 3 Wochen wurde das induzierte embryogene Gewebe vorsichtig isoliert und auf MS-Medium, supplementiert mit 2 mg/l PPT und 5 mg/l 6-Benzyaminopurin, übertragen. Das embryogene Gewebe wurde auf diesem Medium ungefähr 14 Tage lang gehalten und anschließend auf MS-Medium ohne Hormone, Saccharose oder PPT übertragen. Sich entwickelnde Schößlinge wurden auf ½ MS-Medium mit 1,5% Saccharose zur weiteren Entwicklung zu normalen Pflänzchen übertragen. Die resultierenden Pflänzchen wurden in Erde übertragen und im Gewächshaus kultiviert, und drei der transformierten Pflänzchen mit der Bezeichnung RZM34-1, RZM34-12 bzw. RZM34-14 wurden weiter charakterisiert.
  • RZM34-1, RZM34-12, RZM34-14, RZM35-1 und RZM35-18 wurden im Gewächshaus angezogen. Die Aktivität des Expressionsprodukts des bar-Gens in Blättern der Pflanzen wurde wie folgt in einem „PAT-Test" getestet. Jeweils 100 mg Blattgewebe von jeder Pflanze wurden zusammen mit 50 mg säurebehandeltem Seesand (Merck, Darmstadt, Deutschland) und 5 mg Polyvinylpolypyrolidon (PVPP) in einem Eppendorfröhrchen mit einem Glasstab in 50 μl Expressionspuffer (25 mM Tris-HCL pH 7,5, 1 mM Na2-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäuredinatriumsalz) 0,15 mg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,3 mg/ml Dithiothreitol (DTT) und 0,3 mg/ml Rinderserumalbumin) zermahlen. Der Extrakt wurde in einer Mikrozentrifuge 5 Minuten bei 16000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde gewonnen und zehnfach mit TE 25/1 (25 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM Na2-EDTA verdünnt. Danach wurde zu 12 μl des verdünnten Extrakts folgendes zugegeben: 1 μl 1 mM PPT in TE 25/1, 1 μl 2 mM AcetylCoenzym A in TE 25/1 und 2 μl [14C]AcetylCoenzym A (60 mCi/mmol, 0,02 mCi/ml, [NEN Research Products, Dupont, Wilmington, Delaware, USA). Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 37°C inkubiert und auf eine Silikagel-60-tlc-Aluminiumplatte mit Konzentrationszone (Merck) punktförmig aufgetragen. Es wurde eine aufsteigende Chromatographie in einem 3:2-Gemisch aus 1-Propanol und NH4OH (25% NH3) durchgeführt. 14C wurde durch Autoradiographie über Nacht sichtbar gemacht (XAR-5 Kodak-Film). Die Toleranz gegenüber dem Herbizid BASTAR wurde getestet, indem eine kleine Zone nahe der Spitze eines Blatts pro Pflanze mit einer 1%igen Lösung des Herbizids bepinselt wurde und die Anzeichen für eine Schädigung auf und in der Nähe der bepinselten Stellen beobachtet wurden. Während RZM34-1, RZM35-1 und RZM35-18 gar keine Anzeichen für eine Schädigung zeigten, zeigten RZM34-12 und RZM34-14 eine leichte Braunfärbung und ein Austrocknen der bepinselten Stelle. Ebenso konnte gezeigt werden, dass RZM34-1, RZM34-12, RZM34-14, RZM35-1 und RZM35-18 männlich-steril, ansonsten jedoch phänotypisch vollkommen normal waren; beispielsweise war die weibliche Fertilität normal. Die Ährchen der männlichen Blüten wiesen etwa die normale Länge auf, waren jedoch sehr dünn und schienen leer zu sein und öffneten sich überhaupt nicht. Eine ausführliche Analyse zeigte, dass die Antheren zu fast mikroskopischen Strukturen reduziert waren. Dieser Phenotyp deutet nicht nur darauf hin, dass zumindest eine Kopie des Barnase-Gens exprimiert wurde, sondern dass es selektiv in einigen oder allen Geweben der Antheren exprimiert wurde.
  • Eine Southern-Analyse zeigte, dass RZM35-1 und RZM35-18 ein identisches Integrationsmuster aufweisen, wobei nur eine Kopie des Plasmids pVE108 im Genom jeder Pflanze vorhanden ist. Ein kleiner Teil der Plasmid-DNA-Sequenz in Nachbarschaft zur HindIII-Stelle (verwendet für die Linearisierung vor der Elektroporation) schien in der integrierten Kopie zu fehlen. Eine Southern-Analyse von RZM34-1, RZM34-12 und RZM34-14 zeigte, dass jede dieser Pflanzen wahrscheinlich zwei oder drei Kopien eines Teils von oder des gesamten pVE108 integriert in ihrem Genom aufweist. Die Kopien sind höchstwahrscheinlich nicht in einer konkatemeren Konfiguration inseriert.
  • Die Transformanten RZM35-1 und RZM34-1 wurden mit Pollen aus einer nichttransformierten H99-Pflanze bestäubt und Nachkommenpflänzchen gewonnen. Von den aus RZM35-1 gewonnenen 35 Pflänzchen erzielten 16 (46%) ein positives Ergebnis in einem PAT-Test, während 19 (54%) Pat-negativ waren. Dieser Anteil an der F1-Nachkommenschaft unterscheidet sich nicht signifikant von dem unter einer normalen mendelschen Trennung einer aktiven Kopie des chimärischen bar-Gens (X2 = 0,26) erwarteten Verhältnis von 1:1.
  • Von den aus RZM34-1 gewonnenen 34 Pflänzchen erzielten 19 (56%) ein positives Ergebnis in einem PAT-Test, während 15 (44%) PAT-negativ waren. Dieser Anteil an der F1-Nachkommenschaft unterscheidet sich nicht signifikant von den unter einer normalen Mendelschen Trennung erwarteten Verhältnis von 1:1, unter der Annahme, dass die transformierte weibliche Elternpflanze nur eine aktive Kopie oder alternativ mehrere aktive, jedoch eng verknüpfte Kopien des chimärischen bar-Gens aufwies (X2 = 0,47).
  • Beispiel 6: Herstellung von Restorer-Maispflanzen
  • Zygotische Embryos der Mais-Inzuchtlinie H99 wurden wie in Beispiel 5 beschrieben isoliert, enzymatisch behandelt, gewaschen und in Elektroporationspuffer aufgetragen. Jeweils etwa 100 Embryos in 200 μl EPM-KCl wurden in eine Elektroporationsküvette gegeben. Pro Küvette wurden etwa 20 μg einer Plasmid-DNA, nämlich mit HindIII linearisiertes pVE144, zugegeben. Bei pVE144 handelt es sich um ein 6555 bp großes Plasmid, das in Beispiel 2 beschrieben wurde.
  • Die Embryos wurden elektroporiert und die transformierten Zellen selektioniert, zu Callus angezogen und wie in Beispiel 3 beschrieben regeneriert. Transgene Pflanzen wurden auf das Vorhandensein des Fertilitätsrestorergens und des Markierungsgens mittels Southern-Hybridisierung und PCR analysiert. Die Expression des Fertilitätsrestorergens wird mittels Northern-Blotting getestet und die Expression des Markierungsgens mittels NPTII-Test, wie in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt.
  • Beispiel 7: Herstellung von Maintainer-Maispflanzen und einer männlich-sterilen Maislinie sowie Erhalt der männlich-sterilen Maislinie
  • Maintainerpflanzen der vorliegenden Erfindung der Maislinie H99 werden wie in 1 skizziert gewonnen. Eine Pflanze der Mais-Inzuchtlinie H99 mit dem männlich-sterilen Genotyp H99S/s,r/r,p/p, die mit dem Männliche-Sterilität-Gen aus Beispiel 5 transformiert ist, wird mit mit dem Fertilitätsrestorergen aus Beispiel 6 transformierten Pflanzen mit dem Genotyp H99s/s,R/r,p/p gekreuzt. Die Nachkommenschaft, die den Genotyp H99S/s,R/r,p/p aufweist, wird durch PCR-Analyse auf das Vorhandensein der Gene S und R identifiziert. Diese Pflanzen werden geselbstet, was eine Nachkommenschaft mit neun unterschiedlichen Genotypen ergibt. Zwei dieser Genotypen (H99S/S,r/r und H99S/s,r/r) entwickeln sich zu männlich-sterilen Pflanzen, während alle anderen Genotypen sich zu männlich-fertilen Pflanzen entwickeln. Werden diese männlich-fertilen Pflanzen geselbstet, so gestattet die Analyse der Nachkommenschaft die Identifizierung ihres Genotyps. Somit würde: a) die Nachkommenschaft der Selbstungen von H99S/S,R/R H99S/s,R/R, H99s/s,R/R, H99s/s,R/r, und H99s/s,r/r sich allesamt zu männlich-fertilen Pflanzen entwickeln; b) Selbstungen von H99S/s,R/r-Pflanzen Nachkommenschaft produzieren, von der 13 von 16 männlich-fertil wären und, da das Männliche-Sterilität-Gen mit dem Herbizidresistenzgen bar verknüpft ist, 4 der 13 männlich-fertilen Pflanzen empfindlich gegenüber dem Herbizid BASTAR wären; und c) Selbstungen von H99S/S,R/r-Pflanzen Nachkommenschaft produzieren, bei der 12 von 16 fertil (4 von 16 hätten den Genotyp H99S/S,R/R und 8 von 16 hätten den Genotyp H99S/S,R/r), alle gegenüber dem Herbizid resistent wären und deren männlich-sterile Nachkommenschaft (4 von 16) alle für das Männliche-Sterilität-Gen homozygot wären (H99S/S,r/r).
  • Die homozygote männlich-sterile Nachkommenschaft (H99S/S,r/r) der Selbstung (c) wird dann mit ihren männlich-fertilen Geschwistern gekreuzt, und nur dann, wenn die Kreuzung mit Pflanzen des Genotyps H99S/S,R/r durchgeführt wird, sind 50% der resultierenden Pflanzen männlich-steril (alle mit dem GenotypH99S/S,r/r) und 50% männlich-fertil (alle mit dem GenotypH99S/S,R/r). Tatsächlich würde die alternative Kreuzung zwischen H99S/S,r/r und H99S/S,R/R 100% männlich-fertile Nachkommenpflanzen ergeben.
  • Maintainerpflanzen werden durch Kreuzen der Pflanze mit dem Genotyp H99S/s,R/r,p/p mit einer Pflanze, die für das Maintainergen aus Beispiel 2 heterozygot ist, d.h. (H99s/s,r/r,P/p), wobei die letztere Pflanze als die weibliche Elternpflanze verwendet wird, selektioniert. Die Nachkommen mit dem Genotyp H99S/s,r/r,P/p werden mittels durch PCR-Analyse der Nachkommenschaft (die sich leicht durch PCR und Southern-Blotting hinsichtlich des Vorhandenseins der Gene S und P und der Abwesenheit des Gens R identifizieren lässt) ergänzter Testkreuzungen selektioniert. Die selektionierten fertilen Nachkommen werden dann geselbstet. Einer von acht Nachkommen weist den gewünschten Genotyp für eine Maintainerpflanze der vorliegenden Erfindung auf (H99S/S,P/p) und lässt sich weiter mittels Testkreuzungen und PCR-Analyse der Nachkommenschaft selektionieren. Tatsächlich produzieren nur Pflanzen mit diesem Genotyp 50% männlich-sterile Nachkommen (alle H99S/S,p/p) und 50% männlich-fertile Nachkommen (alle H99S/S,P/p), so dass sie gleichzeitig zu sowohl der gewünschten homozygoten männlich-sterilen Linie als auch der Maintainerlinie der vorliegenden Erfindung angezogen werden. Testkreuzungen umfassen ebenso die Bestäubung von Wildtyp-H99-Pflanzen mit Pollen der aus der Selbstung von H99S/s,P/p-Pflanzen gewonnenen Nachkommenpflanzen.
  • Homozygote männlich-sterile Pflanzen mit dem Genotyp H99S/S,r/r,p/p werden dann von Maintainerpflanzen (H99S/S,r/r,P/p) der vorliegenden Erfindung bestäubt. Die gesamte Nachkommenschaft weist den Genotyp H99S/S,r/r,p/p auf, so dass die männlich-sterile Linie wie gewünscht erhalten wird.
  • Beispiel 8: Einführung des Männliche-Sterilität-Gens und des Maintainergens in Mais-Inzuchtlinien durch klassische Züchtung
  • Das Männliche-Sterilität-Gen aus Beispiel 5 sowie das Maintainergen aus Beispiel 2 werden von der Mais-Inzuchtlinie H99 auf eine andere Mais-Inzuchtlinie (A) durch wiederholte Rückkreuzungen wie folgt übertragen. Die Maintainerpflanze H99S/S,P/p wird als weibliche Elternpflanze mit einer nichttransformierten Pflanze der Linie A (As/s,p/p) gekreuzt. Die Nachkommen mit dem Genotyp A-H99S/s,P/p werden durch Screening unter Verwendung von PCR auf das Vorhandensein sowohl des Maintainergens (P) als auch des Männliche-Sterilität-Gens (S) selektioniert. Diese Pflanzen werden dann wiederum als weibliche Elternpflanzen mit As/s,p/p-Pflanzen gekreuzt, wobei diejenigen Nachkommen, die sowohl für das P- als auch das S-Gen heterozygot sind, wiederum mit PCR selektioniert werden. Dieser Rückkreuzungsvorgang wird so lange wiederholt, bis schließlich Pflanzen mit dem Genotyp AS/s,P/p gewonnen werden. Diese Pflanzen werden dann geselbstet und die Nachkommenschaft auf die gleiche Weise wie in Beispiel 7 beschrieben analysiert. Auf diese Weise werden männlich-sterile Pflanzen mit dem Genotyp AS/s,p/p sowie Maintainerpflanzen der vorliegenden Erfindung mit dem Genotyp AS/S,P/p gewonnen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • 1
    • 1. Aktion: Transformation von Maisembryos (z.B. H99) mit Männliche-Sterilität-Gen S, verknüpft mit Herbizidresistenzgen bar (Beispiel 5) Ergebnis: Transformierte Pflanzen mit Genotyp S/s
    • 2. Aktion: Transformation von Maisembryos (z.B. H99) mit Fertilitätsrestorergen R (Beispiel 6) Ergebnis: Transformierte Pflanzen mit Genotyp R/r
    • 3. Aktion: Transformation von Maisembryos (z.B. H99) mit Maintainergen P (Beispiel 3) Ergebnis: Transformierte Pflanzen mit Genotyp P/p
    • 4. Aktion: Kreuzung von S/s,r/r × s/s,R/r. Selektion der Nachkommen auf Vorhandensein beider Gene S und R mittels PCR. Ergebnis: Pflanzen mit Genotyp S/s,R/r
    • 5. Aktion: Selbstung selektionierter Pflanzen aus 4 (optional) Ergebnis: Nachkommenpflanzen mit 9 unterschiedlichen Genotypen
      Figure 00890001
      .. männlich-sterile Pflanzen
    • 6. Aktion: Selbstung männlich-fertiler Nachkommenpflanzen aus 5 (optional) Ergebnis 6.1. Selbstung von S/S,R/R : 100% männlich-fertile Pflanzen Selbstung von S/s,R/R : 100% männlich-fertile Pflanzen Selbstung von s/s,R/R : 100% männlich-fertile Pflanzen Selbstung von s/s,R/r : 100% männlich-fertile Pflanzen Selbstung von s/s,r/r : 100% männlich-fertile Pflanzen 6.2 Selbstung von S/s,R/r : Gleiche Nachkommenschaft wie in 5 13/16 männlich-fertile Pflanzen mit 4/13 herbizidempfindlichen Pflanzen 6.3 Selbstung von S/S,R/r : Nachkommenschaft wie folgt:
      Figure 00890002
      .. männlich-sterile Pflanzen Somit: ¾ männlich-fertile Pflanzen, 0% herbizidempfindlich. Alle männlich-sterilen Pflanzen sind vom Genotyp S/S,r/r
    • 7. Aktion: Kreuzung ♀: P/p (von 3) × ♂: S/s,R/r (von 4) dies entspricht tatsächlich ♀: s/s,r/r,P/p × ♂: S/s,R/r,p/p Ergebnis: Nachkommenschaft mit den folgenden Genotypen
      Figure 00900001
    • 8. Aktion: Von den Nachkommen aus 7 Pflanzen mit Genotyp S/s,r/r,P/p durch Screening mittels PCR und/oder Southern-Blotting auf Vorhandensein des Gens S und P und Abwesenheit des Gens R selektionieren. Ergebnis: Pflanzen mit Genotyp S/s,P/p
    • 9. Aktion: Selbstung von Pflanzen mit Geotyp S/s,P/p (von 8) Ergebnis: Nachkommenschaft mit den folgenden Genotypen
      Figure 00910001
      .. männlich-sterile Pflanzen Grau unterlegte Genotypen können sich nicht entwickeln Gameten (Pollen) durch Expression des Maintainergens P abgetötet werden.
    • 10. Aktion: Selbstung männlich-fertiler Pflanzen aus 9 Ergebnis: 10.1. Selbstung von s/s,P/p : 100 % männlich-fertile Pflanzen Selbstung von s/s,p/p : 100 % männlich-fertile Pflanzen 10.2 Selbstung von S/s,P/p : Gleiche Nachkommenschaft wie in 9 5/8 männlich-fertile Pflanzen mit 2/5 herbizidempfindlichen Pflanzen 10.3 Selbstung von S/S,P/p : Nachkommenschaft wie folgt
      Figure 00910002
      .. männlich-fertile Pflanzen Grau unterlegte Genotypen können sich nicht entwickeln, da männliche Gameten (Pollen) durch Expression des Maintainergens P abgetötet werden.
  • ENDERGEBNIS
    • – ½ männlich-fertile Pflanzen, 0% herbizidempfindlich. Alle diese Pflanzen sind Maintainerpflanzen
    • – ½ männlich-sterile Pflanzen. Alle homozygot für das Männliche-Sterilität-Gen S.

Claims (21)

  1. Die Zelle einer Maintainerpflanze, deren nukleäres Genom folgendes enthält: 1) an einem ersten Locus, einen männlich-sterilen Genotyp in homozygotem Zustand; und 2) an einem zweiten Locus ein Maintainergen in heterozygotem Zustand; wobei die besagten Loci vorzugsweise unverknüpft sind; und es sich bei dem besagten Maintainergen um eine fremde DNA-Sequenz, vorzugsweise eine fremde chimärische DNA-Sequenz, handelt, einschließlich: a) ein Fertilitätsrestorergen, welches folgendes enthält: i) eine Fertilitätsrestorer-DNA, welche ein/e Restorer-RNA und/oder -Protein oder Polypeptid codiert, die/das, wenn sie/es in den Zellen, vorzugsweise den Staubblattzellen, der besagten Pflanze produziert oder überproduziert wird, die phänotypische Expression des besagten nukleären männlich-sterilen Genotyps verhindert, der die besagte Pflanze in Abwesenheit der/des besagten Restorer-RNA, -Proteins oder Polypeptids männlich steril machen würde; und ii) einen Restorer-Promotor, welcher geeignet ist, die Expression der besagten Fertilitätsrestorer-DNA in zumindest den besagten Zellen, vorzugsweise in den besagten Staubblattzellen, zu steuern, so dass die phänotypische Expression des besagten nukleären männlich-sterilen Genotyps verhindert wird, wobei sich die besagte Fertilitätsrestorer-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des besagten Restorer-Promotors befindet; und b) ein Pollenletalitätsgen, das in den Mikrosporen und/oder Pollen der besagten Pflanze selektiv exprimiert wird, um die Produktion von bestäubungsfähigem Pollen zu verhindern und welches folgendes beinhaltet: iii) eine Pollenletalitäts-DNA, die für ein/e pollenletale/s RNA und/oder Protein oder Polypeptid codiert, welche/s, wenn sie/es in den besagten Mikrosporen und/oder Pollen produziert oder überproduziert wird, deren Stoffwechsel, Funktionsfähigkeit und/oder Entwicklung erheblich beeinträchtigt und v) Einen pollenspezifischen Promotor, der geeignet ist, die Expression der besagten Pollenletalitäts-DNA selektiv in den besagten Mikrosporen und/oder Pollen zu steuern, wobei sich die besagte Pollenletalitäts-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter Kontrolle des besagten pollenspezifischen Promotors befindet.
  2. Die Zelle von Anspruch 1, in der das besagte Maintainergen, vorzugsweise am zweiten Locus, auch ein erstes Markierungsgen enthält, welches folgendes beinhaltet: v) eine erste Markierungs-DNA, die eine erste Markierungs-RNA, ein erstes Markierungs-Protein oder -Polypeptid codiert, welches, wenn es zumindest in einem ersten spezifischen Gewebe oder spezifischen Zellen der besagten Pflanze enthalten ist, die besagte Pflanze leicht von anderen Pflanzen unterscheidbar macht, die nicht die besagte erste Markierungs-RNA, das erste Markierungs-Protein oder -Polypeptid zumindest in dem besagten ersten spezifischen Gewebe oder spezifischen Zellen enthalten und, vi) einen ersten Markierungs-Promotor, der geeignet ist, die Expression der besagten ersten Markierungs-DNA zumindest in dem besagten spezifischen Gewebe oder spezifischen Zellen zu steuern, wobei sich die besagte erste Markierungs-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des besagten ersten Markierungs-Promotors befindet.
  3. Die Zelle von Anspruch 1 oder 2, wobei der besagte männlich-sterile Genotyp der besagten Pflanze fremd ist und es sich um ein Männliches-Sterilitäts-Gen handelt, das aus einer fremden DNA-Sequenz besteht, vorzugsweise aus einer fremden chimärischen DNA-Sequenz, die folgendes enthält: 1) eine Männliche-Sterilitäts-DNA, welche ein/e Sterilitäts-RNA, und/oder -Protein oder Polypeptid codiert, die/das, wenn sie/es in den Zellen, vorzugsweise den Staubblattzellen, der besagten Pflanze in Abwesenheit des/der besagten Restorer-DNA, Proteins oder Polypeptids produziert oder überproduziert wird, Stoffwechsel, Funktionsfähigkeit und/oder Entwicklung der besagten Staubblattzellen erheblich beeinträchtigt und 2) einen Sterilitätspromotor, der geeignet ist, die Expression der besagten Männlichen-Sterilitäts-DNA selektiv in den besagten Staubblattzellen zu steuern, wobei sich die besagte Männliche-Sterilitäts-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des besagten Sterilitätspromotors befindet.
  4. Die Zelle von Anspruch 3, in der der besagte männlich-sterile Genotyp, vorzugsweise am ersten Locus, auch ein zweites Markierungsgen enthält, welches folgendes beinhaltet: 3) eine zweite Markierungs-DNA, welche ein/e zweite/s Markierungs-RNA, und/oder Protein oder Polypeptid codiert, durch welche/s die besagte Pflanze, wenn sie/es in mindestens einem zweiten spezifischen Gewebe oder in spezifischen Zellen vorkommt, leicht von anderen Pflanzen zu unterscheiden ist, die nicht die/das besagte zweite Markierungs-RNA, -Protein oder Polypeptid in mindestens dem besagten zweiten spezifischen Gewebe oder in spezifischen Zellen enthalten und 4) einen zweiten Markierungs-Promotor, der geeignet ist, die Expression der besagten zweiten Markierungs-DNA zumindest in das besagte spezifische Gewebe oder spezifische Zellen zu leiten, wobei sich die zweite Markierungs-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit und unter der Kontrolle des zweiten Markierungs-Promotor befindet.
  5. Die Zelle von Anspruch 3 oder 4, wobei die besagte Männliche-Sterilitäts-DNA Barnase codiert.
  6. Die Zelle eines der Ansprüche 3 bis 5, wobei der besagte Sterilitätspromotor aus dem TA29-Promotor von Nicotiana Tabacum oder den Promotoren mit den SEQ ID Nummern 7 bis 10 ausgewählt ist.
  7. Die Zelle von Anspruch 5 oder 6, wobei die besagte Restorer-DNA Barstar codiert.
  8. Die Zelle von einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der besagte Restorerpromotor aus dem TA29-Promotor von Nicotiana Tabacum oder den Promotoren mit den SEQ ID Nummern 7 bis 10 ausgewählt ist.
  9. Die Zelle von Anspruch 1 oder 2, wobei der besagte Männliche-Sterilitäts-Genotyp endogen von der besagten Pflanze produziert wird und für ein rezessives Allel homozygot ist.
  10. Die Zelle von Anspruch 9, in der das besagte Fertilitätsrestorergen das dominante Allel des endogenen männlich-sterilen Genotyps ist, vorzugsweise unter der Kontrolle seines natürlichen Promoters.
  11. Die Zelle eines der Ansprüche 1 bis 10, in der die besagte Pollenletalitäts-DNA eine Ribonuklease codiert, vorzugsweise RNAseT1 oder Barnase.
  12. Die Zelle eines der Ansprüche von 1 bis 11, in der es sich bei dem besagten pollenspezifischen Promotor um den Zm13-Promotor mit der SEQ ID Nummer 1 handelt.
  13. Die Zelle eines der Ansprüche von 2 bis 12, in der die besagte erste oder die besagte zweite Markierungs-DNA einer der folgenden Beschreibungen entspricht: ein Herbizid-Resistenzgen, insbesondere ein sfr oder sfrv-Gen; ein Gen, das ein modifiziertes Zielenzym für ein Herbizid mit verringerter Affinität für das Herbizid codiert, insbesondere eine modifizierte 5-Enolpyruvylshikimate-3-Phosphat-Synthase als Zielenzym für Glyphosat oder eine modifizierte Glutamin-Synthase als Zielenzym für einen Glutamin-Synthase-Inhibitor wie Phosphinotrizin; ein Gen, das ein Protein codiert, welches Resistenz gegen Sulfonylharnstoffherbizide bewirkt; ein Gen, das ein Protein codiert, welches Resistenz gegen das Herbizid Bromoxynil bewirkt; ein Gen, das ein Protein codiert, welches Resistenz gegen das Herbizid 2,4 D bewirkt; ein Gen, das ein Protein oder Polypeptid codiert, welches zumindest das besagte erste oder zweite spezifische Gewebe oder spezifische Zellen einfärbt, insbesondere das Al-Gen oder das Glucuronidase-Gen; ein Gen, das ein Protein oder Polypeptid codiert, welches der besagten Pflanze eine Belastungstoleranz verleiht, insbesondere ein Gen, das Mn-Superoxid-Dismutase codiert; ein Gen, das ein Protein oder Polypeptid codiert, welches eine Resistenz gegen Krankheits- oder Schädlingsbefall bewirkt, insbesondere ein Gen, das ein Endotoxin des Bacillus Thuringensis codiert, welches Resistenz gegen Insekten bewirkt; oder ein Gen, das ein bakterizides Peptid codiert, welches bakterielle Resistenz verleiht.
  14. Die Zelle eines der Ansprüche 2 bis 13, in der der besagte erste oder der besagte zweite Markierungs-Promotor einer der folgenden Beschreibungen entspricht: ein konstitutiver Promotor, insbesondere ein 35S-Promotor, ein 35S'3-Promotor, ein PNOS-Promotor oder ein POCS-Promotor; ein wundinduzierbarer Promotor, insbesondere ein TR1'- oder TR2'-Promotor; ein Promotor, der die Genexpression selektiv in Pflanzengewebe mit Photosyntheseaktivität lenkt, insbesondere ein SSU-Promotor, der die Genexpression selektiv in Blattzellen, Blütenblattzellen oder Samenzellen, insbesondere Samenhüllenzellen lenkt.
  15. Die Zelle eines der Ansprüche 2 bis 12, in der sich die besagten ersten und zweiten Markierungs-DNAs unterscheiden.
  16. Eine Pflanzenzellenkultur, die im Wesentlichen aus Zellen eines der Ansprüche 1 bis 15 besteht.
  17. Eine Pflanze, insbesondere Mais, Ölraps, Weizen, Reis, Sonnenblume, Zuckerrübe, Tomate, Kopfsalat, Paprikasorten, Hirse, Soja, Erbse, Alfalfa, Gräser, Kleesorten, Möhre, Kohlsorten, Lauch, Zwiebel, Tabak, Petunie, Kakao und Zitrus, vor allem Mais, Ölraps, Weizen und Reis, die im Wesentlichen aus den Zellen eines der Ansprüche 1 bis 15 bestehen.
  18. Ein Samen der Pflanze von Anspruch 17, der im Wesentlichen aus Zellen eines der Ansprüche 1 bis 15 besteht.
  19. Ein Maintainergen zum Erhalt einer homogenen Population männlich-steriler Pflanzen, welches folgendes enthält: a) ein Fertilitätsrestorergen, welches folgendes enthält: i) eine Fertilitätsrestorer-DNA, welche ein/e Restorer-RNA, und/oder -Protein oder Polypeptid codiert, die/das, wenn sie/es in den Zellen, vorzugsweise den Staubblattzellen, einer Pflanze produziert oder überproduziert wird, die phänotypische Expression eines nukleären männlich-sterilen Genotyps verhindert, der die besagte Pflanze in Abwesenheit der/des besagten Restorer-RNA, -Proteins oder Polypeptids in den besagten Staubblattzellen männlich steril machen würde, und ii) einen Restorer-Promotor, welcher geeignet ist, die Expression der besagten Fertilitätsrestorer-DNA in zumindest den besagten Zellen, vorzugsweise in den besagten Staubblattzellen, zu steuern, so dass die besagte phänotypische Expression des besagten nukleären männlich-sterilen Genotyps verhindert wird, wobei sich die besagte Fertilitätsrestorer-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des besagten Restorer-Promotors befindet; und b) ein Pollenletalitätsgen, das selektiv in den Mikrosporen und/oder Pollen der besagten Pflanze exprimiert wird, um die Produktion von bestäubungsfähigem Pollen zu verhindern und welches folgendes beinhaltet: iii) eine Pollenletalitäts-DNA, die für ein/e pollenletale/s RNA und/oder Protein oder Polypeptid codiert, welche/s, wenn sie/es in den besagten Mikrosporen und/oder Pollen produziert oder überproduziert wird, deren Stoffwechsel, Funktionsfähigkeit und/oder Entwicklung erheblich beeinträchtigt und iv) Einen pollenspezifischen Promotor, der geeignet ist, die Expression der besagten Pollenletalitäts-DNA selektiv in den besagten Mikrosporen und/oder Pollen zu steuern, wobei sich die besagte Pollenletalitäts-DNA in der gleichen Transkriptionseinheit wie und unter Kontrolle des besagten pollenspezifischen Promotors befindet.
  20. Ein Vektor für die Veränderung der Zelle einer Pflanze, der das Maintainergen von Anspruch 19 enthält.
  21. Eine Methode für den Erhalt einer homogenen Population männlich-steriler Pflanzen oder deren Saatgut, deren nukleäres Genom am besagten ersten Locus von einem der Ansprüche 1, 3–6 und 9, den besagten männlich-sterilen Genotyp eines der Ansprüche 1, 3–6 und 9 in homozygotem Zustand enthält; die besagte Methode beinhaltet den Schritt, die besagten männlich-sterilen Pflanzen mit der Pflanze von Anspruch 17 zu kreuzen.
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