DE69731608T2

DE69731608T2 - Verbessertes barstar-gen

Info

Publication number: DE69731608T2
Application number: DE69731608T
Authority: DE
Inventors: Frank Michiels; Mark Williams
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1996-09-03
Filing date: 1997-09-01
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2017-09-02
Also published as: HK1020585A1; BR9706706A; US6759575B2; PL328819A1; ATE282705T1; CN1218509A; EP0868524A2; CZ133598A3; JP2001511642A; CA2234119A1; JP4159114B2; DE69731608D1; CN1157478C; AU4619797A; AU720071B2; WO1998010081A3; US6372960B1; BRPI9706706B1; EP0868524B1; WO1998010081A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes Barstar-Gen und ein verbessertes Barstar-Protein, welches zur Neutralisierung der Barnase-Aktivität in eukaryotischen Zellen, insbesondere in Pflanzenzellen, verwendet werden kann. Damit kann das verbesserte Barstar-Gen zur Herstellung von Fertilitätsrestorern verwendet werden, welche in der Lage sind, die Fertilität einermännlich-sterilen Pflanzenlinie wiederherzustellen, die in dem Genom ihres Zellkerns ein Hybridgen enthält, das aus einem staubblatt-spezifischen Promotor und einer DNS, die für Barnase codiert besteht. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Restorerpflanzen, die das verbesserte Barstar-Gen in dem Genom ihres Zellkerns enthalten.
Hintergrund der Erfindung
Wegen der allgemeinen Produktivitätssteigerung durch den Heterosis-Effekt ist in vielen, wenn nicht in allen Pflanzenarten die Entwicklung von Hybridsorten sehr erwünscht: die Leistungsüberlegenheit von Hybriden verglichen mit ihren Eltern (siehe z.B. Fehr, 1987, Principles of cultivar development, Volume 1: Theory and Technique, MacMillan Publishing Company, New York; Allard, 1960, Principles of Plant Breeding, John Wiley and Sons, Inc.).
Für die Entwicklung von Hybridsorten muß bei manchen Pflanzenarten eine fast vollständige gegenseitige Bestäubung der Elternpflanzen gewährleistet sein. Dies ist am einfachsten erreicht, indem man eine der Elternlinien männlich steril macht (d.h. indem man sie in einen Zustand versetzt in dem die Pollen entweder fehlen oder nicht befruchtungsfähig sind). Dies kann entweder manuell durch das Entfernen der Antheren erfolgen oder genetisch, indem in einem Elternteil cytoplasmische oder nukleäre Gene angewendet werden, welche die Entwicklung von Antheren und/oder Pollen verhindern (für einen Überblick über die genetischen Hintergründe der Pollensterilität siehe Kaul, 1988, ,Male Sterility in Higher Plants', Springer Verlag).
Bei hybriden Pflanzen, deren Samen das Ernteprodukt ist (z.B. Mais, Ölraps) ist es meistens notwendig, die Fertilität vollständig wiederherzustellen. In Systemen, in denen die männliche Sterilität genetisch kontrolliert wird, setzt dies das Vorhandensein und die Anwendung von Genen voraus, welche die männliche Fertilität wiederherstellen können. Die Entwicklung von Hybridsorten hängt hauptsächlich von der Verfügbarkeit brauchbarer und effektiver Sterilitäts- und Restorer-Gene ab.
Für die meisten Pflanzenarten sind endogene nukleäre Loci bekannt, die Genotypen enthalten, welche die männliche Sterilität beeinflussen können und im Allgemeinen müssen solche Loci für bestimmte rezessive Allele homozygot sein, um einen männlich-sterilen Phänotyp zu produzieren. Die Präsenz eines dominanten ,männlich-fertilen' Allels an solchen Loci resultiert in männlicher Fertilität
Es wurde vor Kurzem gezeigt, dass männliche Sterilität in eine Pflanze induziert werden kann, indem man dem Genom der Pflanze ein chimäres männlich-steriles Gen hinzufügt, welches eine DNS-Sequenz (oder männlich-sterile DNS), die zum Beispiel für ein zytotoxisches Produkt (wie z.B. eine RNase) codiert und von einem hauptsächlich in bestimmten Zellen der männlichen Reproduktionsorgane aktiven Promotor kontrolliert wird. In dieser Hinsicht haben sich staubblatt-selektive Promotoren, wie z.B. der Promotor des TA29-Gens von Nicotiana tabacum als besonders nützlich für diesen Zweck erwiesen. (Mariani et al., 1990, Nature 347: 737, Europäische Patentschrift ("EP") 0,344,029). Indem man dem nukleären Genom der Pflanze ein solches männlich-steriles Gen hinzufügt, wird ein künstlicher männlich-steriler Locus geschaffen, welcher den künstlichen männlich-sterilen Genotyp enthält, der eine männlich-sterile Pflanze erzeugt.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die männliche Fertilität mit Hilfe eines chimärischen Fertilitätsrestorer-Gens wiederhergestellt werden kann, welches eine andere DNS-Sequenz (oder Fertilitätsrestorer-DNS) enthält, die zum Beispiel für ein Protein codiert, das die Aktivität des zytotoxischen Produkts blockiert oder auf andere Weise verhindert, dass das zytotoxische Produkt in den Pflanzenzellen aktiv wird (Europäische Patentschrift "EP" 0,412,911). Zum Beispiel das Barnase-Gen des Bacillus amyloliquefaciens codiert für eine RNase, die Barnase, die von einem Protein (Barstar) blockiert wird, welches von dem Barstar-Gen des B. amyloliquefaciens codiert wird. Das Barnase-Gen kann zur Konstruktion eines Sterilitätsgens genutzt werden, während das Barstar-Gen zur Konstruktion eines Fertilitätsrestorer-Gens genutzt werden kann. Experimente mit verschiedenen Pflanzenarten, wie z.B. Ölraps, haben gezeigt, dass ein chimärisches Barstar-Gen die männliche Fertilität von männlich-sterilen Linien vollständig wiederherstellen kann, wenn deren männliche Sterilität durch die Präsenz eines chimärischen Barnase-Gens hervorgerufen wurde ( EP 0,412,911 , Mariani et al., 1991, Proceedings of the CCIRC Rapeseed Congress, July 9–11, 1991, Saskatoon, Saskatchewan, Canada; Mariani et al., 1992, Nature 357: 384). Indem ein Markierungsgen, wie z.B. ein dominantes Herbizidresistenzgen (z.B. das Bar-Gen, das für Phosphinothricin Acetyl Transferase (PAT) codiert, wodurch das Herbizid Phosphinothricin in eine ungiftige Verbindung umgewandelt wird [De Block et al., 1987, EMBO J. 6: 2513]), an das chimärische männliche Sterilitäts- und/oder Fertilitätsrestorer-Gen gekoppelt wird, können selektive Zuchtsysteme eingesetzt werden, um einheitliche Populationen männlich-steriler Pflanzen zu erhalten ( EP 0,344,029 ; EP 0,412,911 ).
Für Produktion von Hybridsaatgut aller Sorten einer Pflanzenart benötigt man: 1) die Erhaltung geringer Mengen von reinem Saatgut von jeder durch Selbstung erzeugten Elternpflanze, und 2) die Bereitung größerer Saatgutmengen von jeder durch Selbstung erzeugten Elternpflanze. Diese größeren Saatgutmengen werden normalerweise in mehreren (meistens zwei) Vermehrungsstufen produziert, ausgehend von einer kleinen Menge von reinem Saatgut („Basissaatgut"), wobei jede Vermehrungsstufe eine größere Menge reinen Saatguts der durch Selbstung erzeugten Elternpflanze produziert, bis schließlich ein Bestand an Saatgut (das Ausgangssaatgut) aufgebaut wurde, das, wenn ausgesät, ausreicht, um die gewünschten Mengen des Hybridsaatguts zu produzieren. Natürlich verlangt jede Vermehrungsstufe größere Aussaatflächen (Felder).
Barnase ist die von dem Bacillus amyloliquefaciens ausgeschiedene Ribonuklease und Barstar ist der von dem selben Mikroorganismus produzierte Barnase-Inhibitor. (Hartley, 1988, J. Mol. Biol. 202: 913–915). Es wurden mehrere mutierte Barnase- und Barstar-Proteine beschrieben (Hartley, 1993, Biochemistry 32: 5978–5984; Schreiber and Fersht, 1993, Biochemistry 32: 5145–5150; Guillet et al., 1993, Current Biology 1: 165–177; Hartley, 1989, TIBS 14: 450–454; Axe et al., 1996, PNAS 93: 5590–5594; Serrano, 1993, J. Mol. Biol. 233: 305–312).
Man fand, dass einige dieser Mutationen die grundlegende biologische Aktivität der von Bacillus amyloliquefaciens produzierten Barnase und Barstar beibehielten. Es wurden jedoch mindestens zwei Barstar-Mutationen beschrieben, die keine erkennbare Barstar-Aktivität aufweisen (Hartley, 1993, Biochemistry 32: 5978–5984; Guillet et al., 1993, Current Biology 1: 165–177).
Es ist auch bekannt, dass andere verwandte Mikroorganismen Proteine produzieren, die Barnase und Barstar hochgradig ähnlich sind. Der Bacillus intermedius produziert Binase und Binstar (Schulga et al., 1992, NAR 20: 2375; Guillet et al., 1993, supra).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bietet verbesserte Barstar-DNS, die ein Barstar mit einer mit Met-Xaa beginnenden Aminosäuresequenz codieren, wobei Met-Xaa Alanin, Valin, Glycin, aspartische Säure oder Glutamatsäure ist. Vorzugsweise codieren die Barstar-DNS Bartstar mit einer Aminosäuresequenz, welche 1) die Aminosäuresequenz beschrieben als SEQ ID No. 2 ist, wobei die zweite Aminosäure nicht Lysin ist, sondern Alanin, Valin, Glycin, aspartische Säure oder Glutamatsäure, 2) die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 4 ist, oder die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 4 ist, wobei die zweite Aminosäure nicht Alanin ist, sondern Valin, Glycin, aspartische Säure oder Glutamatsäure.
Die vorliegende Erfindung bietet außerdem verbesserte synthetische Barstar-DNS welche weniger als 40% A und T Nukleotide enthalten und/oder einen für Ölraps, Baumwolle Mais, Reis und Weizen, vorzugsweise für Ölraps, Mais und Reis optimierten Codongebrauch haben. Vorzugsweise enthält das synthetische Barstar nicht mehr als 7% CG Dinukleotide und/oder nicht mehr als 9,5% CNG Trinukleotide. Eine bevorzugte synthetische Barstar-DNS codiert ein Barstar mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 4. Eine besonders bevorzugte synthetische Barstar-DNS hat die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 3.
Die vorliegende Erfindung bietet außerdem: chimärische Gene, bei denen die verbesserten Barstar-DNS mit einem expressiblen Promotor operativ verknüpft sind, vorzugsweise einem Promotor, der die Expression selektiv in den Staubbeutelzellen und wenigstens in den Tapetenzellen, Pflanzenzellen und Pflanzen, die diese chimären Gene enthalten, steuert.
Die vorliegende Erfindung bietet außerdem Anwendungsmöglichkeiten der verbesserten Barstar-DNS und verbesserten Barstar-Proteine zur Barnaseneutralisierung in Pflanzenzellen, insbesondere im Hinblick auf die Wiederherstellung männlicher Fertilität in männlich-sterilen Linien.
Die vorliegende Erfindung bietet außerdem verbesserte Barstare mit einer Aminosäuresequenz, welche mit Met-Xaa beginnt, wobei Xaa Alanin, Valin, Glycin, Aspartische Säure oder Glutamatsäure ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Als männlich-sterile ("ms") Pflanze wird hier eine Pflanze einer bestimmten Pflanzenart bezeichnet, die männlich-steril ist als Folge der Expression eines chimärischen männlich-sterilen Gens (S), welches in die nukleäre DNS dieser Pflanze integriert ist und die folgenden operativ verknüpften DNS-Fragmente umfasst:

1) Ein „Sterilitäts-Promotor", welcher die Expression selektiv in den Staubblattzellen steuertt und vorzugsweise wenigstens in den Tapetenzellen, und,
2) Eine „Männliche-Sterilitäts-DNS", die für eine Barnase codiert (die ,Barnase-DNS')

Ein Beispiel für ein solches ms-Gen ist ein Gen das eine Barnase-DNS enthält, die von dem Promotor des TA29-Gens der Tabakpflanze kontrolliert wird, der z.B. in dem Plasmid pVE108 enthalten ist (WO 92/29696).
Als eine Restorer-Pflanze wird hier eine männlich-fertile Pflanze der selben Pflanzenart bezeichnet, welche ein in die nukleäre DNS ihrer Zellen integriertes Fertilitätsrestorer-Gen (R) beinhaltet, welches:

1) Einen „Restorer-Promotor" enthält, der die Expression in denjenigen Staubblattzellen steuert, in welchen der Sterilitäts-Promotor die Expression der Barnase-DNS in der ms-Pflanze steuert, und,
2) Eine „Restorer-DNS" enthält, die für ein Barstar codiert (die 'Barstar-DNS').

Die Barstar-DNS der Restorer-Pflanzen dieser Erfindung ist die verbesserte Barstar-DNS, wie unten beschrieben.
Die Präsenz des Fertilitätsrestorer-Gens stellt die Fertilität in den Nachkommen einer männlich-sterilen Pflanze, die das ms-Gen beinhalten, wieder her. Die Nachkommen sind natürlich durch eine Kreuzung einer männlich-sterilen Pflanze und der Restorer-Pflanze erzeugt worden.
Als restaurierte Pflanze wird hier eine männlich-fertile Pflanze (der gleichen Art wie die männlich-sterile Pflanze und die Restorer-Pflanze) bezeichnet, deren Genom das Männliche-Sterilitäts-Gen und das Fertilitätsrestorer-Gen enthält, wobei insbesondere das Fertilitätsrestorer-Gen die verbesserte Barstar-DNS dieser Erfindung umfasst.
Eine Linie ist die Nachkommenschaft einer bestimmten individuellen Pflanze. Die Pflanzen einer bestimmten Linie gleichen sich in einem oder mehreren bestimmten genetischen oder phänotypischen Merkmalen. Als eine männlich-sterile (ms) Linie wird hier eine Gruppe von Pflanzen einer Pflanzenart bezeichnet, insbesondere einer Pflanzensorte, die alle wegen der Präsenz eines bestimmten ms-Gens an dem gleichen genetischen Locus männlich-steril sind. Gleichermaßen ist eine Restorer-Linie eine Gruppe von Pflanzen einer Pflanzenart, die alle das bestimmte Fertilitätsrestorer-Gen am gleichen genetischen Locus beinhalten. Vorzugsweise haben alle Pflanzen einer ms-Linie (bzw. einer Restorer-Linie) den gleichen Genotyp in Bezug auf den ms-Locus (bzw. den Fertilitätsrestorer-Locus).
Die männliche Fertilität wird in einer männlich-sterilen Linie wiederhergestellt, indem das Fertilitätsrestorer-Gen in die ms-Linie eingeführt wird, z.B. indem Pflanzen der ms-Linie mit Pflanzen der Restorer-Linie gerkreuzt werden, so dass wenigstens ein Teil der Nachkommen restaurierte Pflanzen sind.
Der genetische Hintergrund einer Linie in einer Sorte bestimmt die Gesamtheit der vorhandenen Gene in der Sorte, welche die einzelnen phänotypischen Merkmale dieser Sorte festlegen. Ein fremdes Gen, wie z.B. ein ms-Gen oder ein Restorer-Gen, das durch Genmanipulation eingeführt wurde, um eine bestimmte Linie einer Sorte zu erzeugen, kann somit in verschiedene Sorten (oder sogar in verschiedene Arten) eingeführt werden, die alle verschiedene genetische Hintergründe haben.
In der Produktion von Hybridsaatgut wird die männlich-sterile Linie auch die weibliche oder Mutterlinie genannt, die männlich-fertile (Restorer-) Linie wird auch die männliche oder Vaterlinie genannt.
Allgemein gehen wir hierin davon aus, dass ein Gen mindestens eine Codierungsregion, welche für eine RNA, ein Protein oder Polypeptid codiert, beinhaltet, was operativ mit geeigneten Promotor- und 3' Regulationssequenzen verknüpft ist.
Im Rahmen dieser Erfindung bedeutet die Expression eines Gens, wie z.B. eines chimärischen Gens, dass der Promotor des Gens die Transkription einer DNS in einer biologisch aktiven RNA steuert, d.h. die entweder in der Lage ist, mit einer anderen RNA oder einem Protein zu interagieren, oder welche in ein biologisch aktives Polypeptid oder Protein umgewandelt werden kann.
Der Phänotyp ist die äußere Erscheinung der Expression (oder des Fehlens der Expression) eines Genotyps, d.h. eines Gens oder einer Serie von Genen (z.B. männliche Sterilität, Präsenz eines Proteins oder einer RNA in bestimmten Pflanzengeweben etc.).
Unter einer Barnase wird hierin ein Protein verstanden, welches in der Lage ist einzelsträngige RNA abzubauen und welches die Aminosäuresequenz der Barnase (sekretierter Barnase) beinhaltet, die von dem Bacillus amyloliquefaciens ausgeschieden wird (Hartley, 1988, J. Mol. Biol. 202: 913) oder eine Aminosäuresequenz die zu mindestens 80%, vorzugsweise zu mindestens 85% mit dieser Sequenz übereinstimmt. Barnasen, in diesem Sinne, sind in der Lage, RNA durch eine Reaktion abzubauen, bei welcher zuerst die Phosphodiesterbindungen zwischen der 5' Ribose eines Nukleotids und der Phosphatgruppe, die an dem benachbarten 3' Nukleotid haftet, gespaltet werden. Diese Reaktion produziert anfänglich ein 2',3'-zyklisches Phosphat-Zwischenprodukt, welches in der Folge hydrolysiert und zu dem entsprechenden 3' Nukleosid-Phosphat wird. Barnasen sind außerdem in der Lage, Polyethenoadenosin-Phosphat zu hydrolysieren, wobei ein hochgradig fluorogenes Nukleotidanalogon 1,N-Ethenoadenosin entsteht (Fitzgerald and Hartley, 1993, Anal. Biochem. 214: 544–547) und haben mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 50%, möglichst mindestens 75% der Aktivität von abgesonderter Barnase, gemessen unter normalen Bedingungen (Fitzgerald and Hartley, 1993, Anal. Biochem. 214: 544–547; Hartley, 1993, Biochemistry 32: 5978:5984). Barnasen sind darüber hinaus in der Lage, Wildtyp-Barstar (siehe unten) zu binden, mit einer Dissoziationskonstante von 10^–12 M oder weniger, vorzugsweise mit einer Dissoziationskonstante zwischen 10^–13 M und 10^–14 M (Schreiber and Fersht, 1993, Biochemistry 32: 5145–5150; Hartley, 1993, Biochemistry 32: 5978–5984).
Binase ist die extrazelluläre Ribonuklease die von dem Bacillus intermedius abgesondert wird (Schulga et al., 1992, NAR 20: 2375) und wird im Rahmen dieser Erfindung auch als eine Barnase behandelt.
Der Einfachheit halber wird in der Beschreibung, oder in den Beispielen weiter unten, mit Barnase ein Protein bezeichnet, das die Aminosäuresequenz der von pVE108 codierten Barnase aufweist (WO 92/09696).
Ein Barstar ist ein beliebiges Protein, das in der Lage ist, die abgesonderte Barnase spezifisch zu binden, mit einer Dissoziationskonstante von 10^–12 oder weniger, vorzugsweise mit einer Dissoziationskonstante zwischen 10^–13 M und 10^–14 M (Schreiber and Fersht, 1993, Biochemistry 32: 5145–5150; Hartley, 1993, Biochemistry 32: 5978–5984). Barstare sind bei normalen Bedingungen in der Lage, mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 75%, möglichst mindestens 90% der Aktivität von abgesonderter Barnase in einer equimolaren Mischung von Barstar und abgesonderter Barnase zu blockieren (Hartley, 1993, Biochemistry 32: 5978–5984). Ein Barstar ist ein Protein welches die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthält oder eine Aminosäuresequenz die mindestens zu 80%, vorzugsweise mindestens zu 85% mit dieser Sequenz übereinstimmt. Wildtyp-Barstar ist das von Bacillus amyloliquefaciens produzierte Barstar und hat die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 (siehe auch Hartley, J. Mol. Biol. 1988 202: 913). Selbstverständlich schließt der Begriff Barstar hier auch z.B. die von Hartley (1993, Biochemistry 32: 5978–5984) beschriebenen biologisch aktiven Barstar-Mutationen ein.
Der Begriff Barnase-DNS (oder Barnase-Code-Sequenz) beinhaltet hier alle DNS-Fragmente, die eine Nukleotidsequenz beinhalten, welche für eine Barnase codiert. Eine besonders bevorzugte Barnase-DNS ist die in pVE108 vorhandene Barnase-DNS (WO 92/09696). Ein Barnase-Gen ist ein in Pflanzen exprimierbares chimärisches Gen das eine Barnase-DNS enthält, die operativ mit geeigneten 5' und 3' regulatorischen Regionen verknüpft ist, d.h. eine Promotor-Region die einen von den Polymerasen einer Pflanzenzelle erkannten Promotor beinhaltet und eine 3' Region mit einer Polyadenylierungsstelle.
Der Begriff Barstar-DNS (oder Barstar-Code-Sequenz) beinhaltet hier alle DNS-Fragmente, die eine Nukleotidsequenz beinhalten, welche für ein Barstar codiert. Eine Wildtyp-Barstar-DNS ist eine DNS die für Wildtyp-Barstar codiert und die Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 aufweist. (Hartley, J. Mol. Biol. 1988 202: 913). Ein Barstar-Gen ist ein in Pflanzen exprimierbares chimärisches Gen, welches eine Barstar-DNS enthält, die operativ mit geeigneten 5' und 3' regulatorischen Regionen verknüpft ist, d.h. eine Promotor-Region die einen von den Polymerasen einer Pflanzenzelle erkannten Promotor beinhaltet und eine 3' Region mit einer Polyadenylierungsstelle.
Unter genetischem Locus wird hier der Ort eines bestimmten Gens in dem nukleären Genom, d.h. einem bestimmten Chromosom einer Pflanze verstanden. Zwei Loci können auf verschiedenen Chromosomen sein und sind unabhängig voneinander abgegrenzt. Zwei Loci auf dem selben Chromosom gelten allgemein als verknüpft (außer wenn ausreichende Rekombinationsmöglichkeiten zwischen ihnen bestehen).
Ein endogener Locus ist ein natürlich vorhandener Locus einer Pflanze. Ein fremder Locus ist ein Locus, der in der Pflanze als Folge von dem Einbringen einer fremden DNS durch genetische Transformation gebildet wurde.
In diploiden Pflanzen sind, wie in allen diploiden Organismen, zwei Kopien eines Gens an jedem autosomalen Locus vorhanden. Jedes Gen kann in mehreren verschieden Ausprägungsformen in dem nukleären Genom vorkommen, die Allele genannt werden. Wenn an einem Locus zwei identische Allele vorhanden sind, wird dieser Locus als homozygot bezeichnet, sind zwei verschiedene Allele vorhanden, wird der Locus als heterozygot bezeichnet. Die allelische Zusammensetzung eines Locus, oder einer Serie von Loci ist der Genotyp. Jedes Allel an einem Locus wird mit einem eigenen Symbol dargestellt (z.B. R und -, S und -, wobei - die Abwesenheit des Gens darstellt). Ein fremder Locus ist allgemein an der Anwesenheit und/oder Abwesenheit fremder DNS erkennbar. Ein dominantes Allel wird im Allgemeinen durch einen Großbuchstaben dargestellt und hängt normalerweise mit der Präsenz eines biologisch aktiven Genprodukts (z.B. einem Protein) und einem nachweisbaren phänotypischen Effekt zusammen (z.B. R weist auf die Produktion eines aktiven Barstar-Proteins hin).
Eine Pflanze kann durch die Identifikation des allelischen Zustands von mindestens einem genetischen Locus genetisch beschrieben werden.
Der Genotyp eines beliebigen Locus kann mit den Symbolen der beiden an ihm vorhandenen Allele beschrieben werden (z.B. R/R oder S/-) Der Genotyp von zwei unverknüpften Loci kann als eine Sequenz der Genotypen beider Loci dargestellt werden. (z.B. S/-, R/-).
Eine männlich-sterile Pflanze in diesem Zusammenhang enthält einen fremden „Männlichen-Sterilitäts-Locus", an dem das ms-Gen S vorhanden ist, welches die Pflanze männlich-steril macht, wenn es in den Pflanzenzellen exprimiert wird, ohne das Wachstum und die Entwicklung der Pflanze auf andere Weise maßgeblich zu beeinflussen.
Der ms-Locus enthält im gleichen genetischen Locus auch ein Markierungsgen, welches mindestens:

1) eine erste Markierungs-DNS enthält, die eine erste Markierungs-RNA, ein erstes Markierungs-Protein oder -Polypeptid codiert, welches, wenn es zumindest in einem spezifischen Gewebe oder in spezifischen Zellen einer Pflanze enthalten ist, diese Pflanze leicht von anderen Pflanzen unterscheidbar macht, die nicht die erste Markierungs-RNA, das erste Markierungs-Protein oder -Polypeptid, die/das von der ersten Markierungs-DNS codiert wurde, zumindest in einem spezifischem Gewebe oder spezifischen Zellen enthalten, und,
2) einen ersten Markierungs-Promotor enthält, der in der Lage ist, die Expression der ersten Markierungs-DNS wenigstens in dem spezifischen Gewebe oder den spezifischen Zellen zu steuern: Hierbei befindet sich die erste Markierungs-DNS in der selben Transkriptionseinheit wie und unter der Kontrolle des ersten Markierungs-Promotors.

Eine solches ms-Gen ist immer ein dominantes Allel an einem solchen fremden ms-Locus. Das rezessive Allel entspricht der Abwesenheit des ms-Gens in dem nukleären Genom der Pflanze.
Sterilitäts-Promotoren, die in den ms-Genen in der Mutterlinie dieser Erfindung verwendet werden können sind bereits beschrieben worden ( EP 0,344,029 and EP 0,412,911 ). Jeder Promotor, der zumindest in den Staubblattzellen, vorzugsweise in den Tapetenzellen aktiv ist, eignet sich als Sterilitäts-Promotor. Besonders nützliche Sterilitäts-Promotoren sind Promotoren, die selektiv in den Staubblattzellen aktiv sind, wie z.B. der tapetenzellen-spezifische Promotor des TA29-Gens von Nicotiana tabacum ( EP 0,344,029 ), der in Tabak, Ölraps, Kopfsalat, Chicorée, Mais, Reis, Weizen und anderen Pflanzenarten angewendet werden kann, die PT72-, PT42- und PE1-Promotoren von Reis, die in Reis, Mais, Weizen und anderen Pflanzenarten angewendet werden können (WO 92/13956), der PCA55-Promotor von Mais, der in Mais, Reis, Weizen und anderen Pflanzenarten angewendet werden kann (WO 92/13957), sowie der A9-Promotor eines tapetenzellen-spezifischen Gens von Arabidopsis thaliana (Wyatt et al., 1992, Plant Mol. Biol. 19: 611–922).
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass die „Restorer-Kapazität" (die Fähigkeit und Effizienz einer Restorer-Linie, die männliche Fertilität effektiv in einer weiten Vielfalt von ms-Linien wiederherzustellen) direkt von der Barstar-Menge abhängt, die in den Staubblättern, vor allem in den Tapetenzellen der Restorer-Pflanzen (und ebenso in den Staubblättern, vor allem in den Tapetenzellen der restaurierten Pflanzen) produziert wird. Die Restorer-Kapazität ist wichtig, da eine effiziente Restorer-Linie in vielen verschiedenen männlich-sterilen Linien zur Wiederherstellung der männlichen Fertilität angewendet werden kann, bei denen der Grad, zu dem Barnase in den Staubblättern und besonders in den Tapetenzellen produziert wird (als Folge der Expression eines ms-Gens) unterschiedlich sein kann. Eine mögliche Ursache einer solchen Unterschiedlichkeit der Barnase-Produktion in verschiedenen ms-Linien sind Positionseffekte, d.h. Variationen in der Expression des ms-Gens als Folge unterschiedlicher Einfügungsorte in das nukleäre Genom verschiedener Transformanten. Eine andere Ursache der Variation der Barnase-Produktion zwischen verschiedenen ms-Linien, die das ms-Gen an dem selben genetischen Locus enthalten, sind deren unterschiedliche genetische Hintergründe. Wenn das ms-Gen einer männlich-sterilen Linie einer Pflanzensorte in andere Sorten der selben (oder einer nahe verwandten) Pflanzenart durch Rückkreuzen eingeführt wird, um ms-Linien dieser Sorten zu erzeugen, wird das ms-Gen in verschiedene genetische Hintergründe eingeführt, was sich auf den Grad, zu dem das Gen exprimiert wird, auswirken kann. Die beobachtete Variation der Barnase-Produktion, und die daraus folgenden Probleme hinsichtlich der Fertilitätsrestauration werden noch bedeutender, wenn die Variation der Expression des Restorer-Gens in den verschiedenen Restorer-Pflanzen berücksichtigt wird – diese Variation kann auch von den oben angeführten Ursachen ausgehen, d.h. Positionseffekte der Fertilitätsrestorer-Gene in verschiedenen Restorer-Linien und/oder die unterschiedlichen genetischen Hintergründe der verschiedenen Restorer-Linien. Somit ist es für den Erhalt von Restorer-Linien mit guter Restorer-Kapazität wünschenswert, in Pflanzen exprimierbare chimärische Barstar-Gene verfügbar zu haben, die hochgradig exprimiert werden, umgroße Mengen von Barstar in den Staubblattzellen, besonders in den Antherenzellen, vor allem in den Tapetenzellen einer Pflanze zu produzieren.
Diese Erfindung bietet somit verbesserte Barstar-DNS, die unter normalen Bedingungen am effektivsten in Pflanzenzellen exprimiert werden – wobei sie in diesen Zellen größere Mengen aktiven Barstar-Proteins, insbesondere verbesserten Barstar-Proteins erzeugen, als Wildtyp-Barstar-DNS. Von daher werden verbesserte Fertilitätsrestorer-Gene in Pflanzen von wenigstens einer Pflanzenart (und vorzugsweise in Pflanzen mehrerer Pflanzenarten, insbesondere mehrerer einkeimblättriger Pflanzenarten) zu einem durchschnittlich höheren Grad exprimiert, als ähnliche Restorer-Gene, die Wildtyp-Barstar-DNS enthalten. Der durchschnittlich höhere Grad der Expression bedeutet, dass die Barstar-Menge, die von verschiedenen Restorer-Linien welche das Fertilitätsrestorer-Gen dieser Erfindung an verschiedenen genetischen Loci und/oder bei verschiedenen genetischen Hintergründen enthalten, in bestimmten Organen produziert wird (z.B. den Antheren) deutlich höher ist, als die Barstar-Menge, die in den Staubblattzellen anderer Restorer-Linien produziert wird, die ähnliche Fertilitätsrestorer-Gene mit Wildtyp-Barstar-DNS an verschiedenen genetischen Loci und bei verschiedenen genetischen Hintergründen enthalten.
Im Allgemeinen bietet die Erfindung verbesserte Barstar-Codierungsregionen mit einer Nukleotidsequenz, deren zweites Codon für eine Aminosäure aus der folgenden Gruppe codiert: Valin (Val), Alanin (Ala), aspartische Säure (Asp), Glutamatsäure (Glu) und Glycin (Gly). Es ist besonders wünschenswert, dass dieses zweite Codon Alanin codiert. Diese Codone beginnen mit einem G, was optimale Bedingungen für die Translationsinitiation an Position +4 schafft (d.h. dem ersten Nukleotid des zweiten Codons der Barstar-Codierungs-Sequenz). Somit besteht der N-Terminus des Barstars, welches von der verbesserten Barstar-DNS codiert wurde, aus Met-Xaa, wobei Xaa Ala, Val, Gly, Glu, oder Asp ist, vorzugsweise ein Ala (am besten ein Ala das von einem GCC-Codon codiert wurde). Vorzugsweise codieren die verbesserten Barstar-DNS ein die Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2 enthaltendes Barstar zwischen den Aminosäure-Rückständen 3 und 90. Beispiele von verbesserten Barstar-DNS sind 1) eine Barstar-DNS die ein Barstar mit der Sequenz von SEQ ID No. 2 codiert, wobei die zweite Aminosäure (Lys) wie oben definiert durch Xaa ersetzt wird, und 2) eine Barstar-DNS die ein Barstar mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 4 codiert. Es wurde gezeigt, dass die nicht-konservative Modifikation des N-Terminus des Barstar-Proteins die spezifische Biologische Aktivität des Barstar nicht negativ beeinflusst. Vielmehr wurde durch Western Blotting von Staubblattgewebe nachgewiesen, dass Gene, die diese verbesserten Barstar-DNS enthalten im Allgemeinen mehr Barstar-Protein produzieren, wenn sie in Pflanzen, vor allem in einkeimblättrigen Pflanzen (wie z.B. Mais, Reis und Weizen) exprimiert sind. Diese Steigerung der Barstar-Produktion in Tapetenzellen kann an der verbesserten Translation liegen, aber auch an der verbesserten Stabilität des Barstar-Proteins.
Man fand außerdem, dass die Modifikation einer Barstar-Codierungssequenz, welche den prozentualen AT-Anteil dieser Sequenz auf unter 40% senkt, eine verbesserte Barstar-DNS lieferte, mit der die Produktion von Protein mit Barsta-Aktivität in Pflanzenzellen, insbesondere Tapetenzellen, deutlich gesteigert werden konnte. Solche verbesserten Barstar-Codierungssequenzen werden hier im Allgemeinen als "synthetische" Barstar-Codierungssequenzen bezeichnet.
Vorzugsweise haben die synthetischen Barstar-DNS einen Codon-Gebrauch, der von den Pflanzensorten, an denen sie, z.B. in Restorer-Linien angewendet werden sollen, bevorzugt wird. Ein bevorzugter Codon-Gebrauch einer Barstar-DNS für eine Mehrheit von N Pflanzenarten X1, X2, ... XN bedeutet, dass für jede Aminosäure, für die mehr als ein Codon existiert, das am häufigsten gebrauchte Codon für diese Aminosäure in der synthetischen Barstar-DNS (das „Barstar-Codon" dieser Aminosäure), ein Codon ist, dessen Häufigkeit jeweils in mehr als der Hälfte von N Pflanzenarten 1) wenigstens zwei mal höher ist, als die des am wenigsten gebrauchten Codons und/oder 2) höher als die Hälfte der des am häufigsten gebrauchten Codons ist.
Außerdem ist es vorzuziehen, dass für wenigstens 17, vorzugsweise wenigstens 18 der 19 Aminosäuren, für die multiple Codone existieren, das am häufigsten gebrauchte Codon, vorzugsweise jedes Codon, in der synthetischen Barstar-DNS ein Codon ist, das in jeder der N Pflanzenarten eine Häufigkeit hat, welche 1) wenigstens zwei mal höher ist, als die des am wenigsten gebrauchten Codons und/oder 2) höher als die Hälfte der des am häufigsten gebrauchten Codons ist. Beispiel 2 beschreibt das Design einer bestimmten synthetischen Barstar-DNS mit einem für fünf Pflanzenarten (N = 5) optimierten Codon-Gebrauch, d.h. für Ölraps, Baumwolle, Mais, Weizen und Reis.
Im Rahmen dieser Erfindung werden die von Ikemura veröffentlichten allgemeinen Codon-Häufigkeiten für verschiedene Pflanzenarten verwendet (Ikemura, 1993, In "Plant Molecular Biology Labfax", Croy, ed., Bios Scientific Publishers Ltd., pp. 37–48).
Bevorzugte Pflanzenarten für die Verwendung der synthetischen Barstar-DNS dieser Erfindung sind Ölraps, Baumwolle, Mais, Reis und Weizen, besonders Ölraps, Mais und Reis, vor allem Ölraps und Mais.
Ein weiteres bevorzugtes Merkmal der synthetischen Barstar-DNS ist ein geringes Vorkommen von CG-Dinukleotiden und CNG-Trinukleotiden, die von Methylisierung in Pflanzenzellen betroffen werden. Damit hat das synthetische Barstar dieser Erfindung:

– nicht mehr als 7% CG-Dinukleotide, vorzugsweise nicht mehr als 6% CG-Dinukleotide, möglichst zwischen 5,5 und 6% CG-Dinukleotide (was etwa 15 oder 16 CG-Nukleotide in einer Codierungssequenz von 270–273 bp entspricht), und/oder,
– nicht mehr als 9,5% CNG-Trinukleotide (wobei N ein beliebiges Nukleotid ist), vorzugsweise nicht mehr als 9% CNG-Trinukleotide, möglichst zwischen 8,5 und 9% CNG-Trinukleotide (was etwa 23–25 CNG-Trinukleotiden in einer Codierungssequenz von 270–273 bp entspricht).

Die synthetischen Barstar-DNS dieser Erfindung haben außerdem vorzugsweise die Eigenschaft, dass sie nicht mehr als 7, vorzugsweise nicht mehr als 5, möglichst nicht mehr als 3 Tetranukleotide aufweisen, die nur aus einer Nukleotidsorte bestehen (z.B. AAAA, CCCC, GGGG, TTTT), und dass sie nicht mehr als 2, vorzugsweise nicht mehr als 1 nur aus einer Nukleotidsorte bestehenden Pentanukleotiden aufweisen (z.B. AAAAA, CCCCC, GGGGG, TTTTT).
Die synthetischen Barstar-DNS dieser Erfindung beinhalten diejenigen, die für Wildtyp-Barstar (SEQ ID No. 2) codieren, z.B. eine Barstar-DNS mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 3 zwischen den Positionen 7 und 273, denen ATG voraus geht. Vorzugsweise sind die synthetischen Barstar-DNS dieser Erfindung jedoch synthetische Barstar-Codierungssequenzen, die ein Barstar mit einer Aminosäuresequenz codieren, welche mit Met-Xaa beginnt, wobei Xaa Alanin, Valin, Glycin, Aspartische Säure oder Glutamatsäure ist, vorzugsweise wobei Xaa Alanin ist. Bevorzugte synthetische Barstar-DNS haben die Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 3 zwischen den Positionen 7 und 273, dem ATGGNN, vorzugsweise ATGGCN voraus geht, (wobei N ein beliebiges Nukleotid ist). Eine besonders bevorzugte synthetische Barstar-DNS hat die Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 3.
Vorzugsweise sind die synthetische Barstar-Codierungssequenz und die Wildtyp-Barstar-Codierungssequenz die für Barstar-Proteine codieren zu mindestens 80% identisch.
Im Rahmen dieser Erfindung beschreibt die prozentuale Sequenzgleichheit zweier verwandter Nukleotidsequenzen (d.h. zweier Barstar-DNS) oder Aminosäuresequenzen (d.h. zweier Barstare) die Anzahl der Positionen in den beiden optimal ausgerichteten Sequenzen mit identischen Rückständen (×100), geteilt durch die Anzahl der verglichenen Positionen. Eine Lücke, d.h. eine Position in einem Sequenzpaar in welchem ein Rückstand in einer Sequenz vorhanden ist, aber nicht in der anderen, gilt als eine Position mit nicht identischen Rückständen.
Während Restorer-Gene mit den synthetischen Barstar-DNS dieser Erfindung verwendet werden können, um Restorer-Linien in verschiedenen Pflanzenarten zu erzeugen, eignen sie sich besonders zur Erzeugung von Restorer-Linien in Getreiden, vor allem in Mais, Reis und Weizen.
Diese Erfindung bietet außerdem verbesserte Barstar-Proteine mit einem N- Terminus der aus Met-Xaa besteht (Xaa wie oben definiert). Besonders bevorzugt sind verbesserte Barstare dieser Erfindung welche die Sequenz von SEQ ID No. 2 zwischen den Rückständen 3 und 90 enthalten, Zum Beispiel: 1) ein Barstar mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 4, und 2) ein Barstar mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 2, wobei die zweite Aminosäure (Lys) durch Xaa, wie oben definiert, ersetzt wird.
Natürlich kann die Region dieser bevorzugten verbesserten Barstare, die der Sequenz zwischen den Rückständen 3 und 90 von SEQ ID No. 2 entspricht, varändert werden, solange die gesamte Aminosäuresequenz mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 85%, möglichst mindestens 90% mit SEQ ID No. 2. sequenzgleich ist, und solange das verbesserte Barstar in der Lage ist, unter normalen Bedingungen mindestens 50%, vorzugsweise mindestens 75%, möglichst mindestens 90% der Aktivität abgesonderter Barnase zu blockieren.
Wie oben erwähnt ist eine Modifikation an dem N-Terminus eines Barstar-Proteins (z.B. das Einführen eines N-Terminus der aus Met-Xaa- ... besteht) eine nicht-konservative Modifikation, die sich jedoch nicht negativ auf die spezifische biologische Aktivität der verbesserten Barstare dieser Erfindung auswirkt, wenn diese in Pflanzenzellen produziert werden. Dies wird in Beispiel 6 für das verbesserte Barstar von SEQ ID No. 4 dargestellt.
Diese Erfindung bietet demnach Fertilitätsrestorer-Gene, deren Merkmal ist, dass sie die verbesserten und/oder synthetischen Barstar-DNS dieser Erfindung beinhalten, und die zur Erzeugung verbesserter transgener Restorer-Pflanzen einer Pflanzenart, d.h. Restorer-Pflanzen mit guter Restorer-Kapazität, verwendet werden können. Selbstverständlich kann die Barstar-DNS in dem Fertilitätsrestorer-Gen translationell mit anderen Codierungssequenzen fusioniert werden, so dass es als Teileines Fusionsproteins exprimiert wird.
Prinzipiell kann ein beliebiger Promotor als Restorer-Promotor in dem Fertilitätsrestorer-Gen einer Restorer-Pflanze dieser Erfindung verwendet werden. Die einzige Voraussetzung ist, dass eine solche Restorer-Pflanze, welche das Fertilitätsrestorer-Gen enthält, in der Lage ist, die Fertilität in einer männlich-sterilen Linie wiederherzustellen, d.h. restaurierte Pflanzen (die sowohl das ms-Gen als auch das Fertilitätsrestorer-Gen beinhalten) zu erzeugen, welche phänotypisch normal und männlich fertil sind. Dazu muss der Restorer-Promotor in dem Fertilitätsrestorer-Gen zumindest in den Staubblattzelleneiner Pflanze aktiv sein, in welchen der Sterilitäts-Promotor des entsprechenden ms-Gens die Expression der Barnase-DNS steuern kann. In dieser Hinsicht ist es vorzuziehen, dass der Sterilitäts-Promotor und der Restorer-Promotor identisch sind (z.B. beide TA29 oder beide CA55). Es ist jedoch möglich, dass der Sterilitäts-Promotor nur in Staubblattzellen aktiv ist, während der Restorer-Promotor auch in anderen Zellen aktiv ist. Zum Beispiel kann der Sterilitäts-Promotor staubblatt-spezifisch sein (wie z.B. der TA29- oder der CA55-Promotor), während der Restorer-Promotor ein konstitutiver Promotor ist, wie z.B. der 35S-tap-Promotor, bei dem es sich um einen 35S-Promotor handelt, der verändert wurde, damit er in den Tapetenzellen aktiv ist (van der Meer et al., 1992, the Plant Cell 4: 253–262).
Natürlich gibt es für die verbesserten Restorer-DNS dieser Erfindung neben der Wiederherstellung der männlichen Fertilität in Pflanzen noch weitere Anwendungsmöglichkeiten. In dieser Hinsicht können die verbesserten und/oder synthetischen Barstar-DNS dieser Erfindung in jeder Situation angewendet werden, in der die Neutralisierung der Barnase-Aktivität in Pflanzenzellen erwünscht ist, wie zum Beispiel in den folgenden Publikationen beschrieben: EP 0,412,911 , WO 93/19188, WO 92/21757, WO 93/25695 und WO 95/02157. Bei diesen Anwendungen kann die Transkription der Barstar-DNS von besser geeigneten Promotoren kontrolliert werden, und man kann Promotoren wie den 35S-Promotor oder den Promotor des Nopalin-Synthase-Gens der Agrobacterium T-DNS verwenden. Auch minimale Promotoren (z.B. Pflanzenpromotoren, die im Wesentlichen nur eine TATA-Box ohne andere regulatorische Enhancer-Elemente enthalten) können verwendet werden und es ist sogar möglich, die Barstar-DNS dieser Erfindung auch ohne einen Promotor anzuwenden (wenn z.B. die Transkription der Barstar-DNS von einem endogenen Promotor in transformierten Pflanzenzellen kontrolliert werden soll).
Das in der Restorer-Pflanze verwendete Fertilitätsrestorer-Gen R enthält vorzugsweise auch mindestens ein zweites Markierungsgen, welches zumindest:

1) eine zweite Markierungs-DNS enthält, die eine zweite Markierungs-RNA, -Protein oder Polypeptid codiert, wodurch eine Pflanze, bei der es in mindestens einem spezifischen Gewebe oder in spezifischen Zellen vorkommt, leicht von Pflanzen zu unterscheiden ist, die nicht die, von der zweiten Markierungs-DNS codierte zweite Markierungs-RNA, -Protein oder Polypeptid, in mindestens einem spezifischen Gewebe oder in spezifischen Zellen, enthalten.
2) einen zweiten Markierung-Promotor enthält, der in der Lage ist, die Expression der zweiten Markierungs-DNS zumindest in spezifischem Gewebe oder spezifischen Zellen zu steuern, wobei sich die zweite Markierungs-DNS in der gleichen Transkriptionseinheit und unter der Kontrolle des zweiten Markierungs-Promotor befindet.

Damit enthält eine Restorer-Pflanze dieser Erfindung einen fremden „Restorer-Locus", in dem sich das Restorer-Gen R mit der verbesserten Restorer-DNS dieser Erfindung befindet.
Der Restorer-Locus enthält vorzugsweise auch mindestens ein zweites Markierungs-Gen in dem gleichen genetischen Locus.
Bevorzugte Restorer-Pflanzen dieser Erfindung sind einkeimblättrige Restorer-Pflanzen, vorzugsweise Mais, Reis oder Weizenpflanzen, die durchschnittlich wenigstens 10 ng, vorzugsweise mindestens 20 ng, besonders bevorzugt mindestens 40 ng (und bis zu 100 oder 200 ng) Barstar pro mg Gesamtprotein, das aus ihren isolierten Blütenständen (z.B. Rispen bei Reis, Quasten bei Mais – siehe z.B. Beispiel 4) extrahiert wurde, produzieren.
Besonders bevorzugte Restorer-Pflanzen dieser Erfindung werden die verbesserten Barstare dieser Erfindung produzieren, insbesondere Barstar mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No. 4.
Erste und zweite Markierungs-DNS und erste und zweite Markierungs-Promotoren, die in den ersten und zweiten Markierungsgenen dieser Erfindung verwendet werden können, sind ebenfalls wohl bekannt ( EP 0,344,029 ; EP 0,412,911 ). In dieser Hinsicht wird bevorzugt, dass sich die erste und die zweite Markierungs-DNS unterscheiden, jedoch der erste und der zweite Markierung-Promotor können identisch sein.
Fremde DNS, wie das Fertilitätsrestorer-Gen, das ms-Gen oder das erste oder zweite Markierungsgen besitzen vorzugsweise geeignete 3' Transkriptions-Regulationssequenzen und Polyadenylierungs-Signale, die ihrer Codierungssequenz (d.h. respektive die Fertilitätsrestorer-DNS, die ms-DNS, die erste oder die zweite Markierungs-DNS) nachgeordnet (d.h. 3') sind. In dieser Hinsicht können fremde Transkriptions-3'-End-Formation und Polyadenylierungs-Signale, die für die Expression des Hybridgens geeignet sind verwendet werden. Zum Beispiel können die fremden 3' untranslatierten Enden von Genen verwendet werden, wie z.B. Gen 7 (Velten und Schell (1985) Nucl. Acids Res. 13: 6998), das Octopin-Synthase-Gen (De Greve et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 499; Gielen et al (1983) EMBO J. 3: 835; Ingelbrecht et al., 1989, The Plant Cell 1: 671) und das Nopaline-Synthase-Gen der T-DNS Region von Agrobacterium tumefaciens Ti-Plasmid (De Picker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1: 561), oder das Chalcon-Synthase-Gen (Sommer und Saedler, 1986, Mol. Gen. Genet. 202: 429–434), oder die CaMV 19S/35S Transkriptionseinheit (Mogen et al., 1990, The Plant Cell 2: 1261–1272).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem Fertilitätsrestorer-Gen, dem ms-Gen oder dem ersten oder zweiten Markierungsgen im Allgemeinen um fremde DNS, vorzugsweise fremde chimärische DNS. In dieser Hinsicht haben die Begriffe „fremd" und „chimärisch" in Bezug auf solche DNS die in EP 0,344,029 und EP 0,412,911 beschriebenen Bedeutungen.
Die Zelle einer Pflanze, insbesondere einer Pflanze, die mit Agrobacterium infiziert werden kann, wie die meisten zweikeimblättrigen Pflanzen (z.B. Brassica napus) und einige einkeimblättrigen Pflanzen, kann transformiert werden, indem man ein unschädlich gemachtes („disarmed") Ti-Plasmid, welches das ms-Gen oder das Fertilitätsrestorer-Gen enthält, als Vektor verwendet, der vom Agrobacterium übertragen wird. Diese Transformation kann mittels der in z.B. EP 0,116,718 und EP 0,270,822 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Bevorzugte Ti-Plasmid-Vektoren enthalten die fremde DNS zwischen den Grenzsequenzen, oder zumindest links von der rechten Grenzsequenz der T-DNS des Ti-Plasmids. Natürlich können auch andere Vektoren zur Transformation der Pflanzenzelle verwendet werden, indem Verfahren wie z.B. direkter Gentransfer (wie z.B. in EP 0,233,247 beschrieben), Transformation durch Pollenübertragung (wie z.B. in EP 0,270,356 , PCT Patentschrift „WO" 85/01856 und US Patent 4,684,611 beschrieben), virale Transfektion von Pflanzen-RNA (wie z.B. in EP 0,067,553 und US Patent 4,407,956 beschrieben) und Lipofektion (wie z.B. in US Patent 4,536,475 beschrieben) verwendet werden. Für die Transformation (z.B. durch Elektroporation) der Zellen einkeimblättriger Pflanzen, wie der wichtigsten Getreidearten einschließlich Mais, Reis, Weizen, Gerste, und Roggen kann beschädigtes oder enzymatisch abgebautes intaktes Gewebe, das in der Lage ist, kompakten embryogenen Kallus zu bilden (wie unreife Embryonen in Mais), oder der daraus erhaltene embryogene Kallus (wie Typ I Kallus von Mais), verwendet werden, wie in WO 92/09696 beschrieben. Falls es sich bei der zu transformierenden Pflanze um Mais handelt, können andere neu entwickelte Methoden angewandt werden, wie z.B. die Methode für bestimmte Mais-Linien beschrieben von Fromm et al., 1990, Bio/Technology 8: 833; Gordon-Kamm et al., 1990, Bio/Technology 2: 603 and Gould et al., 1991, Plant Physiol. 95: 426. Falls es sich bei der zu transformierenden Pflanze um Reis handelt, können neu entwickelte Methoden angewandt werden, wie z.B. die Methode für bestimmte Reis-Linien beschrieben von Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274; Datta et al., 1990, Bio/Technology 8: 736; und Hayashimoto et al., 1990, Plant Physiol. 93: 857.
Die transformierte Zelle kann zu einer reifen Pflanze regeneriert werden und die daraus resultierende transformierte Pflanze kann in einem konventionellen Zuchtprogramm verwendet werden, um mehr transformierte Pflanzen mit den gleichen Eigenschaften zu erzeugen, oder um das ms-Gen oder das Fertilitätsrestorer-Gen in andere Sorten der gleichen Pflanzenart einzuführen. Von diesen transformierten Pflanzen produziertes Saatgut enthält das/die chimärische/n Gen/e dieser Erfindung als stabiles genomisches Insert. Somit kann das ms-Gen oder das Fertilitätsrestorer-Gen dieser Erfindung, das in eine bestimmte Pflanzensorte oder Linie eingeführt wurde, jederzeit durch Rückkreuzen in eine andere Linie oder Sorte eingeführt werden.
Die oben beschriebene Methode, welche den AT-Anteil einer codierenden DNS reduziert, während der Codon-Gebrauch dieser codierenden DNS für eine Serie von Pflanzenarten optimiert wird, mit der die synthetischen Barstar-DNS dieser Erfindung gewonnen wurden, kann man natürlich auch an allen Codierungssequenzen anwenden, für die eine optimale Expression in einer Anzahl von Pflanzenarten erwünscht ist. In dieser Hinsicht kann die Methode zum Beispiel an Genen des Bacillus thuringiensis, die insektizide Proteine codieren, angewendet werden, zum Beispiel den vollständigen oder verkürzten Crylab- und Cry9C-Genen ( EP 0,193,259 ; EP 0,654,075 ).
Alle durchgeführten experimentellen Verfahren für die Manipulation rekombinanter DNS entsprechen den standardisierten Verfahren beschrieben in Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, und Ausubel et al., 1994, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, falls nicht anderwertig vermerkt.
Zur Klonierung und/oder Amplifikation von DNS-Fragmenten wurden Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) angewendet. Die Overlap-Extension-PCR wurde bei der Konstruktion von chimärischen Genen angewandt (Horton et al., 1989, Gene 77: 61–68; Ho et al., 1989, Gene 77: 51–59).
Alle PCR Reaktionen wurden unter konventionellen Bedingungen mit der Vent^TM-Polymerase (Cat. No. 254L – Biolabs New England, Beverley, MA 01915, U.S.A.) isoliert von Thermococcus litoralis (Neuner et al., 1990, Arch. Microbiol. 153: 205–207) durchgeführt. Oligonukleotide wurden unter Berücksichtigung der von Kramer und Fritz (1987, Methods in Enzymology 154: 350) aufgestellten Regeln entwickelt und von einem Applied Biosystems 380A DNA-Sythesizer mittels des Phosphoramidit-Verfahrens hergestellt (Beaucage and Caruthers, 1981, Tetrahedron Letters 22: 1859).

Die Beschreibung und die folgenden Beispiele beziehen sich auf die folgende Sequenzliste und die folgenden Darstellungen: Sequenzliste

SEQ ID No. 1:	Wildtyp-Barstar-DNS
SEQ ID No. 2:	Wildtyp-Barstar
SEQ ID No. 3:	Synthetische Barstar-DNS
SEQ ID No. 4:	Verbessertes Barstar
SEQ ID No. 5:	Plasmid pMV71
SEQ ID No. 6:	Relevanter Teil des Plasmids pLH43
SEQ ID No. 7:	T-DNS von Plasmid pTTS24
SEQ ID No. 8:	Oligonukleotid CASOLX1
SEQ ID No. 9:	Oligonukleotid CASOLX2
SEQ ID No. 10:	Plasmid pLH48

Unter einer Nukleotid- oder Aminosäuresequenz zwischen Position X und Y (oder einer Sequenz von Position X bis Position Y) versteht sich eine Sequenz, welche die Rückstände an den Positionen X und Y beinhaltet.
Um funktionelle DNS-Elemente anzugeben, werden die Abkürzungen dieser Liste verwendet.
BEISPIELE
Beispiel 1: Herstellung einer verbesserten Barstar-DNS
Eine verbesserte Barstar-DNS wurde hergestellt, indem das Alanin-Codon GCC durch gezielte Mutagenese zwischen das erste Codon (ATG) und das zweite Codon (AAA) von Wildtyp-Barstar eingefügt wurde. Die verbesserte Barstar-DNS codiert somit ein verbessertes Barstar, welches, verglichen mit Wildtyp-Barstar, einen veränderten N-Terminus hat, der aus Met-Ala-Lys besteht (anstatt aus Met-Lys bei Wildtyp-Barstar). Diese nicht-konservative Modifikation an dem N-Terminus wirkt sich nicht auf die biologische Aktivität des verbesserten Barstars in Pflanzenzellen aus (siehe Beispiel 6).
Beispiel 2: Design und Herstellung einer synthetischen Barstar-DNS
Eine synthetische Barstar-DNS, die das verbesserte Barstar aus Beispiel 1 codiert, wurde unter Berücksichtigung der folgenden Kriterien entwickelt:

– der prozentuale Anteil von A und T Nukleotiden in dem synthetischen Barstar soll unter 40% liegen (Wildtyp-Barstar-DNS hat einen AT-Anteil von 51,6%). AT-reiche Gene haben eine höhere Tendenz, Polyadenylierungssignale und Intron-Erkennungssequenzen zu beinhalten, was die Expression von, vor allem langen, Codierungssequenzen (z.B. Bt-Codierungssequenzen) in Pflanzenzellen verhindern oder verringern kann
– trotz der Zunahme von C- und G-Nukleotiden sollte die Anzahl von CG-Dinukleotiden und CNG-Trinukleotiden so gering wie möglich bleiben Der Grund hierfür ist, dass CG-Dinukleotide und CNG-Trinukleotide für Methylisierung anfällig sind, was ein Gen in Pflanzenzellen neutralisieren kann.
– der Codon-Gebrauch sollte in einer möglichst großen Auswahl von Pflanzenarten optimal sein, insbesondere Ölraps, Baumwolle, Mais, Reis und Weizen. Daher wurden für jede Aminosäure ein oder mehrere Codone zum bevorzugten Gebrauch in der Barstar-DNS ausgewählt, deren Häufigkeit in der Mehrzahl der Pflanzenarten wenigstens zwei mal höher, als die des am wenigsten gebrauchten Codons ist und/oder wenigstens höher als die Hälfte der des am häufigsten gebrauchten Codons. Somit wurden für jede Pflanzenart und Aminosäure eine Liste von Codonen erstellt, deren Häufigkeit wenigstens zwei mal höher ist, als die des in dieser Pflanzenart am wenigsten gebrauchten Codons und/oder wenigstens höher ist, als die Hälfte der des in dieser Pflanzenart am häufigsten gebrauchten Codons (Codone, die diesem Kriterium entsprechen werden als optimale Codone für diese Pflanzenart bezeichnet). Das für die meisten Pflanzenarten optimale Codon wird als das bevorzugte Codon, möglichst als das einzige Codon, für diese Aminosäure der synthetischen Barstar-DNS verwendet. Der Einfachheit halber wurden dieser Analyse die von Ikemura (supra) aufgelisteten Codon-Häufigkeiten zugrunde gelegt.
– Aneinanderreihungen von 4 identischen Nukleotiden sollten vermieden werden

Dies ergab eine synthetische Barstar-DNS mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 3. Obwohl diese synthetische Barstar-DNS einen AT-Anteil von 38.4% hat, beinhaltet sie nur 16 CG-Dinukleotide und 24 CNG-Trinukleotide. Die synthetische Barstar-DNS enthält keine potentiellen Pflanzen-Polyadenylierungssignale oder Intron-Splice-Stellen.
Der Codon-Gebrauch der synthetischen Barstar-DNS scheint in mindestens Ölraps, Baumwolle, Mais, Reis, und Weizen für die Expression geeignet zu sein (Tabelle 1). Von 18 Aminosäuren der synthetischen Barstar-DNS, für die multiple Codone vorhanden sind, werden 17 hauptsächlich (und 16 ausschließlich) von einem Codon codiert, das für jede dieser fünf Pflanzenarten ein optimales Codon ist. Tatsächlich sind alle Aminosäuren, für die multiple Codone vorhanden sind, hauptsächlich von einem Codon codiert, das für mindestens drei dieser fünf Pflanzenarten ein optimales Codon ist.
Die synthetische Barstar-DNS enthält nur einen CCCCC und einen GGGG Abschnitt.
Das synthetische Barstar von SEQ ID No. 3 hat die folgenden, zum Klonen brauchbaren Restriktionsstellen zueigen: NcoI, BspE1 and KasI.
Beispiel 3: Expression von verbesserten Barstar-DNS in Mais-Zellen
Kulturen von Black-Mexican-Sweet-Maiszellen (BMS) wurden von einem Bio-Rad PDS-1000/HE Particle-Gun (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, California, U.S.A.) mit Mikroprojektilen (Goldpartikeln) bombardiert, die wie folgt mit entweder dem Plasmid pLH43 oder dem Plasmid pMV71 beschichtet waren.
BMS-Suspensionszellen wurden auf geeigneten Filtern platziert und in konventionellen Verfahren bombardiert (Kirihara, 1994, in "The Maize Handbook", Freeling and Walbot, eds., Springer Verlag, pp 690–694), denen eine osmotische Vorbehandlung voraus ging. (Russel et al., 1992, In Vitro 28: 97–105). Die Goldpartikel wurden mit einer Mischung der entsprechenden Plasmid-DNS, bestehend aus der Barstar-DNS und dem Plasmid pAct1-D (McElroy et al., 1990, The Plant Cell 2: 163–171) in einem Mischverhältnis von 5:1, durch die, in dem Handbuch des Herstellers beschriebenen Verfahren, beschichtet. Das Plasmid pAct1-D enthält das gus-Gen (das Beta-Glucuronidase codiert) unter der Kontrolleder Promotors des Actin-Gens von Reis, welches von Position 1999 bis 3400 im Wesentlichen die in SEQ ID No. 5 beschriebene Sequenz enthält.
Pro Plasmid wurden zwei bis drei Filter bombardiert. 24 Stunden nach der Bombardierung wurden die Zellen von jedem Filter gesammelt und durch Mahlen in flüssigem Stickstoff aufgebrochen. Die aufgebrochenen Zellen von jedem Filter wurden in zwei gleiche Hälften aufgeteilt, die eine für eine Barstar-Probe, die andere für eine GUS-Probe.
Für jeden Filter wurde das gesamte lösliche Zellprotein einer dieser Hälften in einem Extraktionspuffer extrahiert (50 mM Tris/HCl pH 7.5, 5% Glycerol, 100 mM KCl, 1 mM Benzamidin. HCl, 5 mM e-Amino-n-Caproinsäure, 10 mM EDTA, 10 mM EGTA, 1 μg/ml Antipain, 1 μg/ml Leupeptin, 14 mM Beta-Mercaptoethanol, 1.5% Polyvinylpolypyrrolidon, 1 mM PMSF) Die Proteinkonzentration wurde mit einem Bio-Rad Bradford Protein-Assay bestimmt. Bei jeder Probe wurden 50 μg Protein auf ein 18%iges SDS-Polyacrylamidgel geladen und durch Elektrophorese getrennt. 0.1, 0.5, 1, 2.5 und 5 ng reines Barstar wurden als Positivkontrolle auf das Gel geladen.
Die Proteine wurden dann 2 Stunden bei 60 V mit einem TGM-Puffer (25 mM Tris pH 8.3, 192 mM Glycin, 20% v/v Methanol) auf Hybond-C elektrogeblottet. Dann wurden die Filter erst für 2 Stunden in 0,5% PBS-Tween 20 und danach übernacht in einer Lösung primärer Antikörper (1/1000 Verdünnung von polyklonalem Kaninchen IgG Anti-Barstar Antikörper in PBS-0.5% Tween 20) inkubiert. Die Filter wurden dann vier Male für fünf Minuten in PBS gewaschen und danach für eine Stunde in einer Lösung von EseI-anti-Kaninchen IgG, Meerrettich-Peroxidase gekoppelt (Amersham, Buckinghamshire, Great Britain) 1/1000 verdünnt in PBS-0.5% Tween 20 inkubiert. Die Filter wurden dann wieder vier Male für fünf Minuten in PBS gewaschen, worauf das ECL-Detektionssystem (Amersham) zur Detektion der Proteine verwendet wurde. Die Barstar-Menge wurde durch densitometrische Auswertung der Autoradiogramme gemessen.
Parallel dazu wurde die Beta-Glucuronidase-Aktivität in den Proteinen die aus der anderen Hälfte der aufgebrochenen Zellen von jedem bombardierten Filter extrahiert wurden, mit einem fluorogenen Testsystem gemessen.
Die Barstar-Produktion eines Plasmids wurde bestimmt, indem die Barstar-Menge einer (beliebigen) Einheit mit der GUS-Aktivität verglichen wurde.
pMV71 ist ein Plasmid mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 5 und enthält die verbesserte Barstar-DNS von Beispiel 1. Diese Barstar-DNS ist operativ mit dem Actin-Promotor von Reis und dem 3' untranslatierten Ende des Nopalin-Synthase-Gens der Agrobacterium T-DNS verknüpft.
pLH43 ist ein Plasmid mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 5, bei dem die Sequenz zwischen Nukleotiden 3399 und 4021 durch die Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 6 ersetzt wurde. pLH43 enthält die synthetische Barstar-DNS von Beispiel 2 (SEQ ID No. 3), die operativ mit dem Actin-Promotor von Reis und dem 3' untranslatierten Ende des Nopalin-Synthase-Gens der Agrobacterium T-DNS verknüpft ist.
pTS410 ist ein Plasmid mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 5, aus dem die Nukleotiden 3404 bis 3406 (d.h. das zweite Codon der Barstar-DNS in pMV71) entfernt wurden.
Die Ergebnisse des oben beschriebenen Experiments werden in Tabelle 2 dargestellt, welche die Messungen der einzelnen Bombardierungen zeigt. Es ist klar zu erkennen, dass die Einführung der verbesserten Barstar-DNS von pMV71 und pLH43 zu einer durchschnittlich deutlich höheren Produktion von (verbessertem) Barstar-Protein führte, verglichen mit der Produktion von (Wildtyp-) Barstar nach der Einführung der Wildtyp-Barstar-DNS von pTS410. Außerdem ist erkennbar, dass die Einführung der verbesserten synthetischen Barstar-DNS von pLH43 in Mais-Zellen eine deutlich höhere Produktion von (verbessertem) Barstar-Protein in diesen Zellen zur Folge hat, verglichen mit der Produktion von (ebenfalls verbessertem) Barstar-Protein nach der Einführung der verbesserten Barstar-DNS von pMV71.
Beispiel 4: Expression von verbesserten Barstar DNS in Reispflanzen
Vier transgene männlich-sterile Reis-Linien des Kultivars Kochihibiki wurden unter Verwendung des Plasmids pTS172 erzeugt, wie im Wesentlichen in WO 92/13956 beschrieben. Das Plasmid pTS172 enthält die folgenden chimärischen Gene: P35S-bar-3'g7 und PE1-barnase-3'nos und kann aus pTS173 (siehe unten) hergestellt werden, indem man das größere, mit BstEII und MscI verdaute Fragment von pTS173 an das kleine BstEII-MscI Fragment von pJVR2-E1 ligiert.
Diese Linien wurden als K104, K107, K109 und K111 bezeichnet.
Sieben transgene männlich-fertile Restorer-Reispflanzen des Kultivars Chiyonishiki wurden, wie im Wesentlichen in WO 92/13956 beschrieben, unter Verwendung des Plasmids pTS173 erzeugt, welches die folgenden Hybridgene enthält: P35S-bar-3'g7 und PE1-Wildtyp-Barstar-3'nos. pTS173 wird von pJVR3-E1 (WO 92/13956) abgeleitet, in dem man den 35S-Promotor und das 3' untranslatierte Ende des chimärischen bar-Gens von pJVR3-E1 durch den 35S-Promotor und das 3' untranslatierte Ende des chimärischen bar-Gens von pTTS24 wie folgt ersetzt: Von dem T-DNS Insert des Plasmids pTTS24 (SEQ ID No. 7) wird ein DNS-Fragment, mit dem 3' Ende des T-DNS-Gens 7 und einem Teil des Bar-Gens, mittels einer PCR amplifiziert, wobei die Oligonukleotidprimer CASOLX1 (SEQ ID No. 8), welcher die KpnI-Stelle in dem Bar-Gen überlagert, und CASOLX2 (SEQ ID No. 9) verwendet werden. Das Produkt der PCR wird dann mit AatII und KpnI gespalten und an das große Fragment des mit AatII und KpnI gespaltenen Plasmids pJVR3-E1 ligiert. Das kleinere NcoI + NotI-Fragment (mit P35S) des erzeugten Plasmids wird durch das entsprechende NcoI + NotI-Fragment von pTTS24 (Positionen 880 bis 2281 von SEQ ID No. 7) ersetzt, was in pTS173 resultiert.
Die sich daraus ergebenden Linien wurden als C111, C113, C117, C118, C120, C121 und C125 bezeichnet. Alle diese Pflanzen enthalten somit die Wildtyp-Barstar-DNS von SEQ ID No. 1, kontrolliert von dem E1-Promotor (WO 92/13956).
32 zusätzliche Restorer-Pflanzen wurden mittels Transformation von beschädigtem, kompakten embryogenen Kallus (aus unreifen Reis-Embryonen des Kultivars Kochihibiki) hergestellt, wobei Agrobacterium als Vektor verwendet wurde (WO 92/09696). Bei dem für diese Transformation benutzten Agrobacterium-Stamm handelt es sich um Stamm Ach5 (Genetello et al., 1977, Nature 265: 561–563), ohne dessen Wildtyp-Ti-Plasmid und mit den Plasmiden pGV4000 und pTTS24. pTTS24 ist ein Zwischenvektor, der in seinen wesentlichen Eigenschaften pGSC1700 ähnelt (Cornelissen und Vandewiele, 1989, NAR 17: 19–29), sich aber von diesem hauptsächlich darin unterscheidet, dass ihm das Beta-Lactamase-Gen fehlt und dass er eine T-DNS mit der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. T enthält. pGV4000 ist ein unschädlich gemachtes Ti-Plasmid, welches von pMP90 gewonnen wurde (Koncz und Schell, 1986, Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) und welches eine Region enthält, die eine homologe Rekombination mit einer entsprechenden Region in pTTS24 erlaubt.
Diese Pflanzen, die alle die synthetische Barstar-DNS von Beispiel 2 (SEQ ID No. 3) unter der Kontrolle des E1-Promotors beinhalten, werden mit Nummern bezeichnet, denen das Kürzel OSC voraus geht, wie in Tabelle 3.
Die Menge des Barstar-Proteins wurde in allen Restorer-Linien bestimmt. Pro Linie wurden ein bis zwei unreife Rispen (d.h. Rispen in denen die Mehrzahl der Ährchen in etwa 3,5 bis 4 mm lang ist) einer einzelnen Pflanze in flüssigem Stickstoff zermalmt. Die Proteine wurden extrahiert und wie in Beispiel 3 beschrieben detektiert.
Die Resultate sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Es ist deutlich, dass die Restorer-Linien mit der Barstar-DNS von SEQ ID No. 3 erheblich mehr Barstar produzieren, als die Linien mit der Barstar-DNS von SEQ ID No. 1.
Es wurde bestätigt, dass die Menge von Barstar-mRNA in direktem Zusammenhang mit der Menge von Barstar-Protein in den Rispen steht (keine Daten angegeben). Desweiteren wurde bestätigt, dass die Produktion von Barstar-Protein effektiv auf die Blüten der Rispen beschränkt ist (keine Daten angegeben).
Ausgewählte Restorer-Linien wurden mit den vier männlich-sterilen Linien gekreuzt. Es wurde beobachtet, dass die Restorer-Kapazität der Restorer-Linien mit der in den Blüten produzierten Menge von Barstar-Protein zusammenhing. Linien, die zwischen 4 und 10 ng Barstar pro mg extrahierten Proteins produzieren, waren in der Lage die Mikrosporenentwicklung in männlich-sterilen Linien teilweise zu dem Grad wiederherzustellen, dass die „restaurierten Pflanzen" nicht-bestäubungsfähigen Pollen produzierten (männlich-sterile Pflanzen produzieren keinen Pollen). Es wurde außerdem beobachtet, dass Restorer-Linien die 50 ng oder mehr Barstar pro mg extrahierten Proteins produzierten in der Lage waren, die Fertilität in allen untersuchten männlich-sterilen Linien vollständig wiederherzustellen, d.h. alle restaurierten Nachkommen-Pflanzen produzierten vollständig bestäubungs- und funktionsfähigen Pollen, sowie normalen Samenansatz nach Selbstung.
Ausgewählte Restorer-Linien wurden auch mit sich selbst bestäubt und unreife Rispen wurden von den transgenen Nachkommen-Pflanzen geerntet. Der Grad der Expression, der mittels der Menge produzierten Barstars bestimmt wurde, war wenigstens gleich und in vielen Pflanzen größer als der, der in den primären Transformanten beobachtet wurde. Im Allgemeinen bestätigen diese Beobachtungen, dass der Grad der Barstar-Expression stabil an die Nachkommen vererbt wird.
Beispiel 5: Expression von verbesserter Barstar-DNS in Mais-Zellen
Eine transgene männlich-sterile Mais-Linie, mit der Bezeichnung MS3, wurde unter Verwendung des Plasmids pVE108 wie im Wesentlichen in WO 92/13956 beschrieben, erzeugt.
Mehrere transgene männlich-fertile Restorer-Maispflanzen mit der Wildtyp-Barstar-DNS von SEQ ID No. 1 unter Kontrolle des TA29-Promotors ( EP 344,029 ) oder des CA55-Promotors (WO 92/13957) wurden, wie im Wesentlichen in WO 95/34634 beschrieben, erzeugt. Insbesondere wurden sieben Restorer-Linien durch die Transformation von Mais mit den Plasmiden pCOL100 und pDE110 (WO 92/34634) hergestellt, welches inter alia den TA29-Promotor enthält, der operativ mit der Barstar-DNS wie in SEQ ID No. 1 beschrieben verknüpft ist. Nach Kreuzung mit MS3 Pflanzen war die Restauration unvollständig, wobei maximal 75% der Antheren befruchtungsfähigen Pollen produzierten (dies zeigt, dass die MS3-Linie besonders schwer zu restaurieren ist, da bei anderen männlich-sterilen Linien gute Restaurationsergebnisse erzielt wurden – keine Daten angegeben).
Ähnlicherweise wurden sechs transgene Mais-Restorer-Linien durch die Transformation von Mais mit dem Plasmid pLH48 hergestellt (zusammen mit ausgewählten Plasmiden von pCOL9S oder PLH52 oder p35S-Bperu oder pCOL11 (WO 92/34634)). Alle diese Restorer-Linien enthalten zumindest die synthetische Barstar-DNS von Beispiel 2 (SEQ ID No. 3) unter Kontrolle des TA29-Promotors. Die sechs Restorer-Linien wurden mit MS3-Pflanzen gekreuzt, wobei vier Restorer-Linien vollständige Restauration erzielten. Eine dieser vier Restorer-Linien wurde mit RZM583-0101 bezeichnet.
Die transgene MS3-Linie wurde von der transgenen RZM583-0101-Linie bestäubt und Nachkommen, die sowohl das chimärische Barnase-Gen als auch das chimärische Barstar-Gen enthielten wurden durch PCR Screening identifiziert. Die Seidenfäden von MS3-Pflanzen wurden von diesen fertilitäts-restaurierten Nachkommen bestäubt. Von 90 Nachkommen dieser Kreuzung wurden 15 Pflanzen als homozygot für das chimärische Barnase-Gen von MS3 identifiziert (mittels quantitaivem Southern-Blot-Verfahren). Von diesen waren die Pflanzen, welche das chimärische Barstar-Gen von RZM583-0101 nicht enthielten, männlich-steril, während die Pflanzen, welche dieses Gen enthielten vollständig männlich-fertil waren. Dies zeigt, dass die Fertilität von Pflanzen mit einem chimärischen Barnase-Gen in homozygotem Zustand durch ein chimärisches Barstar-Gen, das die verbesserte synthetische Barstar-DNS enthält, wiederhergestellt werden kann.
Daraus lässt sich der Schluss ziehen, dass die Restorer-Linien, welche die verbesserte synthetische Barstar-DNS enthalten, eine deutlich bessere Restorer-Kapazität besitzen.
Die Barstar-Menge in unreifen Quasten (mit einkernigen Mikrosporen) von Nachkommen-Restorerpflanzen wurde wie im Wesentlichen in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt. Es wurde beobachtet, dass die Menge von Barstar-Protein in den Quasten von Restorer-Pflanzen, welche die verbesserte synthetische Barstar-DNS enthalten, deutlich größer war, als die Menge von Barstar-Protein in den Quasten von Restorer-Pflanzen mit der Wildtyp-Barstar-DNS. Zum Beispiel wurde in einer Pflanze, mit der Wildtyp-Barstar-DNS ein Barstar-Anteil von weniger als 20 ng Barstar/mg Gesamtprotein festgestellt. Im Gegensatz dazu fand man in den unreifen Quasten zweier Linien, welche die verbesserte synthetische Barstar-DNS enthielten, Barstar-Anteile von 210 bzw. 100 ng Barstar/mg Gesamtprotein.
Beispiel 6: Aktivität von Wildtyp-Barstar und verbessertem Barstar in den Staubblattzellen von Ölraps.
Ölraps-Pflanzen (Kultivar Drakkar) wurden mit den Plasmiden pTHW118 oder pTTS139 transformiert, wobei Agrobacterium als Vektor verwendet wurde. Das Plasmid pTHW118 enthält die Wildtyp-Barstar-DNS (SEQ ID No. 1) unter der Kontrolle des TA29-Promotors. Das Plasmid pTTS139 enthält eine verbesserte Barstar-DNS mit einem zusätzlichen GCC-Alanin-Codon zwischen dem ersten und dem zweiten Codon von Wildtyp- Barstar-DNS. Somit codiert die Barstar-DNS in pTTS139 das verbesserte Barstar-Protein von SEQ ID No. 4.
Zwei mit pTHW118 transformierte Ölraps-Linien, bezeichnet als DBN366-0011 bzw. DBN366-0029, und zwei mit pTTS139 transformierte Ölraps-Linien bezeichnet als DBN342-1010 und DBN367-0035 wurden für die quantitative Analyse ausgewählt.
Ölrapsblütenknospen mit einer Länge von ca. 3 bis 4 mm wurden von den Pflanzen isoliert und in flüssigem Stickstoff zermalmt. Die Proteine wurden extrahiert und die Menge des gesamten extrahierten Proteins, sowie die mittels des Western-Blot-Verfahren festgestellte Barstar-Menge wurde, wie im Wesentlichen in Beispiel 3 beschrieben, bestimmt. Tabelle 4 zeigt die Gesamtmenge des extrahierbaren Proteins (Spalte 4) und die Barstar-Menge (Spalte 2), die in jeder Linie gefunden wurden.
Die Barstar-Aktivität wurde mittels eines, im Wesentlichen von Fitzgerald und Hartley (1993, supra) beschriebenen Testsystems gemessen. Zu 600 μl TE Puffer (10 mM Tris/HCl pH 8.0; 1 mM EDTA) wurden

– 20 μl einer 0.02 M NH4 Acetat pH 8.0 Lösung mit 10 μg/ml Rinderserumalbumin und 0.1 μg/ml Barnase,
– "x" μl einer 1:5 Verdünnung von aus den Knospen extrahierten Proteins ("x" = 0, 4, 8, 12, 16, 20 respektive).

Nach dem Mischen und etwa einer Minute Wartezeit, wurden 6 μl einer 1:10 Verdünnung einer Vorratslösung mit 0.4 mg/ml Polyethenoadenosinphosphat in TE-Puffer zugegeben.
Diese Lösung wurde gemischt und sofort in eine Küvette gefüllt, und die Steigerung der Fluoreszenz wurde ein oder zwei Minuten lang aufgezeichnet.
Die Werte der anfänglichen Steigerung der Fluoreszenz/Minute wurden gegen „x" (dem Volumen der Barstar enthaltenden Lösung) aufgetragen. In jedem Fall ergab sich wie erwartet ein lineares Verhältnis. Der Schnittpunkt der Regressionslinie mit der X-Achse wurde berechnet (Tabelle 4, Spalte 3): Dies stellt das Volumen von „x" dar, das genügend Barstar enthält, um 2 ng Barnase vollständig zu neutralisieren (d.h. das Volumen, das eine molare Menge Barstar enthält, die 2 ng Barnase entspricht). Hiervon lässt sich sowohl die Menge von „aktivem" Barstar in den Blütenknospen (Tabelle 4, Spalte 5) als auch das Mengenverhältnis von „aktivem" Barstar zu dem gesamtem, mittels Western Blot entdeckten, Barstar-Protein ableiten.
Aus diesen Verhältniszahlen geht hervor, dass die Aktivität von verbessertem Barstar wenigstens gleich der von Wildtyp-Barstar ist. Jedoch während Linien, die mit pTHW118 (welches Wildtyp-Barstar exprimiert) transformiert wurden, einen Mittelwert von 0.27 (Standardabweichung 0,08) haben, weisen mit pTTS139 transformierte Linien einen Mittelwert von 0,39 (Standardabweichung 0,08) auf. Der Unterschied zwischen den durchschnittlichen Verhältnissen ist statistisch signifikant (t = –26, p < 0.005). Dies erlaubt die Schlussfolgerung, dass in Ölrapsblütenknospen produziertes verbessertes Barstar im Allgemeinen einen größeren Anteil aktiven Barstars aufweist, als Wildtyp-Barstar. Tabelle 1

a) + : bedeutet, dass das Codon ein optimales Codon in dieser Pflanze ist, d.h. es hat in dieser Pflanze eine Häufigkeit, die wenigstens zwei mal höher ist, als die des in dieser Pflanze am wenigsten gebrauchten Codons und/oder wenigstens 50% der des in dieser Pflanze am häufigsten gebrauchten Codons. Codonhäufigkeiten in Pflanzenarten wie von Ikemura (supra) aufgelistet (in Tausend). – : bedeutet, dass das Codon in dieser Pflanze kein optimales Codon ist, wie oben definiert.
b) Aminosäure für die multiple Codone vorhanden sind (nicht Trp, Met)
c) Codon, das in der synthetischen Barstar-DNS von SEQ ID No. 3 für die Aminosäure verwendet wurde.
d) Anzahl der Aminosäuren, die dieses Codon in SEQ ID No. 3 codiert.

a) Mittels Western Blot festgestellte Menge von Barstar/50 μg geladenes Protein.
b) Gus-Aktivität in beliebigen Einheiten
c) Korrigiertes Barstar ng Barstar/Einheiten GUS-Aktivität

^a) unter Detektionslimit

SEQUENZLISTE

Claims

DNA mit einer Barstar, die für ein Barstar mit einer Aminosäuresequenz, die mit Met-Ala beginnt, codiert.
DNA nach Anspruch 1, wobei die Barstar-DNA weniger als 40% A- und T-Nukleotide enthält.
DNA nach Anspruch 1, mit für Raps, Baumwolle, Mais, Reis und Weizen optimiertem „Codon Usage".
DNA nach Anspruch 1, wobei die Barstar-DNA maximal 7% CG-Dinukleotide und maximal 9,5% CNG-Trinukleotide enthält.
DNA nach Anspruch 1, wobei die Barstar-DNA für ein Barstar mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID Nr. 4 codiert.
DNA nach Anspruch 1, wobei die Barstar-DNA die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 3 aufweist.
DNA nach Anspruch 1, wobei die Barstar-DNA die Nukleotidsequenz ATGGCC und im Anschluß daran die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 1 zwischen Position 7 und Position 270 aufweist.
DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Barstar-DNA operativ mit einem Promoter, der die Transkription in Pflanzenzellen steuert, verbunden ist.
DNA nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Promoter um einen Promoter handelt, der die Transkription selektiv in den Staubblattzellen einer Pflanze steuert.
DNA nach Anspruch 8 oder 9, wobei es sich bei dem Promoter um einen Promoter handelt, der die Transkription zumindest in Tapetenzellen einer Pflanze steuert.
DNA nach Anspruch 10, wobei es sich bei dem Promoter um den Promoter des TA29-Gens von Tabak, den Promoter des CA55-Gens von Mais oder den Promoter des E1-, T72- oder T42-Gens von Reis handelt.
DNA nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Promoter um einen konstitutiven Promoter handelt.
DNA nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem Promoter um den 35S-Promoter handelt.
Pflanzenzelle mit der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
Pflanzenzelle nach Anspruch 14, die auch eine Barnase-DNA umfaßt.
Pflanze mit der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
Pflanze nach Anspruch 16, die auch eine Barnase-DNA umfaßt.
Pflanze nach Anspruch 16 oder 17, bei der es sich um eine Raps-, Baumwoll-, Mais-, Reis- oder Weizenpflanze handelt.
Pflanze nach Anspruch 16 oder 17, bei der es sich um eine einkeimblättrige Pflanze handelt.
Pflanze nach Anspruch 19, die mindestens 20 ng Barstar pro mg aus ihrem aus Blütenständen extrahierbarem Gesamtprotein produziert.
Barstar, das von der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7 codiert wird.
Verfahren zur Restorierung der Fertilität einer pollensterilen Pflanzenlinie, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (a) Einbringen eines Hybridgens, das die DNA nach einem der Ansprüche 1–7 in operativer Verknüpfung mit einem Pflanzenpromoter umfaßt, in eine Pflanzenlinie; (b) Kreuzen dieser Pflanzenlinie mit einer pollensterilen Linie, die aufgrund der Expression einer für eine Barnase codierenden Pollensterilitäts-DNA pollensteril ist; sowie (c) Gewinnen von Nachkommenschaft dieser pollensterilen Linie mit diesem Hybridgen, bei der die Fertilität restoriert ist.
Verwendung der DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Restorierung der Fertilität einer pollensterilen Pflanzenlinie, die aufgrund der Expression einer Pollensterilitäts-DNA, die für eine Barnase codiert, pollensteril ist.