DE60027469T2

DE60027469T2 - Hybride von winter-ölraps und methoden zu derer herstellung

Info

Publication number: DE60027469T2
Application number: DE60027469T
Authority: DE
Inventors: Greta De Both; Marc De Beuckeleer
Original assignee: Bayer Bioscience NV
Current assignee: Bayer CropScience NV
Priority date: 1999-12-08
Filing date: 2000-12-06
Publication date: 2006-12-14
Anticipated expiration: 2020-12-07
Also published as: CN1409594A; CN1690211A; US20100248232A1; DE60027469D1; US20010029620A1; CZ306357B6; HK1051295A1; US8026352B2; HUP0203347A2; AU783406B2; CZ20022367A3; CN1690211B; UA88861C2; DK1244348T3; AU3013301A; PL356533A1; EP1244348A1; US6506963B1; US8309699B2; HK1084415A1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Winterraps-(WOSR-)pflanzen, genauer gesagt, ein Paar Winterrapspflanzen, das sich besonders zur Erzeugung von Hybridsamen eignet. Genauer gesagt, ist, die eine Pflanze dadurch gekennzeichnet, daß sie aufgrund des Vorliegens eines Pollensterilitätsgens in ihrem Genom pollensteril ist, während die andere Pflanze dadurch gekennzeichnet ist, daß sie ein Fertilitätsrestorer-Gen trägt, das die Aktivität des Pollensterilitätsgens hemmen kann. Das Paar erfindungsgemäßer WOSR-Pflanzen vereinigt die Fähigkeit zur Bildung von Hybridsamen mit optimaler agronomischer Gesamtleistung, genetischer Stabilität und Anpassungsfähigkeit an unterschiedliche genetische Hintergründe.
Hintergrund der Erfindung
Die phänotypische Expression eines Transgens in einer Pflanze wird sowohl von der Struktur des Gens selbst als auch durch seine Stellung im Pflanzengenom bestimmt. Das Vorliegen des Transgens an verschiedenen Stellen im Genom beeinflußt gleichzeitig den Gesamtphänotyp der Pflanze in unterschiedlicher Weise. Eine agronomisch oder industriell erfolgreiche Einführung eines kommerziell interessanten Merkmals in eine Pflanze durch genetische Manipulation kann in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren ein langwieriges Verfahren sein. Die eigentliche Transformation und Regeneration genetisch transformierter Pflanzen sind nur die ersten in einer Reihe von Selektionsschritten, zu denen ausgiebige genetische Charakterisierung, Züchtung und Evaluation in Feldstudien gehören.
Raps (OSR) (Brassica napus, AACC, 2n = 38) ist eine natürliche Hybride, die sich aus der Inter-Spezies-Hybridisierung von Kohl (Brassica oleracea, CC, 2n = 18) und Rübe (Brassica campestris, AA, 2n = 20) ergibt. Winterraps wird während der letzten 10 Tage des August und der ersten zehn Tage des September ausgesät und im folgenden Juli geerntet, wobei er eine gemäßigte Periode für die Vernalisierung benötigt. Die schnellerwüchsigen Sommerrapse werden im späten März und frühen April ausgesät und Mitte August bis September geerntet. Die Haupttypen des zurzeit angezogenen OSR sind Niedrig- und Hoch-Erucasäure-Varietäten. Doppelt-niedrige-(00-)Varietäten enthalten niedrige Spiegel (üblicherweise weniger als 1%) an Erucasäuren (die für Menschen schwerverdaulich sind) und niedrige Spiegel von Glucosinolaten (durch die das Mehlnebenprodukt für Tiere unverdaulich wird). Gegenwärtige Verwendungen von "00"-Varietäten sind u.a. Öl für den menschlichen Verzehr und proteinreiches Mehl für Tierfutter. Industrielle Verwendungen sind u.a. Beschickungen für pharmazeutische und hydraulische Öle. Hoch-Erucasäure-Raps-(HEAR-)Varietäten werden speziell aufgrund ihres Erucasäuregehalts – gewöhnlich 50–60% des Öls – angebaut. Die hauptsächliche Endverwendung von HEAR ist zur Produktion von Erucamid, einem bei der Polyethan-Herstellung verwendeten "Gleitmittel". Ein kleiner Teil wird zur Herstellung von Behenylalkohol verwendet, der zu wachsartigem rohem Mineralöl gegeben wird, um dessen Fluß zu verbessern.
Winterrapspflanzen sind Zwitter und üblicherweise zu 60–70% selbstbestäubend. Die Produktion von Hybriden und die Einführung genetischer Variation als Basis zur Selektion hing herkömmlicherweise von der Adaptation natürlich auftretender Phänomene ab, wie Selbstinkompatibilität und cytoplasmatische Pollensterilität. Künstliche Bestäubungskontrollverfahren, wie manuelle Kastration oder die Verwendung von Gametoziden, werden bei der OSR-Züchtung aufgrund ihrer beschränkten Durchführbarkeit bzw. hohen Kosten nicht weitverbreitet eingesetzt.
Man hat transgene Verfahren zur Produktion pollen- oder weiblich-steriler Pflanzen entwickelt, die interessante Alternativen zu den herkömmlichen Techniken bieten.
EP 0,344,029 beschreibt ein System zur Gewinnung von Kern-Pollensterilität, wobei Pflanzen mit einem Pollensterilitätsgen transformiert werden, das zum Beispiel eine DNA enthält, die eine Barnase unter Kontrolle eines Tapetum-spezifischen Promotors, PTA29, enthält, die nach der Einführung in eine Pflanze eine selektive Zerstörung von Tapetumzellen gewährleistet. Die Transformation von Tabak- und Rapspflanzen mit einem solchen chimären Gen ergab Pflanzen, in denen die Pollenbildung vollkommen verhindert war (Mariani et al. 1990, Nature 347: 737–741).
Zur Wiederherstellung der Fertilität einer pollensterilen Pflanze wurde ein System entwickelt, wobei die pollensterile Pflanze mit einer transgenen Pflanze gekreuzt wird, die ein Fertilitätsrestorer-Gen trägt, das, wenn es exprimiert wird, die Aktivität des Pollensterilitätsgens hemmen oder verhindern kann ( US 5,689,041 ; US 5,792,929 ). Ein solches Fertilitätsrestorer-Gen wird unter die Kontrolle eines Promotors gestellt, der die Expression in mindestens den Zellen steuert, in denen das Pollensterilitätsgen exprimiert wird. Mariani et al. (1992, Nature 357: 384–387) zeigten, daß die durch das pTA29:Barnase-Gen codierte Sterilität durch das chimäre pTA29:Barstar-Gen in Raps wiederhergestellt werden kann.
Die cytochemische und histochemische Analyse der Antherenentwicklung von Brassica-napus-Pflanzen, die das chimäre pTA29:Barnase-Gen allein oder mit pTA29:Barstar umfassen, wurde von De Block und De Brouwer (1993, Planta 189: 218–225) beschrieben.
Eine erfolgreiche Transformation von Brassica-Spezies wurde durch eine Reihe von Verfahren erhalten, einschließlich Agrobacterium-Infektion (wie zum Beispiel in EP 0,116,718 und EP 0,270,882 beschrieben), Mikroprojektilbeschuß (wie zum Beispiel von Chen et al., 1994, Theor. Appl. Genet. 88: 187–192 beschrieben) und direkter DNA-Aufnahme (wie zum Beispiel von De Block et al. 1989, Plant Physiol. 914: 694–701; Poulsen 1996, Plant Breeding 115: 209–225 beschrieben).
Die vorstehenden Dokumente lehren jedoch nicht die vorliegende Erfindung noch legen sie sie nahe.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Paar WOSR-Pflanzen, die sich besonders zur Erzeugung von Hybridsamen eignen. Genauer gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung eine erste transgene WOSR-Pflanze oder deren Samen, Zellen oder Gewebe, die integriert in ihr Genom eine Expressionskassette enthält, die ein Pollensterilitätsgen enthält, und eine zweite transgene WOSR-Pflanze oder deren Samen, Zellen oder Gewebe, die integriert in ihr Genom eine Expressionskassette enthält, die ein Fertilitätsrestorer-Gen enthält, sowie den Hybridsamen, der durch die Kreuzung der ersten und der zweiten Pflanze erhalten wird, der das Pollensterilitätsgen und/oder das Fertilitätsrestorer-Gen in sein Genom integriert enthält.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung enthält/enthalten die erste WOSR-Pflanze oder deren Samen, Zellen oder Gewebe die Expressionskassette von pTHW107. Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält/enthalten die erste WOSR-Pflanze oder deren Samen, Zellen oder Gewebe das Event MS-BN1.
Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung enthält/enthalten die zweite WOSR-Pflanze oder deren Samen, Zellen oder Gewebe die Expressionskassette von pTHW1118. Bei der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält/enthalten die WOSR-Pflanze oder deren Samen, Zellen oder Gewebe das Event RF-BN1. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die erste WOSR-Pflanze das Event MS-BN1 und die zweite WOSR-Pflanze das Event RF-BN1, und der daraus erhaltene Hybridsamen enthält sogar MS-BN1 und RF-BN1 oder nur RF-BN1.
Die Erfindung betrifft transgenen WOSR-Samen oder eine Pflanze, die aus diesem Samen gezogen werden kann, deren genomische DNA durch eines oder beide der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

a) die genomische DNA kann mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, stärker bevorzugt mindestens vier, am stärksten bevorzugt fünf der Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
i) einen Satz von zwei EcoRI-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2266 bp, und eines mit einer Länge von mehr als 14 kbp;
ii) einen Satz von zwei EcoRV-Fragmenten, wobei eines eine Länge zwischen 1159 und 1700 bp, vorzugsweise von etwa 1,4 kbp, und das andere eine Länge von mehr als 14 kbp hat;
iii) einen Satz von zwei HpaI-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 1986 und 2140 bp, vorzugsweise mit einer Länge von etwa 1990 bp, und eines mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2229 bp;
iv) einen Satz von drei AflIII-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 514 und 805 bp, vorzugsweise mit einer Länge von etwa 522 bp, und eines mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2250 bp, und eines mit einer Länge zwischen 2450 und 2838 bp, vorzugsweise etwa 2477 bp;
v) einen Satz von zwei NdeI-Fragmenten, beide mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise eines mit etwa 6500 bp und eines mit einer Länge von etwa 10 kbp; wobei jedes der Restriktionsfragmente unter Standard-Stringenzbedingungen mit dem 3942-bp-Fragment hybridisieren kann, das die PTA29-Barnase-Sequenz enthält, das durch HindIII-Spaltung des hier beschriebenen Plasmids pTHW107 erhältlich ist; und/oder
b) die genomische DNA kann mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, stärker bevorzugt vier der Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
i) einen Satz von drei BamHI-Fragmenten, wobei eines eine Länge zwischen 805 und 1099 bp, vorzugsweise etwa 814 bp, hat, eines eine Länge zwischen 1700 und 1986 bp, vorzugsweise etwa 1849 bp, hat, eines eine Länge zwischen 2450 und 2838 bp, vorzugsweise etwa 2607 bp, hat und eines eine Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise etwa 6500 bp, hat;
ii) einen Satz von vier EcoRI-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 805 und 1159 bp, vorzugsweise etwa 1094 bp, eines mit einer Länge zwischen 1986 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2149 bp, und zwei mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise eines mit etwa 7000 bp und eines mit einer Länge von etwa 10 kbp;
iii) einen Satz von zwei EcoRV-Fragmenten, wobei beide eine Länge zwischen 5077 und 14057 bp haben, vorzugsweise hat eines eine Länge von etwa 5,4 kbp und das andere eine Länge von etwa 8 kbp;
iv) einen Satz von drei HindIII-Fragmenten, wobei eines eine Länge zwischen 1700 und 2140 bp, vorzugsweise etwa 1969 bp, hat und zwei eine Länge zwischen 2450 und 2838 bp haben, wobei vorzugsweise eines eine Länge von etwa 2565 bp und eines eine Länge von etwa 2635 bp hat; wobei jedes der Restriktionsfragmente unter Standard-Stringenzbedingungen mit dem 2182-bp-Fragment hybridisieren kann, das die PTA29-Barstar-Sequenz enthält, das durch HpaI-Spaltung des hier beschriebenen Plasmids pTHW118 erhältlich ist;

Die vorliegende Erfindung betrifft den Samen einer WOSR-Pflanze oder einer Pflanze, die aus diesem Samen gezogen werden kann, oder deren Zellen oder Gewebe, deren genomische DNA durch eines oder beide der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

a) die genomische DNA kann mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, zum Beispiel mindestens vier, stärker bevorzugt fünf der Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben, die aus der vorstehend unter a) beschriebenen Gruppe ausgewählt sind, die die vorstehend unter a) i), ii), iii), iv) und v) beschriebenen Sätze von Restriktionsfragmenten enthält, wobei die Selektion jede Kombination der vorstehend unter a) beschriebenen i), ii), iii), iv) und v) beinhalten kann; und/oder
b) die genomische DNA kann mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, am stärksten bevorzugt vier der Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben, die aus der vorstehend unter b) beschriebenen Gruppe ausgewählt sind, die die vorstehend unter b) i), ii), iii) und iv) beschriebenen Sätze von Restriktionsfragmenten enthält, wobei die Selektion jede Kombination der vorstehend unter b) beschriebenen i), ii), iii) und iv) beinhalten kann.

Die Erfindung betrifft ferner WOSR-Samen oder aus einem solchen Samen gezogene Pflanzen, deren genomische DNA durch eines oder beide der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

c) die genomische DNA kann verwendet werden, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 260 und 300 bp, vorzugsweise von etwa 280 bp, mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren und/oder
d) die genomische DNA kann verwendet werden, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 195 und 235 bp, vorzugsweise von etwa 215 bp, mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 23 bzw. SEQ ID Nr. 41 zu amplifizieren.

Die Erfindung betrifft ferner WOSR-Samen oder aus diesem Samen gezogene Pflanzen, deren genomische DNA durch die vorstehend unter a) und c) beschriebenen Merkmale und/oder die vorstehend unter b) und d) beschriebenen Merkmale gekennzeichnet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft den Samen einer WOSR-Pflanze oder eine Pflanze, die aus diesem Samen gezogen werden kann, deren genomische DNA durch eines oder beide der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

a) die genomische DNA kann mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, stärker bevorzugt mindestens vier, am stärksten bevorzugt fünf der Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
i) einen Satz von zwei EcoRI-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2266 bp, und eines mit einer Länge von mehr als 14 kbp;
ii) einen Satz von zwei EcoRV-Fragmenten, wobei eines eine Länge zwischen 1159 und 1700 bp, vorzugsweise von etwa 1,4 kbp, und das andere eine Länge von mehr als 14 kbp hat;
iii) einen Satz von zwei HpaI-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 1986 und 2140 bp, vorzugsweise mit einer Länge von etwa 1990 bp, und eines mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2229 bp;
iv) einen Satz von drei AflIII-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 514 und 805 bp, vorzugsweise mit einer Länge von etwa 522 bp, eines mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2250 bp, und eines mit einer Länge zwischen 2450 und 2838 bp, vorzugsweise etwa 2477 bp;
v) einen Satz von zwei NdeI-Fragmenten, beide mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise eines mit etwa 6500 bp und eines mit einer Länge von etwa 10 kbp; wobei jedes der Restriktionsfragmente unter Standard-Stringenzbedingungen mit dem 3942-bp-Fragment hybridisieren kann, das die PTA29-Barnase-Sequenz enthält, die durch HindIII-Spaltung des hier beschriebenen Plasmids pTHW107 erhältlich ist; und/oder
c) die genomische DNA kann verwendet werden, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 260 und 300 bp, vorzugsweise von etwa 280 bp, mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft den Samen einer WOSR-Pflanze, vorzugsweise einer pollensterilen Pflanze, oder einer Pflanze, die aus diesem Samen gezogen werden kann, oder deren Zellen oder Gewebe, deren genomische DNA dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, stärker bevorzugt fünf der Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben kann, die aus der vorstehend beschriebenen Gruppe ausgewählt sind, die die vorstehend unter i), ii), iii), iv) und v) beschriebenen Sätze von Restriktionsfragmenten enthält, wobei die Selektion jede Kombination der vorstehend beschriebenen i), ii), iii), iv) und v) beinhalten kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner den Samen einer WOSR-Pflanze oder eine Pflanze, die aus diesem Samen gezogen wird, deren genomische DNA durch eines oder beide der folgenden Merkmale gekennzeichnet ist:

b) die genomische DNA kann mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, stärker bevorzugt vier der Restriktionsfragmente oder Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
i) einen Satz von drei BamHI-Fragmenten, wobei eines eine Länge zwischen 805 und 1099 bp, vorzugsweise etwa 814 bp, hat, eines eine Länge zwischen 1700 und 1986 bp, vorzugsweise etwa 1849 bp, hat, eines eine Länge zwischen 2450 und 2838 bp, vorzugsweise etwa 2607 bp, hat und eines eine Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise etwa 6500 bp, hat;
ii) einen Satz von vier EcoRI-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 805 und 1159 bp, vorzugsweise etwa 1094 bp, eines mit einer Länge zwischen 1986 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2149 bp, und zwei mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise eines mit etwa 7000 bp und eines mit einer Länge von etwa 10 kbp;
iii) einen Satz von zwei EcoRV-Fragmenten, wobei beide eine Länge zwischen 5077 und 14057 bp haben, vorzugsweise hat eines eine Länge von etwa 5,4 kbp und das andere eine Länge von etwa 8 kbp;
iv) einen Satz von drei HindIII-Fragmenten, wobei eines eine Länge zwischen 1700 und 2140 bp, vorzugsweise etwa 1969 bp, hat und zwei eine Länge zwischen 2450 und 2838 bp haben, wobei vorzugsweise eines eine Länge von etwa 2565 bp und eines eine Länge von etwa 2635 bp hat; wobei jedes der Restriktionsfragmente unter Standard-Stringenzbedingungen mit dem 2182-bp-Fragment hybridisieren kann, das die PTA29-Barstar-Sequenz enthält, das durch HpaI-Spaltung des hier beschriebenen Plasmids pTHW118 erhältlich ist; und/oder
d) die genomische DNA kann verwendet werden, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 195 und 235 bp, vorzugsweise von etwa 215 bp, mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 23 bzw. SEQ ID Nr. 41 zu amplifizieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft den Samen einer WOSR-Pflanze, vorzugsweise einer Fertilitätsrestorer-Pflanze, oder einer Pflanze, die aus diesem Samen gezogen werden kann, oder deren Zellen oder Gewebe, deren genomische DNA mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, am stärksten bevorzugt vier der Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben kann, die aus der vorstehend beschriebenen Gruppe ausgewählt sind, die die vorstehend unter b) i), ii), iii) und iv) beschriebenen Sätze von Restriktionsfragmenten enthält, wobei die Selektion jede Kombination der vorstehend beschriebenen i), ii), iii) und iv) beinhalten kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft transgene WOSR-Pflanzen, -Zellen, -Gewebe oder -Samen, die vorzugsweise durch beide der vorstehend unter b) und/oder d) beschriebenen Merkmale gekennzeichnet sind.
Die Erfindung betrifft ferner transgene, vorzugsweise Hybrid-WOSR-Pflanzen, -Zellen, -Gewebe oder -Samen mit wiederhergestellter Fertilität, die aus der Kreuzung der erfindungsgemäßen pollensterilen Pflanze mit der erfindungsgemäßen Fertilitätsrestorer-Pflanze, die durch die jeweiligen, vorstehend beschriebenen Merkmale gekennzeichnet sind, erhalten werden, wobei die Pflanzen, Zellen, Gewebe oder Samen mit wiederhergestellter Fertilität sowohl durch die vorstehend beschriebenen molekularen Merkmale der pollensterilen als auch der Fertilitätsrestorer-WOSR-Pflanze gekennzeichnet sind. Die Erfindung betrifft ferner transgene, vorzugsweise Hybrid-WOSR-Pflanzen, -Zellen, -Gewebe oder -Samen, die aus der Kreuzung der erfindungsgemäßen pollensterilen Pflanze mit der erfindungsgemäßen Fertilitätsrestorer-Pflanze, die durch die vorstehend beschriebenen molekularen Merkmale gekennzeichnet sind, erhalten werden, wobei die Hybridpflanzen, -zellen, -gewebe oder -samen durch die vorstehend beschriebenen molekularen Merkmale der Fertilitätsrestorer-WOSR-Pflanze gekennzeichnet sind.
Die Erfindung betrifft auch die Samen, die bei der ATCC unter der Eingangsnummer PTA-730 hinterlegt sind, eine aus diesem Samen gezogene Pflanze und Zellen oder Gewebe einer Pflanze, die aus diesem Samen gezogen wurde. Die Erfindung betrifft ferner Pflanzen, die durch Vermehrung von und/oder Züchtung mit einer WOSR-Pflanze, die aus dem bei der ATCC unter der Eingangsnummer PTA-730 hinterlegten Samen gezogen wurde, erhältlich sind.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung von Hybrid-WOSR-Samen, welches das Kreuzen der erfindungsgemäßen pollensterilen WOSR-Pflanze mit der erfindungsgemäßen Fertilitätsrestorer-Pflanze umfaßt.
Die Erfindung betrifft ferner eine WOSR-Pflanze, -Pflanzenzelle, -Pflanzengewebe oder -Samen, enthaltend eine rekombinante DNA, die mindestens ein Transgen enthält, integriert in einen Teil der chromosomalen DNA, die durch die Sequenz der SEQ ID Nr. 22 gekennzeichnet ist, und/oder eine rekombinante DNA, die mindestens ein Transgen enthält, integriert in einen Teil der chromosomalen DNA, die durch die Sequenz der SEQ ID Nr. 34 gekennzeichnet ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Zelle einer WOSR-Pflanze oder einer daraus erhaltenen Pflanze bereit, umfassend das Inserieren eines rekombinanten DNA-Moleküls in einen Teil der chromosomalen DNA einer WOSR-Zelle, das durch die Sequenz der SEQ ID Nr. 22 gekennzeichnet ist, und gegebenenfalls Regenerieren einer WOSR-Pflanze aus der transformierten WOSR-Zelle.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Zelle einer WOSR-Pflanze oder einer daraus erhaltenen Pflanze bereit, umfassend das Inserieren eines rekombinanten DNA-Moleküls in einen Teil der chromosomalen DNA einer WOSR-Zelle, das durch die Sequenz der SEQ ID Nr. 34 gekennzeichnet ist, und gegebenenfalls Regenerieren einer WOSR-Pflanze aus der transformierten WOSR-Zelle.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Identifizieren einer transgenen Pflanze oder deren Zellen oder Geweben, enthaltend das erfindungsgemäße Eliteevent MS-BN1, bei dem eines oder beide der folgenden Merkmale der genomischen DNA der transgenen Pflanze oder deren Zellen oder Geweben herausgefunden wird:

a) die genomische DNA kann mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, stärker bevorzugt mindestens vier, am stärksten bevorzugt fünf der Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
i) einen Satz von zwei EcoRI-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2266 bp, und eines mit einer Länge von mehr als 14 kbp;
ii) einen Satz von zwei EcoRV-Fragmenten, wobei eines eine Länge zwischen 1159 und 1700 bp, vorzugsweise von etwa 1,4 kbp, und das andere eine Länge von mehr als 14 kbp hat;
iii) einen Satz von zwei HpaI-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 1986 und 2140 bp, vorzugsweise mit einer Länge von etwa 1990 bp, und eines mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2229 bp;
iv) einen Satz von drei AflIII-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 514 und 805 bp, vorzugsweise mit einer Länge von etwa 522 bp, eines mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2250 bp, und eines mit einer Länge zwischen 2450 und 2838 bp, vorzugsweise etwa 2477 bp;
v) einen Satz von zwei NdeI-Fragmenten, beide mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise eines mit etwa 6500 bp und eines mit einer Länge von etwa 10 kbp; wobei jedes der Restriktionsfragmente unter Standard-Stringenzbedingungen mit dem 3942-bp-Fragment hybridisieren kann, das die PTA29-Barnase-Sequenz enthält, das durch HindIII-Spaltung des hier beschriebenen Plasmids pTHW107 erhältlich ist; und/oder
c) die genomische DNA kann verwendet werden, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 260 und 300 bp, vorzugsweise von etwa 280 bp, gemäß dem hier beschriebenen PCR-Identifikationsprotokoll mit zwei Primern, die das Eliteevent identifizieren, mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zum Identifizieren einer transgenen Pflanze oder deren Zellen oder Geweben, enthaltend das erfindungsgemäße Eliteevent RF-BN1, bei dem eines oder beide der folgenden Merkmale der genomischen DNA der transgenen Pflanze oder deren Zellen oder Geweben herausgefunden wird:

b) die genomische DNA kann mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, stärker bevorzugt vier der Restriktionsfragmente oder Sätze von Restriktionsfragmenten ergeben, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:
i) einen Satz von drei BamHI-Fragmenten, wobei eines eine Länge zwischen 805 und 1099 bp, vorzugsweise etwa 814 bp, hat, eines eine Länge zwischen 1700 und 1986 bp, vorzugsweise etwa 1849 bp, hat, eines eine Länge zwischen 2450 und 2838 bp, vorzugsweise etwa 2607 bp, hat und eines eine Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise etwa 6500 bp, hat;
ii) einen Satz von vier EcoRI-Fragmenten, eines mit einer Länge zwischen 805 und 1159 bp, vorzugsweise etwa 1094 bp, eines mit einer Länge zwischen 1986 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2149 bp, und zwei mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise eines mit etwa 7000 bp und eines mit einer Länge von etwa 10 kbp;
iii) einen Satz von zwei EcoRV-Fragmenten, wobei beide eine Länge zwischen 5077 und 14057 bp haben, vorzugsweise hat eines eine Länge von etwa 5,4 kbp und das andere eine Länge von etwa 8 kbp;
iv) einen Satz von drei HindIII-Fragmenten, wobei eines eine Länge zwischen 1700 und 2140 bp, vorzugsweise etwa 1969 bp, hat und zwei eine Länge zwischen 2450 und 2838 bp, haben, wobei vorzugsweise eines eine Länge von etwa 2565 bp und eines eine Länge von etwa 2635 bp hat; wobei jedes der Restriktionsfragmente unter Standard-Stringenzbedingungen mit dem 2182-bp-Fragment hybridisieren kann, das die PTA29-Barstar-Sequenz enthält, die durch HpaI-Spaltung des hier beschriebenen Plasmids pTHW118 erhältlich ist; und/oder
d) die genomische DNA kann verwendet werden, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 195 und 235 bp, vorzugsweise von etwa 215 bp, mit Hilfe des hier beschriebenen PCR-Identifikationsprotokolls mit zwei Primern, die das Eliteevent identifizieren, mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 23 bzw. SEQ ID Nr. 41 zu amplifizieren.

Die Erfindung betrifft auch ein Kit zum Identifizieren der Pflanzen, die das erfindungsgemäße Eliteevent MS-BN1 enthalten, wobei das Kit die PCR-Sonden mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 und SEQ ID Nr. 19 enthält.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit zum Identifizieren der Pflanzen, die das erfindungsgemäße Eliteevent RF-BN1 enthalten, wobei das Kit die PCR-Sonden mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 23 und SEQ ID Nr. 41 enthält.
Die Erfindung betrifft auch ein Kit zum Identifizieren des Eliteevents MS-BN1 und/oder RF-BN1 in biologischen Proben, enthaltend mindestens einen spezifischen Primer oder eine spezifische Sonde mit einer Sequenz, die einer Sequenz mit zwischen 80% und 100% Sequenzidentität zu einer spezifischen Region von MS-BN1 entspricht (oder komplementär dazu ist), und/oder mindestens einen spezifischen Primer oder eine spezifische Sonde mit einer Sequenz, die einer Sequenz mit zwischen 80% und 100% Sequenzidentität zu einer spezifischen Region von RF-BN1 entspricht (oder komplementär dazu ist). Vorzugsweise entspricht die Sequenz der Sonde einer spezifischen Region, die einen Teil der 5'- oder 3'-flankierenden Region von MS-BN1 und/oder RF-BN1 enthält. Am stärksten bevorzugt hat die spezifische Sonde eine Sequenz (oder ist komplementär zu einer Sequenz) mit zwischen 80% und 100% Sequenzidentität zu der Pflanzen-DNA-Sequenz innerhalb von SEQ ID Nr. 36 oder SEQ ID Nr. 38 für MS-BN1 oder zu der Pflanzen-DNA-Sequenz innerhalb von SEQ ID Nr. 39 oder SEQ ID Nr. 40 für RF-BN1.
Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Kit zusätzlich zu einem Primer, der spezifisch die 5'- oder 3'-flankierende Region von MS-BN1 und/oder RF-BN1 erkennt, einen zweiten Primer, der spezifisch eine Sequenz innerhalb der fremden DNA von MS-BN1 und/oder RF-BN1 erkennt, für die Verwendung bei einem PCR-Identifikationsprotokoll. Vorzugsweise enthält das erfindungsgemäße Kit zwei (oder mehr) spezifische Primer, von denen einer eine Sequenz innerhalb der 3'-flankierenden Region von MS-BN1 und/oder RF-BN1 erkennt, am stärksten bevorzugt eine Sequenz innerhalb der Pflanzen-DNA-Region der SEQ ID Nr. 36 oder SEQ ID Nr. 38 für MS-BN1 oder der Pflanzen-DNA-Sequenz der SEQ ID Nr. 39 oder SEQ ID Nr. 40 für RF-BN1, und einen anderen, der eine Sequenz innerhalb der fremden DNA von MS-BN1 bzw. RF-BN1 erkennt. Besonders bevorzugt enthält der Primer, der die Pflanzen-DNA-Sequenz innerhalb der 5'-flankierenden Region von MS-BN1 erkennt, die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 19. Insbesondere enthält der Primer, der die Pflanzen-DNA-Sequenz innerhalb der 5'-flankierenden Region von MS-BN1 erkennt, die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 19, und der Primer, der die fremde DNA von MS-BN1 erkennt, enthält die hier beschriebene Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 12. Besonders bevorzugt enthält der Primer, der die Pflanzen-DNA-Sequenz innerhalb der 5'-flankierenden Region von RF-BN1 erkennt, die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 41. Insbesondere enthält der Primer, der die Pflanzen-DNA-Sequenz innerhalb der 5'-flankierenden Region von MS-BN1 erkennt, die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 41, und der Primer, der die fremde DNA von RF-BN1 erkennt, enthält die hier beschriebene Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 23.
Die von der vorliegenden Erfindung umfaßten Verfahren und Kits können für unterschiedliche Zwecke eingesetzt werden, wie, aber nicht beschränkt auf, die folgenden: zur Identifikation von MS-BN1 und/oder RF-BN1 in Pflanzen, Pflanzenmaterial oder in Produkten, wie u.a. Nahrungsmittel- oder Futterprodukten (frisch oder verarbeitet), die Pflanzenmaterial enthalten oder davon stammen; zusätzlich oder alternativ können die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits zur Identifikation von transgenem Pflanzenmaterial für Zwecke der Segregation zwischen transgenem und nicht-transgenem Material verwendet werden; zusätzlich oder alternativ können die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits zur Bestimmung der Qualität (d.h. der Prozent an reinem Material) von Pflanzenmaterial, das MS-BN1 und/oder RF-BN1 enthält, verwendet werden.
Es sollte selbstverständlich sein, daß besondere Ausführungsformen der Erfindung durch die hier genannten abhängigen Ansprüche beschrieben werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die folgende detaillierte Beschreibung, die als Beispiel gegeben wird, aber die Erfindung nicht auf spezifische beschriebene Ausführungsformen beschränken soll, kann in Verbindung mit den hier durch Bezugnahme aufgenommenen beigefügten Figuren verstanden werden, in denen:
1. Plasmidkarte von pVE113
2. Nach Spaltung von genomischer MS-BN1-DNA erhaltene Restriktionskarte
Beladungsreihenfolge des mittels Southern-Blot analysierten Gels: Spur 1, mit EcoR1 gespaltene MS-BN1-DNA, Spur 2, mit EcoRV gespaltene MS-BN1-DNA, Spur 3, mit HpaI gespaltene MS-BN1-DNA, Spur 4, mit AflIII gespaltene MS-BN1-DNA, Spur 5, mit NdeI gespaltene MS-BN1-DNA, Spur 6, mit BamHI gespaltene nicht-transgene WOSR-DNA, Spur 7, mit BamHI gespaltene nicht-transgene WOSR-DNA + mit BamHI gespaltenes Kontrollplasmid pTHW107-DNA.
3. Nach Spaltung von genomischer RF-BN1-DNA erhaltene Restriktionskarte
Beladungsreihenfolge des mittels Southern-Blot analysierten Gels: Spur 1, mit BamHI gespaltene RF-BN1-DNA, Spur 2, mit EcoRI gespaltene RF-BN1-DNA, Spur 3, mit EcoRV gespaltene RF-BN1-DNA, Spur 4, mit HindIII gespaltene RF-BN1-DNA, Spur 5, mit BamHI gespaltene nicht-transgene WOSR-DNA, Spur 6, mit BamHI gespaltene nicht-transgene WOSR-DNA + mit BamHI gespaltenes Kontrollplasmid pTHW118-DNA.
4. PCR-Analyse verschiedener Linien unter Verwendung des MS-BN1-PCR-Identifikationsprotokolls.
Beladungsreihenfolge des Gels: Spur 1, DNA-Probe aus einer OSR-Pflanze, die das transgene Event MS-BN1 enthält, Spur 2, DNA-Probe aus einer OSR-Pflanze, die ein anderes transgenes Event enthält, Spur 3, DNA von Wildtyp-OSR, Spur 4, negative Kontrolle (Wasser), Spur 5, Molekulargewichtsmarker (100-bp-Leiter).
5. PCR-Analyse verschiedener Linien unter Verwendung des RF-BN1-PCR-Identifikationsprotokolls.
Beladungsreihenfolge des Gels: Spur 1, DNA-Probe aus einer OSR-Pflanze, die das transgene Event RF-BN1 enthält, Spur 2, DNA-Probe aus einer OSR-Pflanze, die ein anderes transgenes Event enthält, Spur 3, DNA von Wildtyp-OSR, Spur 4, negative Kontrolle (Wasser), Spur 5, Molekulargewichtsmarker (100-bp-Leiter).
Detaillierte Beschreibung
Der Begriff "Gen", wie hier verwendet, betrifft jede DNA-Sequenz, die mehrere betriebsfähig verbundene DNA-Fragmente enthält, wie einen Promotor und eine 5'-untranslatierte Region (die 5'-UTR), die zusammen die Promotorregion bilden, eine codierende Region (die ein Protein codieren kann oder nicht) und eine 3'-untranslatierte Region (3'-UTR), die eine Polyadenylierungsstelle enthält. In Pflanzenzellen werden gewöhnlich die 5'-UTR, die codierende Region und die 3'-UTR in eine RNA transkribiert, die im Fall eines proteincodierenden Gens in ein Protein translatiert wird. Ein Gen kann zusätzliche DNA-Fragmente enthalten, wie zum Beispiel Introns. Wie hier verwendet, ist ein genetischer Locus die Position eines gegebenen Gens im Genom der Pflanze.
Der Begriff "chimär" bei Bezugnahme auf ein Gen oder eine DNA-Sequenz wird verwendet, um darauf hinzuweisen, daß das Gen oder die DNA-Sequenz mindestens zwei funktionell relevante DNA-Fragmente (wie Promotor, 5'-UTR, codierende Region, 3'-UTR, Intron) enthält, die nicht natürlicherweise miteinander verbunden sind und beispielsweise aus verschiedenen Quellen stammen. "Fremd" in Bezug auf ein Gen oder eine DNA-Sequenz im Hinblick auf eine Pflanzenspezies wird verwendet, um darauf hinzuweisen, daß man das Gen oder die DNA-Sequenz nicht natürlicherweise in dieser Pflanzenspezies findet oder nicht natürlicherweise an diesem genetischen Locus in dieser Pflanzenspezies findet. Der Begriff "fremde DNA" wird hier verwendet, um auf eine DNA-Sequenz, wie sie in das Genom einer Pflanze infolge von Transformation eingebaut wurde, Bezug zu nehmen. Die "transformierende DNA", wie hier verwendet, betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das zur Transformation verwendet wird. Die transformierende DNA enthält üblicherweise mindestens ein "Gen von Interesse" (z.B. ein chimäres Gen), das der transformierten Pflanze ein oder mehrere spezifische Merkmale verleihen kann. Der Begriff "rekombinantes DNA-Molekül" wird beispielhaft verwendet und kann daher ein isoliertes Nukleinsäuremolekül beinhalten, das DNA sein kann und durch Rekombinations- oder andere Verfahren erhalten werden kann.
Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Transgen" ein Gen von Interesse, wie in das Genom einer Pflanze eingebaut. Eine "transgene Pflanze" betrifft eine Pflanze, die mindestens ein Transgen im Genom aller ihrer Zellen enthält.
Die in den erfindungsgemäßen Pflanzen vorhandene fremde DNA enthält vorzugsweise zwei Gene von Interesse, genauer gesagt entweder ein Pollensterilitätsgen und ein Herbizidresistenzgen oder ein Fertilitätsrestorer-Gen und ein Herbizidresistenzgen.
Ein "Pollensterilitätsgen", wie hier verwendet, betrifft ein Gen, das nach Expression in der Pflanze die Pflanze unfähig zur Produktion fertiler lebensfähiger Pollen macht. Ein Beispiel für ein Pollensterilitätsgen ist ein Gen, das eine DNA-Sequenz, die Barnase codiert, unter der Kontrolle eines Promotors enthält, der die Expression in Tapetumzellen steuert. Genauer gesagt, ist das Pollensterilitätsgen erfindungsgemäß "TA29-Barnase", wie hier beschrieben.
Ein "Fertilitätsrestorer-Gen", wie hier verwendet, betrifft ein Gen, das nach Expression in der Pflanze, die ein Pollensterilitätsgen enthält, die phänotypische Expression des Pollensterilitätsgens verhindern und die Fertilität der Pflanze wiederherstellen kann. Genauer gesagt, enthält das Fertilitätsrestorer-Gen eine DNA, die ein Protein oder Polypeptid codiert, das die phänotypische Expression des Pollensterilitätsgens verhindern kann, unter der Kontrolle eines Promotors, der die Expression in mindestens den Zellen steuert, in denen das Pollensterilitätsgen exprimiert wird. Genauer gesagt, ist das Fertilitätsrestorer-Gen erfindungsgemäß "TA29-Barstar", wie hier beschrieben.
Der Einbau eines rekombinanten DNA-Moleküls in das Pflanzengenom ergibt sich gewöhnlich aus einer Transformation einer Zelle oder eines Gewebes (oder einer anderen genetischen Manipulation). Die besondere Stelle des Einbaus ist entweder auf Zufall zurückzuführen oder befindet sich an einer vorbestimmten Stelle (wenn ein Verfahren zum gezielten Einbau verwendet wird).
Die fremde DNA kann durch die Stelle und Konfiguration an der Stelle des Einbaus des rekombinanten DNA-Moleküls in das Pflanzengenom charakterisiert werden. Die Stelle im Pflanzengenom, an der eine rekombinante DNA inseriert wurde, wird auch als "Insertionsstelle" oder "Zielstelle" bezeichnet. Eine Insertion des Transgens in das Pflanzengenom kann mit einer Deletion von Pflanzen-DNA einhergehen, die als "Zielstellendeletion" bezeichnet wird. Eine "flankierende Region" oder "flankierende Sequenz", wie hier verwendet, betrifft eine Sequenz von mindestens 20 bp, vorzugsweise mindestens 50 bp, und bis zu 5000 bp des Pflanzengenoms, die sich entweder direkt stromaufwärts von und ineinander übergehend mit oder unmittelbar stromabwärts von und ineinander übergehend mit der fremden DNA befindet. Transformationsverfahren, die zu zufälliger Integration der fremden DNA führen, ergeben Transformanten mit unterschiedlichen flankierenden Regionen, die für jede Transformante charakteristisch und einzigartig sind. Wird das Transgen in eine Pflanze durch herkömmliche Kreuzung eingebracht, wird/werden seine Insertionsstelle in das Pflanzengenom oder seine flankierenden Regionen in der Regel nicht verändert. Eine "Insertionsregion", wie hier verwendet, betrifft die Region, die der Region von mindestens 40 bp, vorzugsweise mindestens 100 bp, und bis zu mehr als 10000 bp entspricht, die von den stromaufwärts und stromabwärts gelegenen flankierenden Regionen eines Transgens im (untransformierten) Pflanzengenom umfaßt wird und die Insertionsstelle (und mögliche Zielstellendeletion) beinhaltet. Unter Berücksichtigung kleinerer Unterschiede aufgrund von Mutationen innerhalb von Spezies behält eine Insertionsstelle mindestens 85%, vorzugsweise 90%, stärker bevorzugt 95% und am stärksten bevorzugt 100% Sequenzidentität mit der Sequenz bei, die die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen flankierenden Regionen der fremden DNA in einer gegebenen Pflanze dieser Spezies enthält.
Expression eines Gens von Interesse betrifft die Tatsache, daß das Gen der Pflanze ein oder mehrere phänotypische Merkmale (z.B. Herbizidtoleranz) verleiht, von denen beabsichtigt wurde, daß sie durch das Einführen des rekombinanten DNA-Moleküls – der transformierenden DNA –, die während der Transformation verwendet wird (auf Basis der Struktur und Funktion eines Teils des/des ganzen Gens oder eines Teils der/aller Gene von Interesse) verliehen werden.
Ein "Event" ist als (künstlicher) Genlocus definiert, der infolge von genetischer Manipulation eine fremde DNA trägt, die mindestens eine Kopie des (der) Gen(s/e) von Interesse trägt. Die üblichen allelischen Zustände eines Events sind das Vorliegen oder Fehlen der fremden DNA. Wie hier verwendet, betrifft ein "MS"-Event und ein "RF"-Event Events, die die "TA29-Barnase"- bzw. "TA29-Barstar"-Transgene tragen. Ein Event ist phänotypisch durch die Expression eines oder mehrerer Transgene gekennzeichnet. Auf genetischer Ebene ist ein Event Teil der genetischen Ausstattung einer Pflanze. Auf molekularer Ebene ist ein Event durch die Restriktionskarte (wie z.B. mittels Southern-Blot bestimmt) und/oder durch die stromaufwärts und/oder stromabwärts gelegenen flankierenden Sequenzen des Transgens und/oder die molekulare Konfiguration des Transgens gekennzeichnet. Gewöhnlich führt die Transformation einer Pflanze mit einer transformierenden DNA, die mindestens ein Gen von Interesse enthält, zu einer Vielzahl von Events, die jeweils einzigartig sind.
Ein "Eliteevent", wie hier verwendet, ist ein Event, das aus einer Gruppe von Events selektiert wird, die durch Transformation mit der gleichen transformierenden DNA oder durch Rückkreuzung mit Pflanzen, die durch eine solche Transformation erhalten werden, auf Basis der Expression und Stabilität des Transgens und seiner Kompatibilität mit optimalen agronomischen Merkmalen der Pflanze, die es enthält, erhalten werden. Somit sind die Kriterien für eine Eliteevent-Selektion ein oder mehrere, vorzugsweise zwei oder mehrere, vorteilhafterweise alle der folgenden:

a) daß das Vorliegen des Transgens andere gewünschte Merkmale der Pflanze, wie solche, die mit der agronomischen Leistung oder dem kommerziellen Wert in Zusammenhang stehen, nicht beeinträchtigt;
b) daß das Event durch eine gut definierte molekulare Konfiguration gekennzeichnet ist, die stabil vererbt wird und für die geeignete diagnostische Werkzeuge zur Identitätskontrolle entwickelt werden können;
c) daß das (die) Gen(e) von Interesse in dem Transgen eine korrekte, angemessene und stabile räumliche und zeitliche phänotypische Expression sowohl unter heterozygoten (oder hemizygoten) als auch homozygoten Bedingungen des Events mit einem kommerziell annehmbaren Spiegel in einem Bereich von Umweltbedingungen zeigt/zeigen, denen die Pflanzen, die das Event tragen, bei normaler agronomischer Verwendung wahrscheinlich ausgesetzt sind.

Es ist bevorzugt, daß die fremde DNA mit einer Position im Pflanzengenom in Verbindung steht, die eine Introgression in gewünschte kommerzielle genetische Hintergründe gestattet.
Der Status eines Events als Eliteevent wird durch Introgression des Eliteevents in unterschiedliche relevante genetische Hintergründe und Beobachten des Übereinstimmens mit einem, zwei oder allen z.B. der vorstehenden Kriterien a), b) und c) bestätigt.
Zusätzlich wird für die hier beschriebenen Transgene, die Pollensterilität und Fertilitätsrestoration codieren, eine Selektion der Eliteevents auch hinsichtlich der Kompatibilität zwischen diesen Events bestimmt, genauer gesagt, im Hinblick darauf, daß die durch Kreuzen zwischen einer Pflanze mit einem Pollensterilitätsevent und einer Pflanze mit einem Fertilitätsrestorer-Event entstandenen Nachkommen, in denen beide Events vorliegen, die folgenden Merkmale besitzen:

a) eine adäquate phänotypische Expression des Phänotyps mit wiederhergestellter Fertilität, d.h. Pollenfertilität; und
b) phänotypische Expression mit einem kommerziell annehmbaren Spiegel in einem Bereich von Umweltbedingungen, denen die Pflanzen, die die beiden Events tragen, bei normaler agronomischer Verwendung wahrscheinlich ausgesetzt sind.

Ein "Eliteevent" betrifft somit einen genetischen Locus, der ein Transgen enthält, der den oben beschriebenen Kriterien genügt. Eine Pflanze, ein Pflanzenmaterial oder Nachkommen, wie Samen, kann/können ein oder mehrere Eliteevents in ihrem/seinem Genom enthalten.
Die "diagnostischen Werkzeuge", die zur Identifikation eines Eliteevents oder der Pflanze oder des Pflanzenmaterials, die ein Eliteevent enthalten, entwickelt werden, basieren auf den spezifischen genomischen Merkmalen des Eliteevents, wie beispielsweise einer spezifischen Restriktionskarte der genomischen Region, die die fremde DNA enthält, und/oder der Sequenz der flankierenden Region(en) des Transgens. Eine "Restriktionskarte", wie hier verwendet, betrifft einen Satz von Southern-Blot-Mustern, die nach Spalten von genomischer Pflanzen-DNA mit einem bestimmten Restriktionsenzym oder einem Satz von Restriktionsenzymen und Hybridisieren mit einer Sonde, die mit dem Transgen Sequenzähnlichkeit besitzt, unter Standard-Stringenzbedingungen erhalten werden. Standard-Stringenzbedingungen, wie hier verwendet, betrifft die hier beschriebenen Bedingungen zur Hybridisierung oder die herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen, wie von Sambrook et al. (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) beschrieben, die beispielsweise die folgenden Schritte enthalten können: 1) Immobilisieren genomischer Pflanzen-DNA-Fragmente auf einem Filter, 2) Vorhybridisieren des Filters während 1 bis 2 Stunden bei 42°C in 50% Formamid, 5 × SSPE, 2 × Denhardt-Reagens und 0,1% SDS oder 1 bis 2 Stunden bei 68°C in 6 × SSC, 2 × Denhardt-Reagens und 0,1% SDS, 3) Zugabe der Hybridisierungssonde, die markiert wurde, 4) Inkubieren für 16 bis 24 Stunden, 5) Waschen des Filters für 20 min bei Raumtemperatur in 1 × SSC, 0,1% SDS, 6) Waschen des Filters dreimal für jeweils 20 min bei 68°C in 0, 2 × SSC, 0, 1% SDS und 7) Exponieren des Filters für 24 bis 48 Stunden mit Röntgenfilm bei –70°C mit einem Verstärkerschirm.
Aufgrund der in einem Pflanzengenom vor der Einführung der fremden DNA vorliegenden (endogenen) Restriktionsstellen verändert Insertion einer fremden DNA die spezifische Restriktionskarte dieses Genoms. So kann/können eine bestimmte Transformante oder die davon stammenden Nachkommen durch ein oder mehrere spezifische Restriktionsmuster identifiziert werden. Die Bedingungen zur Bestimmung der Restriktionskarte eines Events sind in einem "Restriktionskarten-Identifikationsprotokoll" dargelegt. Alternativ können, nachdem eine oder beide flankierenden Regionen des Transgens sequenziert wurden, PCR-Sonden entwickelt werden, die diese Sequenz(en) in einem "PCR-Identifikationsprotokoll" spezifisch erkennen. Pflanzen oder Pflanzenmaterial, die/das ein Eliteevent enthalten/enthält, können/kann durch Testen gemäß dem PCR-Identifikationsprotokoll mit Hilfe dieser spezifischen Primer identifiziert werden.
Wie hier verwendet, ist eine "biologische Probe" eine Probe von einer Pflanze, von Pflanzenmaterial oder Produkten, die Pflanzenmaterial enthalten. Der Begriff "Pflanze" soll WOSR-(Brassica-napus-)Pflanzengewebe in jedem Reifungsstadium sowie alle Zellen oder Organe, die aus irgendeiner solchen Pflanze entnommen werden oder davon stammen, beinhalten, einschließlich, ohne Beschränkung, aller Samen, Blätter, Stengel, Blüten, Wurzeln, Einzelzellen, Gameten, Zellkulturen, Gewebekulturen oder Protoplasten. "Pflanzenmaterial", wie hier verwendet, betrifft Material, das aus einer Pflanze erhalten wird oder davon stammt. Pflanzenmaterial enthaltende Produkte betreffen Nahrungsmittel, Futter oder andere Produkte, die mit Hilfe von Pflanzenmaterial hergestellt werden oder mit Pflanzenmaterial kontaminiert sein können. Es sollte selbstverständlich sein, daß im Kontext der vorliegenden Erfindung diese biologischen Proben vorzugsweise auf das Vorliegen von Nukleinsäuren untersucht werden, die für MS-BN1 und/oder RF-BN1 spezifisch sind, was das Vorliegen von Nukleinsäuren in den Proben voraussetzt. So betreffen die hier genannten Verfahren zum Identifizieren von Eliteevent MS-BN1 und/oder RF-BN1 in biologischen Proben vorzugsweise die Identifikation von Nukleinsäuren, die das Eliteevent enthalten, in biologischen Proben.
Ein "Kit", wie hier verwendet, betrifft einen Satz von Reagentien zum Zweck der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, genauer gesagt, der Identifikation des Eliteevents MS-BN1 und/oder RF-BN1 in biologischen Proben. Genauer gesagt, enthält eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits mindestens einen oder zwei spezifische Primer, wie vorstehend beschrieben. Gegebenenfalls kann das Kit ferner jedes andere hier im PCR-Identifikationsprotokoll beschriebene Reagens enthalten. Alternativ kann das Kit nach einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung eine spezifische Sonde, wie vorstehend beschrieben, enthalten, die spezifisch mit Nuklein säuren biologischer Proben hybridisiert, um das Vorliegen von MS-BN1 und/oder RF-BN1 darin zu identifizieren. Gegebenenfalls kann das Kit ferner jedes andere Reagens (wie Hybridisierungspuffer, Markierung, aber nicht darauf beschränkt) zur Identifikation von MS-BN1 und/oder RF-BN1 in biologischen Proben mit Hilfe der spezifischen Sonde enthalten.
Das erfindungsgemäße Kit kann zu Zwecken der Qualitätskontrolle (z.B. Reinheit von Samenchargen), des Nachweises des Eliteevents in Pflanzenmaterial oder Material, das Pflanzenmaterial enthält oder davon stammt, wie beispielsweise, aber nicht beschränkt auf, Nahrungsmittel- oder Futterprodukte, verwendet werden und seine Komponenten können speziell daran angepaßt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Entwicklung eines Satzes von Eliteevents in WOSR, MS-BN1 und RF-BN1, die Pflanzen, die diese Events enthalten, die Nachkommen, die aus dem Kreuzen dieser Pflanzen erhalten werden, und die Pflanzenzellen oder das Pflanzenmaterial, die/das von diesen Events stammen/stammt. Pflanzen, die Eliteevent MS-BN1 enthalten, wurden mittels Transformation mit pTHW107, wie im Beispiel 1 beschrieben, erhalten. Pflanzen, die Eliteevent RF-BN1 enthalten, wurden mittels Transformation mit pTHW118, wie ebenfalls im Beispiel 1 beschrieben, erhalten.
Das zur Erzeugung von Eliteevent MS-BN1 verwendete rekombinante DNA-Molekül enthält eine DNA-Sequenz, die ein Barnase-Molekül codiert, unter der Kontrolle eines Promotors, der selektiv die Expression in Tapetumzellen steuert, (als "TA29-Barnase" bezeichnet). Der TA29-Promotor besitzt ein "Tapetum-selektives" Expressionsmuster in OSR (De Block und Debrouwer, Planta 189: 218–225, 1993). Die Expression des TA29-Barnase-Gens in WOSR-Pflanzen führt zur Zerstörung des Tapetums, was die Pflanzen pollensteril macht (Mariani et al., 1990, siehe oben). Das zur Erzeugung von Eliteevent RF-BN1 verwendete rekombinante DNA-Molekül enthält eine DNA-Sequenz, die ein Barstar-Molekül codiert, unter der Kontrolle eines Tapetum-spezifischen Promotors (als "PTA29-Barstar" bezeichnet). Die Expression des TA29-Barstar-Gens in WOSR-Pflanzen verhindert in Gegenwart eines "TA29-Barnase"-Gens in der Pflanze die Aktivität von Barnase in den Tapetumzellen der Pflanze, was die Zerstörung des Tapetums verhindert und somit die Fertilität in diesen Pflanzen wiederherstellt (Mariani et al., 1990, siehe oben).
Die zur Erzeugung von Eliteevent MS-BN1 und RF-BN1 verwendeten rekombinanten DNAs enthalten beide zusätzlich eine DNA-Sequenz, die das Enzym Phosphinothricinacetyltransferase codiert, und den 35S-Promotor des Blumenkohlmosaikvirus, wobei die Phosphinothricinacetyltransferase codierende Sequenz unter der Kontrolle des 35S-Promotors steht (als "35S-bar" bezeichnet). Der 35S-Promotor hat ein "konstitutives" Expressionsmuster in OSR, was bedeutet, daß er in den meisten Zelltypen während des Großteils des Pflanzenlebenszyklus signifikant exprimiert wird. Die Expression des 35S-bar-Gens in OSR-Pflanzen verleiht Resistenz gegen die Herbizidverbindungen Phosphinothricin oder Bialaphos oder Glufosinat oder, allgemeiner, Glutaminsynthetaseinhibitoren oder deren Salze oder optische Isomere.
WOSR-Pflanzen oder Pflanzenmaterial, die/das MS-BN1 enthalten/enthält, können/kann gemäß dem hier im Beispiel 5 für MS-BN1 beschriebenen Restriktionskarten-Identifikationsprotokoll identifiziert werden. Kurz gesagt, wird genomische WOSR-DNA mit einer Auswahl (vorzugsweise mit zwei bis fünf) der folgenden Restriktionsenzyme gespalten: EcoRI, EcoRV, NdeI, HpaI, AflIII, wird dann auf Nylonmembranen übertragen und mit dem 3942-bp-HindIII-Fragment von Plasmid pTHW107 (oder der darin enthaltenen T-DNA) hybridisiert. Dann wird für jedes verwendete Restriktionsenzym bestimmt, ob die folgenden Fragmente identifiziert werden können:

– EcoRI: ein Fragment mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2266 bp, und ein Fragment mit einer Länge von mehr als 14 kbp;
– EcoRV: ein Fragment mit einer Länge zwischen 1159 und 1700 bp, vorzugsweise von etwa 1,4 kbp und ein Fragment mit einer Länge von mehr als 14 kbp;
– HpaI: ein Fragment mit einer Länge zwischen 1986 und 2140 bp, vorzugsweise mit einer Länge von etwa 1990 bp, und ein Fragment mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2229 bp;
– AflIII: ein Fragment mit einer Länge zwischen 514 und 805 bp, vorzugsweise mit einer Länge von etwa 522 bp, ein Fragment mit einer Länge zwischen 2140 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2250 bp, und ein Fragment mit einer Länge zwischen 2450 und 2838 bp, vorzugsweise etwa 2477 bp;
– NdeI: zwei Fragmente mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise eines mit etwa 6500 bp und eines mit einer Länge von etwa 10 kbp;

Die Längen der DNA-Fragmente werden durch Vergleich mit einem Satz von DNA-Fragmenten bekannter Länge, insbesondere den PstI-Fragmenten von Phage-lambda-DNA bestimmt. Ein Fragment von mehr als 14 kbp wird als eines mit einer Länge zwischen 14 kbp und 40 kbp eingeschätzt, wenn die Extraktion der DNA nach dem Verfahren von Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, Bd. 3, S. 19–21) erfolgt.
Wenn das Pflanzenmaterial nach Spaltung mit mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei, insbesondere mit mindestens vier, genauer gesagt mit allen dieser Restriktionsenzyme DNA-Fragmente mit der gleichen Länge, wie die oben beschriebenen, ergibt, wird bestimmt, daß die WOSR-Pflanze Eliteevent MS-BN1 trägt.
Pflanzen oder Pflanzenmaterial, die/das MS-BN1 enthalten/enthält, können/kann auch gemäß dem hier im Beispiel 5 für MS-BN1 beschriebenen PCR-Identifikationsprotokoll identifiziert werden. Kurz gesagt, wird genomische WOSR-DNA mit Hilfe von PCR unter Verwendung eines Primers, der spezifisch eine flankierende Sequenz von MS-BN1, vorzugsweise die hier beschriebene 5'- oder 3'-flankierende Sequenz von MS-BN1, erkennt, insbesondere des Primers mit der Sequenz SEQ ID Nr. 19, und eines Primers, der eine Sequenz in dem Transgen erkennt, insbesondere des Primers mit der Sequenz SEQ ID Nr. 12, amplifiziert. Endogene WOSR-Primer werden als Kontrollen verwendet. Wenn das Pflanzenmaterial ein Fragment zwischen 260 und 300 bp, vorzugsweise von etwa 280 bp, ergibt, wird bestimmt, daß die WOSR-Pflanze Eliteevent MS-BN1 enthält.
Pflanzen, die MS-BN1 tragen, sind phänotypisch durch die Tatsache gekennzeichnet, daß sie in Abwesenheit eines Restorer-Gens in ihrem Genom pollensteril sind. Eine pollensterile Pflanze ist dadurch definiert, daß sie nicht in der Lage ist, fertile lebensfähige Pollen zu produzieren.
Pflanzen, die MS-BN1 tragen, können beispielsweise aus Samen erhalten werden, die MS-BN1 enthalten und bei der ATCC unter der Eingangsnummer PTA-730 hinterlegt sind. Solche Pflanzen können weiter vermehrt werden, um das erfindungsgemäße Eliteevent in andere Kultivare der gleichen Pflanzenspezies einzuführen.
WOSR-Pflanzen oder Pflanzenmaterial, die/das RF-BN1 enthalten/enthält, können/kann gemäß dem hier im Beispiel 5 für RF-BN1 beschriebenen Restriktionskarten-Identifikationsprotokoll identifiziert werden. Kurz gesagt, wird genomische WOSR-DNA mit einer Auswahl (vorzugsweise mit zwei bis vier) der folgenden Restriktionsenzyme gespalten: BamHI, EcoRI, EcoRV und HindIII, wird dann auf Nylonmembranen übertragen und mit dem 2182-bp-HpaI-Fragment von Plasmid pTHW118 (oder der darin enthaltenen T-DNA) hybridisiert. Dann wird für jedes verwendete Restriktionsenzym bestimmt, ob die folgenden Fragmente identifiziert werden können:

– BamHI: ein Fragment mit einer Länge zwischen 805 und 1099 bp, vorzugsweise etwa 814 bp, ein Fragment mit einer Länge zwischen 1700 und 1986 bp, vorzugsweise etwa 1849 bp, ein Fragment mit einer Länge zwischen 2450 und 2838 bp, vorzugsweise etwa 2607 bp, und ein Fragment mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise etwa 6500 bp;
– EcoRI: ein Fragment mit einer Länge zwischen 805 und 1159 bp, vorzugsweise etwa 1094 bp, ein Fragment mit einer Länge zwischen 1986 und 2450 bp, vorzugsweise etwa 2149 bp, und zwei Fragmente mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise eines von 7000 bp und eines mit einer Länge von etwa 10 kbp;
– EcoRV: zwei Fragmente mit einer Länge zwischen 5077 und 14057 bp, vorzugsweise eines mit einer Länge von etwa 5,4 kbp und von etwa 8 kbp;
– HindIII: ein Fragment mit einer Länge zwischen 1700 und 1986 bp, vorzugsweise etwa 1969 bp, und zwei Fragmente mit einer Länge zwischen 2450 und 2838 bp, vorzugsweise eines mit einer Länge von etwa 2565 bp und eines mit einer Länge von etwa 2635 bp.

Die Längen der DNA-Fragmente werden durch Vergleich mit einem Satz von DNA-Fragmenten bekannter Länge, insbesondere den PstI-Fragmenten von Phage-lambda-DNA, bestimmt.
Wenn das Pflanzenmaterial nach Spaltung mit mindestens zwei, vorzugsweise mindestens 3, stärker bevorzugt mit allen dieser Restriktionsenzyme DNA-Fragmente mit der gleichen Länge, wie die oben beschriebenen, ergibt, wird bestimmt, daß die WOSR-Pflanze Eliteevent RF-BN1 enthält.
Pflanzen oder Pflanzenmaterial, die/das RF-BN1 enthalten/enthält, können/kann auch gemäß dem hier im Beispiel 5 für RF-BN1 beschriebenen PCR-Identifikationsprotokoll identifiziert werden. Kurz gesagt, wird genomische WOSR-DNA mit Hilfe von PCR unter Verwendung eines Primers, der spezifisch eine flankierende Sequenz von RF-BN1, vorzugsweise die hier beschriebene 5'- oder 3'-flankierende Sequenz von RF-BN1, erkennt, insbesondere des Primers mit der Sequenz SEQ ID Nr. 41, und eines Primers, der eine Sequenz in dem Transgen erkennt, insbesondere des Primers mit der Sequenz SEQ ID Nr. 23, amplifiziert. Endogene WOSR- Primer werden als Kontrollen verwendet. Wenn das Pflanzenmaterial ein Fragment zwischen 195 und 235 bp, vorzugsweise von etwa 215 bp, ergibt, wird bestimmt, daß die WOSR-Pflanze Eliteevent RF-BN1 enthält.
Pflanzen, die RF-BN1 tragen, sind durch die Tatsache gekennzeichnet, daß Barstar in den Zellen des Tapetums exprimiert wird. Es wurde gezeigt, daß die Produktion von Barstar in den Tapetumzellen der Pflanze für die Produktion von Pollen weder nützlich noch schädlich ist (Mariani et al. 1992, siehe oben). So führt in Abwesenheit eines Pollensterilitätsgens im Genom der Pflanze das TA29-Barstar-Gen zu keinem sichtbaren Phänotyp. In Gegenwart eines Pollensterilitätsgens im Genom der Pflanze führt das TA29-Barstar-Gen zu einem Phänotyp mit wiederhergestellter Fertilität, d.h. einem fertilen Phänotyp. Eine Pflanze mit einem Phänotyp mit wiederhergestellter Fertilität ist als eine Pflanze definiert, die trotz des Vorliegens eines Pollensterilitätsgens in ihrem Genom in der Lage ist, fertile lebensfähige Pollen zu produzieren.
Pflanzen, die RF-BN1 tragen, können beispielsweise aus Samen erhalten werden, die bei der ATCC unter der Eingangsnummer PTA-730 hinterlegt sind. Solche Pflanzen können weiter vermehrt und/oder in einem herkömmlichen Züchtungsprotokoll verwendet werden, um das erfindungsgemäße Eliteevent in andere Kultivare der gleichen Pflanzenspezies einzuführen.
Pflanzen, die MS-BN1 und/oder RF-BN1 enthalten, sind auch durch ihre Glufosinat-Toleranz gekennzeichnet, wozu im Kontext der vorliegenden Erfindung gehört, daß Pflanzen gegenüber dem Herbizid Liberty^TM tolerant sind. Toleranz gegenüber Liberty^TM ist durch das Kriterium definiert, daß Sprühen der Pflanzen im Drei- bis Vierblattstadium (3V bis 4V) mit mindestens 200 Gramm Wirkstoff/Hektar (g.a.i./ha), vorzugsweise 400 g.a.i./ha und möglicherweise bis zu 1600 g.a.i./ha, die Pflanzen nicht abtötet. Pflanzen, die MS-BN1 und/oder RF-BN1 enthalten, können weiter durch das Vorliegen von Phosphinothricinacetyltransferase in ihren Zellen, wie durch den PAT-Test (De Block et al. 1987, siehe oben) bestimmt, charakterisiert werden.
Die erfindungsgemäßen WOSR-Pflanzen können auf herkömmliche Weise kultiviert werden. Das Vorliegen des 35S-bar-Gens gewährleistet, daß sie gegenüber Glufosinat tolerant sind. Daher können Unkräuter in den Feldern, auf denen solche WOSR-Pflanzen angezogen werden, durch Anwendung von Herbiziden, die Glufosinat als Wirkstoff enthalten (wie Liberty^TM), bekämpft werden.
Pflanzen, die MS-BN1 und/oder RF-BN1 enthalten, sind auch dadurch gekennzeichnet, daß sie agronomische Merkmale besitzen, die mit kommerziell erhältlichen WOSR-Varietäten in den US vergleichbar sind. Die agronomischen Merkmale von Relevanz sind: Pflanzenhöhe, Festigkeit/Steifheit des Strohs, Neigung zum Umlegen, Winterhärte, Ausfallfestigkeit, Dürretoleranz, Krankheitsbeständigkeit (Wurzelhals- und Stengelfäule (Leptosphaeria maculans), Blattfleckenkrankheit (Cylindrosporium concentricum), Sklerotinia) sowie Kornproduktion und -ausbeute.
Es wurde beobachtet, daß das Vorliegen der hier beschriebenen fremden DNA in den Insertionsregionen des Brassica-napus-WOSR-Pflanzengenoms, insbesondere an diesen Insertionsstellen in dem Brassica-napus-WOSR-Pflanzengenom, den Pflanzen, die diese Events enthalten, besonders interessante phänotypische und molekulare Merkmale verleiht. Genauer gesagt, führt das Vorliegen der fremden DNA in diesen besonderen Regionen im Genom dieser Pflanzen zu einer stabilen phänotypischen Expression der Transgene, ohne irgendeinen Aspekt der gewünschten agronomischen Leistung der Pflanzen signifikant zu beeinträchtigen, was sie für die Produktion von Hybrid-WOSR besonders geeignet macht. So wird gezeigt, daß die Insertionsregionen, die SEQ ID Nr. 22 und SEQ ID Nr. 34, genauer gesagt, der Insertionsstelle von MS-BN1 und RF-BN1 darin entsprechen, besonders geeignet für die Einführung eines (von) Gen(s/en) von Interesse sind. Genauer gesagt, sind die Insertionsregionen von MS-BN1 (SEQ ID Nr. 22) und RF-BN1 (SEQ ID Nr. 34) oder die Insertionsstellen von MS-BN1 bzw. RF-BN1 darin besonders geeignet für die Einführung von Plasmiden, die ein Pollensterilitätsgen bzw. ein Fertilitätsrestorer-Gen enthalten, die eine optimale Expression jedes dieser Gene oder beider Gene in einer Pflanze gewährleisten, ohne die agronomische Leistung zu beeinträchtigen.
Ein rekombinantes DNA-Molekül kann mit Hilfe gezielter Insertionsverfahren spezifisch in eine Insertionsregion inseriert werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann bekannt und beinhalten zum Beispiel homologe Rekombination mit Hilfe einer Rekombinase, wie FLP-Rekombinase aus Saccharomyces cerevisiae (US-Patent 5,527,695), CRE-Rekombinase aus dem Escherichia-coli-Phagen P1 (veröffentlichte PCT-Anmeldung WO 9109957), die Rekombinase von pSRI aus Saccharomyces rouxii (Araki et al., 1985, J Mol Biol 182: 191–203) oder das lambda-Phagen-Rekombinationssystem, wie im US-Patent 4,673,640 beschrieben, aber nicht auf diese beschränkt.
Wie hier verwendet, betrifft "Sequenzidentität" im Hinblick auf Nukleotidsequenzen (DNA oder RNA) die Anzahl an Positionen mit identischen Nukleotiden, geteilt durch die Anzahl an Nukleotiden in der kürzeren der beiden Sequenzen. Das Alignment der beiden Nukleotidsequenzen erfolgt durch den Wilbur-und-Lipman-Algorithmus (Wilbur und Lipman, 1983) mit Hilfe einer Fenstergröße von 20 Nukleotiden, einer Wortlänge von 4 Nukleotiden und einer Lückenstrafe von 4. Eine computerunterstützte Analyse und Interpretation von Sequenzdaten, einschließlich des oben beschriebenen Sequenzalignments, kann z.B. geeigneterweise mit den Intelligence^TM-Suite-Programmen (Intelligenetics Inc., CA) durchgeführt werden. Sequenzen werden als "im wesentlichen gleich" angegeben, wenn diese Sequenzen eine Sequenzidentität von mindestens etwa 75%, insbesondere mindestens etwa 80%, genauer gesagt mindestens etwa 85%, ganz besonders etwa 90%, insbesondere etwa 95%, insbesondere etwa 100% haben, ganz besonders identisch sind. Es ist deutlich, daß, wenn gesagt wird, daß RNA-Sequenzen im wesentlichen gleich sind oder einen bestimmten Grad an Sequenzidentität mit DNA-Sequenzen besitzen, Thymin (T) in der DNA-Sequenz als gleich mit Uracil (U) in der RNA-Sequenz angesehen wird.
Wie hier verwendet, soll "enthaltend" so verstanden werden, daß es das Vorliegen der genannten Merkmale, Schritte oder Komponenten, wie angegeben, bezeichnet, aber das Vorliegen oder Hinzufügen eines oder mehrerer Merkmale, Zahlen, Schritte oder Komponenten oder Gruppen von diesen nicht ausschließt. So kann z.B. eine Nukleinsäure oder ein Protein, enthaltend eine Sequenz von Nukleotiden oder Aminosäuren, mehr Nukleotide oder Aminosäuren als die tatsächlich genannten enthalten, d.h. in eine größere Nukleinsäure oder ein größeres Protein eingebettet sein. Ein chimäres Gen, das eine DNA-Sequenz enthält, die funktionell oder strukturell definiert ist, kann zusätzliche DNA-Sequenzen enthalten usw.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Entwicklung und die Merkmale von WOSR-Pflanzen, die die Eliteevents MS-BN1 und RF-BN1 tragen.
Wenn nicht anders angegeben, werden alle DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, wie in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY, und in Band 1 und 2 von Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USA beschrieben. Standardmaterialien und -verfahren zur Pflanzenmolekulararbeit sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993) von R. D. D. Croy, veröffentlicht von BIOS Scientific Publications Ltd. (GB) und Blackwell Scientific Publications, GB, beschrieben.

In der Beschreibung und den Beispielen wird auf folgende Sequenzen Bezug genommen:

SEQ ID Nr. 1:	Plasmid pTHW107
SEQ ID Nr. 2:	Plasmid pTHW118
SEQ ID Nr. 3:	Primer 248
SEQ ID Nr. 4:	Primer 249
SEQ ID Nr. 5:	Primer 247
SEQ ID Nr. 6:	Primer 250
SEQ ID Nr. 7:	Primer 251
SEQ ID Nr. 8:	Primer 254
SEQ ID Nr. 9:	Primer 258
SEQ ID Nr. 10:	Primer SP6
SEQ ID Nr. 11:	Primer T7
SEQ ID Nr. 12:	Primer 201 (BNA01)
SEQ ID Nr. 13:	Sequenz mit der 5'-flankierenden Region von MS-BN1
SEQ ID Nr. 14:	Primer 611
SEQ ID Nr. 15:	Primer 259
SEQ ID Nr. 16:	Primer 260
SEQ ID Nr. 17:	Primer 24
SEQ ID Nr. 18:	Sequenz mit der 3'-flankierenden Region von MS-BN1
SEQ ID Nr. 19:	Primer 51 (BNA02)
SEQ ID Nr. 20:	Primer 48
SEQ ID Nr. 21:	Sequenz mit der Zielstellendeletion von MS-BN1
SEQ ID Nr. 22:	Insertionsregion von MS-BN1
SEQ ID Nr. 23:	Primer 193 (BNA03)
SEQ ID Nr. 24:	Sequenz mit der 5'-flankierenden Region von RF-BN1
SEQ ID Nr. 25:	Primer 286
SEQ ID Nr. 26:	Primer 314
SEQ ID Nr. 27:	Primer 315
SEQ ID Nr. 28:	Primer 316
SEQ ID Nr. 29:	Primer 288
SEQ ID Nr. 30:	Sequenz mit der 3'-flankierenden Region von RF-BN1
SEQ ID Nr. 31:	Primer 269
SEQ ID Nr. 32:	Primer 283

SEQ ID Nr. 33:	Primer 284
SEQ ID Nr. 34:	Integrationsregion von RF-BN1
SEQ ID Nr. 35:	Primer 57
SEQ ID Nr. 36:	Sequenz mit der 5'-flankierenden Region von MS-BN1 in WOSR
SEQ ID Nr. 37:	Primer 68
SEQ ID Nr. 38:	Sequenz mit der 3'-flankierenden Region von MS-BN1 in WOSR
SEQ ID Nr. 39:	Sequenz mit der 5'-flankierenden Region von RF-BN1 in WOSR
SEQ ID Nr. 40:	Sequenz mit der 3'-flankierenden Region von Rf-BN1 in WOSR
SEQ ID Nr. 41:	Primer 268 (BNA04)
SEQ ID Nr. 42:	Primer BNA05
SEQ ID Nr. 43:	Primer BNA06

BEISPIELE
Beispiel 1. Transformation von Brassica napus mit einem Pollensterilitätsgen und einem Restorer-Gen
a) Konstruktion der chimären DNA, die das Barnase-Gen unter der Kontrolle eines Tapetum-spezifischen Promotors enthält (pTHW107).
Plasmid pTHW107 (SEQ ID Nr. 1) stammte im wesentlichen von dem Zwischenproduktvektor pGSV1. pGSV1 selbst stammt von pGSC1700 (Cornelissen und Vandewielle, 1989), enthält aber eine künstliche T-Region, die aus der linken und der rechten Grenzsequenz der TL-DNA von pTiB6S3 und Multilinker-Klonierungsstellen besteht, die die Insertion chimärer Gene zwischen den T-DNA-Grenz-Repeats gestatten. Der pGSV1-Vektor ist auf dem Grundgerüst des Plasmids mit einem Barstar-Gen mit Regulationssignalen für die Expression in E. coli ausgestattet.
Eine vollständige Beschreibung der zwischen den Grenz-Repeats von pTHW107 enthaltenen DNA ist in Tabelle 1 angegeben:
Tabelle 1: T-DNA des Plasmids pTHW107
b) Konstruktion der chimären DNA, die das Barstar-Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors enthält (pTHW118)
Plasmid pTHW118 (SEQ ID Nr. 2) stammte ebenfalls im wesentlichen vom Vektor pGSV1 (siehe oben). Eine vollständige Beschreibung der zwischen den Grenz-Repeats von pTHW118 enthaltenen DNA ist in Tabelle 2 angegeben:
Tabelle 2: T-DNA des Plasmids pTHW118
c) Transformation von Brassica napus
Zur Transformation von Brassica napus wurde das Vektorsystem, wie von Deblaere et al. (1985, 1987) beschrieben, verwendet. Das Vektorsystem besteht aus einem Agrobacterium-Stamm und zwei Plasmidkomponenten: 1) einem nicht-onkogenen Ti-Plasmid (pGV400) und 2) einem Zwischenklonierungsvektor auf Basis von Plasmid pGSV1. Das nicht-onkogene Ti-Plasmid, aus dem die T-Region deletiert wurde, trägt die vir-Gene, die für den Transfer einer auf dem zweiten Plasmid klonierten T-DNA in das Pflanzengenom benötigt werden. Die aus der Dreifachpaarung zwischen diesen Komponenten erhaltenen Agrobacterium-Stämme können zur Pflanzentransformation verwendet werden.
Die Selektion erfolgte auf allen Stufen, mit Ausnahme der Setzlingregeneration, die in Abwesenheit von PPT durchgeführt wurde, um das Wachstum zu beschleunigen, auf Phosphinothricin (PPT). Dies führte zu einem Satz von Primärtransformanten (Pflanzen der Generation T₀).
Beispiel 2. Entwicklung von Events
2.1. Charakterisierung transgener Events
2.1.1. Southern-Blot-Analyse von MS-Events
Das Vorliegen des Transgens und die Anzahl an Geninsertionen wurde mittels Standard-Southern-Blot-Analyse überprüft. Genomische Gesamt-DNA wird aus 1 g Sproßgewebe nach Dellaporta (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, Bd. 3, S. 19–21 oder Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19: 11) isoliert und mit dem Restriktionsenzym SacI gespalten. SacI hat eine einzelne Restriktionsstelle innerhalb des T-DNA-Fragments zwischen dem Barnase- und dem bar-Konstrukt. Die Southern-Analyse erfolgte mit den folgenden zwei Sonden:
"Barnase"-Sonde: 478-bp-PstI-EcoRI-Fragment von Plasmid pVE 113
"bar"-Sonde: 546-bp-NcoI-BglII-Fragment von Plasmid pDE110
Die Plasmide pVE113 und pDE110 sind in 1 bzw. WO 92/09696 beschrieben.
Die Hybridisierung der MS-Events mit der Barnase-Sonde ergab eine 12-Kb-Bande, während die Hybridisierung mit der bar-Sonde ein 14-Kb-Fragment ergab.
Die relative Bandenintensität lieferte einen Hinweis darauf, ob Pflanzen für den transgenen Locus homozygot oder hemizygot waren. Es wurde gefunden, daß zwei Events einfache Insertionen aufwiesen.
Dies wurde durch die Tatsache bestätigt, daß das Segregationsmuster des Transgens durch mendelnde Vererbung eines einzelnen Locus erklärt werden konnte.
2.1.2. Southern-Blot-Analyse von RF-Events
Das Vorliegen des Transgens und die Anzahl an Geninsertionen wurde mittels Standard-Southern-Blot-Analyse überprüft. Genomische Gesamt-DNA wurde aus 1 g Sproßgewebe (nach Doyle et al. 1987, Phytochem. Bull. 19: 11) isoliert und mit dem Restriktionsenzym SacI gespalten. SacI hat eine einzelne Restriktionsstelle innerhalb des T-DNA-Fragments zwischen dem Barnase- und dem bar-Konstrukt. Die Southern-Analyse erfolgte mit den folgenden zwei Sonden:
"Barstar"-Sonde: 436-bp-HindIII-PstI-Fragment von Plasmid pVE113
"bar"-Sonde: 546-bp-NcoI-BglII-Fragment von Plasmid pDE110
Die Hybridisierung der RF-Events mit der Barstar-Sonde ergab eine 3-Kb-Bande, während die Hybridisierung mit der bar-Sonde ein 14-Kb-Fragment ergab.
Die relative Bandenintensität lieferte einen Hinweis darauf, ob Pflanzen für den transgenen Locus homozygot oder hemizygot waren. Es wurde gefunden, daß mehrere Events einfache Insertionen aufwiesen.
Dies wurde durch die Tatsache bestätigt, daß das Segregationsmuster des Transgens durch mendelnde Vererbung eines einzelnen Locus erklärt werden konnte.
2.1.3. Allgemeiner Pflanzenphänotyp und agronomische Leistung
T₁-Pflanzen sowohl der MS- als auch der RF-Events wurden hinsichtlich einer Reihe phänotypischer Merkmale, einschließlich Pflanzenhöhe, Festigkeit/-Steifheit des Strohs, Neigung zum Umlegen, Ausfallfestigkeit, Dürretoleranz, Krankheitsbeständigkeit (Wurzelhals- und Stengelfäule (Leptosphaeria maculans), Blattfleckenkrankheit (Cylindrosporium concentricum), Sklerotinia) sowie Kornproduktion und -ausbeute, untersucht.
Es wurde festgestellt, daß die Linien hinsichtlich der gezeigten agronomischen Merkmale verglichen mit der untransformierten Varietät sowie einer Reihe von Raps-Kultivaren gleich (oder besser) waren. In einigen Fällen segregierten die Pflanzen für ein oder mehrere der obengenannten Merkmale zu somaklonaler Variation. Wenn dies nicht zur Einführung eines kommerziell interessanten phänotypischen Merkmals führte, wurden diese Pflanzen verworfen.
2.2. Entwicklung von Linien mit dem MS- oder RF-Merkmal
Die verschiedenen hemizygoten T₀-Setzlinge ("Ms/-" oder "Rf/-") wurden aus der Gewebekultur in Gewächshauserde überführt. Das Vorliegen des Transgens und die Kopienzahl wurden mittels Southern-Blot-Analyse (siehe oben) überprüft. Man ließ die Pflanzen blühen, und Sterilität bzw. Fertilität der Blüten wurden untersucht. Die T₀-Pflanzen wurden mit Wildtyp-Pflanzen (-/-) gekreuzt, um T1-Samen (MsT1 und RfT1) herzustellen. T1-Samen wurden im Gewächshaus angepflanzt und aufgezogen. Die Pflanzen wurden hinsichtlich der Toleranz gegenüber Glufosinate-Ammonium untersucht. Ms-T1-Pflanzen wurden außerdem hinsichtlich Sterilitäts-/Fertilitätssegregation (bei ungesprühten Pflanzen) bewertet, während Rf-T1-Pflanzen auf fertile Blüten untersucht wurden.
Ms-T1-Pflanzen, die das Transgen enthielten, wurden zur Produktion von MsRf-F1-Samen mit einer Tester-Pflanze gekreuzt, die für ein Fertilitätsrestorer-Gen homozygot (Rf/Rf) war. Diese Saat (Ms/-, Rf/- und -/-, Rf/-) wurde im Gewächshaus angepflanzt und mit Liberty^TM gesprüht. Verbleibende F1-Nachkommen werden hinsichtlich Fertilitäts-/Sterilitätssegregation untersucht, um zu testen, ob das Pollensterilitätsmerkmal in Brassica napus angemessen wiederhergestellt werden konnte (Fertilität nahe 100%).
Die besten Events wurden für weitere Untersuchungen selektiert. Ms-T1-Pflanzen wurden mit einem homozygoten Fertilitätrestorer gekreuzt, und die Saat wurde im Feld ausgepflanzt. Die Pflanzen wurden hinsichtlich der Toleranz gegenüber dem Herbizid Liberty^TM (bei 800 Gramm Wirkstoff pro Hektar (g.a.i./ha), die für Bauern empfohlene Dosis beträgt 400 g.a.i./ha), hinsichtlich Fertilitäts-/Sterilitätssegregation und allgemeiner phänotypischer Merkmale untersucht. Die Linien, in denen die Fertilität zu 100% wiederhergestellt war und bei denen verglichen mit der isogenen Wildtypkontrolle keine negativen Strafen für den Phänotyp oder die agronomische Leistung (unter (d) ausgeführt) beobachtet wurden, wurden selektiert.
Rf-T1-Pflanzen, die das Transgen enthielten, wurden zur Produktion von F1-Samen mit einer Tester-Pflanze gekreuzt, die das Pollensterilitätsgen (Ms/-) enthielt. Diese Saat wurde im Gewächshaus ausgepflanzt, mit Liberty^TM gesprüht, und die Wiederherstellung der Fertilität wurde untersucht (nahezu 100%).
Inzwischen wurden Rf-T1-Pflanzen zur Produktion von S1 einer Selbstung unterzogen. Die S1-Pflanzen werden im Gewächshaus angezogen, mit Liberty^TM gesprüht und zur Produktion von S2 einer erneuten Selbstung unterzogen; aus S2 wurden homozygote Individuen selektiert.
2.3. Kombination von MS- und RF-Events.
Die selektierten Ms-T1-Pflanzen wurden zum Testen der Fertilitätswiederherstellung mit den selektierten Rf-S2-Events im Gewächshaus gekreuzt. Die Saat wurde erneut im Gewächshaus ausgepflanzt, Pflanzen wurden mit Liberty^TM gesprüht, und die Fertilität der Blüten wurde überprüft.
2.4. Testen von MS- und RF-Events in unterschiedlichen genetischen Hintergründen und an verschiedenen Stellen
Die selektierten Events wurden in zwei verschiedene genetische Hintergründe eingebracht, die sich heterotisch unterscheiden, um zu zeigen, daß die MS- und RF-Events gut funktionieren und keine negative Strafe auf die Ausbeute oder Qualität in einem beliebigen gestesteten Hintergrund mit sich bringen.
Gleichzeitig werden die selektierten MS- und RF-Events in vier bis fünf verschiedenen Umgebungen getestet, um sicherzustellen, daß es keine negative Wechselwirkung zwischen der Umgebung und den MS- oder RF-Events gibt.
Auf der nächsten Stufe wurde die Produktion von Hybridsamen unter Verwendung der selektierten MS- und RF-Events im Feld ausgiebiger untersucht. Das selektierte MS-Event wurde in seinem ursprünglichen Hintergrund und in zwei verschiedenen und heterotisch unterschiedlichen Hintergründen mit dem selektierten RF-Event in seinem ursprünglichen Hintergrund und in zwei verschiedenen und heterotisch unterschiedlichen Hintergründen gekreuzt. Die F1-Hybride wurde hinsichtlich der Resistenz gegen Liberty^TM, Fertilität, sowie der agronomischen Gesamtleistung (Ausbeute und Qualität) untersucht.
2.5. Selektion von Eliteevents
Das vorstehend beschriebene Selektionsverfahren bei der Entwicklung transgener MS-Linien ergab mehrere Eliteevents, die eine optimale Expression des Transgens, d.h. Resistenz gegen Glufosinat-Ammonium, einen pollensterilen Phänotyp und Empfänglichkeit für vollständige Fertilitätswiederherstellung mit einer homozygoten Restorer-Linie, genauer gesagt mit dem selektierten RF-Eliteevent, zeigten.
Das vorstehend beschriebene Selektionsverfahren bei der Entwicklung transgener RF-Linien ergab mehrere Eliteevents, die eine optimale Expression des Transgens, d.h. Resistenz gegen Glufosinat-Ammonium, und die Fähigkeit zur Wiederherstellung der Fertilität der F1 bei Kreuzung mit einer Pflanze, die ein Pollensterilitätsgen trägt, genauer gesagt mit dem selektierten MS-Eliteevent, zeigten.
Beispiel 3: Einbringen selektierter Kandidaten-Eliteevents in WOSR
Mehrere MS- und RF-Eliteevents, die wie oben beschrieben in B. napus entwickelt wurden, wurden durch wiederholte Rückkreuzung von Pflanzen der Drakkar-Varietät in einen WOSR-Kultivar eingeführt.
Die Pflanzen wurden untersucht, und es wurde festgestellt, daß:

a) das Vorliegen der fremden DNA andere gewünschte Merkmale der Pflanze, wie beispielsweise solche in Zusammenhang mit der agronomischen Leistung oder dem kommerziellen Wert, nicht beeinträchtigte;
b) das Event durch eine gut definierte molekulare Konfiguration gekennzeichnet war, die stabil vererbt wurde;
c) das (die) Gen(e) von Interesse in der fremden DNA eine korrekte, angemessene und stabile räumliche und zeitliche phänotypische Expression sowohl unter heterozygoten (oder hemizygoten) als auch homozygoten Bedingungen des Events mit einem kommerziell annehmbaren Spiegel in einem Bereich von Umweltbedingungen, denen die Pflanzen, die das Event tragen, bei normaler agronomischer Verwendung wahrscheinlich ausgesetzt sind, zeigten.

Die Pflanzen wurden ferner im Hinblick auf ihre agronomischen Merkmale und ihre agronomische Leistung verglichen mit Wildtyp-WOSR-Spezies untersucht.
Ausgiebige Feldversuche zeigten, daß bestimmte Kandidaten-Eliteevents von Sommerraps, wenn sie in WOSR eingebracht wurden, zu Pflanzen führten, die eine angemessene Expression der Gene von Interesse in der fremden DNA in Kombination mit optimaler agronomischer Leistung zeigten. Diese Events wurden als MS- und RF-Eliteevents in WOSR selektiert und als MS-BN1 bzw. RF-BN1 bezeichnet.
Beispiel 4. Charakterisierung der Eliteevents MS-BN1 und RF-BN1
Nach der Identifikation der MS-BN1- und RF-BN1-Events als Eliteevents, bei denen die Expression des entsprechenden Transgens sowie die agronomische Gesamtleistung optimal waren, wurden die Loci der Transgene auf molekularer Ebene im Detail analysiert. Dies beinhaltete Southern-Blot-Analyse (mit Hilfe mehrerer Restriktionsenzyme) und Sequenzierung der flankierenden Regionen des Transgens.
4.1. Southern-Blot-Analyse mit Hilfe mehrerer Restriktionsenzyme
Blattgewebe wurde von transgenen und Kontrollpflanzen geerntet. Genomische Gesamt-DNA wurde aus dem Blattgewebe nach Dellaporta et al. (1983, Plant Molecular Biology Reporter, 1, Bd. 3, S. 19–21) isoliert. Die DNA-Konzentration jeder Präparation wurde durch Messen der optischen Dichte in einem Spektralphotometer bei einer Wellenlänge von 260 nm bestimmt.
Es wurden 10 μg genomische DNA mit Restriktionsenzym in einem endgültigen Reaktionsvolumen von 40 μl gespalten, wobei die vom Hersteller vorgeschlagenen Bedingungen angewendet wurden. Die Dauer der Spaltung und/oder die Menge an Restriktionsenzym wurden so eingestellt, daß vollständige Spaltung der genomischen DNA-Proben ohne unspezifischen Abbau gewährleistet war. Nach der Spaltung wurden 4 μl Beladungsfarbstoff zu den gespaltenen DNA-Proben zugegeben, und sie wurden auf ein 1%iges Agarosegel geladen.
Die folgenden Kontroll-DNAs wurden ebenfalls auf das Gel geladen:

– eine negative Kontrolle mit genomischer DNA, die von einer nicht-transgenen Brassica-Pflanze präpariert wurde. Diese negative Kontrolle wurde zur Bestätigung des Fehlens von Hintergrundhybridisierung verwendet.
– eine DNA-positive Kontrolle: mit einer heterozygoten Einzelkopieintegration des Transgens in das Brassica-napus-Genom, 10 μg genomische DNA enthält die gleiche Anzahl an Moleküläquivalenten wie ± 19 Picogramm 1501-bp-PvuI-HindIII-Fragment von pTHW118-DNA (Größe des diploiden Brassica-napus-Genoms: 0,8 × 10⁹ bp). Die Menge, die einer Plasmidkopie pro Genom entspricht, wird zu 1 μg gespaltener nicht-transgener Brassica napus-DNA gegeben. Die Rekonstitutionsprobe soll zeigen, daß die Hybridisierungen unter Bedingungen durchgeführt werden, die die Hybridisierung der Sonde mit Zielsequenzen gestatten.

Mit PstI gespaltene Phage-lambda-DNA (Stamm CIind 1 ts 857 Sam 7, Life Technologies) wurde als Größenstandard eingeschlossen.
Nach der Elektrophorese wurden die DNA-Proben (gespaltene genomische Brassica-DNA, Kontrollen und Größenstandard-DNA) mittels Kapillarblotting während 12 bis 16 Stunden auf eine Nylonmembran überführt.
Die DNA-Matrizen, die zur Sondenherstellung für MS-BN1-Events verwendet wurden, wurden durch Restriktionsspaltung von PTW107 mit HindIII hergestellt. Dies setzte ein 3942-bp-DNA-Fragment frei, das einen relevanten Teil der transformierenden DNA (Teil von PSSUARA, 3'nos, Barnase, PTA29) enthält.
Die DNA-Matrizen, die zur Sondenherstellung für RF-BN1-Events verwendet wurden, wurden durch Restriktionsspaltung von PTW118 mit HpaI hergestellt. Dies setzte ein 2182-bp-DNA-Fragment frei, das einen relevanten Teil der transformierenden DNA (Teil von PSSUARA, 3'nos, Barstar, PTA29) enthält.
Nach der Reinigung wurden die DNA-Fragmente gemäß Standardverfahren markiert und zur Hybridisierung mit der Membran verwendet.
Die Hybridisierung erfolgte unter Standard-Stringenzbedingungen: Die markierte Sonde wurde durch Erhitzen für 5 bis 10 Minuten in einem Wasserbad bei 95°C bis 100°C und Abkühlen auf Eis für 5 bis 10 Minuten denaturiert und zur Hybridisierungslösung (6 × SSC (20 × SSC ist 3,0 M NaCl, 0,3 M Na-Citrat, pH 7,0), 5 × Denhardt (100 × Denhardt = 2% Ficoll, 2% Polyvinylpyrrolidon, 2% Rinderserumalbumin), 0,5% SDS und 20 μg/ml denaturierte Träger-DNA (einzelsträngige Fischsperma-DNA mit einer durchschnittlichen Länge von 120–3000 Nuleotiden)) gegeben. Die Hybridisierung wurde über Nacht bei 65°C durchgeführt. Die Blots wurden dreimal für 20 bis 40 Minuten bei 65°C mit der Waschlösung (2 × SSC, 0,1% SDS) gewaschen.
Die Autoradiogramme wurden elektronisch gescannt.
4.1.1. MS-BN1
Die Restriktionsmuster, die nach Spaltung von genomischer MS-BN1-DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, sind in 2 dargestellt und in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3: Restriktionskarte von MS-BN1

(*)Die Längen dieser Fragmente sind die aus der Restriktionskarte des Plasmids pTHW107 vorhergesagten.

4.1.2. RF-BN1
Die Restriktionsmuster, die nach Spaltung von genomischer RF-BN1-DNA mit verschiedenen Restriktionsenzymen erhalten wurden, sind in 3 dargestellt und in Tabelle 4 zusammengefaßt. Tabelle 4: Restriktionskarte von RF-BN1

(*)Die Längen dieser Fragmente sind die aus der Restriktionskarte des pTHW118-Vektors mit BamHI vorhergesagten.

4.2. Identifikation der flankierenden Regionen
Die flankierenden Regionen der Eliteevents MS-BN1 und RF-BN1 wurden zunächst für Sommer-OSR identifiziert, in dem die Events entwickelt wurden, und dann für WOSR überprüft.
4.2.1. Identifikation der flankierenden Regionen von MS-BN1
4.2.1.1. Rechte (5'-)flankierende Region
Für die Sequenz der flankierenden Region der rechten Grenze von MS-BN1 wurde eine ligationsvermittelte Polymerase-Kettenreaktion (Mueller et al. 1989, Science 780–786; Maxine et al., 1994, PCR Methods and Applications, 71–75) mit Extension Capture (Törmanen et al., 1993, NAR 20: 5487–5488) verwendet.
Die zur Linker-Herstellung verwendeten Oligonukleotide waren:
Auf die Herstellung des Linkers folgte die Erststrangsynthese aus mit NcoI gespaltener genomischer MS-BN1-DNA mit Hilfe eines biotinylierten genspezifischen Primers:
Der Linker wurde dann an die Erststrang-DNA ligiert, die dann an Magnetperlen gekuppelt wurde, von denen der nicht-biotinylierte Strang eluiert wurde. Diese DNA wurde in einer PCR-Amplifikation im größeren Maßstab mit Hilfe der folgenden Primer verwendet:
Diese PCR ergab ein Fragment von etwa 1150 bp. Dieses rechte Grenzfragment wurde aus einem Agarosegel eluiert, und eine geschachtelte PCR erfolgte an einer 100-fachen Verdünnung dieser DNA mit Hilfe der folgenden Primer:
Dies ergab ein Fragment von etwa 1000 bp, das aus dem Agarosegel eluiert, gereinigt und mit dem pGem^®-T-Vektor ligiert wurde. Die rekombinante Plasmid-DNA wurde mit Hilfe einer Standard-PCR-Reaktion mit den folgenden Primern durchmustert:
Dies ergab die folgenden Fragmente: SP6-T7: 1224 bp
SP6-MDB201: 1068 bp
T7-MDB201: 1044 bp
Das rechte Grenzfragment wurde gereinigt und sequenziert (SEQ ID Nr. 13) und ergab 963 bp, von denen bp 1–867 Pflanzen-DNA entsprechen und bp 868 bis 953 der T-DNA von pTW107 entsprechen.
4.2.1.2. Linke (3'-)flankierende Region von MS-BN1
Die Sequenz der linken Grenzregion, die das inserierte Transgen im MS-BN1-Event flankiert, wurde mit Hilfe des Thermal-Asymmetric-Interlaced-(TAIL-)PCR-Verfahrens, wie von Liu et al. (1995, The Plant Journal 8 (3): 457–463) beschrieben, durchgeführt. Dieses Verfahren verwendet drei geschachtelte spezifische Primer in aufeinanderfolgenden Reaktionen zusammen mit einem kürzeren mehrdeutigen degenerierten (arbitrary degenerate, AD-) Primer, so daß die relativen Amplifikationseffizienzen spezifischer und unspezifischer Produkte thermisch gesteuert werden können. Die spezifischen Primer wurden so, daß sie an die Grenze des Transgens hybridisierten, und im Hinblick auf ihre Hybridisierungsbedingungen ausgewählt. Eine kleine Menge (5 μl) ungereinigte Sekundär- und Tertiär-PCR-Produkte wurden auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Das Tertiär-PCR-Produkt wurde zur präparativen Amplifikation verwendet, gereinigt und an einem Sequenzierautomaten mit Hilfe des DyeDeoxy-Terminator-Cycle-Kits sequenziert.
Die folgenden Primer wurden verwendet:
wobei: N = A, C, T oder g; S = C oder g; W = A oder T
Das mit Hilfe von HCA24-MDB611 amplifizierte Fragment war ca. 540 bp groß, von denen 537 bp sequenziert wurden (3'-Flanke: SEQ ID Nr. 18). Die Sequenz zwischen bp 1 und bp 180 enthielt pTHW107-DNA, während die Sequenz zwischen bp 181 und bp 537 Pflanzen-DNA entsprach.
4.2.1.3. Identifikation der Zielstellendeletion
Unter Verwendung von Primern, die Sequenzen innerhalb der flankierenden Regionen des Transgens entsprachen, an Wildtyp-Brassica napus var. Drakkar als Matrize wurde die Insertionsstelle des Transgens identifiziert.
Die folgenden Primer wurden verwendet:
Dies ergab ein 178-bp-Fragment (SEQ ID Nr. 21), in dem bp 132 bis 150 einer Zielstellendeletion entsprechen.
4.2.1.4. Identifikation der MS-BN1-Insertionsregion
Auf Basis der Identifikation der flankierenden Regionen und der Zielstellendeletion konnte die Insertionsregion von MS-BN1 bestimmt werden (SEQ ID Nr. 22)
1–822: 5'-flankierende Region bp 46–867 von SEQ ID Nr. 13
823–841 Zielstellendeletion bp 132–150 von SEQ ID Nr. 21
842–1198: 3'-flankierende Region bp 181 bis 537 von SEQ ID Nr. 18
4.2.2. Identifikation der flankierenden Regionen von RF-BN1
Die flankierenden Grenzregionen von RF-BN1 wurden mit Hilfe von Vectorette-PCR (Verwendung von Vectorette- und Subvektorette-PCR zur Isolation der das Transgen flankierenden DNA, Maxine J. Allen, Andrew Collick und Alec J. Jeffreys PCR Methods and Applications – 1994 (4) Seiten 71–75) mit genomischer RF-BN1-DNA, die mit HindIII gespalten war, als Matrize bestimmt. Der Vectorette-Linker wurde mit Hilfe der vorstehend beschriebenen Primer MDB248 (SEQ ID Nr. 3) und MDB249 (SEQ ID Nr. 4) hergestellt.
4.2.2.1. Rechte (5'-)flankierende Region von BN-RF1
Die folgenden Primer wurden verwendet:
Dies ergab ein 1077-bp-Fragment (SEQ ID Nr. 24), in dem bp 1–881 Pflanzen-DNA entsprechen und bp 882–1077 T-DNA von pTW118 entsprechen.
4.2.2.2. Linke (3'-)flankierende Region von BN-RF1
Zur Identifikation der 3'flankierenden Region von Eliteevent BN-RF1 wurde eine TAIL-PCR, wie oben beschrieben, mit Hilfe eines mehrdeutigen degenerierten Primers und von in der T-DNA in der Nähe der linken Grenze lokalisierten Primern durchgeführt.
Die verwendeten Primer waren: Mehrdeutiger degenerierter Primer:
wobei: N = A, C, T oder g; S = C oder g; W = A oder T
T-DNA-Primer:
Ein Fragment von etwa 2000 bp wurde erhalten. Dieses Fragment wurde in einen pGem^®-T-Vektor kloniert und als Matrize für eine PCR-Reaktion unter Verwendung der folgenden Primer verwendet:
Pflanzen-DNA-Primer:
T-DNA Primer:
Dies ergab ein Fragment von etwa 1500 bp (SEQ ID Nr. 30), wobei bp 1–166 T-DNA von Plasmid pTW118 entsprechen und bp 167–1441 Pflanzen-DNA entsprechen.
4.2.2.3. Molekulare Analyse der Zielstellendeletion
Die Zielstellendeletion wurde mit dem (oben beschriebenen) TAIL-PCR-Verfahren kloniert, wobei für genomische Wildtyp-DNA und Pflanzen-DNA spezifische Primer stromaufwärts des T-DNA-Inserts, die zum Insert gerichtet waren, verwendet wurden: Mehrdeutiger degenerierter Primer:
wobei: N = A, C, T oder g; S = C oder g; W = A oder T
Pflanzen-DNA-Primer:
Ein Fragment von 1068 bp (SEQ ID Nr. 34) wurde erhalten, worin:
53–83: 5'-flankierende Region
84–133: Zielstellendeletion
134–1055: 3'-flankierende Region
Nach Insertion der T-DNA wurden 51 bp der Zielstelle deletiert. Ein Vergleich der Wildtyp-Locus-Sequenz mit dem Rf3-Locus zeigte das Vorliegen von Füll-DNA an der rechten Grenzverbindungsstelle. Die TCTCG-Füllsequenz an der rechten Grenze wird von TCA am 5'-Ende und CGA am 3'-Ende flankiert. Diese Tripletts werden auch am Bruchpunkt der Zielstellendeletion bzw. der T-DNA gefunden. Eine Suche in distaleren Pflanzensequenzen zeigte einen möglichen Ursprung dieser Füll-DNA. Die TCA.TCTCG.CGA-Sequenz befindet sich auch in der Pflanzen-DNA am 3'-Ende der Zielstellendeletion. Sie ist die Kernsequenz von zwei 13 bp langen identischen Repeats, die sich 209 bp stromabwärts des Bruchpunktes der Zielstellendeletion befinden.
Die Insertionsregion für RF-BN1 kann so definiert werden, daß sie die linke flankierende Region, die Zielstellendeletion und die rechte flankierende Region wie folgt enthält:
1–881: 5'-flankierende Region (bp 1–881 von SEQ ID Nr. 24)
882–932: Zielstellendeletion (bp 84–133 von SEQ ID Nr. 34)
933–2207 3'-flankierende Region (bp 167–1441 von SEQ ID Nr. 30)
4.3. Genetische Analyse des Locus
Die genetische Stabilität der Inserts für die zwei Events wurde durch molekulare und phänotypische Analyse in den Nachkommenpflanzen über mehrere Generationen untersucht.
Southern-Blot-Analysen von Pflanzen der T₀-, T₁- und T₂-Generation wurden sowohl im Hinblick auf Event MS-BN1 als auch RF-BN1 verglichen. Es wurde gefunden, daß die erhaltenen Muster für jedes der Events in den verschiedenen Generationen identisch waren. Dies beweist, daß die molekulare Konfiguration der Transgene sowohl in MS-BN1- als auch RF-BN1-haltigen Pflanzen stabil war.
Die MS-BN1- und RF-BN1-Events zeigten für ihre jeweiligen Transgene mendelnde Segregation als einzelne genetische Loci in mindestens drei aufeinanderfolgenden Generationen, was zeigt, daß die Inserts stabil sind.
Auf Basis der obigen Ergebnisse wurden MS-BN1 und MS-RF1 als Eliteevents identifiziert.
4.4. Identifikation der flankierenden Sequenzen von MS-BN1 und RF-BN1 in WOSR
Die flankierenden Sequenzen der Eliteevents MS-BN1 und RF-BN1 in WOSR wurden unter Verwendung von Primern bestimmt, die auf Basis der flankierenden Sequenzen dieser Events in Sommerraps entwickelt wurden.
Die rechte (5'-)flankierende Sequenz von MS-BN1 in WOSR wurde mit Hilfe eines T-DNA-Primers (SEQ ID Nr. 12) und eines in der Pflanzen-DNA der rechten Grenze von MS-BN1 lokalisierten Primers bestimmt:
Dies ergab ein Fragment von 909 bp (SEQ ID Nr. 36) mit einer Sequenz, die im wesentlichen gleich der Sequenz SEQ ID Nr. 13 (ab Nukleotid 98) ist.
Die linke (3'-)flankierende Sequenz von MS-BN1 in WOSR wurde mit Hilfe eines T-DNA-Primers (SEQ ID Nr. 17) und eines in der Pflanzen-DNA an der linken Grenze von MS-BN1 lokalisierten Primers bestimmt:
Dies ergab ein Fragment von 522 bp (SEQ ID Nr. 38) mit einer Sequenz, die im wesentlichen gleich der Sequenz SEQ ID Nr. 18 ist.
Die rechte (5'-)flankierende Sequenz von RF-BN1 in WOSR wurde mit Hilfe eines T-DNA-Primers (SEQ ID Nr. 12) und eines in der Pflanzen-DNA an der rechten Grenze von RF-BN1 lokalisierten Primers (SEQ ID Nr. 31) bestimmt. Dies ergab ein Fragment von 694 bp (SEQ ID Nr. 39) mit einer Sequenz, die im wesentlichen gleich der Sequenz SEQ ID Nr. 24 (von Nukleotid 293 bis 980) ist.
Die Sequenz der linken Grenze von RF-BN1 in WOSR wurde mit Hilfe eines T-DNA-Primers (SEQ ID Nr. 26) und eines in der Pflanzen-DNA an der linken Grenze von RF-BN1 lokalisierten Primers (SEQ ID Nr. 29) bestimmt. Dies ergab ein Fragment von 1450 bp, von denen 1279 sequenziert wurden (SEQ ID Nr. 40). Es wurde gefunden, daß diese Sequenz im wesentlichen gleich der Sequenz SEQ ID Nr. 30 (von Nukleotid 141 bis 1421) ist.
Somit wurde bestätigt, daß die linke und die rechte Grenzsequenz der Eliteevents MS-BN1 und RF-BN1 in SOSR und WOSR im wesentlichen gleich sind.
Beispiel 5: Entwicklung diagnostischer Werkzeuge zur Identitätskontrolle
Die folgenden Protokolle wurden entwickelt, um jegliches WOSR-Pflanzenmaterial zu identifizieren, das das Eliteevent MS-BN1 enthält.
5.1. MS-BN1- und RF-BN1-Eliteevent-Restriktionskarten-Identifikationsprotokoll
WOSR-Pflanzen, die das Eliteevent MS-BN1 enthalten, können mittels Southern-Blotting im wesentlichen unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie im Beispiel 4.1. beschrieben, identifiziert werden. So wird genomische WOSR-DNA 1) mit mindestens zwei, vorzugsweise mindestens 3, insbesondere mit mindestens 4, genauer gesagt, mit allen der folgenden Restriktionsenzyme gespalten: EcoRI, EcoRV, NdeI, HpaI, AflIII, 2) auf Nylonmembranen übertragen und 3) mit dem 3942-bp-HindIII-Fragment von Plasmid pTHW107 hybridisiert. Wenn für mindestens zwei der verwendeten Restriktionsenzyme DNA-Fragmente mit der gleichen Länge, wie die in Tabelle 3 von Beispiel 4.1.1. aufgelisteten, identifiziert werden, wird bestimmt, daß die WOSR-Pflanze das Eliteevent MS-BN1 trägt.
WOSR-Pflanzen, die das Eliteevent RF-BN1 enthalten, können mittels Southern-Blotting im wesentlichen unter Verwendung des gleichen Verfahrens, wie im Beispiel 4.1. beschrieben, identifiziert werden. So wird genomische WOSR-DNA 1) mit mindestens zwei, vorzugsweise mindestens 3, am stärksten bevorzugt mit allen der folgenden Restriktionsenzyme gespalten: BamHI EcoRI, EcoRV, HindIII, 2) auf Nylonmembranen übertragen und 3) mit dem 2182-bp-HpaI-Fragment von Plasmid pTHW118 hybridisiert. Wenn für mindestens zwei der verwendeten Restriktionsenzyme DNA-Fragmente mit der gleichen Länge, wie die in Tabelle 4 von Beispiel 4.1.2. aufgelisteten, identifiziert werden, wird bestimmt, daß die WOSR-Pflanze das Eliteevent RF-BN1 trägt.
5.2. Polymerase-Kettenreaktion-Identifikationsprotokoll für das MS-BN1- und RF-BN1-Eliteevent
Bevor versucht wird, Unbekannte zu durchmustern, muß ein Testlauf mit allen angemessenen Kontrollen durchgeführt werden. Das dargestellte Protokoll kann eine Optimierung im Hinblick auf Komponenten erfordern, die sich zwischen den Laboren unterscheiden (Matrizen-DNA-Präparation, Taq-DNA-Polymerase, Qualität der Primer, dNTPs, Thermocyler usw.).
Die Amplifikation der endogenen Sequenz spielt in dem Protokoll eine Schlüsselrolle. Man muß PCR- und Thermozyklusbedingungen erzielen, die äquimolare Mengen sowohl der endogenen als auch der transgenen Sequenz in einer bekannten transgenen genomischen DNA-Matrize amplifizieren. Wenn das endogene Fragment, auf das abgezielt wird, nicht amplifiziert wird, oder wenn die Sequenzen, auf die abgezielt wird, nicht mit den gleichen Ethidiumbromid-Anfärbeintensitäten, wie mittels Agarosegelelektrophorese beurteilt, amplifiziert werden, kann eine Optimierung der PCR-Bedingungen erforderlich sein.
5.2.1. Matrizen-DNA
Matrizen-DNA wird aus einer Blattaustanzung oder einem einzelnen Samen nach Edwards et al. (Nucleic Acid Research, 19, S. 1349, 1991) präpariert. Wenn mit anderen Verfahren präparierte DNA verwendet wird, sollte ein Testlauf unter Verwendung verschiedener Mengen an Matrize durchgeführt werden. Gewöhnlich liefern 50 ng genomischer Matrizen-DNA die besten Ergebnisse.
5.2.2. Zugewiesene positive und negative Kontrollen
Die folgenden positiven und negativen Kontrollen sollten in einen PCR-Lauf eingeschlossen werden:

– Master-Mix-Kontrolle (DNA-negative Kontrolle). Dabei handelt es sich um eine PCR, bei der keine DNA zur Reaktion gegeben wird. Wenn das erwartete Ergebnis, keine PCR-Produkte, beobachtet wird, bedeutet dies, daß der PCR-Cocktail nicht mit Ziel-DNA kontaminiert war.
– Eine DNA-positive Kontrolle (genomische DNA-Probe, von der bekannt ist, daß sie die transgenen Sequenzen enthält). Eine erfolgreiche Amplifikation dieser positiven Kontrolle zeigt, daß die PCR unter Bedingungen durchgeführt wurde, die die Amplifikation von Zielsequenzen gestatten.
– Eine Wildtyp-DNA-Kontrolle. Dabei handelt es sich um eine PCR, bei der die bereitgestellte Matrizen-DNA aus einer nicht-transgenen Pflanze präparierte genomische DNA ist. Wenn das erwartete Ergebnis, keine Amplifikation des transgenen PCR-Produkts, aber Amplifikation des endogenen PCR-Produkts, beobachtet wird, zeigt dies, daß keine nachweisbare Transgen-Hintergrundamplifikation in einer genomischen DNA-Probe erfolgt.

5.2.3. Primer
Die folgenden Primer, die das Transgen und eine flankierende Sequenz von MS-BN1 spezifisch erkennen, werden verwendet:
Zur Identifikation von Pflanzenmaterial, das RF-BN1 enthält, werden die folgenden Primer verwendet, die das Transgen und eine flankierende Sequenz von RF-BN1 spezifisch erkennen:
Primer, die eine endogene Sequenz ansteuern, sind im PCR-Cocktail immer enthalten. Diese Primer dienen als interne Kontrolle in unbekannten Proben und in der DNA-positiven Kontrolle. Ein positives Ergebnis mit dem endogenen Primerpaar zeigt, daß eine gute DNA mit angemessener Qualität in der genomischen DNA-Präparation für die Herstellung eines PCR-Produkts vorliegt.
Die verwendeten endogenen Primer sind:
5.2.4. Amplifizierte Fragmente
Die erwarteten amplifizierten Fragmente in der PCR-Reaktion sind:
5.2.5. PCR-Bedingungen
Der PCR-Mix für 50-μl-Reaktionen enthält:
5 μl Matrizen-DNA
5 μl 10 × Amplifikationspuffer (mit Taq-Polymerase angereichert)
1 μl 10 mM dNTPs
1 μl BNA01 (MS-BN1) oder BNA03 (RF-BN1) (10 pmol/μl)
1 μl BNA02 (RF-BN1) oder BNA04 (RF-BN1) (10 pmol/μl)
0,5 μl BNA05 (10 pmol/μl)
0,5 μl BNA06 (10 pmol/μl)
0,2 μl Taq-DNA-Polymerase (5 Einheiten/μl)
Wasser bis auf 50 μl
Das Thermozyklusprofil, nach dem für optimale Ergebnisse vorgegangen werden muß, ist das folgende:
4 min bei 95°C
Gefolgt von: 1 min bei 95°C
1 min bei 57°C
2 min bei 72°C
Für 5 Zyklen
Gefolgt von: 30 s bei 92°C
30 s bei 57°C
1 min bei 72°C
Für 22 bis 25 Zyklen
Gefolgt von: 5 Minuten bei 72°C
5.2.6. Agarosegel-Analyse
Zwischen 10 und 20 μl der PCR-Proben sollten auf ein 1,5%iges Agarosegel (Trisborat-Puffer) mit einem geeigneten Molekulargewichtsmarker (z.B. 100-bp-Leiter, PHARMACIA) aufgetragen werden.
5.2.7. Validierung der Ergebnisse
Daten von transgenen Pflanzen-DNA-Proben in einem einzigen PCR-Lauf und einem einzigen PCR-Cocktail sollten nicht akzeptabel sein, wenn nicht 1) die DNA-positive Kontrolle die erwarteten PCR-Produkte zeigt (transgene und endogene Fragmente), 2) die DNA-negative Kontrolle im Hinblick auf die PCR-Amplifikation negativ ist (keine Fragmente) und 3) die Wildtyp-DNA-Kontrolle das erwartete Ergebnis zeigt (Amplifikation des endogenen Fragments).
Spuren, die sichtbare Mengen der transgenen oder endogenen PCR-Produkte der erwarteten Größen aufweisen, zeigen, daß die entsprechende Pflanze, aus der die genomische Matrizen-DNA präpariert wurde, das MS-BN1- und/oder RF-BN1-Eliteevent geerbt hat. Spuren, die keine sichtbaren Mengen eines der transgenen PCR-Produkte und sichtbare Mengen des endogenen PCR-Produkts zeigen, zeigen, daß die entsprechende Pflanze, aus der die genomische Matrizen-DNA präpariert wurde, das Eliteevent nicht enthält. Spuren, die keine sichtbaren Mengen der endogenen und transgenen PCR-Produkte zeigen, zeigen, daß die Qualität und/oder Quantität der genomischen DNA die Erzeugung eines PCR-Produkts nicht gestattete(n). Diese Pflanzen können nicht bewertet werden. Die genomische DNA-Präparation sollte wiederholt werden, und ein neuer PCR-Lauf mit den angemessenen Kontrollen muß durchgeführt werden.
5.2.8. Verwendung eines unterscheidenden PCR-Protokolls zur Identifikation von MS-BN1 und RF-BN1
WOSR-Blattmaterial von Pflanzen, die entweder MS-BN1, RF-BN1 oder ein anderes transgenes Event enthalten, wurde gemäß dem oben beschriebenen Protokoll getestet. Proben von WOSR-Wildtyp wurden als negative Kontrollen verwendet.
Die Ergebnisse der PCR-Analyse sind in den 4 und 5 veranschaulicht.
4 veranschaulicht das Ergebnis, das mit dem Eliteevent-PCR-Identifikationsprotokoll für MS-BN1 an zwei WOSR-Proben erhalten wurde (Spur 1 und 2). Man erkennt, daß Spur 1 das Eliteevent enthält, weil die 280-bp-Bande nachgewiesen wird, während die Probe in Spur 2 kein MS-BN1 enthält.
5 veranschaulicht das Ergebnis, das mit dem Eliteevent-PCR-Identifikationsprotokoll für RF-BN1 an zwei WOSR-Proben erhalten wurde (Spur 1 und 2). Man erkennt, daß Spur 1 das Eliteevent enthält, weil die 215-bp-Bande nachgewiesen wird, während die Probe in Spur 2 kein RF-BN1 enthält.
Beispiel 6: Produktion von Hybridsamen mit Hilfe von MS-BN1 und RF-BN1 in WOSR
WOSR-Pflanzen, die MS-BN1 enthielten und pollensteril waren, wurden mit WOSR-Pflanzen gekreuzt, die für RF-BN1 homozygot waren. Hybridsamen wurde von MS-BN1 gewonnen und bei der ATCC unter der ATCC-Eingangsnummer PTA-730 hinterlegt.
Dieser Hybridsamen wurde erneut im Feld ausgepflanzt. Es wurde gefunden, daß die Pflanzen zu 100% fertil waren und ausgezeichnete agronomische Merkmale zeigten. Hybridpflanzen enthielten entweder sowohl MS-BN1 als auch RF-BN1 oder nur das RF-BN1-Event.
Beispiel 7: Einbringen von MS-BN1 und RF-BN1 in bevorzugte WOSR-Kultivare
Die Eliteevents MS-BN1 und RF-BN1 wurden mittels wiederholter Rückkreuzung von Pflanzen, die das Event MS-BN1 bzw. RF-BN1 enthielten, in eine Reihe landwirtschaftlich bedeutender WOSR-Kultivare eingeführt.
Es wurde beobachtet, daß die Introgression der Eliteevents in diese Kultivare keines der wünschenswerten phänotypischen oder agronomischen Merkmale dieser Kultivare signifikant beeinflußte (kein "linkage drag"), während die Expression des Transgens, wie durch Glufosinat-Toleranz bestimmt, kommerziell annehmbare Spiegel erreicht. Dies bestätigt den Status von Event MS-BN1 und RF-BN1 als Eliteevents.
Wie in den nachstehenden Ansprüchen verwendet, soll der Begriff "Pflanze", wenn nicht eindeutig anders angegeben, Pflanzengewebe in jedem Reifungsstadium sowie alle Zellen, Gewebe oder Organe, die aus irgendeiner solchen Pflanze entnommen worden sind oder davon stammen, einschließlich, ohne Beschränkung, alle Samen, Blätter, Stengel, Blüten, Wurzeln, Einzelzellen, Gameten, Zellkulturen, Gewebekulturen oder Protoplasten, beinhalten.
Samen, die Eliteevent MS-BN1 und Eliteevent RF-BN1 oder nur Eliteevent RF-BN1 enthalten, wurden bei der American Tissue Culture Collection unter der Eingangsnummer: PTA730 hinterlegt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Winterrapspflanze, -samen, -pflanzenzelle oder -gewebe, enthaltend das Eliteevent RF-BN1, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 195 und 235 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 23 bzw. SEQ ID Nr. 41 zu amplifizieren, wobei diese Pflanze, dieser Samen, diese Pflanzenzelle oder dieses Pflanzengewebe von den unter der ATCC-Eingangsnummer PTA-730 hinterlegten Samen erhältlich ist.
Pflanze, Samen, Pflanzenzelle oder Gewebe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 215 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 23 bzw. SEQ ID Nr. 41 zu amplifizieren.
Pflanze, Samen, Pflanzenzelle oder Gewebe nach Anspruch 1, weiterhin enthaltend das Eliteevent MS-BN1, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 260 und 300 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren.
Pflanze, Samen, Pflanzenzelle oder Gewebe nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 280 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren.
Pflanze, Samen, Pflanzenzelle oder Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch erhältlich, daß man eine Pflanze mit einer Winterrapspflanze, die aus dem bei der ATCC unter der Eingangsnummer PTA-730 hinterlegten Samen stammt, kreuzt.
Pflanze, Samen, Pflanzenzelle oder Gewebe nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei es sich um eine Hybridpflanze, -samen oder Hybridpflanzenzelle oder -gewebe handelt.
Winterrapspflanze, -samen, -pflanzenzelle oder -gewebe, enthaltend das Eliteevent MS-BN1, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 260 und 300 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren, wobei diese Pflanze, dieser Samen, diese Pflanzenzelle oder dieses Pflanzengewebe von den unter der ATCC-Eingangsnummer PTA-730 hinterlegten Samen erhältlich ist.
Pflanze, Samen, Pflanzenzelle oder Gewebe nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 280 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren.
Verfahren zur Herstellung von Hybridsamen, das folgendes umfaßt: a) Identifizieren einer transgenen, pollensterilen Winterrapspflanze, enthaltend das Eliteevent MS-BN1, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 260 und 300 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren, wobei die transgene, pollensterile Winterrapspflanze von den unter der ATCC-Eingangsnummer PTA-730 hinterlegten Samen erhältlich ist, b) Kreuzen der in Schritt (a) identifizierten transgenen, pollensterilen Winterrapspflanze mit einer Fertilitätsrestorer-Winterrapspflanze, die ein Fertilitätsrestorer-Gen, das eine DNA enthält, die für einen Ribonukleasehemmer unter der Kontrolle eines Promotors, der die Expression dieser DNA zumindest in den Zellen, in denen das Pollensterilitäts-Gen des Eliteevents MS-BN1 exprimiert wird, steuert, codiert, stabil in ihr Genom integriert enthält; sowie c) Ernten des Hybridsamens von der pollensterilen Winterrapspflanze.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Fertilitätsrestorer-Pflanze das Eliteevent RF-BN1 enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 215 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 23 bzw. SEQ ID Nr. 41 zu amplifizieren, wobei die Fertilitätsrestorer-Pflanze von den unter der ATCC-Eingangsnummer PTA-730 hinterlegten Samen erhältlich ist.
Transgener Hybridsamen von Winterraps, erhältlich nach dem Verfahren gemäß Anspruch 9 oder 10.
Verfahren zur Identifikation einer transgenen Pflanze oder deren Zellen oder Geweben, enthaltend das Eliteevent MS-BN1, bei dem herausgefunden wird, ob die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 260 und 300 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem herausgefunden wird, ob die genomische DNA der transgenen Pflanze oder deren Zellen oder Gewebe dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 280 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 zu amplifizieren.
Kit zum Identifizieren einer transgenen Pflanze, deren Zellen oder Geweben, enthaltend das Eliteevent MS-BN1, wobei dieses Kit PCR-Primer enthält, von denen einer eine Fremd-DNA-Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 1 erkennt und ein zweiter eine 5'-flankierende Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 13 oder eine 3'-flankierende Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 18 erkennt, zur Verwendung in einem PCR-Identifikationsprotokoll.
Kit nach Anspruch 14, wobei der Primer, der die Fremd-DNA-Sequenz von MS-BN1 erkennt, eine Fremd-DNA-Sequenz von MS-BN1 innerhalb SEQ ID Nr. 13 oder innerhalb SEQ ID Nr. 18 erkennt.
Kit nach Anspruch 14, wobei die PCR-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 12 bzw. SEQ ID Nr. 19 enthalten.
Verfahren zur Identifikation einer transgenen Pflanze oder deren Zellen oder Geweben, enthaltend das Eliteevent RF-BN1, bei dem herausgefunden wird, ob die genomische DNA dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe zwischen 195 und 235 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 23 bzw. SEQ ID Nr. 41 zu amplifizieren.
Verfahren nach Anspruch 16, bei dem herausgefunden wird, ob die genomische DNA der transgenen Pflanze oder deren Zellen oder Gewebe dazu verwendet werden kann, um ein DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 215 Basenpaaren mit Hilfe einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primern mit der Nukleotidsequenz SEQ ID Nr. 23 bzw. SEQ ID Nr. 41 zu amplifizieren.
Kit zum Identifizieren einer transgenen Pflanze, deren Zellen oder Geweben, enthaltend das Eliteevent RF-BN1, wobei dieses Kit PCR-Primer enthält, von denen einer eine Fremd-DNA-Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 2 erkennt und ein zweiter eine 5'-flankierende Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 24 oder eine 3'-flankierende Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 30 erkennt, zur Verwendung in einem PCR-Identifikationsprotokoll.
Kit nach Anspruch 19, wobei der Primer, der die Fremd-DNA-Sequenz von RF-BN1 erkennt, eine Fremd-DNA-Sequenz von RF-BN1 innerhalb SEQ ID Nr. 24 oder innerhalb SEQ ID Nr. 30 erkennt.
Kit nach Anspruch 19, wobei die PCR-Primer die Nukleotidsequenz von SEQ ID Nr. 23 bzw. SEQ ID Nr. 41 enthalten.
Kit zum Identifizieren des Eliteevents MS-BN1 in biologischen Proben, wobei das Kit mindestens einen PCR-Primer oder eine Sonde, der bzw. die eine 5'-flankierende Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 13 oder eine 3'-flankierende Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 18 erkennt, enthält.
Kit nach Anspruch 22, wobei der PCR-Primer oder die Sonde, der bzw. die die 5'-flankierende Sequenz von MS-BN1 erkennt, die Sequenz von SEQ ID Nr. 19 enthält.
Kit nach Anspruch 22 oder 23, das weiterhin mindestens einen zweiten PCR-Primer oder eine zweite Sonde, der bzw. die eine Fremd-DNA-Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 1 erkennt, enthält.
Kit nach Anspruch 24, wobei der zweite PCR-Primer oder die zweite Sonde eine Fremd-DNA-Sequenz von MS-BN1 innerhalb SEQ ID Nr. 13 oder innerhalb von SEQ ID Nr. 18 erkennt.
Kit nach Anspruch 24, wobei der zweite PCR-Primer oder die zweite Sonde die Sequenz von SEQ ID Nr. 12 enthält.
Verfahren zur Bestätigung der Reinheit von Samen, bei dem mit einem Primer oder einer Sonde, der bzw. die spezifisch eine 5'-flankierende Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 13 oder eine 3'-flankierende Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 18 erkennt, eine für MS-BN1 spezifische DNA-Sequenz in Samenproben nachgewiesen wird.
Verfahren zum Durchmustern von Samen auf das Vorliegen von MS-BN1, bei dem mit einem spezifischen Primer oder einer spezifischen Sonde, der bzw. die spezifisch eine 5'-flankierende Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 13 oder eine 3'-flankierende Sequenz von MS-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 18 erkennt, eine für MS-BN1 spezifische DNA-Sequenz in Proben einer Samencharge nachgewiesen wird.
Kit zum Identifizieren des Eliteevents RF-BN1 in biologischen Proben, wobei das Kit mindestens einen PCR-Primer oder eine Sonde, der bzw. die eine 5'-flankierende Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 24 oder eine 3'-flankierende Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 30 erkennt, enthält.
Kit nach Anspruch 29, wobei der PCR-Primer oder die Sonde, der bzw. die die 5'-flankierende Sequenz von RF-BN1 erkennt, die Sequenz von SEQ ID Nr. 41 enthält.
Kit nach Anspruch 29 oder 30, das weiterhin mindestens einen zweiten PCR-Primer oder eine zweite Sonde, der bzw. die eine Fremd-DNA-Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 2 erkennt, enthält.
Kit nach Anspruch 31, wobei der zweite PCR-Primer oder die zweite Sonde eine Fremd-DNA-Sequenz von RF-BN1 innerhalb SEQ ID Nr. 24 oder innerhalb von SEQ ID Nr. 30 erkennt.
Kit nach Anspruch 31, wobei der zweite PCR-Primer oder die zweite Sonde die Sequenz von SEQ ID Nr. 23 enthält.
Verfahren zur Bestätigung der Reinheit von Samen, bei dem mit einem spezifischen Primer oder einer spezifischen Sonde, der bzw. die spezifisch eine 5'-flankierende Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 24 oder eine 3'-flankierende Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 30 erkennt, eine für RF-BN1 spezifische DNA-Sequenz in Samenproben nachgewiesen wird.
Verfahren zum Durchmustern von Samen auf das Vorliegen von RF-BN1, bei dem mit einem spezifischen Primer oder einer spezifischen Sonde, der bzw. die spezifisch eine 5'-flankierende Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 24 oder eine 3'-flankierende Sequenz von RF-BN1 innerhalb von SEQ ID Nr. 30 erkennt, eine für RF-BN1 spezifische DNA-Sequenz in Proben einer Samencharge nachgewiesen wird.