CN105121651B - 杂交芸苔属植物及其生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供转基因的芸苔属植物、植物材料和种子,特别是油籽油菜植物，其特征在于这些植物具有两种特定转化事件的组合，即包含雄性不育转基因的MS‑B2和包含育性恢复转基因的RF‑BN1。本发明还提供分别包含所述事件的之一的一对芸苔属植物，及其在生产杂交种子中的用途。

Description

杂交芸苔属植物及其生产方法

发明领域

本发明涉及转基因的芸苔属植物、植物材料和种子,特别是油籽油菜(oilseedrape)植物，其特征在于这些植物包含两个特定转化事件的组合，具体为在芸苔属基因组特定位置存在雄性不育基因，和在芸苔属基因组另一特定位置存在育性恢复基因。本发明还涉及一对转基因芸苔属植物，特别是油籽油菜植物，其特别适于生产杂交种子。更具体地，一种植物的特征为雄性不育，因为在其基因组中存在雄性不育基因，而另一种植物的特征为携带可阻止雄性不育基因活性的育性恢复基因。本发明的这对芸苔属植物将形成杂交种子的能力与最佳总体农学性能、遗传稳定性以及对不同遗传背景的适应性相结合。

发明背景

转基因在植物中的表型表达由该基因自身的结构及其在植物基因组中的位置来决定。同时，(外源DNA中的)转基因在基因组的不同位置存在，可以以不同方式影响植物的总体表型。通过遗传操作对植物从农业上或工业上成功导入商业感兴趣的性状是一个漫长的、受不同因素影响的过程。经遗传转化的植物的实际转化和再生只是一系列选择步骤的第一步，其中所述选择步骤包括广泛的遗传鉴定、育种及野外试验的评估。

术语“油菜籽”(rapeseed)涵盖芸苔属物种的各种种子。芸苔属(植物)作为最有价值的油料作物在从中国和印度到芬兰和加拿大广泛种植。多数芸苔属种类属于十字花科家族。它们起源于二倍体物种，具有从7(地中海包心菜(Brassica fruticulosa))到12(白芥(Sinapsis alba))的非整倍体(aneuploid)染色体数。在加拿大最广泛种植的芸苔属物种为芜菁(turnip rape)，或Brassica campestris(aa,n＝10)。甘蓝(Brassica oleracea)(cc,n＝9)在近期进化史中分化为至少六种园艺种类，包括椰菜，花椰菜和甘蓝(cabbage)。黑芥(Brassica nigra)(bb,n＝8)或称黑芥(black mustard)是商业上的较不重要的作物，主要以其种子为人所知，芥末起初由其种子制得。从这些基本种类，在更近期的进化阶段中通过互交(intercross)产生双倍体杂种(amphiploid)。这之中最重要的是欧洲油菜(Brassica napus)(aacc)以及芥菜(Brassica juncea)(aabb)或称褐芥菜(brownmustard)，前者的冬季种类在北欧提供了最高的油菜籽产量，后者为印度次大陆主要的油料作物之一。尽管不同芸苔属物种(特别是那些基因组相容的)之间的互交是可能的，并且经常出于育种目的进行互交，但不是所有的性状(或基因)都能够从一个物种转移到另一物种，或在转移到不同物种时，不是所有的特性(或基因)都能够保持相同的特征(或表达模式)。因此，在一个芸苔属物种中赋予天然或嵌合基因最佳表达的遗传基因座，在另一物种中不一定具有相同的效果。

芸苔属物种为两性的，一般60-70％为自花传粉。作为选择基础，杂交体的产生和遗传变异的导入通常依赖于对自然发生现象(例如自身不相容性和细胞质雄性不育)的适应。在芸苔属育种中未广泛使用人工授粉控制法例如手工去雄或使用杀配子剂，分别是因为它们有限的实用性和高成本。

已开发了用于产生雄性或雌性不育植物的转基因方法，它们提供了有意义的常规技术替代方法。

EP 0,344,029描述了用于获得核雄性不育的体系，其中将植物用雄性不育基因转化，所述雄性不育基因包含例如在绒毡层(tapetum)特异启动子TA29控制下的编码芽孢杆菌RNA酶分子的DNA,当该基因掺入植物中后，可选择性破坏绒毡层细胞。用此基因转化烟草及油籽油菜植物导致花粉形成完全受阻的植物(Mariani等，1990,Nature 347:737-741)。

De Block和De Brouwer(1993,Planta 189:218-225)描述了包含嵌合PTA29:芽孢杆菌RNA酶基因的欧洲油菜植物花药发育的细胞化学和组织化学分析。

为恢复雄性不育植物之子代的育性，开发了这样的体系，其中雄性不育植物与携带育性恢复基因的转基因植物杂交，育性恢复基因在表达时可抑制或阻止雄性不育基因的活性(US 5,689,041；US 5,792,929；De Block和De Brouwer,同上)。WO 96/26283中描述了在雄性不育植物的生产中使用共同调节的(多个)基因以增加具有良好农艺学性状的转化体的(产生)频率。典型地，当不育性DNA编码芽孢杆菌RNA酶，共同调节的DNA将编码芽孢杆菌RNA酶抑制剂。

原种事件MS-B2，和包含赋予雄性不育性的此原种事件的雄性不育植物，在WO01/31042中详细描述(在此引入作为参考)，包括转基因和所插入的转基因紧侧翼的植物DNA序列的表征。

包含原种事件MS-B2的参考种子以ATCC保藏号PTA-850于1999年10月14日保藏于ATCC(10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209)。同一种子的另一样品以保藏号PTA-2485保藏。MS-B2的备选名字为MS 11。

原种事件RF-BN1，和包含赋予雄性不育性的此原种事件的雄性不育植物，在WO01/41558中详细描述(在此引入作为参考)，包括转基因和所插入的转基因紧侧翼的植物DNA序列的表征。

包含原种事件RF-BN1的参考种子以ATCC保藏号PTA-730于1999年9月20日保藏于ATCC(10801 University Blvd.,Manassas,VA 20110-2209)。RF-BN1的备选名字为Rf 3。

WO01/41558还描述了原种事件MS-BN1，包含该事件的雄性不育植物，以及鉴定这样的植物及其子代的方法。MS-BN1的备选名字为MS 8。

MS-BN1和RF-BN1事件包含在以商标名In

Canola出售的杂交欧洲油菜植物中。

前述这些文件既未描述芸苔属植物中MS-B2和RF-BN1的具体组合，也未描述其在杂交种子生产中的用途。迄今也未提及芥菜中的RF-BN1，以及MS-B2增加芸苔属油料种子植物产量的用途。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了从油籽油菜植物，例如欧洲油菜或芥菜生产杂交种子的方法，包含如下步骤，提供包含原种事件MS-B2的雄性不育的雌性亲本油籽油菜植物，包含所述原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC；提供包含原种事件RF-BN1的雄性不育的雄性亲本油籽油菜植物，优选为纯合形式，包含所述原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC；用来自所述雄性亲本油籽油菜植物的花粉对所述雌性亲本油籽油菜植物进行授粉；并从所述雌性亲本植物收获杂交种子。

在另一实施方案中，本发明提供了油籽油菜植物，例如欧洲油菜或芥菜植物，其核基因组中包含至少一个拷贝的原种事件MS-B2，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，还包含至少一个拷贝的原种事件RF-BN1，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。本发明还提供了这样的油籽油菜植物的细胞或组织或种子。

在本发明的另一实施方案中，提供了一对油籽油菜植物，以用于生产杂交种子，其中一种植物包含原种事件MS-B2，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，另一种所述油籽油菜植物包含原种事件RF-BN1，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

本发明的目的还在于提供油籽油菜植物，例如欧洲油菜或芥菜植物的基因组DNA，其核基因组中包含至少一个拷贝的原种事件MS-B2，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，还包含至少一个拷贝的原种事件RF-BN1，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

本发明还提供了包含原种事件RF-BN1的芥菜，及其细胞和种子，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。这样的植物还可包含原种事件MS-B2，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。

本发明还提供了原种事件MS-B2的用途，用于提高转基因油籽油菜植物例如芥菜植物的种子产量，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。

在本发明另一实施方案中，提供了增加油籽油菜植物产量的方法，包含如下步骤，提供具有原种事件MS-B2的油籽油菜植物，包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。

附图简述

图1：应用除草剂后MS/RF杂交欧洲油菜种系的活力(vigor)比对。图A：无草铵膦应用。图B：一次草铵膦应用。图C：两次草铵膦应用。方块：MS-BN1/RF-BN1植物；点：MS-B2/RF-BN1植物。

图2：应用除草剂后MS/RF杂交欧洲油菜种系的产量比对。图A：无草铵膦(glufosinate-ammonium)应用。图B：一次草铵膦应用。图C：两次草铵膦应用。暗灰色条：MS-BN1/RF-BN1植物；浅灰色条：MS-B2/RF-BN1植物。Loc1至Loc5：田间试验位置；AVG：所有位置的平均值。将MS-BN1/RF-BN1植物设为100％，产量以与其相比的％显示。

发明详述

本发明描述了在油籽油菜植物，特别是欧洲油菜和芥菜中雄性不育事件MS-B2和育性恢复事件RF-BN1的新组合。

本发明基于以下令人意想不到的发现(及其他)，当芸苔属油籽油菜植物中还包含赋予雄性不育的原种事件MS-B2时，赋予育性恢复的原种事件RF-BN1足以有效地在该植物中恢复育性。尽管RF-BN1此前曾成功用于在包含原种事件MS-BN1的油籽油菜植物中恢复育性，但不可预料RF-BN1是否也能在包含原种事件MS-B2的油籽油菜植物中恢复育性。不同的包含雄性不育性的原种事件具有由转基因雄性不育基因表达的芽孢杆菌RNA酶产物的不同表达水平，无法预测由RF-BN1中的转基因育性恢复基因产生的芽孢杆菌RNA酶抑制剂(barstar)水平能够匹配在其他个体雄性不育事件中芽孢杆菌RNA酶(barnase)的表达。如在下文实施例中所示，与同一雄性不育事件MS-B2与其他育性恢复事件的组合相比，本发明的组合导致实质更高的产量。

此外，RF-BN1曾被描述为位于C基因组(见WO 01/31042；也见例如www.agbios.com/dbase.php？action＝showProd&data＝MS8xRF3)。因此，本领域技术人员直接不会考虑将RF-BN1从欧洲油菜(aacc)中引入不含C-基因组的芥菜(aabb)。然而本说明书提供了RF-BN1位于A-基因组的数据，从而使得可以通过杂交将其引入芥菜。

此外，田间试验显示，与不含MS-B2的等基因植物系相比，MS-B2的存在增加平均产量(谷物产量(grain yield))。

因此在本发明的一个实施方案中，提供了从油籽油菜植物，例如欧洲油菜或芥菜，生产杂交种子的方法，包含如下步骤

-提供包含原种事件MS-B2的雄性不育雌性亲本油籽油菜植物，其中原种事件MS-B2包含雄性不育基因；

-提供包含原种事件RF-BN1的雄性不育雄性亲本油籽油菜植物，其中原种事件RF-BN1，优选以纯合形式，包含育性恢复基因；

-使得来自所述雄性亲本油籽油菜植物的花粉对所述雌性亲本油籽油菜植物进行授粉；并

-从所述雌性亲本植物收获杂交种子。

此处所用的术语“基因”指的是任何DNA序列，其包含一些可操作连接的DNA片段，例如启动子和5’非翻译区(5’UTR)(它们一起形成启动子区域)，编码区(其编码或不编码蛋白质)以及包含聚腺苷酸化位点的3’非翻译区(3’UTR)。在植物细胞中通常5’UTR、编码区和3’UTR转录为RNA，在蛋白质编码基因的情况下其被翻译为蛋白质。基因可包括额外的DNA片段，例如内含子。如此处所用，基因座为一个给定基因在植物基因组中的位置。

当提到基因或DNA序列时所用的术语“嵌合”是指这样的基因或DNA序列，其包含至少两种相互间为非天然连接的、且例如来自不同来源的、功能相关的DNA片段(例如启动子、5’UTR、编码区、3’UTR、内含子)。谈到某植物物种的基因或DNA序列时，“外源”指，该基因或DNA序列非天然存在于该植物物种中，或该基因或DNA序列非天然存在于该植物物种的该基因座中。此处所用术语“外源DNA”指作为转化的结果而掺入植物基因组的DNA序列。此处所用“转化DNA”指用于转化的重组DNA分子。转化DNA通常包含可将一种或多种特定特性赋予被转化植物的至少一种“目的基因”(例如嵌合基因)。术语“重组DNA分子”用于示例并因此可以包括这样的分离的核酸分子，所述分离的核酸分子可为DNA且其可通过重组或其它方法获得。

此处所用的术语“转基因”指掺入植物基因组的目的基因。“转基因植物”指在其所有细胞的基因组中包含至少一个转基因的植物。

在本发明的植物中存在的外源DNA优选地包含两种目的基因，更具体地，雄性不育基因和除草剂抗性基因，或育性恢复基因和除草剂抗性基因。

此处所用术语“雄性不育基因”指的是这样的基因，其在植物中表达后，使植物不能产生能育的、能活的花粉。雄性不育基因的实例为包含编码芽孢杆菌RNA酶之DNA序列的基因，其中编码芽孢杆菌RNA酶的DNA序列处于介导其于绒毡层细胞中表达的启动子的控制下。更具体地，本发明的雄性不育基因为此处描述的“TA29-芽孢杆菌RNA酶”。

此处所用的“育性恢复基因”指的是这样的基因，其在含有雄性不育基因的植物中表达后，可阻止雄性不育基因的表型表达，使该植物恢复育性。更具体地，育性恢复基因包含编码可阻止雄性不育基因表型表达的蛋白质或多肽的DNA，其中所述DNA处于介导其至少在表达雄性不育基因的细胞中表达的启动子的控制下。更具体地，本发明的育性恢复基因为此处所述的“TA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂”。

植物基因组中重组DNA分子的掺入通常来自细胞或组织的转化(或来自另一种遗传操作)。掺入的具体位点或是随机的或是事先决定的位置(如果用靶向整合方法的话)。

外源DNA可表征为重组DNA分子在植物基因组中掺入位点的位置和构型。重组DNA在植物基因组中的插入位点也称为“插入位点”或“靶位点”。植物基因组中转基因的插入可以与植物DNA的缺失相关，称为“靶位点缺失”。此处所用的“侧翼区”或“侧翼序列”指的是植物基因组的至少20bp，优选地至少50bp，以及高达5000bp的序列，该序列位于外源DNA的紧上游且与之邻接，或位于外源DNA的紧下游且与之邻接。导致外源DNA随机整合的转化步骤会产生具有不同侧翼区的转化体，对每一个转化体而言其是特征性的和独特的。当转基因通过传统杂交导入植物时，其在植物基因组中的插入位点或其侧翼区一般不改变。此处所用的“插入区”指的是这样的区域，其对应于至少40bp，优选地至少100bp,以及高达10000bp以上的区域，在(未转化的)植物基因组中所述区域被包围在转基因的上游和下游侧翼区中且包括插入位点(以及可能的靶位点缺失)。考虑到由于种内突变引起的小差异，插入区与该物种的给定植物中包含外源DNA的上游和下游侧翼区的序列保持至少85％，优选地90％,更优选地95％,且最优选地100％序列同一性。

目的基因的表达指的是，该基因赋予了植物一种或多种表型性状(例如除草剂抗性)，其中所述表型性状是(基于部分或全部目的基因的结构和功能)原预期通过转化中所用的重组DNA分子(转化DNA)的导入而赋予的性状。

“事件”定义为作为遗传操作结果的(人工的)基因座，其携带包含至少一拷贝目的基因的外源DNA。事件的典型等位基因状态为外源DNA的存在或缺失。此处所用的“MS”事件和RF“事件”指分别携带“TA29-芽孢杆菌RNA酶”和“TA29-芽孢杆菌RNA酶抑制剂”的事件。事件在表型上可以通过一个或多个转基因的表达来表征。在基因水平上，事件是植物基因组成的一部分。在分子水平上，事件可以通过限制性酶切图谱(例如通过Southern印迹确定)和/或通过转基因的上游和/或下游侧翼序列，和/或转基因的分子构型来表征。通常，用包含至少一个目的基因的转化DNA转化植物可以导致多个事件，其中每一个事件都是独特的。

此处所用的“原种事件”指，对于通过用同一转化DNA转化或通过与自该转化获得的植物回交而获得的一组事件，基于转基因的表达和稳定性及转基因与含有它的植物之最佳农艺学特性的相容性而从该组事件中选择的事件。因此原种事件选择的标准为一种或多种，优选地两种或多种，有利地为所有的下列标准:

a)转基因的存在不降低其它所期望有的植物特性，例如那些与农学特性或商业价值相关的特性；

b)事件的特征在于充分确定的分子构型，该分子构型可以稳定遗传，且可针对该分子构型开发用于身份控制的合适诊断工具；

c)在事件的杂合(或半合子)和纯合的情况下，转基因中的目的基因均可以在一系列的环境条件下以商业可接受水平显示正确、合适且稳定的空间和时间表型表达，其中所述环境条件是携带该事件的植物在正常农业应用中可能遇到的环境条件。

优选，外源DNA与可以允许渐渗入所期望的商业遗传背景中的植物基因组的位置关联。

事件属于原种事件的情形，可以通过将该原种事件渐渗入不同的相关遗传背景中并观察是否符合例如上述a),b)和c)中的一个、两个或所有标准而证实。

另外，对于此处描述的编码雄性不育和育性恢复的转基因，对原种事件的选择也取决于这些事件间的相容性，更具体地，通过携带雄性不育事件的植物与携带育性恢复事件的植物杂交所产生的、存在两种事件的子代，具有以下特征:

a)育性恢复表型，即雄性能育性，的充分表型表达，以及

b)在携带两事件的植物在正常农业应用中可能遇到的一系列环境条件下，表型表达为商业可接受的水平。

因此“原种事件”指的是包含转基因的基因座，其满足上述标准。植物、植物材料或子代例如种子可在其基因组中包含一个或多个原种事件。

原种事件MS-B2如WO 01/31042中所述已被详细表征(特别见实施例1和3)。转化DNA在实施例1中描述。转基因插入后的侧翼植物DNA序列已经分离和鉴定(见WO 01/31042，特别是实施例3.2以及SEQ ID No 1和2)。WO 01/31042，特别是实施例5中描述了可以鉴定生物材料中原种事件MS-B2的诊断PCR。当芸苔属植物、细胞、种子或组织中存在原种事件MS-B2时，可使用其基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度在160和200bp之间，特别是约183bp的DNA片段，其中两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 3和SEQ ID No 4。参考种子已经以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。原种事件MS-B2的备选名字为MS11。

原种事件RF-BN1如WO 01/41558中所述已被详细表征(特别见实施例1b和4.2.2)。转化DNA在实施例1b中描述。转基因插入后的侧翼植物DNA序列已经分离和鉴定(见WO 01/31042，特别是实施例4.2.2以及SEQ ID No 5和6)。WO 01/41558，特别是实施例5.2中描述了可以鉴定生物材料中原种事件RF-BN1的诊断PCR。当芸苔属植物、细胞、种子或组织中存在原种事件RF-BN1时，可使用其基因组DNA，经聚合酶链反应扩增出长度在195和235bp之间，特别是约215bp的DNA片段，其中两条引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No 7和SEQ IDNo 8。参考种子已经以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。原种事件RF-BN1的备选名字为RF3或ACS-BN003-6。

拥有RF-BN1或MS-B2的植物可例如从保藏于ATCC的种子获得。此类植物可进一步繁殖和/或用于常规育种方案以将本发明的原种事件导入相同植物物种的其它栽培品种。保藏的种子属于欧洲油菜物种。尽管如此，从欧洲油菜向芥菜引入位于A-基因组上的等位基因或转基因的方法是本领域熟知的，并包括反复回交(back-crossing)。

本发明第一次提供了在其核基因组中包含原种事件RF-BN1的芥菜植物、种子、细胞和组织，包含育性恢复基因组。先前可获得的信息指示原种事件RF-BN1存在于C-基因组；而此处提供的信息将RF-BN1插入定位于A-基因组，使得该原种事件能够转移至芥菜。

拥有MS-B2和/或RF-BN1的芸苔属植物的特征还在于它们的草铵膦耐受性，在本发明的上下文中包括植物耐受除草剂Liberty^TM。Liberty^TM耐受性由如下标准定义:在3至4叶期(3V至4V)用至少200克活性成分/公顷(g.a.i./ha)，优选地400g.a.i./ha，及可能高达1600g.a.i./ha，喷洒植物时，不杀死该植物。拥有MS-B2和/或RF-BN1的植物还可以通过用PAT测定法测出它们的细胞中存在膦丝菌素乙酰转移酶而表征(De Block等，1987,EMBOJ.6:2513-2518)。

本发明的芸苔属植物可用常规方法培育。35S-bar基因的存在使它们对草铵膦具耐受性。因此在生长此类芸苔属植物的田间可通过使用包含草铵膦作为活性成分的除草剂(例如Liberty^TM)控制杂草。

田间试验进一步显示，与没有MS-B2的等基因植物系相比，芸苔属植物中存在MS-B2导致种子或谷物产量增加。因此，本发明的一个实施方案是提高油籽油菜植物种子产量的方法，包含提供具有原种事件MS-B2的油籽油菜植物的步骤。

除非另外明确指出，在下列权利要求中所用的术语“植物”旨在包含在任一成熟阶段的植物组织，以及取自或衍生自此类植物的任一细胞、组织或器官，包括但不限于，任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。此处所使用的植物细胞涵盖不可再生的植物细胞。

此处所使用的“芸苔属植物”指十字花科(Brassicacea)植物，优选包含A基因组的植物。优选所述芸苔属植物属于欧洲油菜、芜菁(Brassica rapa或Brassica campestris)或芥菜物种之一。可选的，所述植物可属于源自这些芸苔属物种互交得到的物种，如Brassica napocampestris，或源自这些芸苔属物种之一与十字花科另一物种的人工杂交。此处所使用的“油籽油菜植物”指欧洲油菜、芜菁或芥菜物种之任一。

根据本发明的油籽油菜植物也可用除草剂、杀真菌剂或杀虫剂处理，除草剂包括二氯皮考啉酸(clopyralid)、氯甲草(diclofop)、吡氟禾草灵(fluazifop)、草铵膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、吡草胺(metazachlor)、氟乐灵(trifluralin)、胺苯黄隆(ethametsulfuron)、喹草酸(quinmerac)、喹禾灵(quizalofop)、烯草酮(clethodim)、醌肟草(tepraloxydim)；杀真菌剂，包括腈嘧菌酯(azoxystrobin)、多菌灵(carbendazim)、氟恶菌(fludioxonil)、异丙定(iprodione)、丙氯灵(prochloraz)、烯菌酮(vinclozolin)；杀虫剂包括虫螨威(carbofuran)、有机磷酸酯(Organophosphate)、除虫菊酯(Pyrethroids)、噻虫啉(thiacloprid)、溴氰菊酯(deltamethrin)、吡虫啉(imidacloprid)、噻虫胺(clothianidin)、噻虫嗪(thiamethoxam)、啶虫脒(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、β-氟氯氰菊酯(β-cyfluthrin)、γ和λ氯氟氰菊酯(Cyhalothrin)、氟胺氰菊酯(tau-fluvalinate)、乙虫清(ethiprole)、艾克敌105(spinosad)、Spinotoram、氟虫酰胺(flubendiamide)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、或4-{[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2,2-二氟乙基)-氨基}呋喃-2(5H)-酮。

此处所用的“包含”可解释为，规定存在所述特征、整数、步骤或组分，但不排除存在或加入另外的一个或多个特征、整数、步骤、组分、或它们的组。这样例如包含核苷酸或氨基酸序列的核酸或蛋白质可包含较实际所述及的要多的核苷酸或氨基酸，即包括在较大的核酸或蛋白质中。包含功能上或结构上确定的DNA序列之嵌合基因可包含额外的DNA序列等。

下列实施例描述了拥有原种事件MS-B2和RF-BN1的油籽油菜植物的特征。

除非另外指出，所有的重组DNA技术均按照描述的标准方法进行，描述见Sambrook等(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring HarbourLaboratory Press,NY和Ausubel等(1994)Current Protocols in Molecular Biology,Current Protocols,USA的卷1和2。植物分子研究的标准材料和方法的描述见PlantMolecular Biology Labfax(1993)，R.D.D.Croy著，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications,UK出版。

在说明书和实施例中，述及以下序列:

SEQ ID No 1:5'侧翼序列MS-B2

SEQ ID No 2:3'侧翼序列MS-B2

SEQ ID No 3:用于检测MS-B2的寡核苷酸引物1

SEQ ID No 4:用于检测MS-B2的寡核苷酸引物2

SEQ ID No 5:5'侧翼序列RF-BN1

SEQ ID No 6:3'侧翼序列RF-BN1

SEQ ID No 7:用于检测RF-BN1的寡核苷酸引物1

SEQ ID No 8:用于检测RF-BN1的寡核苷酸引物2

SEQ ID No 9:质粒pTHW118

SEQ ID No 10:质粒pTCO113

本发明的以上描述旨在说明而非限制性。

本领域技术人员可对所述实施方案进行不同变化或修改，而不脱离本发明的精神或范围。

实施例

实施例1.MS-B2和RF-BN1的简短描述

1.1.原种事件MS-B2

原种事件MS-B2通过对欧洲油菜植物进行农杆菌介导的转化产生，其中使用嵌合DNA，其包含在绒毡层特异性启动子(pTCO113)控制下的芽孢杆菌RNA酶基因。

质粒pTCO113基本上衍生自中间载体pGSV1。载体pGSV1自身衍生自pGSC1700(Cornelissen和Vandewielle,1989),但包含由pTiB6S3的TL-DNA之左和右边界序列组成的人工T-区、和允许在T-DNA边界重复序列之间插入嵌合基因的多接头克隆位点。pGSV1载体在质粒的主框架上提供芽孢杆菌RNA酶抑制剂基因并提供用于在大肠杆菌(E.coli)中表达的调节信号。

表1对包含在pTCO113边界重复序列之间的DNA进行了充分描述(SEQ ID No.10):

表1.包含在pTCO113的T-DNA边界重复之间的DNA的核苷酸位置

如WO 01/31042中所述分离侧翼序列。

右(5’)侧翼区

5’侧翼区作为约415bp的片段扩增，其全序列已测定(SEQ ID No.1)。在核苷酸1和234之间的序列对应于植物DNA，而核苷酸235和415之间的序列对应于T-DNA。

左(3’)侧翼区

3’侧翼区作为约416bp的片段扩增，其全序列已测定(SEQ ID No.2)。在核苷酸1和193之间的序列对应于T-DNA，而核苷酸194和416之间的序列对应于植物DNA。

PCR鉴定MS-B2

如WO 01/31042中所述，包含生物材料的MS-B2可使用其中描述的PCR鉴定程序鉴定。

可以使用下列特异识别MS-B2的外源DNA和侧翼序列的引物:

B01:5’-gAA.ATC.CAT.gTA.AAg.CAg.CAg.gg-3’(SEQ ID No.3)(靶向：植物DNA)

B02:5’-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CTT.gAC-3’(SEQ ID No.4)(靶向：T-DNA)

PCR反应中预期的扩增片段为:

对引物对B01-B02：183bp(MS-B2原种事件)

1.2.原种事件RF-BN1

原种事件RF-BN1通过对欧洲油菜植物进行农杆菌介导的转化产生，其中使用嵌合DNA，其包含在TA29启动子控制下的芽孢杆菌RNA酶抑制剂(pTHW118)。

质粒pTHW118也基本上衍生自中间载体pGSV1(描述见上)。表2对包含在pTHW118的边界重复序列之间的DNA进行了充分描述(SEQ ID No.9):

表2:质粒pTHW118的T-DNA

如WO 01/41558中所述分离侧翼序列。

右(5’)侧翼区

5’侧翼区作为约1077bp的片段扩增，其全序列已测定(SEQ ID No.5)。在核苷酸1和881之间的序列对应于植物DNA。，而核苷酸882和1077之间的序列对应于T-DNA。

左(3’)侧翼区

3’侧翼区作为约1500bp的片段扩增，其全序列已测定(SEQ ID No.6)。在核苷酸1和166之间的序列对应于T-DNA，而核苷酸167和1441之间的序列对应于植物DNA。

PCR鉴定RF-BN1

如WO 01/41558中所述，包含生物材料的RF-BN1可使用其中描述的PCR鉴定程序鉴定。

为鉴定包含RF-BN1的植物材料，使用特异识别RF-BN1的转基因和侧翼序列的下列引物:

BNA03:5’-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3’(SEQ ID 7)(靶向：转基因)

BNA04:5’-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.ATg.CC-3’(SEQ ID 8)(靶向：植物DNA)

PCR反应中预期的扩增片段为:

对引物对BNA03-BNA04：215bp(RF-BN1原种事件)

实施例2.鉴定RF-BN1基因座所在的基因组以及引入芥菜

为确定RF-BN1基因座是位于欧洲油菜的A基因组还是C基因组，在4种不同的欧洲油菜BC1分离群中分析RF-BN1与该芸苔属植物基因组上已知标记的共遗传性(co-heritage)或连锁，所述分离群源自以纯合状态包含RF-BN1转基因的供体系和不含转基因的轮回亲本(recurrent parent)之间的杂交。使用AFLP方法产生遗传标记。适应性修改应用Vos等(1995,NAR 23:4407-4414,EP0534858和US 6,045,994)中的AFLP分析。为鉴定与RF-BN1连锁的AFLP标记，根据Michelmore等(1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:9828-9823)，进行分离群体分组分析(bulked segregant analysis，BSA)。

在BC1群的至少46份个体样品上分析在RF-BN1阳性植物(包含可见AFLP标记)和RF-BN1阴性植物(其中该同一标记不可见)集合之间显示差异扩增的所有AFLP遗传标记，其中AFLP标记在BSA分析中已显示潜在连锁。只保留显示与RF-BN1PCR标记显著共分离的标记，不满足这一标准的其他潜在标记作为来自BSA分析的假阳性排除。对于每一个BC1群，分别使用在个体植物上产生的所保留的AFLP标记和RF-BN1PCR标记的数据，进行连锁分析，其中使用JoinMap 3.0版(Van Ooijen和Vorrips(2001)JoinMap 3.0版,Software for thecalculation of genetic linkage maps,Plant Research International,Wageningen,The Netherlands)。由于4份单独图谱围绕RF-BN1基因座显示相当的一致性，这4份BC1图谱可以使用同一软件整合为一份BC1图谱，代表RF-BN1周围的区域，从而允许进行RF-BN1基因座的局部作图。

随后，将所得的RF-BN1区的局部图谱与代表所有欧洲油菜染色体的遗传参考图谱相比较。对于此参考图谱，已根据Sharpe等(1995,Genome 38:112-1121)和Parkin等(1995,Genome 38:1122-1131)指定染色体号。N01至N10为A-基因组染色体，而N11至N19为C-基因组染色体。RF-BN1区图谱和来自参考图谱的N07染色体之间存在非常清楚的相关性，后者已知为A-基因组染色体。RF-BN1位于欧洲油菜的A-基因组上。

通过从包含事件RF-BN1的Drakkar品种植物重复回交，将事件RF-BN1引入芥菜栽培品种。在至少4个世代的加速回交之后，检验芥菜植物，并确立：

a)外源DNA的存在并不降低其它所期望有的植物特性，例如那些与农学特性或商业价值相关的特性；

b)事件的特征在于稳定遗传的、充分确定的分子构型；

c)在事件的杂合(或半合子)和纯合的情况下，外源DNA中的目的基因均在一系列的环境条件下以商业可接受水平显示出了正确、合适且稳定的空间和时间表型表达，其中所述环境条件是携带该事件的植物在正常农业应用中可能遇到的环境条件。此外，与野生型芥菜物种相比，评估了这些植物的农学特性和性能。

田间的大量测试证明，芥菜中的RF-BN1导致，该植物显示了外源DNA中目的基因的足够表达，即雄性不育表型，以及最佳农艺学性能。因此，尽管最初在欧洲油菜中开发，但令人意外的是，RF-BN1也是芥菜中的原种事件。因此，RF-BN1可有效用于在包含MS-B2的芥菜中恢复育性。

实施例3.MS-B2/RF-BN1植物的农艺学性能

田间检测包含MS-B2/RF-BN1事件的芸苔属油籽油菜植物、以及等基因非转基因对照植株(checks)以及包含其他育性恢复事件的MS-B2植物。相关产量数据总结在下表中。

需注意，在分析中包括了其他植物系的田间试验数据，用于计算均值、显著性等。

清楚地，包含MS-B2和RF-BN1的植物系产量始终高于包含MS-B2和其他雄性恢复事件例如RF-BN2的植物系。

同时清楚地，包含MS-B2的植物系产量高于等基因非转基因植物系。

表3.地理位置1处的田间试验

表4.地理位置2处的田间试验

表5.地理位置3处的田间试验

表6.田间试验总结

实施例4.MS-B2/RF-BN1欧洲油菜植物与MS-BN1/RF-BN1欧洲油菜植物的农艺学性能比较

在5个地点(4个重复/所有样地)进行田间试验，以与相同遗传背景的MS-BN1/RF-BN1杂种相比，确认MS-B2/RF-BN1欧洲油菜杂种的育性恢复，并评估除草剂耐受和农艺学性能。

在没有草铵膦喷雾(A)或以草铵膦

常规应用处理一次(B)或两次(C)的情况下，测定产量和活力。

结果总结于图1中。无论是无草铵膦处理、处理一次(B)或两次(C)，MS-B2/RF-BN1杂种的活力始终高于MS-BN1/RF-BN1的活力。

总体上MS-B2/RF-BN1杂种倾向于比MS-BN1/RF-BN1杂种更早开花(开始和结束)并更早成熟。

还测定了上述A、B、C类田间试验的产量，结果总结于图2。MS-B2/RF-BN1杂种比MS-BN1/RF-BN1杂种产量高2％-5％。

还观察到在所有基因型和地点，MS-B2/RF-BN1上的恢复均为完全的。

总而言之，本发明涉及下述编号的段落中所述的实施方案。

1.从油籽油菜植物生产杂交种子的方法，包含如下步骤，

a.提供包含原种事件MS-B2的雄性不育的雌性亲本油籽油菜植物，其中包含所述原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC；

b.提供，优选以纯合形式，包含原种事件RF-BN1的雄性不育的雄性亲本油籽油菜植物，其中包含所述原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC；

c.使得来自所述雄性亲本油籽油菜植物的花粉对所述雌性亲本油籽油菜植物进行授粉；和

d.从所述雌性亲本植物收获杂交种子。

2.根据段落1的方法，其中所述油籽油菜植物属于欧洲油菜或芥菜物种。

3.油籽油菜植物，其核基因组中包含至少一个拷贝的原种事件MS-B2，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC；还包含至少一个拷贝的原种事件RF-BN1，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

4.根据段落3的油籽油菜植物，其中所述油籽油菜植物属于欧洲油菜或芥菜物种。

5.段落3的油籽油菜植物的细胞或组织或种子。

6.一对油籽油菜植物，其用于生产杂交种子，其中一种植物包含原种事件MS-B2，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC；另一种所述油籽油菜植物包含原种事件RF-BN1，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

7.根据段落2的油籽油菜植物的基因组DNA。

8.包含原种事件RF-BN1的芥菜植物或植物细胞，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

9.根据段落5的芥菜植物的种子，其包含原种事件RF-BN1，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

10.根据段落8的植物或细胞，还包含原种事件MS-B2，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。

11.原种事件MS-B2的用途，用于提高转基因油籽油菜植物的种子产量，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。

12.根据段落11的用途，其中所述油籽油菜植物为芥菜。

13.增加油籽油菜植物产量的方法，包含如下步骤，提供具有原种事件MS-B2的油籽油菜植物，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。

14.生产杂交芥菜种子和植物的方法，包含：

a.套作(Interplant)包含原种事件MS-B2的芥菜植物和包含原种事件RF-BN1的芥菜植物；

b.使得植物间交叉授粉；

c.从包含原种事件MS-B2的芥菜植物收获种子。

15.包含原种事件RF-BN1的芥菜植物在生产子代植物或生产种子中的用途。

16.RF-BN1在恢复包含MS-B2的芥菜植物的雄性育性中的用途。

17.包含RF-BN1的芥菜的基因组DNA。

18.根据段落17的基因组DNA，还包含MS-B2。

19.芥菜植物细胞、植物或种子，在其基因组中包含具有SEQ ID No.5的核苷酸序列的序列、和具有SEQ ID No.6的核苷酸序列的序列，并在上述序列之间包含barstar抑制剂编码序列。

20.段落19的植物细胞、植物或种子，在其基因组中还包含具有SEQ ID No.1的核苷酸序列的序列、和具有SEQ ID No.2的核苷酸序列的序列，并在上述序列之间包含barnase抑制剂的编码序列。

21.生产杂交欧洲油菜种子和植物的方法，包括：

a.套作包含原种事件MS-B2的欧洲油菜植物和包含原种事件RF-BN1的欧洲油菜植物；

b.使得植物间交叉授粉

c.从包含原种事件MS-B2的欧洲油菜植物收获种子。

22.包含RF-BN1且还包含MS-B2的欧洲油菜的基因组DNA。

23.欧洲油菜植物细胞、植物或种子，在其基因组中包含具有SEQ ID No.5的核苷酸序列的序列、和具有SEQ ID No.6的核苷酸序列的序列，并在所述序列之间包含barstar抑制剂的编码序列；还包含具有SEQ ID No.1的核苷酸序列的序列和具有SEQ ID No.2的核苷酸序列的序列，并在所述序列之间包含barnase抑制剂的编码序列。

Claims (13)

1.从油籽油菜植物生产杂交种子的方法，包含如下步骤，

a.提供包含原种事件MS-B2的雄性不育的雌性亲本油籽油菜植物，其中包含所述原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC；

b.提供包含原种事件RF-BN1的雄性能育的雄性亲本油籽油菜植物，其中包含所述原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC；

c.使得来自所述雄性亲本油籽油菜植物的花粉对所述雌性亲本油籽油菜植物进行授粉；和

d.从所述雌性亲本植物收获杂交种子。

2.根据权利要求1的方法，其中所述雄性能育的雄性亲本油籽油菜植物包含纯合形式的原种事件RF-BN1。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述油籽油菜植物属于欧洲油菜或芥菜物种。

4.根据权利要求1或2的方法，其中所述方法还包括获得油籽油菜植物或其植物细胞，其中所述植物或植物细胞在核基因组中包含至少一个拷贝的原种事件MS-B2和至少一个拷贝的原种事件RF-BN1，其中包含该原种事件MS-B2的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC，其中包含该原种事件RF-BN1的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

5.根据权利要求4的方法，其中所述油籽油菜植物属于欧洲油菜或芥菜物种。

6.一对油籽油菜植物用于生产杂交种子的用途，其中一种植物包含原种事件MS-B2，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC；另一种所述油籽油菜植物包含原种事件RF-BN1，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

7.根据权利要求3的方法产生的油籽油菜植物的基因组DNA，所述基因组DNA包含原种事件MS-B2和原种事件RF-BN1。

8.包含原种事件RF-BN1的芥菜植物用于产生后代植物或用于产生种子的用途，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

9.一种产生包含原种事件RF-BN1的芥菜植物或其植物细胞的方法，其中所述方法包括将原种事件RF-BN1引入芥菜植物或其植物细胞中，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA-730保藏于ATCC。

10.根据权利要求9的方法，还包含将原种事件MS-B2通过渐渗引入所述芥菜植物或其植物细胞，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。

11.原种事件MS-B2的用途，用于提高转基因油籽油菜植物的种子产量，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。

12.根据权利要求11的用途，其中所述油籽油菜植物为芥菜。

13.增加油籽油菜植物产量的方法，包含如下步骤，提供具有原种事件MS-B2的油籽油菜植物，其中包含该原种事件的参考种子以保藏号ATCC_PTA 2485或ATCC_PTA-850保藏于ATCC。

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