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Allgemeiner Stand der
Technik
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Die
phänotypische
Expression eines Transgens in einer Pflanze wird sowohl von der
Struktur des Gens selbst als auch von seiner Lage im pflanzlichen
Genom bestimmt. Das Vorhandensein des Transgens (in einer Fremd-DNA)
an unterschiedlichen Lagen im Genom bestimmt auch den pflanzlichen
Phänotyp
insgesamt auf unterschiedliche Art und Weise. Die landwirtschaftlich
oder industriell erfolgreiche Einführung eines kommerziell interessanten
Merkmals in eine Pflanze mittels Gentechnik kann in Abhängigkeit
von verschiedenen Faktoren ein langwieriger Vorgang sein. Die Transformation
selbst und die Regeneration von genetisch transformierten Pflanzen
sind nur die ersten Schritte in einer Reihe von Selektionsschritten,
zu denen auch die ausführliche
genetische Charakterisierung, Züchtung
sowie Auswertung in Feldversuchen zählen, was schlußendlich
zur Selektion eines Elite-Events führt.
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Die
eindeutige Identifizierung eines Elite-Events wird angesichts der
Diskussionen neuartiger Lebensmittel/Futtermittel, Trennung von
GMO- und Nicht-GMO-Produkten
sowie die Identifikation von Markenartikeln immer wichtiger. Idealerweise
ist solch ein Identifikationsverfahren schnell und einfach und erfordert
keinen großen
Laboratoriumsaufwand. Außerdem
sollte das Verfahren Ergebnisse liefern, die eine eindeutige Bestimmung
des Elite-Events ermöglichen,
ohne daß eine
Interpretation durch Fachleute erforderlich ist, die jedoch falls
erforderlich einer Untersuchung durch Fachleute standhält.
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GAT-ZM1
wurde als Elite-Event bei der Entwicklung von Mais, das gegenüber dem
Herbizid Liberty® resistent ist, selektiert,
und zwar dadurch, daß man
Mais mit dem Plasmid pUC/Ac transformierte, welches das pat-Gen
ent hält,
das für
Phosphinotricintoleranz codiert. Es ist im Handel unter der Bezeichnung
Liberty Link®-Mais
verfügbar,
wie zum Beispiel Liberty Link® A6460LL, der von der
AgriGold/Akin Seed Company vertrieben wird. Die Mittel für einfache
und eindeutige Verfahren zum Identifizieren des Elite-Events GAT-ZM1
in biologischen Proben werden im vorliegenden Text beschrieben.
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Darstellung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Identifizieren des
Elite-Events GAT-ZM1 in biologischen Proben, die auf Primern oder
Sonden beruhen, welche spezifisch die am 5'- und/oder 3'-Ende liegenden flankierenden Sequenzen
von GAT-ZM1 erkennen.
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Genauer
gesagt betrifft die Erfindung ein Verfahren, bei dem man eine Sequenz
einer von einer in biologischen Proben vorhandenen Nukleinsäure amplifiziert,
und zwar mittels einer Polymerase-Kettenreaktion mit mindestens
zwei Primern, von denen der eine die am 5'- oder 3'-Ende liegende flankierende Region von GAT-ZM1
erkennt und der andere eine Sequenz innerhalb der Fremd-DNA erkennt, wodurch
man zu einem DNA-Fragment mit einer Länge zwischen 100 und 350 Bp
gelangt. Vorzugsweise erkennen die Primer eine Sequenz innerhalb
der am 5'-Ende gelegenen
flankierenden Region von GAT-ZM1, am stärksten bevorzugt innerhalb
der am 5'-Ende gelegenen
flankierenden Region gemäß SEQ ID
Nr. 6, bzw. eine Sequenz innerhalb der Fremd-DNA. Besonders bevorzugt
umfaßt
der Primer, der die am 5'-Ende
gelegene flankierende Region erkennt, die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
Nr. 11 und der Primer, der eine Sequenz innerhalb der Fremd-DNA
erkennt, die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 12, die im vorliegenden
Text beschrieben sind.
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Genauer
gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren
des Elite-Event GAT-ZM1 in biologischen Proben, wobei man bei diesem
Verfahren eine Sequenz von einer in einer biologischen Probe vor handenen
Nukleinsäure
amplifiziert, und zwar mittels einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei
Primern, die die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID Nr. 11 bzw. SEQ ID
Nr. 12 aufweisen, wodurch man zu einem DNA-Fragment mit einer Länge zwischen
180 und 220 Bp, vorzugsweise von ungefähr 200 Bp, gelangt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die spezifischen flankierenden
Sequenzen von GAT-ZM1 wie im vorliegenden Text beschrieben, die
für die
Entwicklung von spezifischen Identifikationsverfahren für GAT-ZM1
in biologischen Proben verwendet werden können. Insbesondere betrifft
die Erfindung die am 5'-Ende
und/oder 3'-Ende
gelegenen flankierenden Regionen von GAT-ZM1, die für die Entwicklung
von spezifischen Primern und Sonden verwendet werden können. Die
Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Identifizierung des Vorliegens
von GAT-ZM1 in biologischen Proben, die auf solchen spezifischen
Primern oder Sonden beruhen.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin Kits zum Identifizieren des Elite-Events
GAT-ZM1 in biologischen Proben, wobei diese Kits mindestens einen
Primer oder eine Sonde, der/die spezifisch die am 5'-Ende oder 3'-Ende gelegene flankierende
Regionen von GAT-ZM1 erkennt.
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Vorzugsweise
umfaßt
das erfindungsgemäße Kit zusätzlich zu
einem Primer, der spezifisch die am 5'-Ende oder 3'-Ende
gelegene flankierende Region von GAT-ZM1 erkennt, einen zweiten
Primer, der spezifisch eine Sequenz innerhalb der Fremd-DNA von
GAT-ZM1 erkennt, für
ein PCR-Identifikationsprotokoll.
Vorzugsweise umfaßt
das erfindungsgemäße Kit zwei
spezifische Primer, von denen der eine eine Sequenz innerhalb der
am 5'-Ende gelegenen
flankierenden Region von GAT-ZM1 erkennt, am stärksten bevorzugt innerhalb
der am 5'-Ende gelegenen
flankierenden Region von SEQ ID Nr. 6, während der andere eine Sequenz innerhalb
der Fremd-DNA erkennt. Besonders bevorzugt umfaßt der Primer, der die am 5'- Ende gelegene flankierende Region erkennt,
die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
Nr. 11 und der Primer, der das Transgen erkennt, die Nukleotidsequenz
gemäß SEQ ID
Nr. 12, die im vorliegenden Text beschrieben sind.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zum Identifizieren des Elite-Events
GAT-ZM1 in biologischen Proben, wobei dieses Kit die PCR-Primer
mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID
Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 für
das im vorliegenden Text beschriebene GAT-ZM1-PCR-Identifikationsprotokoll.
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Die
Erfindung betrifft auch ein Kit zum Identifizieren des Elite-Events
GAT-ZM1 in biologischen Proben, wobei dieses Kit eine spezifische
Sonde mit einer Sequenz umfaßt,
die einer Sequenz mit zwischen 80% und 100% Sequenzidentität mit einer
spezifischen Region von GAT-ZM1
aufweist, entspricht bzw. hierzu komplementär ist. Vorzugsweise entspricht
die Sequenz der Sonde einer spezifischen Region, die einen Teil
der am 5'-Ende oder
3'-Ende gelegenen
flankierenden Region von GAT-ZM1 umfaßt. Am stärksten bevorzugt weist die
spezifische Sonde eine Sequenz mit zwischen 80% und 100% Sequenzidentität mit der
Sequenz zwischen dem Nukleotid 286 und dem Nukleotid 466 von SEQ
ID Nr. 6 auf bzw. ist hierzu komplementär.
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Die
von der vorliegenden Erfindung umfaßten Verfahren und Kits können für verschiedene
Zwecke verwendet werden, wie zum Beispiel für die folgenden, was jedoch
keine Einschränkung
darstellt: zum Identifizieren von GAT-ZM1 in Pflanzen, Pflanzenmaterial
oder Produkten wie – was
jetzt jedoch keine Einschränkung
darstellen soll – frischen
oder verarbeiteten Nahrungs- oder Futtermittelprodukten, die Pflanzenmaterial umfassen
bzw. sich davon ableiten; zusätzlich
oder alternativ dazu können
die erfindungsgemäßen Verfahren und
Kits zum Identifizieren von transgenem pflanzlichem Material zwecks
Trennung zwischen transgenem und nichttransgenem Material verwendet
werden; zusätzlich
oder alternativ dazu können
die erfindungsgemäßen Verfahren
und Kits zur Bestimmung der Qualität (d.h. Prozent reines Material)
von pflanzlichem Material, das GAT-ZM1 umfaßt, verwendet werden.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin die am 5'-Ende und/oder 3'-Ende liegenden flankierenden Regionen von
GAT-ZM1 sowie spezifische
Primer und Sonden, die aus dem am 5'-Ende und/oder 3'-Ende liegenden flankierenden Sequenzen
von GAT-ZM1 entwickelt wurden.
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Detaillierte Beschreibung
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Der
Einbau eines rekombinanten DNA-Moleküls in das Pflanzengenom ist
typischerweise das Ergebnis einer Transformation einer Zelle oder
eines Gewebes (oder einer sonstigen genetischen Manipulation). Die jeweilige
Einbaustelle beruht entweder auf "zufallsmäßiger" Integration oder liegt an einer vorbestimmtem Lage
(wenn ein gezieltes Integrationsverfahren verwendet wird).
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Die
DNA, die in das Pflanzengenom als Ergebnis einer Transformation
einer Pflanzenzelle oder eines Pflanzengewebes mit einer rekombinanten
DNA oder "transformierenden
DNA" eingeführt worden
ist, wird im folgenden als "Fremd-DNA" bezeichnet, die
ein oder mehrere "Transgene" umfaßt. Fremd-DNA
kann daher sowohl rekombinante DNA sowie neu eingeführte umgeordnete
DNA der Pflanze umfassen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung
soll jedoch der Begriff "Pflanzen-DNA" DNA der Pflanze
bedeuten, die am selben genetischen Locus in der entsprechenden
Wildtyppflanze vorkommt. Die Fremd-DNA kann durch die Lage und die
Konfiguration an der Einbaustelle des rekombinanten DNA-Moleküls im Pflanzengenom
charakterisiert werden. Die Stelle in dem Pflanzengenom, an der
eine rekombinante DNA insertiert worden ist, wird auch als "Insertionsstelle" bzw. "Zielstelle" bezeichnet. Die
Insertion der rekombinanten DNA in das Pflanzengenom kann mit einer
Deletion von Pflanzen-DNA einhergehen, was als "Zielstellendeletion" bezeichnet wird. Eine "flankierende Region" oder "flankierende Sequenz" bedeutet im vorliegenden
Zusammenhang eine Sequenz mit einer Länge von mindestens 20 Bp, vorzugsweise
mindestens 50 Bp, und bis zu 5000 Bp des Pflanzengenoms, die entweder
unmittelbar stromaufwärts
von der und anschließend
an die, bzw. stromabwärts
von der und anschließend
an die Fremd-DNA liegt. Transformationsvorgänge, die zu einer zufallsmäßigen Integration
der Fremd-DNA führen,
ergeben Transformanten mit unterschiedlichen flankierenden Regionen,
die für jede
Transformante charakteristisch und einmalig sind. Wird die rekombinante
DNA in eine Pflanze durch traditionelles Kreuzen eingeführt, so
sind ihre Insertionsstelle im Pflanzengenom bzw. ihre flankierenden
Regionen im allgemeinen unverändert.
Der Begriff "Insertionsregion" bedeutet im vorliegenden
Zusammenhang diejenige Region, die der Region von mindestens 40
Bp, vorzugsweise mindestens 100 Bp, und bis zu 10 000 Bp entspricht,
die von der Sequenz beinhaltet wird, welche die stromaufwärts und/oder
stromabwärts
gelegene flankierende Region einer Fremd-DNA im Pflanzengenom umfaßt. Unter
Berücksichtigung
von kleineren Unterschieden aufgrund von Mutationen innerhalb einer
Art behält
eine Insertionsregion beim Einkreuzen in eine Pflanze derselben
Art mindestens 85%, vorzugsweise 90%, stärker bevorzugt 95%, am stärksten bevorzugt 100%
Sequenzidentität
mit der Sequenz bei, die die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen
flankierenden Regionen der Fremd-DNA in der ursprünglich mittels
Transformation erhaltenen Pflanze umfaßt.
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Ein
Event wird als (künstlicher)
Genlocus definiert, der aufgrund von genetischer Manipulation ein Transgen
mit mindestens einer Kopie eines interessierenden Gens trägt. Der
typische Allelzustand eines Events ist das Vorliegen bzw. Fehlen
der Fremd-DNA. Ein Event ist phänotypisch
durch die Expression des Transgens charakterisiert. Auf Genebene
ist ein Event ein Teil der Erbinformation einer Pflanze. Auf Molekularebene
kann ein Event mit der Restriktionskarte (z.B. gemäß Southern-Blotting), durch
die stromaufwärts und/oder
stromabwärts
gelegenen flankierenden Sequenzen des Transgens, der Lage von molekularen
Markern und/oder die molekulare Konfiguration des Transgens charakterisiert
werden. Üblicherweise
führt die Transformation
einer Pflanze mit einer transformierenden DNA, die mindestens ein
interessierendes Gen umfaßt,
zu mehreren Events, von denen jedes einzigartig ist.
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Ein
Elite-Event bedeutet im vorliegenden Zusammenhang ein Event, das
aus einer Gruppe von Events ausgewählt ist, wobei diese Events
durch Transformation mit derselben transformierenden DNA oder durch Rückkreuzen
mit Pflanzen, die durch solch eine Transformation erhalten wurden,
erhalten wurden, und zwar auf Grundlage der Expression und Stabilität des Transgens
bzw. der Transgene und seiner/ihrer Kompatibilität mit optimalen agronomischen
Eigenschaften der Pflanze, die es/sie umfaßt. Bei den Kriterien für die Selektion des
Elite-Events handelt
es sich daher um ein oder mehr, vorzugsweise zwei oder mehr, vorteilhaft
alle der folgenden Kriterien:
- a) daß das Vorhandensein
der Fremd-DNA keine ungünstigen
Auswirkungen auf andere gewünschte
Eigenschaften der Pflanze, wie solche, die agronomische Leistung
oder handelsmäßigen Wert
betreffen, ausübt;
- b) daß das
Event durch eine gut definierte molekulare Konfiguration charakterisiert
ist, die stabil vererbt wird und für die geeignete Mittel für die Identitätskontrolle
entwickelt werden können;
- c) daß das
interessierende Gen bzw. die interessierenden Gene eine korrekte,
angemessene und stabile räumliche
und zeitliche phänotypische
Expression aufweist/aufweisen, und zwar sowohl dann, wenn das Event
heterozygot (oder hemizygot) und homozygot vorliegt, und zwar in
einem wirtschaftlich annehmbaren Ausmaß in einem Bereich von Umweltbedingungen,
bei dem die Möglichkeit
besteht, daß die
Pflanzen, die das Event tragen, bei normaler agronomischer Verwendung
ausgesetzt sind.
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Es
wird bevorzugt, daß die
Fremd-DNA mit einer Position in dem Pflanzengenom in Zusammenhang steht,
die ein leichtes Hineinzüchten
in gewünschte
wirtschaftliche genetische Hintergründe ermöglicht.
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Die
Tatsache, daß es
sich bei einem Event um ein Elite-Event handelt, wird dadurch bestätigt, daß das Elite-Event in verschiedene
relevante genetische Hintergründe
hineingezüchtet
wird, und zwar unter Berücksichtigung
von einem, zwei oder allen Kriterien, z. B. a), b) und c) (siehe
oben).
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Der
Begriff "Elite-Event" bezieht sich daher
auf einen Genlocus, der eine Fremd-DNA umfaßt, die den oben beschriebenen
Kriterien entspricht. Eine Pflanze, ein Pflanzenmaterial oder eine
Nachkommenschaft wie Samen kann/können ein oder mehrere Elite-Events
in ihrem/seinem Genom umfassen.
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Die
Mittel, die zum Identifizieren eines Elite-Events oder der Pflanze,
des Pflanzenmaterials, die/das ein Elite-Event umfaßt, oder
von Produkten, die Pflanzenmaterial umfassen, das das Elite-Event
umfaßt,
entwickelt wurden, beruhen auf den spezifischen genomischen Eigenschaften
des Elite-Events wie z.B. eine spezifische Restriktionskarte der
Genomregion, die die Fremd-DNA umfaßt, molekulare Marker oder
die Sequenz der flankierenden Region(en) der Fremd-DNA.
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Sobald
eine oder beide der flankierenden Regionen der Fremd-DNA sequenziert
worden ist/sind, können
Primer und Sonden entwickelt werden, die diese Sequenz(en) in der
Nukleinsäure
(DNA oder RNA) einer Probe spezifisch erkennen, und zwar mittels
einer molekularbiologischen Technik. So kann zum Beispiel ein PCR-Verfahren
entwickelt werden, um das Elite-Event in biologischen Proben (wie
Proben von Pflanzen, Pflanzenmaterial oder Produkten, die Pflanzenmaterial
umfassen) zu identifizieren. Solch eine PCR beruht auf mindestens
zwei spezifischen "Primern", von denen einer
eine Sequenz innerhalb der am 5'-Ende
oder am 3'-Ende
flankierenden Region des Elite-Events erkennt und der andere eine
Sequenz innerhalb der Fremd-DNA erkennt. Die Primer verfügen vorzugsweise über eine
Sequenz von zwischen 15 und 35 Nukleotiden, die unter optimierten
PCR-Bedingungen eine Sequenz innerhalb der am 5'-Ende oder am 3'-Ende flankierenden Region des Elite-Events
bzw. die Fremd-DNA des Elite-Events "spezifisch erkennen", so daß ein spezifisches Fragment
("Integrationsfragment") ausgehend von einer
Nukleinsäureprobe,
die das Elite-Event umfaßt,
amplifiziert wird. Dies bedeutet, daß nur das Integrationsfragment,
auf das abgezielt wurde, und keine andere Sequenz in dem Pflanzengenom
oder in der Fremd-DNA unter optimierten PCR-Bedingungen amplifiziert wird.
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Vorzugsweise
weist das Integrationsfragment eine Länge von zwischen 50 und 500
Nukleotiden, am stärksten
bevorzugt zwischen 100 und 350 Nukleotiden, auf. Vorzugsweise weisen
die spezifischen Primer eine Sequenz auf, die zwischen 80 und 100%
Identität
mit einer Sequenz innerhalb der am 5'- oder am 3'-Ende flankierenden Region des Elite-Events
bzw. der Fremd-DNA des Elite-Events aufweist, vorausgesetzt, daß die "Mismatches" noch eine spezifische
Identifikation des Elite-Events
mit diesen Primern unter den optimierten PCR-Bedingungen gestatten. Der Bereich der
noch duldbaren "Mismatches" kann jedoch leicht
durch Versuche bestimmt werden, was dem Fachmann bekannt ist.
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Da
die Sequenz der Primer und ihre relative Lage im Genom einzigartig
für das
Elite-Event sind, wird eine Amplifikation des Integrationsfragments
nur in solchen biologischen Proben stattfinden, die das Elite-Event
(eigentlich dessen Nukleinsäure)
umfassen. Vorzugsweise wird, wenn eine PCR zwecks Identifikation des
Vorliegens von GAT-ZM1 in unbekannten Proben durchgeführt wird,
eine Kontrolle eines Primersatzes mitgeführt, mit Hilfe dessen ein Fragment
innerhalb eines "Housekeeping"-Gens der Pflanzenart
des Events amplifiziert werden kann. Bei den "Housekeeping"-Genen handelt es sich um Gene, die
in den meisten Zelltypen exprimiert werden und die mit grundlegenden
Stoffwechselaktivitäten,
die allen Zellen gemeinsam sind, im Zusammenhang stehen. Vorzugsweise
handelt es sich bei dem Fragment, das vom "Housekeeping"-Gen amplifiziert wird, um ein Fragment,
das größer als
das amplifizierte Intgrationsfragment ist. Je nach den zu analysierenden
Proben können
noch andere Kontrollen mitgeführt
werden.
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Standard-PCR-Protokolle
sind im Stand der Technik beschrieben, wie z.B. "PCR Applications Manual" (Roche Molecular
Biochemicals, 2. Ausgabe, 1999). Die optimalen Bedingungen für die PCR,
darunter auch die Sequenz der spezifischen Primer, ist in einem "PCR-Identifikationsprotokoll" für jedes
Elite-Event festgelegt. Es ist jedoch klar, daß verschiedene Parameter in
dem PCR-Identifikatiosprotokoll
den jeweiligen Laboratoriumsbedingungen angepaßt werden müssen und leicht abgeändert werden
müssen,
um ähnliche
Ergebnisse zu erzielen. So kann zum Beispiel die Verwendung einer
unterschiedlichen DNA-Präparationsmethode es
erforderlich machen, daß z.
B. die verwendete Menge Primer, Polymerase und Reassoziationsbedingungen abgeändert werden
müssen. Ähnlich kann
es die Auswahl von anderen Primern erforderlich machen, daß andere
Optimalbedingungen für
das PCR-Identifikatiosprotokoll gewählt werden müssen. Diese
Abänderungen werden
dem Fachmann jedoch selbstverständlich
erscheinen; sie sind außerdem
in derzeit verfügbaren PCR-Handbüchern, wie
den oben angegebenen beschrieben.
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Es
können
jedoch auch spezifische Primer verwendet werden, um ein Integrationsfragment
zu amplifizieren, das als "spezifische
Sonde" zum Identifizieren
von GAT-ZM1 in biologischen
Proben verwendet werden kann. Ein In-Kontakt-Bringen von Nukleinsäure einer
biologischen Probe mit der Sonde unter Bedingungen, die ein Hybridisieren
der Sonde mit ihrem entsprechenden Fragment in der Nukleinsäure gestatten,
führt zur
Bildung eines Nukleinsäure/Sonde-Hybrids.
Die Bildung dieses Hybrids kann nachgewiesen werden (z. B. Markieren
der Nukleinsäure
oder Sonde), wobei die Bildung dieses Hybrids anzeigt, daß GAT-ZM1
vorliegt. Solche Identifikationsverfahren, die auf einer Hybridisierung
mit einer spezifischen Sonde (entweder auf einem Festphasenträger oder
in Lösung)
beruhen, sind bereits im Stand der Technik beschrieben. Bei der
spezifischen Sonde handelt es sich vorzugsweise um eine Sequenz,
die unter optimierten Bedingungen spezifisch mit einer Region innerhalb
der das 5'- oder
3'-Ende flankierenden
Region des Elite-Events
hybridisiert, wobei vorzugsweise auch ein Teil der Fremd-DNA im
unmittelbaren Anschluß daran
umfaßt
ist (im folgenden als "spezifische
Region" bezeichnet).
Die spezifische Sonde umfaßt
vorzugsweise eine Sequenz mit zwischen 50 und 500 Bp, vorzugsweise
100 bis 250 Bp, mit zumindest 80%, vorzugsweise zwischen 80 und
85%, stärker bevorzugt
zwischen 85 und 90%, besonders bevorzugt zwischen 90 und 95% am
stärksten
bevorzugt zwischen 95% und 100% Identität (oder Komplementarität) zu der
Nukleotidsequenz einer spezifischen Region. Vorzugsweise umfaßt die spezifische
Sonde eine Sequenz mit ungefähr
15 bis ungefähr
100 unmittelbar aufeinanderfolgenden Nukleotiden, die mit einer
spezifischen Region des Elite-Events identisch sind (bzw. dazu komplementär sind).
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Ein "Kit" bedeutet im vorliegenden
Zusammenhang einen Satz Reagentien, der dem Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens
dient, genauer gesagt der Identifikation des Elite-Events GAT-ZM1
in biologischen Proben. Genauer gesagt umfaßt eine bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Kits
mindestens einen oder zwei spezifische Primer, wie sie oben beschrieben
sind. Gegebenenfalls kann das Kit außerdem noch ein beliebiges
sonstiges Reagens umfassen, das im vorliegenden Text im PCR-Identifikationsprotokoll
beschrieben ist. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung kann das Kit jedoch auch eine spezifische, wie oben
beschriebene Sonde umfassen, die spezifisch mit der Nukleinsäure von
biologischen Proben hybridisiert, um das Vorhandensein von GAT-ZM1
in diesen biologischen Proben zu identifizieren. Gegebenenfalls
kann das Kit weiterhin ein beliebiges sonstiges Reagens zum Identifizieren
von GAT-ZM1 in biologischen Proben mit der spezifischen Sonde umfassen
(wie zum Beispiel Hybridisierungspuffer, Marker, was jedoch keine
Einschränkung
darstellen soll).
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Das
erfindungsgemäße Kit kann
für Qualitätskontrollzwecke
(z. B. Reinheit von Saatgutchargen), zwecks Nachweis des Elite-Events
in Pflanzenmaterial oder Material, das Pflanzenmaterial umfaßt bzw.
von diesem abstammt, wie zum Beispiel Nahrungsmittel- oder Futtermittelprodukte,
was jedoch keine Einschränkung
darstellen soll, verwendet werden und seine Bestandteile können diesen
Zwecken spezifisch angepaßt werden.
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Im
vorliegenden Zusammenhang bezieht sich "Sequenzidentität" in Bezug auf Nukleotidsequenzen (DNA
oder RNA) auf die Anzahl der Positionen mit identischen Nukleotiden
dividiert durch die Anzahl Nukleotide in der kürzeren der beiden Sequenzen.
Das Alignment der beiden Nukleotidsequenzen wird nach dem Algorithmus
von Wilbur und Lipmann (Wilbur und Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad.
Sci. USA 80:726) durchgeführt
und zwar mit einer Window Size von 20 Nukleotiden, einer Word Length
von 4 Nukleotiden und einer Gap Penalty von 4. Die computergestützte Analyse
und Interpretation der Sequenzdaten, darunter auch des Sequenz-Aligments
wie es oben beschrieben wurde, kann z.B. bequem mit den Programmen
von IntelligeneticsTM Suite (Intelligenetics
Inc., CA) oder dem Sequenzanalyse-Softwarepaket von Genetics Computer
Group (GCG, University of Wisconsin Biotechnology center) durchgeführt werden.
Sequenzen werden als "im
wesentlichen ähnlich" bezeichnet, wenn
diese Sequenzen eine Sequenzidentität von mindestens ungefähr 75%, insbesondere
von mindestens ungefähr
80%, ganz besonders von mindestens ungefähr 85%, höchst besonders von ungefähr 90%,
speziell ungefähr
95%, spezieller ungefähr
100%, aufweisen. Es ist klar, daß von RNA-Sequenzen gesagt
wird, daß sie
DNA-Sequenzen im wesentlichen ähnlich
sind bzw. einen gewissen Grad an Sequenzidentität mit DNA-Sequenzen aufweisen,
das Thymidin (T) in der DNA-Sequenz als dem Uracil (U) in der RNA-Sequenz
gleichwertig betrachtet wird. Der Begriff "komplementär zu" bedeutet im vorliegenden Zusammenhang
die Komplementarität
zwischen den Nukleotiden A und T (U) bzw. G und C in Nukleotidsequenzen.
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Der
Begriff "Primer" umfaßt im vorliegenden
Zusammenhang eine beliebige Nukleinsäure, die zum Anstarten der
Synthese einer entstehenden Nukleinsäure in einem matrizenabhängigen Vorgang,
wie PCR, fähig ist.
Typischerweise handelte es sich bei Primern um Oligonukleotide mit
einer Länge
von 10 bis 30 Basenpaaren, es können
jedoch auch längere
Sequenzen verwendet werden. Primer können in Doppelstrangform bereitgestellt
werden, die Einzelstrangform ist jedoch bevorzugt. Sonden können als
Primer verwendet werden, sind jedoch dergestalt, daß sie an
die Ziel-DNA oder -RNA binden und brauchen nicht in einem Amplifikationsvorgang
verwendet werden.
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Der
Begriff "erkennend" bezieht sich im
vorliegenden Zusammenhang, wenn er sich auf spezifische Primer bezieht,
auf die Tatsache, daß die
spezifischen Primer spezifisch mit einer Nukleinsäuresequenz
im Elite-Event hybridisieren, und zwar unter denjenigen Bedingungen,
die in dem Verfahren beschrieben sind (wie den Bedingungen des PCR-Identifikationsprotokolls),
wobei die Spezifität
durch das Vorhandensein von positiven und negativen Kontrollen bestimmt
wird.
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Der
Begriff "hybridisierend" bezieht sich im
vorliegenden Zusammenhang, wenn er sich auf spezifische Sonden bezieht,
auf die Tatsache, daß die
Sonde unter standardmäßigen Stringentbedingungen
an eine spezifische Region in der Nukleinsäuresequenz des Elite-Events
bindet. Der Begriff standardmäßige Stringentbedingungen
bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf die Hybridisierungsbedingungen,
wie sie im vorliegenden Text beschrieben sind, oder auf die traditionellen
Hybridisierungsbedingungen, wie sie zum Beispiel von Sambrook et
al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold
Spring Harbour Laboratory Press, NY) beschrieben sind, und die zum
Beispiel die folgenden Schritte beinhalten können: 1) Immobilisierung von
DNA-Fragmenten des
pflanzlichen Genoms auf einem Filter, 2) ein- bis zweistündiges Vorhybridisieren
des Filters bei 42°C
und 50% Formamid, 5 × SSPE,
2 × Denhardt-Reagens
und 0,1% SDS, oder ein- bis zweistündiges Vorhybridisieren des
Filters bei 68°C
in 6 × SSC,
2 × Denhardt-Reagens
und 0,1% SDS, 3) Versetzen mit der Hybridisierungssonde, die markiert
worden ist, 4) 16- bis
24stündiges
Inkubieren, 5) 20minütiges
Waschen des Filters mit 1 × SSC,
0,1% SDS bei Raumtemperatur, 6) dreimaliges 20minütiges Waschen
des Filters, jeweils bei 68°C
mit 0,2 × SSC,
0,1% SDS, sowie 7) 24- bis 48stündiges
Einwirkenlassen des Filters auf einen Röntgenfilm bei –70°C mit einer
Verstärkerfolie.
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Im
vorliegenden Zusammenhang ist eine biologische Probe eine Probe
einer Pflanze, eines Pflanzenmaterials oder von Produkten, die Pflanzenmaterial
enthalten. Der Begriff "Pflanze" soll Pflanzengewebe
von Mais (Zea mays) in einem beliebigen Reifestadium beinhalten,
sowie beliebige Zellen, Gewebe oder Organe, die von solch einer
Pflanze entnommen wurden bzw. davon abstammen, darunter auch beliebige
Samen, Blätter,
Stengel, Blüten,
Wurzeln, Einzelzellen, Gameten, Zellkulturen, Gewebekulturen oder
Protoplasten, was jedoch keine Einschränkung darstellen soll. Der
Begriff "Pflanzenmaterial" bezieht sich im
vorliegenden Zusammenhang auf Material, das von einer Pflanze erhalten
wurde oder davon abstammt. Produkte, die Pflanzenmaterial enthalten,
beziehen sich auf Nahrungsmittel-, Futtermittel- oder sonstige Produkte,
die unter Verwendung von Pflanzenmaterial hergestellt wurden oder
die Pflanzenmaterial als Verunreinigung enthalten können. Es
ist klar, daß im
Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung solche biologischen
Proben auf das Vorhandensein von Nukleinsäuren, die für GAT-ZM1 spezifisch sind,
geprüft
werden, was voraussetzt, daß Nukleinsäuren in
den Proben vorliegen. Die im vorliegenden Zusammenhang erwähnten Verfahren
zum Identifizieren des Elite-Events GAT-ZM1 in biologischen Proben
beziehen sich also auf die Identifikation von Nukleinsäuren, die
das Elite-Event umfassen, in biologischen Proben.
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Im
vorliegenden Zusammenhang ist "umfassend" dahingehend zu verstehen,
daß es
das Vorhandensein der erwähnten
Merkmale, ganzen Zahlen, Schritte, Reagentien oder Bestandteile,
wie sie erwähnt wurden,
vorschreibt, was jedoch nicht das Vorhandensein oder das Hinzufügen von
einem/einer oder mehreren Merkmalen ganzen Zahlen, Schritten oder
Komplementen, oder Gruppen davon, ausschließt. So kann z. B. eine Nukleinsäure oder
ein Protein, die/das eine Nukleotid- oder Aminosäuresequenz umfaßt, weitere
Nukleotide oder Aminosäuren
und nicht nur die tatsächlich
angegebenen umfassen, sie bzw. es kann also in einer größeren Nukleinsäure bzw.
einem größeren Protein
eingebettet vorliegen. Ein chimäres
Gen, das eine DNA-Sequenz, die funktionsmäßig oder strukturmäßig definiert
ist, umfaßt,
kann zusätzliche
DNA-Sequenzen umfassen usw.
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Die
folgenden Beispiele beschreiben die Identifikation der Entwicklung
von Mitteln zum Identifizieren des Elite-Events GAT-ZM1 in biologischen
Proben.
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Falls
nicht anders erwähnt
werden alle DNA-Rekombinationstechniken gemäß Standardprotokollen durchgeführt, wie
sie bei Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
zweite Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY und in
den Bänden
1 und 2 von Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular
Biology, Current Protocols, USA, beschrieben sind. Standardmaterial
und Standardmethoden für molekularbiologische
Arbeiten an Pflanzen sind in Plant Molecular Biology Labfax (1993)
von R. D. D. Croy, verlegt bei BIOS Scientific Publications Ltd
(UK) und Blackwell Scientific Publications, UK, beschrieben.
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In
der Beschreibung und den Beispielen werden die folgenden Sequenzen
erwähnt:
SEQ
ID Nr. 1: Sequenz der genetischen Elemente des Vektors pUC/Ac
SEQ
ID Nr. 2: Primer MDB286
SEQ ID Nr. 3: Primer MDB391
SEQ
ID Nr. 4: Primer MDB411
SEQ ID Nr. 5: Primer MDB420
SEQ
ID Nr. 6: Nukleotidsequenz, die eine das 5'-Ende flankierende Region von GAT-ZM1
umfaßt
SEQ
ID Nr. 7: Primer MDB439
SEQ ID Nr. 8: Primer VDS44
SEQ
ID Nr. 9: Primer MDB522
SEQ ID Nr. 10: Nukleotidsequenz, die
eine das 3'-Ende
flankierende Region von GAT-ZM1 umfaßt
SEQ ID Nr. 11: Primer
COR17
SEQ ID Nr. 12: Primer COR18
SEQ ID Nr. 13: Primer
COR15
SEQ ID Nr. 14: Primer COR16
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Kurze Beschreibung der
Zeichnung
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Die
folgenden Beispiele, die die Erfindung nicht auf spezifische, beschriebene
Ausführungsformen
einschränken
sollen, können
in Verbindung mit der beigelegten Abbildung verstanden werden, die
per Referenz in den vorliegenden Text aufgenommen wurde und in der:
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1:
Beurteilung von Unbekannten mit dem für GAT-ZM1 entwickelten PCR-Identifikationsprotokoll.
Reihenfolge der Auftragung auf das Gel: Unbekannte: Bahn 1, 2, 5,
6, 8, 11, 13, 14, DNA-Proben
aus Maispflanzen, die das transgene Event GAT-ZM1 umfassen; Bahn
4, 9, 10, 12, DNA-Proben
von Maispflanzen, die das Elite-Event GAT-ZM1 nicht umfassen; Bahn
3, PCR-Versagen. Kontrollbahnen: Bahn 19, 21, Kontroll-DNA-Proben
von Maispflanzen, die das Elite-Event GAT-ZM1 umfassen; Bahn 20, 22, Kontroll-DNA-Proben
von Wildtyp-Maispflanzen; Bahn 23, matrizenfreie Kontrolle; Bahn
24, Molekulargewichtsmarker.
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Beispiele
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1. Identifiktion der flankierenden
Regionen des Elite-Events
GAT-ZM1
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Herbizidresistenter
Mais wurde dadurch entwickelt, daß man Mais mit dem Vektor pUC/Ac
transformierte, der die Codiersequenz eines pat-Gens, das für das Enzym
Phosphinothricin-Acetyltransferase codiert, unter der Kontrolle
des konstitutiven 35S-Promoters aus dem Blumenkohlmosaikvirus umfaßt. Eine
genaue Beschreibung der genetischen Elemente von pUC/Ac findet sich
in Tabelle 1. Die Nukleotidsequenz der genetischen Elemente von
pUC/Ac findet sich in SEQ ID Nr. 1. Tabelle:
genetische Elemente des Vektors pUC/Ac
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Die
Selektion des Elite-Events GAT-ZM1 beruhte auf einem ausführlichem
Selektionsvorgang, das auf guter Expression und Stabilität des Herbizidresistenzgens
und seiner Kompatibilität
mit optimalen agronomischen Eigenschaften beruhte.
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Die
Sequenz der die Fremd-DNA im GAT-ZM1-Event flankierenden Regionen
wurde mit dem "thermal asymmetric
interlaced" (TAIL)
PCR-Verfahren, das von Liu et al. (1995, Plant J. 8(3):457-463)
beschrieben wurde, bestimmt. Bei diesen Verfahren werden drei "nested" Primer in aufeinanderfolgenden
Reaktionen verwendet, und zwar gemeinsam mit einem kürzeren zufällig ge wählten degenerierten
Primer, so daß die
relativen Amplifikationsraten in spezifischen und unspezifischen
Produkten thermisch kontrolliert werden können. Die spezifischen Primer
wurden aufgrund ihres Reassoziierens mit der Border der Fremd-DNA
und auf Grundlage ihrer Reassoziationsbedingungen gewählt. Eine
kleine Menge (5 μl)
von nichtaufgereinigten Produkten der zweiten und dritten PCR wurden
auf einem 1%igen Agarosegel analysiert. Mit dem Produkt der dritten
PCR wurde eine präparative
Amplifikation durchgeführt
und es wurde aufgereinigt und auf einem automatischen Sequenziergerät mit dem
DyeDeoxy Terminator Zyklus-Kit sequenziert.
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1.1. Rechte (das 5'-Ende) flankierende
Region
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Bei
den verwendeten Primern handelte es sich um:
-
Das
mit MDB286-MDB420 amplifizierte Fragment wies eine Länge von
ungefähr
1100 Bp auf; seine vollständige
Sequenz wurde bestimmt (SEQ ID Nr. 6). Die Sequenz zwischen dem
Nukleotid 1 und dem Nukleotid 341 entspricht Pflanzen-DNA, während die
Sequenz zwischen Nukleotid 342 und Nukleotid 1041 T-DNA entspricht.
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1.2. Linke (das 3'-Ende) flankierende
Region
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Bei
den verwendeten Primern handelte es sich um:
-
Das
mit MDB286-MDB522 amplifizierte Fragment wies eine Länge von
ungefähr
450 Bp auf; seine vollständige
Sequenz wurde bestimmt (SEQ ID Nr. 10). Die Sequenz zwischen dem
Nukleotid 1 und dem Nukleotid 342 entspricht Pflanzen-DNA, während die
Sequenz zwischen Nukleotid 343 und Nukleotid 484 T-DNA entspricht.
-
2. Entwicklung eines Polymerasekettenreaktions-Identifikationsprotokolls
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2.1. Primer
-
Es
wurden spezifische Primer entwickelt, die Sequenzen innerhalb des
Elite-Events erkennen. Genauer gesagt wurde ein Primer entwickelt,
der eine Sequenz innerhalb der das 5'-Ende flankierenden Region von GAT-ZM1
erkennt. Dann wurde innerhalb der Sequenz der Fremd-DNA ein zweiter
Primer gewählt,
so daß die Primer
eine Sequenz von ungefähr
200 Bp abdecken. Es wurde gefunden, daß die folgenden Primer in einer PCR-Reaktion
mit GAT-ZM1-DNA zu besonders klaren, reproduzierbaren Ergebnissen
führen:
COR17:
5'-ggg.TgA.gCT.CgA.ATg.TTg.TTC.T-3' (SEQ ID 11) (Ziel:
Pflanzen-DNA)
COR18: 5'-TCT.TAg.ACg.TCA.ggT.ggC.ACT.T-3' (SEQ ID 12) (Ziel:
T-DNA)
-
Bei
dem PCR-Cocktail werden vorzugsweise Primer mitverwendet, die eine
endogene Sequenz als Zielsequenz haben. Diese Primer dienen als
interne Kontrolle bei unbekannten Proben und der DNA-Positivkontrolle.
Ein positives Ergebnis mit dem endogenen Primer-Paar zeigt an, daß in dem
genomischen DNA-Präparat
genug DNA in entsprechender Qualität vorliegt, um zu einem PCR-Produkt zu gelangen.
Die endogenen Primer wurden so gewählt, daß sie ein "Housekeeping"-Gen in Zea mays erkennen:
COR15:
5'-AgC.gTC.AAg.gAT.CAT.Tgg.TgT.C-3' (SEQ ID 13) (befindet
sich im Zea mays-Alkoholdehydrogenase 1 Gen von (X04050))
COR16:
5'-ggC.CAA.gTT.CAg.CAT.AAg.CTg.T-3' (SEQ ID 14) (befindet
sich im Zea mays-Alkoholdehydrogenase 1 Gen von (X04050))
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2.2. Amplifizierte Fragmente
-
Bei
den erwarteten amplifizierten Fragmenten in der PCR-Reaktion handelt
es sich um:
für
das Primer-Paar COR15–COR16:
513 Bp (endogene Kontrolle)
für das Primer-Paar COR17–COR18:
202 Bp (GAT-ZM1-Elite-Event)
-
2.3. Matrizen-DNA
-
Matrizen-DNA
wurde gemäß Edwards
et al. (Nucleic Acid Research, 19, S. 1349, 1991) aus einem ausgestanzten
Blattstück
präpariert.
Verwendet man DNA, die nach anderen Methoden präpariert wird, so sollte ein
Testlauf mit unterschiedlichen Matrizenmengen durchgeführt werden. Üblicherweise
führen
50 ng genomische Matrizen-DNA zu den besten Ergebnissen.
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2.4. Zugeordnete Positiv-
und Negativkontrollen
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Um
falsch-positive oder falsch-negative Resultate zu vermeiden, wurde
festgesetzt, daß die
folgenden Positiv- und Negativkontrollen bei einer PCR mitlaufen
gelassen werden sollen:
- – Master-Mix-Kontrolle (DNA-Negativkontrolle).
Hierbei handelt es sich um eine PCR, bei der keine DNA zum Ansatz
gegeben wird. Gelangt man zu dem erwarteten Ergebnis, nämlich keine
PCR-Produkte, so zeigt dies an, daß der PCR-Cocktail nicht mit
Ziel-DNA verunreinigt war.
- – Eine
DNA-Positivkontrolle (genomische DNA-Probe, von der bekannt ist,
daß sie
die transgenen Sequenzen enthält).
Eine erfolgreiche Amplifikation dieser Positivkontrolle zeigt an,
daß die
PCR unter Bedingungen durchgeführt
wurde, die die Amplifikation der Zielsequenzen ermöglichen.
- – Eine
Wildtyp-DNA-Kontrolle. Hierbei handelt es sich um eine PCR, in der
die bereitgestellte Matrizen-DNA genomische DNA ist, die aus einer
nichttransgenen Pflanze präpariert
wurde. Wird das erwartete Ergebnis beobachtet, nämlich keine Amplifikation eines
transgenen PCR-Produkts, jedoch Amplifikation des endogenen PCR-Produkts,
so zeigt dies an, daß in
einer genomischen DNA-Probe keine nachweisbare Hintergrundamplifikation
des Transgens stattfindet.
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2.5. PCR-Bedingungen
-
Optimale
Ergebnisse wurden unter den folgenden Bedingungen erzielt:
- – die
PCR-Mischung für
25-μl-Reaktionen
enthält:
2,5 μl Matrizen-DNA
2,5 μl 10 × Amplifikationspuffer
(wird mit der Taq-Polymerase mitgeliefert)
0,5 μl 10 mM dNTPs
0,5 μl COR17 (10
pmol/μl)
0,5 μl COR18 (10
pmol/μl)
2,5 μl COR15 (10
pmol/μl)
2,5 μl COR16 (10
pmol/μl)
0,1 μl Taq-DNA-Polymerase
(5 Einheiten/μl)
Wasser
ad 25 μl
- – das
Thermocycling-Pofil, nach dem vorgegangen werden muß, um optimale
Ergebnisse zu erzielen, lautet folgendermaßen:
4
Minuten bei 95°C | danach: | 1
Minute bei 95°C
1
Minute bei 57°C
2
Minuten bei 72°C
5
Zyklen |
| danach: | 30
Sekunden bei 92°C
30
Sekunden bei 57°C
1
Minute bei 72°C
25
Zyklen |
| danach: | 5
Minuten bei 72°C |
-
2.6. Agarosegel-Analyse
-
Um
die Ergebnisse der PCR optimal sichtbar zu machen, wurde festgesetzt,
daß zwischen
10 und 20 μl
der PCR-Proben auf
ein 1,5%iges Agarosegel (Tris-Borat-Puffer) gemeinsam mit einem
entsprechenden Molekulargewichtsmarker (z. B. 100 Bp Leiter von
PHARMACIA) aufzutragen sind.
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2.7. Validierung der Ergebnisse
-
Es
wurde bestimmt, daß Daten
von DNA-Proben transgener Pflanzen innerhalb je einer PCR und innerhalb
je einem PCR-Cocktail nicht annehmbar sind, außer wenn 1) die DNA-Positivkontrolle
die erwarteten PCR-Produkte (transgene und endogene Fragmente) aufweist,
2) die DNA-Negativkontrolle negativ für die PCR-Amplifizierung ist
(keine Fragmente) und 3) die Wildtyp-DNA-Kontrolle das erwartete
Ergebnis (Amplifikation endogener Fragmente) aufweist.
-
Geht
man gemäß dem PCR-Identifikationsprotokoll
für GAT-ZM1
wie oben beschrieben vor, so zeigen Bahnen mit sichtbaren Mengen
der transgenen und endogenen PCR-Produkte
in den erwarteten Größen, daß die entsprechende
Pflanze, aus der die genomische Matrizen-DNA präpariert worden war, das GAT-ZM1-Elite-Event
geerbt hat. Bahnen, die keine sichtbaren Mengen eines der transgenen
PCR-Produkte aufweisen und dafür
sichtbare Mengen des endogenen PCR-Produkts aufweisen, zeigen an,
daß die
entsprechende Pflanze, aus der die genomische Matrizen-DNA präpariert
worden ist, das Elite-Event nicht umfaßt. Bahnen, die keine der endogenen
und transgenen PCR-Produkte aufweisen, zeigen an, daß es die
Qualität
und/oder Menge der genomischen DNA nicht ermöglicht hat, ein PCR-Produkt
zu erzeugen. Diese Pflanzen können
nicht beurteilt werden. Die genomische DNA-Präparation ist zu wiederholen
und eine neue PCR ist mit den entsprechenden Kontrollen durchzuführen.
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2.8. Verwendung eines
differenzierenden PCR-Protikolls zum Identifizieren von GAT-ZM1
-
Bevor
man versucht, unbekanntes Material zu durchmustern, ist ein Probelauf
mit allen entsprechenden Kontrollen durchzuführen. Es könnte erforderlich sein, daß das entwickelte
Protokoll für
Komponenten, die von Labor zu Labor unterschiedlich sind (Präparation
der Matrizen-DNA, Taq-DNA-Polymerase, Qualität der Primer, dNTPs, Thermocycler
usw.) optimiert werden müssen.
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Der
Amplifikation der endogenen Sequenz kommt in dem Protokoll eine
Schlüsselrolle
zu. Man muß zu
PCR- und Thermocycling-Bedingungen gelangen, die äquimolare
Mengen der endogenen Sequenz sowie der transgenen Sequenz in einer
bekannten transgenen genomischen DNA-Matrize amplifizieren. Jedesmal, wenn
das endogene Zielfragment nicht amplifiziert wird, oder wenn die
Zielsequenzen nicht mit derselben Ethidiumbromid-Färbeintensität amplifiziert
werden (gemäß Agarosegel-Elektrophorese),
kann eine Optimierung der PCR-Bedingungen erforderlich sein.
-
Blattmaterial
von Zea mays von verschiedenen Pflanzen, von denen manche GAT-ZM1
umfassen, wurden gemäß dem oben
beschriebenen Protokoll geprüft.
Als Positiv- und Negativkontrollen wurden Proben von GAT-ZM1-Elite-Event
und von Zea mays-Wildtyp verwendet.
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1 zeigt
das Ergebnis, das mit dem Elite-Event-PCR-Identifikationsprotokoll
für GAT-ZM1
bei mehreren Maispflanzenproben erzielt wurde (Bahn 1 bis 14). Es
wurde gefunden, daß die
Proben in den Bahnen 1, 2, 5, 6, 7, 8, 11, 13 und 14 das Elite-Event
enthalten, da die 202 Bp große
Bande nachgewiesen wird, während
die Proben in den Bahnen 4, 9, 10 und 12 nicht GAT-ZM1 umfassen.
Bahn 3 zeigt ein PCR-Versagen an, da die Kontrollbande nicht nachgewiesen
wird. Die Bahnen 19 und 20 stellen Proben von GAT-ZM1-Positivkontrollen
dar, während
die Bahnen 20 und 22 Kontrollen für nichttransgenen Zea mays
darstellen; Bahn 23 stellt die Probe für die Negativkontrolle (Wasser)
dar, und Bahn 24 stellt den Molekulargewichtsmarker (100 Bp) dar.
-
3. Verwendung eines spezifischen
Integrationsfragments als Sonde für den Nachweis von Material,
daß GAT-ZM1
umfaßt
-
