WO2019163064A1 - Ｐｃｒ成否判定法 - Google Patents

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WO2019163064A1
WO2019163064A1 PCT/JP2018/006551 JP2018006551W WO2019163064A1 WO 2019163064 A1 WO2019163064 A1 WO 2019163064A1 JP 2018006551 W JP2018006551 W JP 2018006551W WO 2019163064 A1 WO2019163064 A1 WO 2019163064A1
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nucleic acid
primer
sequence
pcr
target nucleic
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PCT/JP2018/006551
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加藤　真吾
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学校法人 慶應義塾
株式会社ニコン
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology

Definitions

  • the present invention relates to a PCR success / failure determination method.
  • PCR In PCR, when the target PCR product is not obtained, a positive control is added to determine whether PCR has succeeded in order to determine whether the PCR itself has failed or whether there is no target nucleic acid as a template in the sample.
  • Non-patent document 1 Funakoshi website: PCR positive control "PCRChecker" introduction page.
  • PCRChecker PCR positive control
  • a template having a sequence different from that of the target nucleic acid and a primer set for amplifying the template are widely used.
  • introduction of a plurality of templates and primer sets into the PCR system may cause an unintended amplification reaction or decrease the yield of the target PCR product.
  • An object of the present invention is to provide a method for determining the success or failure of PCR with little influence on the amplification reaction of the target nucleic acid.
  • the present inventor By adding two short nucleic acids having sequences complementary to each other at the 3 ′ end in the PCR reaction system, the present inventor stably produced a primer-dimer-like duplex. It was found that it can be used as a positive control for PCR. As one of the two nucleic acids having sequences complementary to each other at the 3 ′ end, a nucleic acid having the same sequence as one of the primers for the target nucleic acid may be used. According to this method, it is not necessary to add an extra template nucleic acid as in the case of the conventional positive control, so that the influence on the amplification reaction of the target nucleic acid can be reduced.
  • the gist of the present invention is as follows. (1) a first nucleic acid of 14 mer to 35 mer, A 14-mer to 35-mer second nucleic acid having a sequence complementary to the 3 ′ end of the first nucleic acid at the 3 ′ end; A PCR success / failure determination agent.
  • the PCR success / failure determination agent according to (1) wherein the complementary sequence has 4 to 12 bases.
  • Either one of the first nucleic acid and the second nucleic acid is The sequence according to any one of (1) to (3) above, wherein at least a partial sequence of any one of the primers for amplifying the target nucleic acid includes a sequence in which the 5 ′ side and the 3 ′ side are inverted.
  • Either one of the first nucleic acid and the second nucleic acid is Any one of (1) to (3) above, comprising a sequence in which the 5 ′ side and the 3 ′ side are inverted with respect to the complementary sequence of at least a part of one of the primers for amplifying the target nucleic acid
  • the PCR success / failure determination agent according to one item.
  • a step of performing PCR by adding the PCR success / failure determination agent according to any one of (1) to (6) above to a sample, and a PCR amplification product by the first nucleic acid and the second nucleic acid Detecting PCR success / failure determination method.
  • the PCR success / fail judgment agent according to any one of (1) to (6) above, A nucleic acid detection kit comprising a primer for amplifying the target nucleic acid. (9) Further, it has a sequence complementary to the upstream region adjacent to the 5 ′ end of a part of the target nucleic acid sequence (target sequence) and a sequence complementary to the downstream region adjacent to the 3 ′ end of the target sequence.
  • the nucleic acid detection kit according to (8) above comprising a primer that does not contain a sequence complementary to the target sequence.
  • the nucleic acid detection kit according to (8) or (9) above which contains, as a probe, a nucleic acid having a sequence capable of hybridizing with at least a part of the PCR product of the first nucleic acid or the second nucleic acid.
  • the nucleic acid detection kit according to (10) further comprising, as a probe, a nucleic acid having a sequence capable of hybridizing with at least a part of the PCR product of the target nucleic acid.
  • the carrier is a rectangular strip composed of cellulose fibers, and the probe is linearly fixed in a direction perpendicular to the longitudinal direction of the strip. kit.
  • the present invention provides a PCR success / failure determination agent and a success / failure determination method that hardly affect the amplification reaction of a target nucleic acid.
  • the result of creating a primer dimer for positive control by PCR using a reverse primer for the target nucleic acid and a forward primer with 6, 8 or 10 base sequences complementary to the 3 ′ end of the reverse primer as a positive control primer set Electrophoresis image.
  • the result (electrophoresis image) which produced the primer dimer for positive control by PCR using a reverse primer and a contraverse primer or a contra positive converse primer is shown.
  • the result (electrophoresis image) which observed the inhibitory effect with respect to amplification of a target nucleic acid (HIV-1 RNA) by adding a converse primer or a contra positive converse primer in addition to a forward primer and a reverse primer is shown.
  • F1 is a forward primer
  • F2 is a jumped primer
  • R1 is a reverse primer.
  • double-stranded DNA (c and d) having a single-stranded loop is generated in addition to long double-stranded DNA (a) and short double-stranded DNA (b).
  • a, b, and d are synthesized by DNA extension, and a, b, c, and d are generated by once denaturing the PCR product into single strands and hybridizing again. It is explanatory drawing about the principle in which the primer dimer for positive control is formed.
  • the PCR success / failure determination agent of this embodiment includes a 14-mer to 35-mer first nucleic acid and a second nucleic acid.
  • the 3 ′ end of the first nucleic acid and the 3 ′ end of the second nucleic acid have sequences complementary to each other.
  • PCR In PCR, using a primer (forward primer and reverse primer) designed in pairs so as to sandwich the nucleic acid region (target nucleic acid) to be amplified, a DNA polymerase repeatedly synthesizes the complementary strand of the target nucleic acid. Thus, the target nucleic acid is amplified.
  • heat denaturation dissociates double-stranded DNA as a template into single-stranded DNA by heat
  • annealing primer binds to single-stranded DNA.
  • the forward primer is the template antisense strand
  • the reverse primer is the template.
  • the target nucleic acid is amplified by repeating the three steps of binding to the sense strand and extension reaction (by synthesizing the complementary strand of the original DNA from the primer by DNA polymerase).
  • the principle of the PCR success / failure determination agent of this embodiment will be described with reference to FIG.
  • the first nucleic acid 90 and the second nucleic acid 94 have portions 92 and 96 that are complementary to each other at their 3 ′ ends.
  • an extension reaction occurs in which the first nucleic acid 90 and the second nucleic acid 94 function as primers and use each other as a template, Regions 102 and 104 are synthesized to form a primer-dimer-like duplex 100.
  • the PCR success / failure determination agent of this embodiment unlike the conventional positive control, it is not necessary to add an extra template to the reaction system, so that the influence on the amplification of the target nucleic acid can be reduced.
  • the first nucleic acid 90 and the second nucleic acid 94 are referred to as “positive control primers” (in the case of distinguishing between forward and reverse, “positive control forward primer”, “positive control reverse primer”). Sometimes referred to as “positive control primer set”. Further, the primer-dimer-like double strand 100 obtained by PCR of the primer set for positive control is sometimes referred to as “primer primer for positive control”.
  • forward primer or “reverse primer” simply means a target nucleic acid amplification primer, but in order to clarify the meaning, the term “target nucleic acid forward primer” or “target nucleic acid reverse primer” Sometimes terminology is used.
  • the PCR positive control means a substance that is produced with good reproducibility when the PCR occurs normally. Therefore, when the target nucleic acid is not detected but the positive control is detected, it can be understood that the PCR has occurred normally and the amount of the target nucleic acid in the sample was below the detection limit. On the other hand, if neither the target nucleic acid nor the positive control was detected, it is considered that the PCR itself did not occur normally, so that the target nucleic acid was not detected just because the target nucleic acid was not detected. It cannot be judged.
  • the first nucleic acid and the second nucleic acid of this embodiment have sequences complementary to each other at the 3 ′ end, and form a primer-dimer-like double strand by PCR, and a target nucleic acid amplification reaction Those having sequences that are less likely to affect are selected.
  • the length of the first nucleic acid and the second nucleic acid can be the same as that of a primer usually used for PCR, and is, for example, 14 mer to 35 mer. It may be 20-30mer.
  • the sequences complementary to each other are appropriately determined according to the length of the first nucleic acid and the second nucleic acid, and can be, for example, 3 to 12 bases, or 4 to 10 bases.
  • One sequence of the first nucleic acid and the second nucleic acid may be the same sequence as the forward primer for the target nucleic acid or the reverse primer for the target nucleic acid.
  • the second nucleic acid sequence is placed at the 3 ′ end of the target nucleic acid reverse primer and the target nucleic acid forward primer at the 3 ′ end.
  • Complementary sequences may be added.
  • the complementary sequence may be added to the sequence of the full length of the target nucleic acid reverse primer, or may be added to a sequence obtained by removing several bases from the 3 ′ end of the target nucleic acid reverse primer.
  • sequence at the 5 ′ end of the second nucleic acid may be a sequence unrelated to the reverse primer for the target nucleic acid, and the sequence at the 3 ′ end may be a sequence complementary to the 3 ′ end of the forward primer for the target nucleic acid.
  • the first nucleic acid sequence is the same as the target nucleic acid reverse primer, the second nucleic acid sequence can be similarly designed.
  • the first nucleic acid and / or the second nucleic acid may have a sequence that does not compete with the target nucleic acid primer as much as possible so as not to affect the amplification reaction of the target nucleic acid.
  • the sequence that does not compete with the target nucleic acid primer as much as possible at least a part of the target nucleic acid primer includes a sequence in which the 5 ′ side and the 3 ′ side are inverted.
  • sequence of the forward primer for the target nucleic acid includes the following sequence (1): 5′-CAAGCAGCHATGCAAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 1) (1)
  • a nucleic acid containing the following sequence (2) obtained by inverting the 5 ′ side and the 3 ′ side of the sequence (1) can be used as the first or second nucleic acid.
  • 5′-TAAACGTAHCGACGAAC-3 ′ SEQ ID NO: 2
  • a sequence obtained by inverting the 5 ′ side and the 3 ′ side of a partial sequence of the target nucleic acid primer in this way is referred to as a “converse sequence”, and a positive-conversion primer including a converse sequence is referred to as a “converse primer”.
  • reverse primer is unlikely to compete with the target nucleic acid primer, but because the target nucleic acid primer and the base composition are exactly the same, the advantage is that the target nucleic acid amplification efficiency and the positive control primer dimer production efficiency are almost the same. There is.
  • the converse primer may be one in which a base is further added to one or both ends of the converse sequence.
  • a sequence complementary to the 3 ′ end of the other positive control primer can be added to the 3 ′ end of the converse sequence.
  • Converse sequences can be, for example, 14-35 bases, 20-30 bases, 23-27 bases.
  • the total length of the converse primer is preferably 14 to 35 bases.
  • sequence that does not compete with the target nucleic acid primer as much as possible is a sequence in which the 5 ′ side and the 3 ′ side are reversed with respect to at least a part of the complementary strand of the target nucleic acid primer.
  • one sequence of the target nucleic acid primer includes the following sequence (3): 5′-CAAGCAGCHATGCAAAT-3 ′ (SEQ ID NO: 3) (3) Since the complementary strand of the sequence (3) is the following sequence (4), 5′-ATTTGCATDGCTGCTTG-3 ′ (SEQ ID NO: 4) (4)
  • a nucleic acid containing the following sequence (5) obtained by inverting the 5 ′ side and the 3 ′ side of the sequence (4) can be used as the first or second nucleic acid.
  • a sequence obtained by inverting the 5 ′ side and 3 ′ side of a part of the complementary strand of the target nucleic acid primer is referred to as a “contrapositive / converse sequence”. It is called “Contrapositive Converse Primer”.
  • the contra-positive / converse primer is less likely to compete with the target nucleic acid primer and has the same Tm value as the target nucleic acid primer, so the target nucleic acid amplification efficiency and the positive control primer dimer production efficiency are almost the same. There is an advantage of becoming.
  • the contra-positive / converse primer may be one in which a base is further added to one or both ends of the contra-positive / converse sequence.
  • a sequence complementary to the 3 ′ end of the other positive control primer can be added to the 3 ′ end of the contrapositive contra sequence.
  • the contra-positive / converse sequence can be, for example, 14 to 35 bases, 20 to 30 bases, or 23 to 27 bases.
  • the total length of the contrapositive / converse primer should be 14 to 35 bases.
  • the concentration ratio between the first nucleic acid and the second nucleic acid and the target nucleic acid primer can be appropriately determined by those skilled in the art.
  • the concentration of the first nucleic acid is for the target nucleic acid.
  • the concentration of the primer may be 1/1 to 1/64, preferably 1/4 to 1/32, and more preferably 1/8 to 1/32.
  • a detectable labeling substance may be bound to the first nucleic acid and / or the second nucleic acid. Thereby, the primer dimer for positive control can be detected by detecting the labeling substance.
  • the labeling substance may be a labeling substance that emits a detectable signal itself or a labeling substance that emits a signal in combination with other components. Examples of the labeling substance that emits a detectable signal per se include fluorescent labeling substances (for example, FITC, rhodamine, etc.). Examples of labeling substances that emit signals in combination with other components include haptens such as biotin and digoxigenin, enzymes such as alkaline phosphatase, and peroxidase.
  • a technique for binding a labeling substance to a primer can be appropriately selected from known means by those skilled in the art.
  • biotin is bound to the first nucleic acid and / or the second nucleic acid, PCR amplification is performed, and the PCR product is colored by reacting colored particles in which avidin is bound to biotin bound to the PCR product. can do.
  • the “target nucleic acid” may be RNA or DNA, and may be either double-stranded or single-stranded. In the case of single-stranded DNA or single-stranded RNA, either the sense strand or the antisense strand may be used.
  • the term “target nucleic acid” refers to a nucleic acid having a sequence to be subjected to PCR amplification, and may refer to a nucleic acid (template nucleic acid) originally contained in a sample as long as it has such a sequence. In some cases, both amplification products may be referred to collectively.
  • the target nucleic acid when it is DNA, it may be genomic DNA, cDNA, synthetic DNA, mitochondrial DNA, chloroplast DNA, or the like, and may be cDNA reverse-transcribed from RNA.
  • the length of the target nucleic acid may be any length that can be amplified by PCR, and the length that can be amplified by PCR is said to be several bases to several tens of kilobases, but is preferably 1000 bases or less, 200 to 260 bases are preferred.
  • Samples containing the target nucleic acid include whole blood, serum, plasma, urine, feces, cerebrospinal fluid, semen, saliva, tissue, cells, sputum, nasal discharge, biological samples, plant extracts / pulverized products, foods, Examples include, but are not limited to, drinking water, biological preparations, soil, water such as lakes and rivers, drainage, sewage, and the like.
  • the forward primer for target nucleic acid and the reverse primer for target nucleic acid can be designed by a known method or a method equivalent thereto.
  • the length of the primer for the target nucleic acid may be 14-35mer, preferably 18-27mer.
  • the primer set for the target nucleic acid should not have mutually complementary sequences at the 3 'end so that primer dimers other than the primer dimer for positive control are not formed.
  • the 3 'ends of the target nucleic acid forward primers or the target nucleic acid reverse primers may be designed so as not to be complementary to each other.
  • the target nucleic acid primer set avoid the 3 'end T so as not to cause mismatches; design so as not to take secondary structure in the primer; make the primer GC content about 40-60%;
  • the bases that make up the primer (G, A, T, C) are randomly distributed so that they do not partially become GC-rich or AT-rich; the Tm value of the primer should be around 55-60 ° C, Paired primers can be designed according to known rules such as selecting primers having close Tm values.
  • Detectable labeling substances may be bound to the target nucleic acid forward primer and the target nucleic acid reverse primer in the same manner as the first nucleic acid and the second nucleic acid. It is also preferable to label the target nucleic acid primer and the first or second nucleic acid with a labeling substance that can be detected by the same technique.
  • the PCR success / failure determination method of the present embodiment includes a step of performing PCR by adding a primer set for a target nucleic acid and the above-described PCR success / failure determination agent to a sample, and a PCR product of the first nucleic acid and the second nucleic acid, that is, Detecting a primer dimer for positive control.
  • the method for detecting the PCR product using the first nucleic acid and the second nucleic acid is not particularly limited, and various methods can be used, such as nucleic acid chromatography, microarray, nucleic acid hybridization, electrophoresis, and the like. . When a labeling substance is bound to the first nucleic acid or the second nucleic acid, the labeling substance may be detected.
  • the primer dimer for positive control after PCR amplification is double-stranded
  • the present inventors once denatured it into single strands and once again made rapid double strand formation, the primer dimer for positive control It has been found that a single-stranded portion is generated and can be detected by hybridizing to a single-stranded probe. Therefore, the presence or absence of the primer dimer for positive control can be confirmed by capturing the primer dimer for positive control by nucleic acid chromatography or microarray and detecting the labeling substance.
  • PCR amplification is performed by binding biotin to the first nucleic acid or the second nucleic acid, denatured to single strand by adding strong alkali to the double-stranded primer dimer for positive control, and avidin to biotin Coloring is performed by combining colored particles combined with.
  • a single-stranded probe having a sequence complementary to at least a part of a positive control primer dimer is fixed to a nucleic acid chromatography strip. After that, neutralization with a weak acid makes the positive primer primer dimer abruptly form a double strand, and when it is developed on a strip for nucleic acid chromatography, the colored positive primer primer dimer is captured in the single strand probe. And coloring is confirmed on the strip.
  • Detection of the amplification product of the target nucleic acid can also be carried out by the same method as the primer dimer for positive control.
  • the amplification product of the target nucleic acid is also detected by hybridization to a single-stranded probe such as nucleic acid chromatography or microarray, reproducibility and detection sensitivity can be improved by using the jumped primer described below.
  • the jumped primer has a sequence complementary to the upstream region adjacent to the 5 ′ end of a part of the target nucleic acid sequence (target sequence) and a sequence complementary to the downstream region adjacent to the 3 ′ end of the target sequence. It is a primer and does not contain a sequence complementary to the target sequence (FIG. 6).
  • the 5 ′ end of the jumped primer and the 5 ′ end of the forward primer coincide.
  • FIG. 6 shows the case where the jumped primer has a sequence overlapping with the forward primer
  • the jumped primer may have a sequence overlapping with the reverse primer.
  • the length of the target sequence may be about one third of the length of the target nucleic acid, preferably 45 to 90 bases.
  • the length of the jumped primer is preferably 30 mer to 70 mer, and preferably 33 to 51 mer.
  • the length of the sequence complementary to the upstream region adjacent to the 5 ′ end of the target sequence in the jumped primer may be 15 mer to 35 mer, and preferably 18 to 27 mer.
  • the length of the sequence complementary to the downstream region adjacent to the 3 ′ end of the target sequence in the jumped primer may be 15 mer to 35 mer, and preferably 15 to 24 mer.
  • the concentration ratio of jumped primer and forward primer (or reverse primer) may be 1/4 to 1/32, and preferably 1/4 to 1/16.
  • DNA polymerase, buffer, Mg ion, dNTP, reverse transcriptase, PCR enhancer, etc. may be used.
  • PCR heat denaturation (dissociation of double-stranded DNA as a template into single-stranded DNA by heat), annealing (binding a primer to single-stranded DNA), extension reaction (by DNA polymerase, the original DNA is removed from the primer)
  • the temperature, time, and cycle number of the three steps may be appropriately adjusted.
  • a part of the target nucleic acid sequence (target sequence) in the PCR product or a sequence complementary thereto may be detected by hybridizing with a single-stranded probe.
  • the single-stranded probe may have a sequence complementary to part or all of the target sequence or a sequence complementary thereto.
  • the length of the probe is preferably 14-30 mer.
  • PCR amplifies a target nucleic acid (double strand) consisting of a sense strand and an antisense strand, and a portion of the double-stranded DNA (target sequence or a sequence complementary thereto). It is considered that a single-stranded DNA is formed, and this single-stranded portion is hybridized with a single-stranded probe and detected (see “Double-stranded loop-shaped single-stranded portion in FIG. 7). c. and d.).
  • the double-stranded DNA of the PCR amplification product is once denatured into a single strand, and then a double strand is rapidly formed.
  • a method of denaturing double-stranded DNA once into a single strand and then rapidly forming a double strand includes, for example, treating a PCR product with a strong alkali (eg, NaOH) and then a weak acid (eg, CH 3 COOH). ) To neutralize.
  • a strong alkali eg, NaOH
  • a weak acid eg, CH 3 COOH
  • the PCR product may be heat denatured (eg, heated at 94 ° C.
  • the container containing the PCR product may be rapidly cooled in ice water (eg, at a rate of 94 ° C. to 10 ° C./sec). To 0 ° C to 4 ° C). Sensitivity increases when double-stranded DNA of PCR products is denatured to single-strand by strong alkali or heat, and single strand is rapidly returned to double-strand again due to pH change from alkaline to neutral or rapid cooling. Yes.
  • the nucleic acid amplification or detection kit of this embodiment includes a PCR success / failure determination agent containing a first nucleic acid and a second nucleic acid, and a target nucleic acid primer.
  • a PCR success / failure determination agent containing a first nucleic acid and a second nucleic acid
  • a target nucleic acid primer for example, when the reverse primer of the target nucleic acid primer is used as the first nucleic acid or the second nucleic acid, the primer included in the nucleic acid amplification or detection kit includes the target nucleic acid forward primer, the first nucleic acid, And the second nucleic acid.
  • the primers included in the detection kit are the forward primer and reverse primer for the target nucleic acid, the first nucleic acid, and the second nucleic acid. 4 types of nucleic acids. When there are a plurality of types of target nucleic acids, the number of target nucleic acid primer sets may be increased accordingly. Moreover, you may add the jumped primer mentioned above.
  • the nucleic acid amplification or detection kit may include an amplified target nucleic acid, a probe for detecting a primer dimer for positive control, and a carrier on which the probe is immobilized.
  • a carrier on which the probe is immobilized examples include cellulose, nitrocellulose, nylon, polyether sulfone, silica gel, agarose, dextrin, gelatin, and the like.
  • the shape of the carrier examples include a plate shape and a strip shape.
  • Examples of the carrier on which the probe is immobilized include a strip for nucleic acid chromatography on which a single-stranded probe capable of hybridizing to the target nucleic acid and the positive control primer dimer is immobilized.
  • the strip for nucleic acid chromatography is formed of, for example, cellulose fiber, and a probe for a target nucleic acid and a probe for a positive control primer dimer are previously applied in a straight line in a direction perpendicular to the longitudinal direction. If the PCR product is developed in the longitudinal direction by dropping the PCR product on the strip or immersing the strip in the PCR product, and if the target nucleic acid or the primer dimer for positive control is included, the PCR product is hybridized.
  • “being able to hybridize” means to hybridize under stringent conditions.
  • the stringent conditions include, for example, 5% Denhardt's Solution (containing 0.1% Ficoll (Pharmacia), 0.1% polyvinylpyrrolidone, 0.1% bovine serum albumin), 0.5% SDS, and 100 ⁇ g / ml salmon sperm DNA. This refers to the conditions of washing at 65 ° C. in a 6 ⁇ SSC solution (1 ⁇ SSC is 0.15 M NaCl, 15 mM sodium citrate).
  • Stringency can be controlled by salt concentration (ionic strength), temperature, etc. Under conditions of higher stringency, ie lower salt concentration and higher temperature, only DNA with sufficiently high homology will hybridize. Soybeans.
  • the kit of this embodiment may include a microarray in which a single-stranded probe capable of hybridizing to a target nucleic acid and a positive-control primer dimer is immobilized instead of the strip for nucleic acid chromatography.
  • the kit of this embodiment may further contain a positive-control primer dimer and / or a labeling reagent for detecting the target nucleic acid.
  • a positive-control primer dimer and / or a labeling reagent for detecting the target nucleic acid contains colored particles in which biotin is bound to a first nucleic acid, a second nucleic acid, a forward primer, and / or a reverse primer, and avidin is bound as a labeling reagent.
  • the kit of this embodiment further includes DNA polymerase, dNTP, PCR buffer, Mg ion, nucleic acid chromatography development buffer (in the case of nucleic acid chromatography), microarray buffer (in the case of microarray analysis), nucleic acid hybridization buffer, handling Instructions etc. may be included.
  • Example 1 Detection of target nucleic acid by agarose gel electrophoresis and PCR success / failure determination 1.1
  • Target nucleic acid primer design and sequence PCR amplification using HIV-1 (derived from 8E5 cells) as the target nucleic acid can be used to determine the success or failure of PCR using a primer dimer for positive control, or agarose gel electrophoresis is used. Confirmed.
  • the forward primer and reverse primer for PCR amplification of the target nucleic acid had the following sequences. Biotin was bound to the 5 ′ end of the reverse primer as a labeling substance. [BioOn] indicates that biotin is bound.
  • Positive control primer set design and reverse sequence primer were also used as positive control reverse primers.
  • the forward primer for positive control removes 6 bases, 8 bases or 10 bases from the 3 ′ end of the forward primer, and 6 bases, 8 bases or 10 bases complementary to the 3 ′ end of the reverse primer (underlined) Each of the sequences was given.
  • PCR solution was prepared as follows.
  • a liquid and B liquid were mixed on the thermal cycler.
  • PCR profile was performed as follows. After performing heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, the cycle reaction was performed at a heat denaturation of 97 ° C. for 5 seconds; annealing at 56 ° C. for 10 seconds; 5 seconds; annealing 56 ° C., 10 seconds; extension reaction 72 ° C., 15 seconds. After completion of the cycle reaction, the temperature was kept at 4 ° C.
  • Electrophoresis agarose gel 2% GenePure LE agarose, 0.05% ethidium bromide, TAE buffer Buffer: 0.05% ethidium bromide, TAE buffer Electrophoresis tank: BIO CRAFT, BE-548 Electrophoretic conditions: 160V, 30 minutes Electrophoretic molecular weight marker: Bio-Regenerations, BRG-100-02, 100bp DNA Ladder An agarose gel electrophoresis image of the PCR product is shown in FIG. In FIG. 1, lanes 1 to 8 and lane M each contain the following primers.
  • the reverse primer was also used as the reverse primer for positive control.
  • a reverse primer and a contra-positive / converse primer were designed as follows. Each underlined part is a sequence complementary to the 3 ′ end of the reverse primer, and other than the underlined part is a converse sequence or a contrapositive contra sequence designed based on the sequence of the forward primer.
  • RT-PCR was performed by adding various concentrations of a contra primer or a contra-positive contra primer, and not adding a template DNA or RNA.
  • the PCR solution was prepared as follows.
  • a liquid and B liquid were mixed on the thermal cycler.
  • PCR profile was performed as follows. After performing heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, the cycle reaction was performed at a heat denaturation of 97 ° C. for 5 seconds; annealing at 56 ° C. for 10 seconds; 5 seconds; annealing 56 ° C., 10 seconds; extension reaction 72 ° C., 15 seconds. After completion of the cycle reaction, the temperature was kept at 4 ° C.
  • each lane includes the following primers.
  • the PCR solution was prepared as follows.
  • solution B was mixed on a thermal cycler.
  • PCR profile was performed as follows. After performing heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, the cycle reaction was performed at a heat denaturation of 97 ° C. for 5 seconds; annealing at 56 ° C. for 10 seconds; 5 seconds; annealing 56 ° C., 10 seconds; extension reaction 72 ° C., 15 seconds. After completion of the cycle reaction, the temperature was kept at 4 ° C.
  • each lane includes the following primers.
  • bands considered to be positive-conversion primer dimers formed by the reverse primer and reverse primer were detected depending on the concentration of the reverse primer.
  • a band considered to be an amplification product of the target nucleic acid was also detected at a position above the band considered to be a positive-control primer dimer.
  • a band considered to be a positive-conversion primer dimer formed by a contra-positive and reverse primer and a reverse primer was detected depending on the concentration of the contra-positive / converse primer.
  • a band considered to be an amplification product of the target nucleic acid was also detected at a position above the band considered to be a positive-control primer dimer.
  • positive primer primer dimer is stably produced in a concentration-dependent manner, while amplification of target nucleic acid is inhibited to some extent by the production of positive primer primer dimer, but this inhibition is also concentration-dependent. confirmed. Therefore, it was shown that the PCR success / failure determination using the positive-conversion primer can be performed simultaneously with the detection of the target nucleic acid by appropriately selecting the concentration of the converse primer or the contra-positive / converse primer.
  • Example 2 Detection of target nucleic acid by nucleic acid chromatography and PCR success / failure determination 2.1 Target Nucleic Acid Primer Design and Sequence
  • Example 2 it was confirmed using nucleic acid chromatography whether or not PCR amplification by a positive control primer dimer could be performed in PCR amplification using HIV-1 RNA as a target nucleic acid.
  • the same gagM-1FB and gagM-3RB-Bio as in Example 1 were used as the forward primer and the reverse primer for amplification of the target nucleic acid. Further, the following primers were added as jumped primers so that a single-stranded portion was formed in the amplification product of the target nucleic acid.
  • the nucleic acid chromatography strip is complementary to the target nucleic acid (HIV-1 gag region) probe complementary to the target nucleic acid (HIV-1, gag probe) and HIV-2 genome U3 region.
  • a and B, C and D, E and F, and G and H have complementary sequences, respectively.
  • the following arrangement was applied to the strip.
  • the three red lines on the strip are marks used for positioning when applying the probe to the strip.
  • A 5'-CCCATTCTGCAGCYTCYTCATTG-3 '(HIV-1, gag probe) (SEQ ID NO: 18)
  • B 5'-CAATGARGARGCTGCAGAATGGG-3 '(HIV-1, gag probe) (SEQ ID NO: 19)
  • C 5'-CACCCAGGCTCTACCTGCTA-3 '(HIV-2, U3 probe)
  • D 5'-TAGCAGGTAGAGCCTGGGTG-3 '(HIV-2, U3 probe)
  • E 5'-ACACAGCACTCGTCTTCAACTCC-3 '(T.
  • pallidum probe (SEQ ID NO: 22) F, 5'-GGAGTTGAAGACGAGTGCTGTGT-3 '(T. pallidum probe) (SEQ ID NO: 23) G, 5'-TACGACGCTACTGTCAGTGTC-3 '(probe for positive control) (SEQ ID NO: 24) H, 5'-GACACTGACAGTAGCGTCGTA-3 '(probe for positive control) (SEQ ID NO: 25)
  • PCR amplification PCR solution with the positive control primer set added was prepared as follows.
  • Solution A was added to 100 copies of HIV-1 RNA (1.0 ⁇ l), and solution B was mixed on a thermal cycler.
  • PCR profile was performed as follows. After performing heat denaturation at 94 ° C. for 2 minutes, the cycle reaction was performed at a heat denaturation of 97 ° C. for 5 seconds; annealing at 56 ° C. for 10 seconds; 5 seconds; annealing 56 ° C., 10 seconds; extension reaction 72 ° C., 40 seconds in a cycle of 15 seconds. After completion of the cycle reaction, the temperature was kept at 4 ° C.
  • PCR product 5.0 ⁇ l 0.5N NaOH 1.0 ⁇ l
  • CH 3 COOH was added to neutralize, and conditions were set to rapidly form a double strand.
  • a dye-labeled latex bead bound to avidin and a chromatographic developing solution were also added in the following amounts.
  • Dye-labeled latex beads 2.0 ⁇ l 100 mM NaCl buffer (chromatographic developing solution) 10.0 ⁇ l
  • the strip was immersed in this solution. Developed at room temperature for 10 minutes. After 10 minutes, 10.0 ⁇ l of 100 mM NaCl buffer was newly added to wash the strip. Depending on the position of the strip band, it was confirmed that the desired product was produced.
  • FIGS. FIG. 4 shows the results of RT-PCR performed without adding a template (HIV-1 RNA).
  • a signal was detected only at the position of the positive control probe G, and it was confirmed that a positive control primer dimer was formed. Thereby, it can be determined that the reason why the signal of the target nucleic acid is not output is not due to the failure of PCR, but that the target nucleic acid is not contained in the sample.
  • the positive control primer dimer hybridizes to the positive control probe H that is complementary to the positive control probe G. In this experiment, details are unknown, but only the side modified with biotin is denatured. It is considered that the condition is likely to be a single strand due to neutralization, and it is considered that the signal was detected only in the probe G.
  • FIG. 5 shows the results of RT-PCR with 100 copies of template (HIV-1 RNA) added. Signals could be detected at the positions of gag probes A and B. Further, a signal was also detected at the position of the positive control probe G, confirming that a positive control primer dimer was formed, and it was shown that the target nucleic acid could be detected even when a positive control primer set was added.
  • the primer dimer for positive control when the signal of the target nucleic acid cannot be detected, it can be determined whether PCR failure is caused or the target nucleic acid is not contained in the sample. Inhibition of amplification of the target nucleic acid by the primer for use was limited, and it was confirmed that the target nucleic acid could be detected well. All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
  • the present invention can be used for genetic testing in fields such as medicine and food.
  • ⁇ SEQ ID NO: 21> The arrangement of probes (HIV-2, U3 probe) applied to the D position of the strip is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 22> The sequence of the probe (T. pallidum genome) applied to the E position of the strip is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 23> The sequence of the probe (T. pallidum genome) applied to the F position of the strip is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 24> The arrangement of the probe (positive control probe) applied to the G position of the strip is shown.
  • ⁇ SEQ ID NO: 25> The arrangement of the probe (positive control probe) applied to the H position of the strip is shown.

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Abstract

目的のPCR産物の収量に影響を及ぼしにくい、PCRのポジティブコントロールを提供する。１４ｍｅｒ～３５ｍｅｒの第一の核酸と、前記第一の核酸の３'末端と相補的な配列を３'末端に有する１４ｍｅｒ～３５ｍｅｒの第二の核酸と、を含むＰＣＲの成否判定剤。ＰＣＲの成否判定方法及び核酸検出キットも提供される。

Description

ＰＣＲ成否判定法
　本発明は、PCR成否判定法に関する。
　PCRにおいては、目的のPCR産物が得られなかったときに、PCR自体が失敗したのか、試料中に鋳型となる標的核酸が存在しなかったのか見極めるため、ポジティブコントロールを加えてPCRの成否を判断することが一般的である（非特許文献1：フナコシ社ウェブサイト：PCR用ポジティブコントロール「PCRChecker」紹介ページ）。ポジティブコントロールとしては、標的核酸とは配列が異なる鋳型と、この鋳型を増幅するプライマーセットが広く用いられている。しかし、PCR系に複数の鋳型とプライマーセットが導入されることにより、意図しない増幅反応が生じたり、目的のPCR産物の収量が減少したりすることがある。そのため、標的核酸の増幅反応への影響が小さいPCRの成否判定方法が求められている。
　一方、PCRを行うと、プライマーダイマーと呼ばれる副産物が生じることが知られている（特許文献1：WO2015/012363 A1）。ターゲットのPCR増幅反応に影響し得るため、一般に、プライマーダイマーは少なければ少ないほどよいとされている。また、産生されるプライマーダイマーの量は、プライマーの配列や目的のPCR産物の量等に影響されるため、安定しないことが知られている。
フナコシ社ウェブサイト：PCR用ポジティブコントロール「PCRChecker」紹介ページ（掲載日：2015年8月5日）：http://www.funakoshi.co.jp/catalogs/%E8%A9%A6%E8%96%AC/%E9%81%BA%E4%BC%9D%E5%AD%90%E5%B7%A5%E5%AD%A6/PCR%E3%83%BB%E3%82%B7%E3%83%BC%E3%82%AF%E3%82%A8%E3%83%B3%E3%82%B7%E3%83%B3%E3%82%B0/PCR%E7%94%A8%E8%A3%BD%E5%93%81/63022
WO2015/012363 A1
　本発明は、標的核酸の増幅反応への影響が少ないPCRの成否判定法を提供することを目的とする。
　本発明者は、PCRの反応系に、3’末端に互いに相補的な配列を有する2本の短い核酸を加えておくことにより、プライマーダイマー様の二本鎖が安定的に産生され、これをPCRのポジティブコントロールとして使用できることを見出した。上記3’末端に互いに相補的な配列を有する2本の核酸のうちの1本として、標的核酸用のプライマーのうちの1本と同じ配列の核酸を用いてもよい。この方法によれば、従来のポジティブコントロールのように余分な鋳型核酸を加える必要がないため、標的核酸の増幅反応への影響を少なくすることができる。
　以下、3’末端に互いに相補的な配列を有する2本の核酸をそれぞれ「ポジコン用フォワードプライマー」「ポジコン用リバースプライマー」「ポジコン用プライマー（フォワードとリバースを区別しない場合）」と呼び、両者を合わせて「ポジコン用プライマーセット」と呼ぶことがある。また、ポジコン用プライマーセットのPCRによって得られる二本鎖を「ポジコン用プライマーダイマー」と呼ぶことがある。
　本発明の要旨は以下の通りである。
（1）14mer～35merの第一の核酸と、
　前記第一の核酸の3’末端と相補的な配列を3’末端に有する14mer～35merの第二の核酸と、
を含むPCRの成否判定剤。
（2）前記相補的な配列は、4塩基から12塩基である、上記（1）に記載のPCRの成否判定剤。
（3）前記第一の核酸及び第二の核酸のいずれか一方は、標的核酸を増幅するためのプライマーセットの一方である、上記（1）又は（2）に記載のPCRの成否判定剤。
（4）前記第一の核酸及び第二の核酸のいずれか一方は、
　前記標的核酸を増幅するためのプライマーのいずれか一方の少なくとも一部の配列について、5’側と3’側を反転させた配列を含む、上記（1）から（3）のいずれか一項に記載のPCRの成否判定剤。
（5）前記第一の核酸及び第二の核酸のいずれか一方は、
　前記標的核酸を増幅するためのプライマーのいずれか一方の少なくとも一部の配列の相補的について、5’側と3’側を反転させた配列を含む、上記（1）から（3）のいずれか一項に記載のPCRの成否判定剤。
（6）前記第一の核酸及び第二の核酸は、いずれも標的核酸を増幅するためのプライマーセットとは異なる配列を有する、上記（1）又は（2）に記載のPCRの成否判定剤。
（7）試料に、上記（1）から（6）のいずれか一項に記載のPCRの成否判定剤を加えてPCRを行う工程と、前記第一の核酸及び第二の核酸によるPCR増幅産物を検出する工程と、
を含むPCRの成否判定方法。
（8）上記(1)から(6)のいずれか一項に記載のPCRの成否判定剤と、
　前記標的核酸を増幅するためのプライマーと、を含む核酸検出キット。
（9）さらに、標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の5’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の3’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するが、前記ターゲット配列に相補的な配列を含まないプライマーを含む、上記（8）に記載の核酸検出キット。
（10）前記第一の核酸又は第二の核酸によるPCR産物の少なくとも一部とハイブリダイズ可能な配列を有する核酸をプローブとして含む、上記（8）又は（9）に記載の核酸検出キット。
（11）さらに、前記標的核酸のPCR産物の少なくとも一部とハイブリダイズ可能な配列を有する核酸をプローブとして含む、上記（10）に記載の核酸検出キット。
（12）前記プローブは、担体に保持されている、上記（10）又は（11）に記載の核酸検出キット。
（13）前記担体は、セルロース繊維で構成された長方形のストリップであり、前記プローブは、前記ストリップの長手方向と垂直な方向に直線状に固定されている、上記（12）に記載の核酸検出キット。
　本発明により、標的核酸の増幅反応に影響を与えにくい、PCRの成否判定剤及び成否判定方法が提供される。
標的核酸用のリバースプライマーと、リバースプライマーの3'末端に相補的な配列を6、8又は10塩基付与したフォワードプライマーとをポジコン用プライマーセットとして用い、PCRによってポジコン用プライマーダイマーを作製した結果（電気泳動像）を示す。 リバースプライマーと、コンバースプライマー又はコントラポジティブ・コンバースプライマーとを用い、PCRによってポジコン用プライマーダイマーを作製した結果（電気泳動像）を示す。 フォワードプライマーとリバースプライマーに加えて、コンバースプライマー又はコントラポジティブ・コンバースプライマーを添加して、標的核酸（HIV-1のRNA）の増幅に対する阻害効果を観察した結果（電気泳動像）を示す。 フォワードプライマー及びリバースプライマーとは関係なく配列を設計したポジコン用プライマーセットを添加して、標的核酸（HIV-1のRNA）を加えずにPCRを行い、PCR産物をクロマトグラフィーで検出した結果を示す。 図４と同じポジコン用プライマーセットを添加して、標的核酸（HIV-1のRNA）を加えてPCRを行い、PCR産物をクロマトグラフィーで検出した結果を示す。 標的核酸の配列に対する標的核酸用プライマーセット（フォワードプライマー、ビオチン標識リバースプライマー、及びジャンプトプライマー）の結合位置と、プローブの結合位置を示す。 ジャンプトプライマーを含む標的核酸用プライマーセットでPCRを行うことにより生成する二本鎖DNAを説明する図である。F1はフォワードプライマー、F2はジャンプトプライマー、R1はリバースプライマーである。PCRが終わると、長い二本鎖DNA(a)と短い二本鎖DNA（b）のほかに、ループ状の一本鎖部分を持つ二本鎖DNA（cとd）が生成する。a、b、dはDNA伸長により合成され、a、b、c、d はPCR産物を一旦一本鎖に変性させ、再度ハイブリダイゼーションさせることにより生成する。 ポジコン用プライマーダイマーが形成される原理についての説明図である。
　以下、本発明の実施の形態についてより詳細に説明する。本発明は、この形態に限定されることはなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、変更、改変などが可能である。
＜PCR成否判定剤＞
　本実施形態のPCR成否判定剤は、14mer～35merの第一の核酸及び第二の核酸を含む。第一の核酸の3'末端と、第二の核酸の3'末端は互いに相補的な配列有する。第一の核酸及び第二の核酸を加えてPCRを行うと、二本鎖が安定的に産生されるので、これをポジティブコントロールとして、PCRの成否を判定することができる。
　PCRは、増幅を行いたい核酸領域（標的核酸）を挟むようにペアで設計したプライマー（フォワードプライマーとリバースプライマー）を用いて、DNAポリメラーゼによって、標的核酸の相補鎖を合成する反応を繰り返し行うことにより、標的核酸を増幅する反応である。PCRでは、熱変性（鋳型となる二本鎖DNAを熱で一本鎖DNAに解離させる）、アニーリング（一本鎖DNAにプライマーを結合させる。フォワードプライマーは鋳型アンチセンス鎖に、リバースプライマーは鋳型センス鎖に結合する）、伸長反応（DNAポリメラーゼによって、プライマーから元のDNAの相補鎖を合成する）の3ステップが繰り返され、標的核酸が増幅される。
　図８を参照して本実施形態のPCR成否判定剤の原理を説明する。第一の核酸９０と第二の核酸９４は、それぞれその3’末端に互いに相補的な部分９２、９６を有する。第一の核酸９０及び第二の核酸９４を含む反応系でPCR増幅を行うと、第一の核酸９０及び第二の核酸９４がプライマーとして機能して互いに相手を鋳型とする伸長反応が起こり、領域１０２及び１０４が合成され、プライマーダイマー様の二本鎖１００が形成される。
　本実施形態のPCR成否判定剤によれば、従来のポジティブコントロールと異なり、余分な鋳型を反応系に加える必要がないので、標的核酸の増幅に与える影響を低くすることができる。
　以下、第一の核酸９０及び第二の核酸９４を「ポジコン用プライマー」（フォワードとリバースを区別する場合には「ポジコン用フォワードプライマー」、「ポジコン用リバースプライマー」）と呼び、両者を合わせて「ポジコン用プライマーセット」と呼ぶことがある。また、ポジコン用プライマーセットのPCRによって得られるプライマーダイマー様の二本鎖１００を「ポジコン用プライマーダイマー」と呼ぶことがある。
　また、単に「フォワードプライマー」又は「リバースプライマー」という場合は標的核酸増幅用のプライマーを意味するが、意味を明確にするために「標的核酸用フォワードプライマー」又は「標的核酸用リバースプライマー」との用語を使うこともある。
　本実施形態においてPCRのポジティブコントロールとは、PCRが正常に起こったときに再現性良く産生される物質を意味する。したがって、標的核酸は検出されないがポジティブコントロールは検出された場合、PCRは正常に起こったと考えられ、試料中の標的核酸量が検出限界以下だったと解することができる。一方、標的核酸もポジティブコントロールも検出されなかった場合は、PCR自体が正常に起こらなかったものと考えられるので、標的核酸が検出されなかったからといって、試料に標的核酸が含まれていなかったと判断することはできない。
　本実施形態の第一の核酸と第二の核酸は、3'末端に互いに相補的な配列を有し、PCRによってプライマーダイマー様の二本鎖を形成する配列であって、標的核酸の増幅反応に影響を及ぼしにくい配列を有するものが選択される。
　第一の核酸と第二の核酸の長さは、PCRに通常用いられるプライマーと同程度の長さとすることができ、例えば、14mer～35merである。20～30merとしてもよい。
　互いに相補的な配列は、第一の核酸及び第二の核酸の長さ等に応じて適宜決定されるが、例えば、3塩基～12塩基、又は4塩基～10塩基とすることができる。
　第一の核酸及び第二の核酸の一方の配列を、標的核酸用フォワードプライマー又は標的核酸用リバースプライマーと同じ配列としてもよい。例えば、第一の核酸の配列を標的核酸用フォワードプライマーと同じ配列にする場合、第二の核酸の配列を、標的核酸用リバースプライマーの3’末端に、標的核酸用フォワードプライマーの3’末端と相補的な配列を付加したものとしてもよい。相補的な配列は、標的核酸用リバースプライマーの全長の配列に付加してもよく、標的核酸用リバースプライマーの3’末端を数塩基除去した配列に付加してもよい。また、第二の核酸の5’末端の配列は標的核酸用リバースプライマーとは関係のない配列とし、3’末端の配列は標的核酸用フォワードプライマーの3’末端と相補的な配列としてもよい。
　第一の核酸の配列を標的核酸用リバースプライマーと同じ配列にする場合も、同様に第二の核酸の配列を設計することができる。
　第一の核酸及び／又は第二の核酸は、標的核酸の増幅反応に影響を与えないよう、標的核酸用プライマーとできるだけ競合しない配列にしてもよい。
　標的核酸用プライマーとできるだけ競合しない配列の一例として、標的核酸用プライマーの少なくとも一部について、5’側と3’側を反転させた配列が挙げられる。例えば、標的核酸用フォワードプライマーの配列が以下の配列（１）を含む場合、
　　5'-CAAGCAGCHATGCAAAT-3'（配列番号：１）・・・（１）
　配列（１）の5’側と3’側を反転させることによって得られる以下の配列（２）を含む核酸を第一又は第二の核酸として用いることができる。
　　5'-TAAACGTAHCGACGAAC-3'（配列番号：２）・・・（２）
　以下、このように標的核酸用プライマーの一部の配列の5’側と3’側を反転させた配列を「コンバース配列」といい、コンバース配列を含むポジコン用プライマーを「コンバースプライマー」と呼ぶ。
　コンバースプライマーは、標的核酸用プライマーと競合する可能性が低い一方、標的核酸用プライマーと塩基の組成がまったく同じなので、標的核酸の増幅効率とポジコン用プライマーダイマーの産生効率がほぼ同じになるという利点がある。
　コンバースプライマーは、コンバース配列の一端又は両端にさらに塩基を付加したものでもよい。例えば、コンバース配列の3’末端に、もう一方のポジコン用プライマーの3’末端と相補的な配列を追加することができる。
　コンバース配列は、例えば14～35塩基、20～30塩基、23～27塩基とすることができる。コンバース配列の一端又は両端に塩基を付加してコンバースプライマーとする場合、コンバースプライマー全長が14～35塩基であるとよい。
　標的核酸用プライマーとできるだけ競合しない配列の別の例として、標的核酸用プライマーの少なくとも一部の相補鎖について、5’側と3’側を反転させた配列が挙げられる。例えば、標的核酸用プライマーの一方の配列が、以下の配列（３）を含む場合、
　　5'-CAAGCAGCHATGCAAAT-3'（配列番号：３）・・・（３）
　配列（３）の相補鎖は以下の配列（４）となるから、
　　5'-ATTTGCATDGCTGCTTG-3'（配列番号：４）・・・（４）
　配列（４）の5’側と3’側を反転させることによって得られる以下の配列（５）を含む核酸を第一又は第二の核酸として用いることができる。
　　5'-GTTCGTCGDTACGTTTA-3'（配列番号：５）・・・（５）
　以下、このように標的核酸用プライマーの一部の相補鎖の5’側と3’側を反転させた配列を「コントラポジティブ・コンバース配列」といい、コントラポジティブ・コンバース配列を含むポジコン用プライマーを「コントラポジティブ・コンバースプライマー」と呼ぶ。
　コントラポジティブ・コンバースプライマーは、標的核酸用プライマーと競合する可能性がコンバースプライマーよりさらに低く、標的核酸用プライマーとTm値が同じなので、標的核酸の増幅効率とポジコン用プライマーダイマーの産生効率がほぼ同じになるという利点がある。
　コントラポジティブ・コンバースプライマーは、コントラポジティブ・コンバース配列の一端又は両端にさらに塩基を付加したものでもよい。例えば、コントラポジティブ・コンバース配列の3’末端に、もう一方のポジコン用プライマーの3’末端と相補的な配列を追加することができる。
　コントラポジティブ・コンバース配列は、例えば14～35塩基、20～30塩基、23～27塩基とすることができる。コントラポジティブ・コンバース配列の一端又は両端に塩基を付加してコントラポジティブ・コンバースプライマーとする場合、コントラポジティブ・コンバースプライマー全長が14～35塩基であるとよい
　第一の核酸及び第二の核酸と、標的核酸用プライマーの濃度比は、当業者が適宜決定することができる。例えば、第一の核酸を、標的核酸用フォワードプライマーのコンバースプライマー又はコントラポジティブ・コンバースプライマーとし、第二の核酸を、標的核酸用リバースプライマーとする場合、第一の核酸の濃度は、標的核酸用プライマーの濃度の1/1～1/64であるとよく、好ましくは、1/4～1/32であり、より好ましくは、1/8～1/32である。
　第一の核酸及び／又は第二の核酸には、検出可能な標識物質を結合させてもよい。これにより、標識物質を検出することによってポジコン用プライマーダイマーを検出することができる。標識物質は、それ自体が検出可能なシグナルを発する標識物質であっても、他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質であってもよい。それ自体が検出可能なシグナルを発する標識物資としては、蛍光標識物質（例えば、FITC、ローダミン等。）が挙げられる。他の成分と組み合わせてシグナルを発する標識物質としては、ビオチン、ジゴキシゲニンなどのハプテン、アルカリホスファターゼ、ペルオキシターゼなどの酵素等が挙げられる。プライマーに標識物質を結合させる手法は、当業者が適宜公知の手段から選択することができる。
　例えば、第一の核酸及び／又は第二の核酸にビオチンを結合させてPCR増幅を行い、PCR産物に結合しているビオチンにアビジンを結合させた着色粒子を反応させることによって、PCR産物を着色することができる。
　本実施形態において、「標的核酸」は、RNAであってもDNAであってもよく、二本鎖と一本鎖のいずれであってもよい。一本鎖DNA又は一本鎖RNAの場合、センス鎖又はアンチセンス鎖のどちらであってもよい。本明細書において用語「標的核酸」は、PCR増幅の対象となる配列を有する核酸をいい、かかる配列を有する限り、試料に最初から含まれていた核酸（鋳型核酸）を指す場合もあり、PCRの増幅産物を指す場合もあり、その双方をまとめて指す場合もある。標的核酸がDNAである場合、ゲノムDNA、cDNA、合成DNA、ミトコンドリアDNA，葉緑体DNAなどであるとよく、RNAから逆転写されたcDNAであってもよい。
　標的核酸の長さは、PCRで増幅可能な長さであればよく、PCRで増幅可能な長さは、数塩基から数十キロ塩基と言われているが、1000塩基以下であるとよく、200～260塩基が好ましい。
　標的核酸を含む試料としては、全血、血清、血漿、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織、細胞、喀痰、鼻汁のような生体由来試料、植物抽出物・粉砕物、食品、飲料水、生物学的製剤、土壌、湖沼や河川などの水、排水、下水などを例示することができるが、これらに限定されるわけではない。
　標的核酸用フォワードプライマーと標的核酸用リバースプライマーは、公知の方法又はそれに準ずる方法で設計することができる。標的核酸用プライマーの長さは、14-35merであるとよく、18～27merが好ましい。標的核酸用プライマーセットは、ポジコン用プライマーダイマー以外のプライマーダイマーが形成されないよう、3’末端に相互に相補的な配列を有しない方がよい。また、標的核酸用フォワードプライマー同士、又は標的核酸用リバースプライマー同士の3’末端も、相互に相補的な配列とならないように設計するとよい。標的核酸用プライマーセットは、その他、ミスマッチが起こらないように3’末端のTは避ける；プライマー内で二次構造をとらないように設計する；プライマーのGC含量は40～60％くらいとする；プライマーを構成する塩基（G, A, T, C）をランダムに分布させ、部分的にGCリッチ、ATリッチにならないようにする；プライマーのTm値は、55～60℃くらいになるようにし、ペアとなるプライマーは互いにTm値の近いものを選ぶ、などの公知の規則にしたがって設計することができる。
　標的核酸用フォワードプライマーと標的核酸用リバースプライマーにも、第一の核酸及び第二の核酸と同様に、検出可能な標識物質を結合させておいてもよい。標的核酸用プライマーと、第一又は第二の核酸とを、同じ手法で検出できる標識物質で標識することも好ましい。
＜PCR成否判定方法＞
　本実施形態のPCR成否判定方法は、試料に、標的核酸用プライマーセットと、上述したPCR成否判定剤とを加えてPCRを行う工程と、第一の核酸及び第二の核酸によるPCR産物、すなわちポジコン用プライマーダイマーを検出する工程と、を含む。
　第一の核酸及び第二の核酸によるPCR産物を検出する方法は特に限定されず、様々な方法を利用することができ、例えば、核酸クロマトグラフィー、マイクロアレイ、核酸ハイブリダイゼーション、電気泳動などが挙げられる。第一の核酸又は第二の核酸に標識物質が結合している場合には、標識物質を検出してもよい。
　PCR増幅後のポジコン用プライマーダイマーは二本鎖であるが、本発明者は、これを一旦一本鎖に変性させ、再度急速に二本鎖を形成する条件にすると、ポジコン用プライマーダイマーにも一本鎖部分が生じ、一本鎖プローブにハイブリダイズさせて検出できることを見出した。したがって、核酸クロマトグラフィーやマイクロアレイなどでポジコン用プライマーダイマーを捕捉し、標識物質を検出することにより、ポジコン用プライマーダイマーの存否を確認することができる。
　例えば、第一の核酸又は第二の核酸にビオチンを結合させてPCR増幅を行い、二本鎖となっているポジコン用プライマーダイマーに強アルカリを加えて一本鎖に変性させるとともに、ビオチンにアビジンを結合させた着色粒子を結合させて着色する。一方、ポジコン用プライマーダイマーの少なくとも一部に相補的な配列を有する一本鎖プローブを核酸クロマトグラフィー用ストリップに固定しておく。その後、弱酸による中和でポジコン用プライマーダイマーが急激に二本鎖を形成する条件とするとともに、核酸クロマトグラフィー用ストリップに展開させると、着色されたポジコン用プライマーダイマーが一本鎖プロー部に捕捉され、ストリップ上に着色が確認される。
　標的核酸の増幅産物の検出も、ポジコン用プライマーダイマーと同じ方法で行うことができる。
　標的核酸の増幅産物も核酸クロマトグラフィーやマイクロアレイなどの一本鎖プローブへのハイブリダイズで検出する場合、以下に説明するジャンプトプライマーを利用することで、再現性及び検出感度を上げることができる。
　ジャンプトプライマーは、標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の5’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の3’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するプライマーであって、ターゲット配列に相補的な配列を含まない（図6）。ジャンプトプライマーの５’末端とフォワードプライマーの５’末端は一致していることが望ましい。図6では、ジャンプトプライマーがフォワードプライマーと重複する配列を有する場合を記載したが、ジャンプトプライマーはリバースプライマーと重複する配列を有してもよい。
　ターゲット配列の長さは、標的核酸の長さの3分の1程度であるとよく、45～90塩基が好ましい。
　ジャンプトプライマーの長さは、30mer～70merであるとよく、33～51merが好ましい。
　ジャンプトプライマーにおけるターゲット配列の5’末端に隣接する上流領域に相補的な配列の長さは、15mer～35merであるとよく、18～27merが好ましい。
　ジャンプトプライマーにおけるターゲット配列の3’末端に隣接する下流領域に相補的な配列の長さは、15mer～35merであるとよく、15～24merが好ましい。
　PCRにおいて、ジャンプトプライマーとフォワードプライマー（あるいはリバースプライマー）の濃度比は、1/4～1/32であるとよく、1/4～1/16が好ましい。
　その他、PCR増幅においては、DNAポリメラーゼ、バッファー、Mgイオン、dNTP、逆転写酵素、PCRエンハンサーなどを用いるとよい。
　PCRにおける、熱変性（鋳型となる二本鎖DNAを熱で一本鎖DNAに解離させる）、アニーリング（一本鎖DNAにプライマーを結合させる）、伸長反応（DNAポリメラーゼによって、プライマーから元のDNAの相補鎖を合成する）の3ステップの温度と時間並びにサイクル数は、適宜調整するとよい。
　ジャンプトプライマーを用いてPCR増幅を行った場合、PCR産物中の標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）又はそれに相補的な配列を一本鎖プローブとハイブリダイズさせて検出するとよい。一本鎖プローブは、ターゲット配列又はそれに相補的な配列の一部又は全部に相補的な配列を有するとよい。
　プローブの長さは、14～30merであるとよい。
　ジャンプトプライマーを用いた場合、PCRにより、センス鎖とアンチセンス鎖からなる標的核酸（二本鎖）が増幅される他、二本鎖DNAの一部（ターゲット配列又はそれに相補的な配列）が一本鎖になったDNAが形成され、この一本鎖部分が一本鎖プローブとハイブリダイズして、検出されると考えられる（図7の「ループ状の一本鎖部分を持つ二本鎖ｃ．及びｄ．）。
　検出感度を高めるには、ＰＣＲ増幅産物の二本鎖ＤＮＡを一旦一本鎖に変性させ、その後急速に二本鎖を形成させるとよい。この工程により、図１の「ループ状の一本鎖部分を持つ二本鎖」がより多く形成されると考えられる。二本鎖ＤＮＡを一旦一本鎖に変性させ、その後急速に二本鎖を形成させる方法としては、例えば、PCR産物を強アルカリ（例えば、NaOH）で処理した後、弱酸（例えば、CH3COOH）で中和する方法が挙げられる。あるいはまた、PCR産物を熱変性させてから（例えば、94℃で2分間加熱）PCR産物を収容する容器を氷水に入れて急冷してもよい（例えば、94℃から10℃/secくらいの速度で0℃～4℃の範囲に急冷する）。強アルカリや熱によりPCR産物の二本鎖DNAを一本鎖に変性し、アルカリ性から中性へのpH変化や急冷により、一本鎖を再び急速に二本鎖に戻すと、検出感度が上昇しうる。
＜核酸検出キット＞
　本実施態様の核酸の増幅又は検出キットは、第一の核酸及び第二の核酸を含むPCRの成否判定剤と、標的核酸用プライマーとを含む。
　例えば、標的核酸用プライマーのリバースプライマーを、第一の核酸又は第二の核酸として利用する場合には、核酸の増幅又は検出キットに含まれるプライマーは、標的核酸用フォワードプライマー、第一の核酸、及び第二の核酸の3種類となる。また、標的核酸用プライマーを、第一の核酸又は第二の核酸として利用しない場合には、検出キットに含まれるプライマーは、標的核酸用のフォワードプライマー及びリバースプライマー、第一の核酸、及び第二の核酸の4種類となる。
　標的核酸の種類が複数の場合は、それに応じて標的核酸用プライマーセットを増やしてもよい。また、上述したジャンプトプライマーを加えてもよい。
　核酸の増幅又は検出キットは、増幅された標的核酸と、ポジコン用プライマーダイマーを検出するためのプローブや、プローブを固定した担体を含んでいてもよい。担体の材質としては、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリエーテルスルフォン、シリカゲル、アガロース、デキストリン、ゼラチンなどを例示することができ、担体の形状は、例えばプレート状やストリップ状が挙げられる。
　プローブを固定した担体としては、例えば、標的核酸及びポジコン用プライマーダイマーにハイブリダイズ可能な一本鎖プローブを固定した核酸クロマトグラフィー用のストリップが挙げられる。核酸クロマトグラフィー用のストリップは、例えば、セルロース繊維で形成され、標的核酸に対するプローブと、ポジコン用プライマーダイマーに対するプローブを、長手方向と垂直な方向に直線状に予め塗布しておく。PCR産物をストリップに滴下するか、PCR産物にストリップを浸漬することによりPCR産物が長手方向に展開され、標的核酸又はポジコン用プライマーダイマーが含まれていれば、それぞれのプローブとハイブリダイズする。
　本明細書において、「ハイブリダイズが可能である」とは、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることを意味する。ストリンジェントな条件とは、例えば、5%Denhardt's Solution（0.1%Ficoll（Pharmacia社）、0.1%ポリビニルピロリドン、0.1%ウシ血清アルブミンを含む）と、0.5%SDSと、100μg/mlサケ精子DNAを含む6×SSC溶液（1×SSCは0.15M NaCl、15mM クエン酸ナトリウム）中において65℃で洗浄する条件をいう。ストリンジェンシーは塩濃度（イオン強度）、温度等によって制御することができ、ストリンジェンシーがより高い条件、即ち塩濃度がより低く、温度がより高い条件では、相同性が十分に高いDNAのみがハイブリダイズする。
　本実施態様のキットは、核酸クロマトグラフィー用のストリップに代えて、標的核酸及びポジコン用プライマーダイマーにハイブリダイズ可能な一本鎖プローブを固定したマイクロアレイを含んでいてもよい。
　本実施態様のキットは、さらに、ポジコン用プライマーダイマー及び／又は標的核酸を検出するための標識試薬を含んでもよい。例えば、第一の核酸、第二の核酸、フォワードプライマー、及び／又はリバースプライマーにビオチンが結合しており、標識試薬としてアビジンを結合させた着色粒子を含む。
　本実施形態のキットは、さらに、DNAポリメラーゼ、dNTP、PCRバッファー、Mgイオン、核酸クロマトグラフィー展開バッファー（核酸クロマトグラフィーの場合）、マイクロアレイ用バッファー（マイクロアレイ分析の場合）、核酸ハイブリダイゼーション用バッファー、取扱説明書などを含んでもよい。

　以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例1〕アガロースゲル電気泳動による標的核酸の検出とPCR成否判定
1.1　標的核酸用プライマーの設計と配列
　実施例1では、HIV-1（8E5細胞由来）のRNAを標的核酸とするPCR増幅においてポジコン用プライマーダイマーによるPCR成否判定ができるか、アガロースゲル電気泳動を用いて確認した。
　標的核酸をPCR増幅するためのフォワードプライマーとリバースプライマーは以下の配列とした。リバースプライマーには標識物質として5’末端にビオチンを結合させた。[BioOn]はビオチンが結合していることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
1.2　ポジコン用プライマーセットの設計と配列
　リバースプライマーを、ポジコン用リバースプライマーとしても使用した。ポジコン用フォワードプライマーは、フォワードプライマーの3’末端を6塩基、8塩基、又は10塩基除去し、リバースプライマーの3’末端と相補的な配列を6塩基、8塩基、又は10塩基（下線部）それぞれ付与した配列とした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
1.3　ポジコン用プライマーセットのPCR増幅
　鋳型となるDNA又はRNAを加えずRT-PCRした。
　PCR液は以下のように作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
　A液とB液をサーマルサイクラー上で混合した。
　PCR profileは以下のとおりに行った。
　熱変性94℃、2分行った後、サイクル反応を熱変性97℃、5秒；アニーリング56℃、10秒；伸長反応72℃、15秒のサイクルで5回行った後、熱変性94℃、5秒；アニーリング56℃、10秒；伸長反応72℃、15秒のサイクルで30回行った。サイクル反応終了後4℃に保持した。
1.4　ポジコン用プライマーダイマーによるPCR成否判定
電気泳動
アガロースゲル：2% GenePure LE agarose、 0.05% ethidium bromide、 TAE buffer
緩衝液： 0.05% ethidium bromide、TAE buffer
泳動槽： BIO CRAFT、BE-548
泳動条件：160V、30分泳動
分子量マーカー：株式会社バイオ・リジェネレーションズ、BRG-100-02、100bp DNA Ladder
　PCR産物のアガロースゲル電気泳動像を図１に示す。
　図１中、レーン1～8とレーンMは、それぞれ以下のプライマーを含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　図１に示されるとおり、レーン1～6ではバンドが検出され、レーン7及び8ではバンドが検出されなかった。このことから、3’末端に相互に相補的な配列を有する二本の核酸をPCR増幅すると、プライマーダイマー様の二本鎖が安定的に増幅されることが確認された。
1.5　フォワードプライマーに対するコンバースプライマーとコントラポジティブ・コンバースプライマーの設計と検討
　本実験でもリバースプライマーを、ポジコン用リバースプライマーとしても使用した。一方、ポジコン用フォワードプライマーとして、フォワードプライマーのコンバースプライマーとコントラポジティブ・コンバースプライマーを以下のように設計した。それぞれ下線部は、リバースプライマーの3’末端と相補的な配列であり、下線部以外は、フォワードプライマーの配列に基づいて設計したコンバース配列又はコントラポジティブ・コンバース配列である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　フォワードプライマーとリバースプライマーに加えて、様々な濃度のコンバースプライマー又はコントラポジティブ・コンバースプライマーを添加して、鋳型となるDNA又はRNAは加えずにRT-PCRを行った。
　PCR液は下のように作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　A液と、B液をサーマルサイクラー上で混合した。
　PCR profileは以下のとおりに行った。
　熱変性94℃、2分行った後、サイクル反応を熱変性97℃、5秒；アニーリング56℃、10秒；伸長反応72℃、15秒のサイクルで5回行った後、熱変性94℃、5秒；アニーリング56℃、10秒；伸長反応72℃、15秒のサイクルで30回行った。サイクル反応終了後4℃に保持した。
　結果を図２に示す。図２中、各レーンはそれぞれ以下のプライマーを含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　図２に示されるとおり、レーン1～4ではバンドが検出され、レーン5及び6ではバンドが検出されなかった。このことから、コンバースプライマー又はコントラポジティブプライマーを用いても、3’末端にリバースプライマーの3’末端と相補的な配列を有すると、プライマーダイマー様の二本鎖が安定的に増幅されることが確認された。
1.6　鋳型を加えたPCR増幅
　フォワードプライマーとリバースプライマーに加えて、様々な濃度のコンバースプライマー又はコントラポジティブ・コンバースプライマーを添加し、鋳型として100コピーのHIV-1のRNAを加えてRT-PCRを行った。
　PCR液は下のように作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
　A液を100コピーのHIV-1のRNA（1.0μl）に加えた後、B液をサーマルサイクラー上で混合した。
　PCR profileは以下のとおりに行った。
　熱変性94℃、2分行った後、サイクル反応を熱変性97℃、5秒；アニーリング56℃、10秒；伸長反応72℃、15秒のサイクルで5回行った後、熱変性94℃、5秒；アニーリング56℃、10秒；伸長反応72℃、15秒のサイクルで30回行った。サイクル反応終了後4℃で保温した。
　結果を図３に示す。
　　結果を図３に示す。図３中、各レーンはそれぞれ以下のプライマーを含む。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　レーン1～10では、コンバースプライマーとリバースプライマーによって形成されたポジコン用プライマーダイマーと考えられるバンドが、コンバースプライマーの濃度依存的に検出された。レーン7～10では、ポジコン用プライマーダイマーと考えられるバンドより上の位置に、標的核酸の増幅産物であると考えられるバンドも検出された。
　レーン11～20では、コントラポジティブ・コンバースプライマーとリバースプライマーによって形成されたポジコン用プライマーダイマーと考えられるバンドが、コントラポジティブ・コンバースプライマーの濃度依存的に検出された。レーン17～20では、ポジコン用プライマーダイマーと考えられるバンドより上の位置に、標的核酸の増幅産物であると考えられるバンドも検出された。
　以上の結果から、ポジコン用プライマーダイマーは濃度依存的に安定して産生される一方、標的核酸の増幅はポジコン用プライマーダイマーの産生によりある程度阻害されるものの、この阻害も濃度依存的であることが確認された。したがって、コンバースプライマー又はコントラポジティブ・コンバースプライマーの濃度を適切に選択することにより、標的核酸の検出と同時に、ポジコン用プライマーによるPCR成否判定ができることが示された。
〔実施例2〕核酸クロマトグラフィーによる標的核酸の検出とPCR成否判定
2.1　標的核酸用プライマーの設計と配列
　実施例2では、HIV-1のRNAを標的核酸とするPCR増幅においてポジコン用プライマーダイマーによるPCR成否判定ができるか、核酸クロマトグラフィーを用いて確認した。
　標的核酸の増幅用のフォワードプライマーとリバースプライマーには、実施例1と同じgagM-1FBとgagM-3RB-Bioを用いた。さらに、ジャンプトプライマーとして以下のプライマーを加えて、標的核酸の増幅産物に一本鎖部分が形成されるようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
2.2　ポジコン用プライマーセットの設計
　ポジコン用プライマーセットとして、以下の2つのDNAを使用した。いずれもフォワードプライマー及びリバースプライマーとは関係のない配列とし、3’末端の8塩基が互いに相補的になるように設計した。相補的な配列を下線で示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 　このポジコン用プライマーセットによれば、以下の相補的な二本鎖がハイブリダイズしたポジコン用プライマーダイマーが形成される。
5'-TACGACGCTACTGTCAGTGTCCTGTGACTGTCATCGCAGCAT-3'（配列番号１６）
5'-[BioOn]ATGCTGCGATGACAGTCACAGGACACTGACAGTAGCGTCGTA-3'（配列番号１７）
2.3　ストリップに塗布するプローブ
　核酸クロマトグラフィーのストリップに、標的核酸（HIV-1のgag領域）に相補的な配列のプローブ（HIV-1, gagプローブ）、HIV-2ゲノムのU3領域に相補的な配列（HIV-2, U3プローブ）、Treponema pallidumゲノムの一部に相補的な配列（T. pallidumプローブ）、及びポジコン用プライマーダイマーに相補的な配列（ポジコン用プローブ）のDNAを、プローブとして塗布した。AとB、CとD、EとF、GとHはそれぞれ相補的な配列を有する。
　ストリップに塗布したのは以下の配列である。ストリップ上の3本の赤線は、ストリップにプローブを塗布する際の位置決めに使用した目印である。
A,  5'-CCCATTCTGCAGCYTCYTCATTG-3'(HIV-1, gagプローブ)（配列番号１８）
B,  5'-CAATGARGARGCTGCAGAATGGG-3'(HIV-1, gagプローブ)（配列番号１９）
C,  5'-CACCCAGGCTCTACCTGCTA-3'(HIV-2, U3プローブ)（配列番号２０）
D,  5'-TAGCAGGTAGAGCCTGGGTG-3' (HIV-2, U3プローブ)（配列番号２１）
E,  5'-ACACAGCACTCGTCTTCAACTCC-3'(T. pallidumプローブ)（配列番号２２）
F,  5'-GGAGTTGAAGACGAGTGCTGTGT-3'(T. pallidumプローブ)（配列番号２３）
G,  5'-TACGACGCTACTGTCAGTGTC-3'(ポジコン用プローブ)（配列番号２４）
H,  5'-GACACTGACAGTAGCGTCGTA-3'(ポジコン用プローブ)（配列番号２５）
2.4　ポジコン用プライマーセットを加えたPCR増幅
　PCR液は以下のように作成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000012
　A液を100コピーのHIV-1のRNA（1.0μl）に加え、B液をサーマルサイクラー上で混合した。
　PCR profileは以下のとおりに行った。
　熱変性94℃、2分行った後、サイクル反応を熱変性97℃、5秒；アニーリング56℃、10秒；伸長反応72℃、15秒のサイクルで5回行った後、熱変性94℃、5秒；アニーリング56℃、10秒；伸長反応72℃、15秒のサイクルで40回行った。サイクル反応終了後4℃に保持した。
2.5　強アルカリによる変性を行ったPCR産物のクロマトグラフィー
　PCR産物に対して以下の量でNaOHを加え、二本鎖を一本鎖に変性させる処理を行った。
PCR産物　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0μl
0.5N NaOH　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.0μl
　よく撹拌した後、以下の分量のCH3COOHを加えて中和し、急速に二本鎖を形成する条件とした。また、アビジンが結合した色素標識ラテックスビーズとクロマトグラフィー展開液も以下の分量で加えた。
0.5N CH3COOH　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 1.0μl
色素標識ラテックスビーズ　　　　　　　　　　　　　 2.0μl
100mM NaCl buffer（クロマトグラフィー展開液）　　 10.0μl
　この溶液にストリップを浸漬させた。室温で10分間展開させた。10分経過後、100mM NaCl bufferを新たに10.0μl加え、ストリップを洗浄した。
　ストリップのバンドの位置によって、目的の産物が出来ているか確認した。
2.6　判定結果
　クロマトグラフィーの展開及び判定を37℃で行った。
　結果を図４及び５に示す。図４は、鋳型（HIV-1のRNA）を加えずにRT-PCRを行った結果である。
　ポジコン用プローブGの位置でのみシグナルが検出され、ポジコン用プライマーダイマーが形成されたことが確認できた。これにより、標的核酸のシグナルが出ない原因が、PCRの失敗によるものではなく、試料中に標的核酸が含まれていなかったことであると判断することができる。
　なお、ポジコン用プローブGと相補的なポジコン用プローブHにもポジコン用プライマーダイマーがハイブリダイズするが、この実験の場合は詳細は不明であるが、biotinで修飾された側だけが核酸の変性と中和によってsingle strandになりやすい条件となっていると考えられ、プローブGにのみシグナルが検出されたものと考えられる。
　図５は鋳型（HIV-1のRNA）100コピーを加えてRT-PCRを行った結果である。
　gagプローブA及びBの位置にシグナルを検出できた。また、ポジコン用プローブGの位置にもシグナルが検出され、ポジコン用プライマーダイマーが形成されたことが確認され、ポジコン用プライマーセットを加えても、標的核酸を検出できることが示された。
　以上の結果から、ポジコン用プライマーダイマーによれば、標的核酸のシグナルが検出できないときに、PCRの失敗が原因なのか試料中に標的核酸が含まれないことが原因なのか判定できること、また、ポジコン用プライマーによる標的核酸の増幅の阻害は限定的で、標的核酸も良好に検出できることが確認された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
　本発明は、医療や食品などの分野における遺伝子検査に利用することができる。
＜配列番号1＞
5'-CAAGCAGCHATGCAAAT-3'
＜配列番号2＞
5'-TAAACGTAHCGACGAAC-3'
＜配列番号3＞
5'-CAAGCAGCHATGCAAAT-3'
＜配列番号4＞
5'-ATTTGCATDGCTGCTTG-3'
＜配列番号5＞
5'-GTTCGTCGDTACGTTTA-3'
＜配列番号6＞
gagM-1FBの配列を示す。
＜配列番号7＞
gagM-3RB-bioの配列を示す。
＜配列番号8＞
gagM-1FB-comp6の配列を示す。
＜配列番号9＞
gagM-1FB-comp8の配列を示す。
＜配列番号10＞
gagM-1FB-comp10の配列を示す。
＜配列番号11＞
gagM-1FB-converseの配列を示す。
＜配列番号12＞
gagM-1FB-contrapositiveの配列を示す。
＜配列番号13＞
gagM-1FA-3FBの配列を示す。
＜配列番号14＞
Control-C-Ex8の配列を示す。
＜配列番号15＞
Control-CC-Bioの配列を示す。
＜配列番号16＞
5'-TACGACGCTACTGTCAGTGTCCTGTGACTGTCATCGCAGCAT-3'
＜配列番号17＞
5'-[BioOn]ATGCTGCGATGACAGTCACAGGACACTGACAGTAGCGTCGTA-3'
＜配列番号18＞
ストリップのAの位置に塗布したプローブ（HIV-1, gag probe）の配列を示す。
＜配列番号19＞
ストリップのBの位置に塗布したプローブ（HIV-1, gag probe）の配列を示す。
＜配列番号20＞
ストリップのCの位置に塗布したプローブ（HIV-2, U3 probe）の配列を示す。
＜配列番号21＞
ストリップのDの位置に塗布したプローブ（HIV-2, U3 probe）の配列を示す。
＜配列番号22＞
ストリップのEの位置に塗布したプローブ（T. pallidum genome）の配列を示す。
＜配列番号23＞
ストリップのFの位置に塗布したプローブ（T. pallidum genome）の配列を示す。
＜配列番号24＞
ストリップのGの位置に塗布したプローブ（ポジコン用プローブ）の配列を示す。
＜配列番号25＞
ストリップのHの位置に塗布したプローブ（ポジコン用プローブ）の配列を示す。

Claims (13)

  1. 　１４ｍｅｒ～３５ｍｅｒの第一の核酸と、
    　前記第一の核酸の３’末端と相補的な配列を３’末端に有する１４ｍｅｒ～３５ｍｅｒの第二の核酸と、
    を含むＰＣＲの成否判定剤。
  2. 　前記相補的な配列は、４塩基から１２塩基である、請求項１に記載のＰＣＲの成否判定剤。
  3. 　前記第一の核酸及び第二の核酸のいずれか一方は、標的核酸を増幅するためのプライマーセットの一方である、請求項１又は２に記載のＰＣＲの成否判定剤。
  4. 　前記第一の核酸及び第二の核酸のいずれか一方は、
    　前記標的核酸を増幅するためのプライマーのいずれか一方の少なくとも一部の配列について、５’側と３’側を反転させた配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＰＣＲの成否判定剤。
  5. 　前記第一の核酸及び第二の核酸のいずれか一方は、
    　前記標的核酸を増幅するためのプライマーのいずれか一方の少なくとも一部の配列の相補鎖について、５’側と３’側を反転させた配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＰＣＲの成否判定剤。
  6. 　前記第一の核酸及び第二の核酸は、いずれも標的核酸を増幅するためのプライマーセットとは異なる配列を有する、請求項１又は２に記載のＰＣＲの成否判定剤。
  7. 　試料に、請求項１から６のいずれか一項に記載のＰＣＲの成否判定剤を加えてＰＣＲを行う工程と、
    　前記第一の核酸及び第二の核酸によるＰＣＲ増幅産物を検出する工程と、
    を含むＰＣＲの成否判定方法。
  8. 　請求項１から６のいずれか一項に記載のＰＣＲの成否判定剤と、
    　標的核酸を増幅するためのプライマーと、を含む核酸検出キット。
  9. 　さらに、標的核酸の配列の一部（ターゲット配列）の５’末端に隣接する上流領域に相補的な配列及び前記ターゲット配列の３’末端に隣接する下流領域に相補的な配列を有するが、前記ターゲット配列に相補的な配列を含まないプライマーを含む、請求項８に記載の核酸検出キット。
  10. 　前記第一の核酸又は第二の核酸によるＰＣＲ産物の少なくとも一部とハイブリダイズ可能な配列を有する核酸をプローブとして含む、請求項８又は９に記載の核酸検出キット。
  11. 　さらに、前記標的核酸のＰＣＲ産物の少なくとも一部とハイブリダイズ可能な配列を有する核酸をプローブとして含む、請求項１０に記載の核酸検出キット。
  12. 　前記プローブは、担体に保持されている、請求項１０又は１１に記載の核酸検出キット。
  13. 　前記担体は、セルロース繊維で構成された長方形のストリップであり、前記プローブは、前記ストリップの長手方向と垂直な方向に直線状に固定されている、請求項１２に記載の核酸検出キット。
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