JP2003524416A - 生物学的サンプル中のエリートイベントｇａｔ−ｚｍ１を同定する方法およびキット - Google Patents

生物学的サンプル中のエリートイベントｇａｔ−ｚｍ１を同定する方法およびキット

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Abstract

(57)【要約】 生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１の迅速かつ明解な同定を可能にするツールを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 植物におけるトランスジーンの表現型発現は、遺伝子自体の構造とその植物ゲ
ノム内の位置とによって決定される。同時に、ゲノム内の異なる位置に（外来Ｄ
ＮＡの）トランスジーンが存在すると、その植物の全表現型に様々な点で影響を
与えるであろう。遺伝子操作によって、植物中に商業的に興味深い形質を農学的
または工業的に首尾良く導入することは、種々の要素しだいで非常に長い手順に
なることがある。遺伝子形質転換植物の実際の形質転換および再生は、広範囲に
わたる遺伝子特性決定、育種、および野外実験での評価を含めた一連の選択ステ
ップの初めに過ぎず、その結果として、エリートイベント（elite event）の選
択がもたらされる。
【０００２】 エリートイベントの明確な同定は、Novel Food/Feedに関する審議、ＧＭＯお
よび非ＧＭＯ製品の分離、ならびに未公表材料の同定のために、ますます重要に
なっている。そのような同定法は、広範囲な実験設備を必要とせず、迅速かつ簡
単に行われるのが理想的である。さらに、そのような同定法は、専門家の分析な
しにエリートイベントを明確に同定し得る結果を提供しなければならないが、必
要な場合には専門家の監督下に置かれる。
【０００３】 ホスフィノトリシン耐性をコードするｐａｔ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ／
Ａｃを用いてトウモロコシを形質転換することによる、除草剤Liberty（登録商
標）耐性トウモロコシの作出におけるエリートイベントとしてＧＡＴ−ＺＭ１が
選択された。このトウモロコシは、例えば、AgriGold/Akin Seed Companyが販売
しているLiberty Link（登録商標） Ａ６４６０ＬＬなどのLiberby Link（登録
商標）トウモロコシとして市販されている。本明細書では、生物学的サンプル中
のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための簡単かつ明確な方法に使用
するためのツールを記載する。
【０００４】 発明の概要 本発明は、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定する
方法に関し、この方法は、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキン
グ配列を特異的に認識するプライマーまたはプローブに基づく。
【０００５】 より特定的に言えば、本発明は、生物学的サンプル中に存在する核酸の配列を
増幅することを含む方法に関し、この方法は、１００〜３５０ｂｐのＤＮＡ断片
を得るために、一方がＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキング領
域を認識し、他方が外来ＤＮＡ内の配列を認識する、少なくとも２つのプライマ
ーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を用いる。これらのプライマーは、それぞれ
、好ましくはＧＡＴ−ＺＭ１の５′フランキング領域内の配列、最も好ましくは
配列番号６の５′フランキング領域内の配列、および外来ＤＮＡ内の配列を認識
する。５′フランキング領域を認識するプライマーが本明細書に記載の配列番号
１１のヌクレオチド配列を含み、外来ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーが配
列番号１２のヌクレオチド配列を含むのが特に好ましい。
【０００６】 本発明は、より特定的には、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−
ＺＭ１を同定する方法に関し、この方法は、１８０〜２２０ｂｐ、好ましくは約
２００ｂｐのＤＮＡ断片を得るために、それぞれ、配列番号１１および配列番号
１２のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖
反応を用いて、生物学的サンプル中に存在する核酸配列を増幅することを含む。
【０００７】 さらに、本発明は、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１に特異的な同定法を
開発するために用い得る、本明細書記載のＧＡＴ−ＺＭ１の特定フランキング配
列に関する。より特定的に言えば、本発明は、特異的プライマーおよびプローブ
の作成に用い得るＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキング領域に
関する。さらに、本発明は、そのような特異的プライマーまたはプローブを使用
して、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１の存在を同定する方法に関する。
【０００８】 本発明は、さらに、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を
同定するためのキットに関し、これらのキットは、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′または
３′フランキング領域を特異的に認識する少なくとも１つのプライマーまたはプ
ローブを含む。
【０００９】 本発明のキットは、ＰＣＲ同定プロトコールに用いるために、ＧＡＴ−ＺＭ１
の５′または３′フランキング領域を特異的に認識するプライマーのほかに、Ｇ
ＡＴ−ＺＭ１の外来ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する第２のプライマーを含む
のが好ましい。本発明のキットは、一方が、好ましくは、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′
フランキング領域内、最も好ましくは、配列番号６の５′フランキング領域内の
配列を認識し、他方が、外来ＤＮＡ内の配列を認識する、２つの特異的プライマ
ーを含む。５′フランキング領域を認識するプライマーが本明細書記載の配列番
号１１のヌクレオチド配列を含み、トランスジーンを認識するプライマーが配列
番号１２のヌクレオチド配列を含むのが特に好ましい。
【００１０】 本発明はさらに、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同
定するためのキットに関し、このキットは、本明細書記載のＧＡＴ−ＺＭ１ Ｐ
ＣＲ同定プロトコールに用いるために、配列番号１１および配列番号１２のヌク
レオチド配列を有するＰＣＲプライマーを含む。
【００１１】 また、本発明は、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同
定するためのキットに関し、このキットは、ＧＡＴ−ＺＭ１の特定領域と８０〜
１００％の配列同一性を有する配列に対応する（またはそのような配列に相補的
な）配列を有する特異的プローブを含む。このプローブの配列は、ＧＡＴ−ＺＭ
１の５′または３′フランキング領域の一部を含む特定領域に対応しているのが
好ましい。この特異的プローブは、配列番号６のヌクレオチド２８６〜４６６の
配列と８０〜１００％の配列同一性を有する配列を有する（またはそのような配
列に相補的である）のが最も好ましい。
【００１２】 本発明により包含される方法およびキットは、植物、植物材料、または植物材
料を含むかそれらに由来する（生鮮もしくは加工）食品もしくは飼料などを含む
がそれらには限定されない製品におけるＧＡＴ−ＺＭ１の同定などを含むがそれ
らには限定されない種々の目的に用い得る。さらにまたはその代わりに、本発明
の方法およびキットは、トランスジェニック材料と非トランスジェニック材料と
を分離するためのトランスジェニック植物材料の同定に用い得る。さらにまたは
その代わりに、本発明の方法およびキットは、ＧＡＴ−ＺＭ１を含む植物材料の
品質（すなわち、純粋材料パーセント）の測定に用い得る。
【００１３】 本発明はさらに、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキング領域
に加えて、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキング配列から作成
した特異的プライマーおよびプローブに関する。
【００１４】 詳細な説明 組換えＤＮＡ分子の植物ゲノムへの組込みは、通常、細胞もしくは組織の形質
転換（または別の遺伝子操作）の結果生じる。特定の組込み部位は、「ランダム
」組込みによるか、または（標的向け組込みプロセスを用いた場合には）予定さ
れた位置にある。
【００１５】 組換えＤＮＡまたは「形質転換ＤＮＡ」を用いた植物細胞または組織の形質転
換の結果として植物ゲノムに導入されたＤＮＡは、以後、１つ以上の「トランス
ジーン」を含む「外来ＤＮＡ」と称される。したがって、外来ＤＮＡは、組換え
ＤＮＡと共に、新たに挿入され、再配列された植物ＤＮＡを含み得る。しかし、
本発明の状況では用語「植物ＤＮＡ」とは、対応する野生型植物中の同じ遺伝子
座に見出される植物ＤＮＡを表す。外来ＤＮＡは、植物ゲノム内の組換えＤＮＡ
分子の組込み部位の位置および配置によって特性決定し得る。植物ゲノム内の組
換えＤＮＡ挿入部位は、「挿入部位」または「標的部位」とも称される。組換え
ＤＮＡの植物ゲノムへの挿入は、「標的部位欠失」（target site deletion）と
称される、植物ＤＮＡの欠失と一体にさせ得る。本明細書に用いられている限り
において、「フランキング領域」または「フランキング配列」とは、外来ＤＮＡ
の直ぐ上流に位置して外来ＤＮＡと隣接しているか、または外来ＤＮＡの直ぐ下
流に位置して外来ＤＮＡと隣接している、少なくとも２０ｂｐ、好ましくは少な
くとも５０ｂｐ、最大５０００ｂｐの植物ゲノム配列を表す。外来ＤＮＡのラン
ダム組込みをもたらす形質転換手順により、それぞれ特有かつ独自の、異なるフ
ランキング領域を有する複数の形質転換細胞が生じる。組換えＤＮＡを慣用的な
交配を介して植物に導入した場合、通常、植物ゲノム中のその挿入部位またはそ
のフランキング領域は変わらない。本明細書に用いられている限りにおいて、「
挿入領域」とは、植物ゲノム内の外来ＤＮＡの上流および／もしくは下流のフラ
ンキング領域を含む配列を包含する、少なくとも４０ｂｐ、好ましくは少なくと
も１００ｂｐ、最大１００００ｂｐの領域に相当する領域を表す。種内突然変異
によるわずかな相違を考慮に入れれば、同種植物と交配させると、挿入領域は、
初期に形質転換によって得られた植物中の外来ＤＮＡの上流および下流フランキ
ング領域を含む配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは
９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を保持する。
【００１６】 イベントとは、遺伝子操作の結果として、目的遺伝子の少なくとも１つのコピ
ーを含むトランスジーンを保有する（人工）遺伝子座と定義される。あるイベン
トの典型的なアレルの状態は、外来ＤＮＡの存在または不在である。事象は、表
現型的にはトランスジーンの発現によって特性決定される。遺伝子レベルでは、
事象は植物の遺伝子構成の一部である。分子レベルでは、事象は、（例えば、サ
ザーンブロッティングにより決定されるような）制限酵素マップにより、トラン
スジーンの上流および／または下流フランキング配列、トランスジーンの分子マ
ーカーおよび／または分子配置によって特性決定し得る。通常、少なくとも１つ
の目的遺伝子を含む形質転換ＤＮＡを用いて植物を形質転換すると、それぞれが
独自の多数のイベントがもたらされる。
【００１７】 本明細書に用いられている限りにおいて、エリートイベントとは、トランスジ
ーンの発現および安定性ならびにトランスジーンを含む植物の最適な作物学的特
性との適合性に基づいて、同一形質転換ＤＮＡを用いた形質転換によるか、また
はそのような形質転換によって得られた植物との戻し交配によって得られる一群
の事象から選択される事象である。したがって、エリートイベントの選択基準は
、以下の基準の１つ以上、好ましくは２つ以上、有利にはすべてである： （ａ） 外来ＤＮＡの存在が、作物学的性能または商業的価値に関するものなど
の、植物の他の所望の特性を弱めないこと； （ｂ） その事象が安定に遺伝し、同一性制御用の適切なツールの開発が可能で
ある明確に定義された分子配置によって特性決定されること； （ｃ） １つまたは複数の目的遺伝子が、その事象のヘテロ接合（または半接合
）状態においてもホモ接合状態においても、その事象を有する植物が正常な作物
学的用途において暴露される環境条件範囲において商業的に許容し得るレベルで
、正しく、適切、かつ安定した空間的、時間的表現型発現を示すこと。
【００１８】 外来ＤＮＡは、所望の商用遺伝子バックグラウンドに容易に遺伝子移入し得る
植物ゲノム内の位置に結合しているのが好ましい。
【００１９】 エリートイベントとしてのある事象の状態は、エリートイベントを異なる関連
遺伝子バックグラウンドに遺伝子移入すること、および上記基準、例えば、（ａ
）、（ｂ）および（ｃ）の１つ、２つまたはすべてに合致することを観察するこ
とによって確認される。
【００２０】 したがって、「エリートイベント」とは、上記基準に合致する、外来ＤＮＡを
含む遺伝子座を表す。植物、植物材料または種子などの後代は、そのゲノム内に
１つ以上のエリートイベントを含み得る。
【００２１】 エリートイベントまたは植物、エリートイベントを含む植物材料、またはエリ
ートイベントを有する植物材料を含む製品を同定するべく開発されたツールは、
外来ＤＮＡ、分子マーカーまたは外来ＤＮＡの一方もしくは両側のフランキング
領域の配列を含むゲノム領域の特定の制限酵素マップなどの、エリートイベント
の特定のゲノム特性に基づいている。
【００２２】 外来ＤＮＡの一方または両側のフランキング領域が配列決定されたら、分子生
物学的方法を用いてサンプル中の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のこの（これらの
）配列を特異的に認識するプライマーおよびプローブを作成することができる。
例えば、（植物、植物材料または植物材料を含む製品などの）生物学的サンプル
中のエリートイベントを同定するＰＣＲ法を開発し得る。そのようなＰＣＲは、
一方がエリートイベントの５′または３′フランキング領域を認識し、他方が外
来ＤＮＡ内の配列を認識する、少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づく
。これらのプライマーは、エリートイベントを含む核酸サンプルから特定の断片
（「組込み断片」）が増幅されるように、最適化ＰＣＲ条件下に、それぞれ、エ
リートイベントの５′または３′フランキング領域内およびエリートイベントの
外来ＤＮＡ内の配列を「特異的に認識する」１５〜３５ヌクレオチドの配列を有
するのが好ましい。これは、最適化ＰＣＲ条件下に、植物ゲノムまたは外来ＤＮ
Ａ内の標的組込み断片のみが増幅され、他の配列は増幅されないことを意味する
。
【００２３】 組込み断片は、５０〜５００ヌクレオチドの長さを有するのが好ましく、１０
０〜３５０ヌクレオチドが最も好ましい。特異的プライマーは、それぞれ、エリ
ートイベントの５′または３′フランキング領域内およびエリートイベントの外
来ＤＮＡ内の配列と８０〜１００％同一の配列を有するのが好ましいが、但し、
ミスマッチがあっても、最適化ＰＣＲ条件下にこれらのプライマーを用いてエリ
ートイベントを特異的に同定し得ることを条件とする。しかし、許容可能なミス
マッチ範囲は、実験により容易に決定できるし、当業者には公知である。
【００２４】 特異的プライマーの配列およびゲノム内でのそれらの相対位置はエリートイベ
ントに特有であるから、組込み断片の増幅は、エリートイベント（の核酸）を含
む生物学的サンプル中でのみ生じる。未知サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１の存在を
同定するためにＰＣＲを実施する際には、エリートイベントを有する植物種の「
ハウスキーピング遺伝子」内の断片を増幅し得るプライマーセットにコントロー
ルを加えるのが好ましい。ハウスキーピング遺伝子は、ほとんどの細胞型で発現
し、すべての細胞に共通する基本代謝活性に関与する遺伝子である。ハウスキー
ピング遺伝子から増幅された断片は、増幅組込み断片より大きい断片であるのが
好ましい。分析サンプルに応じて、他のコントロールを加え得る。
【００２５】 標準ＰＣＲプロトコールは、「PCR Application Manual」（Roche Molecular
Biochemicals, 2nd Edition, 1999）におけるように、当該技術に記載されてい
る。特異的プライマーの配列を含めた、ＰＣＲに最適な条件は、各エリートイベ
ントに関する「ＰＣＲ同定プロトコール」に詳述されている。しかし、ＰＣＲ同
定プロトコールにおける多くのパラメータは、特定の実験室条件に合わせて調整
する必要があり、類似の結果が得られるように僅かに改変し得るものと了解され
る。例えば、異なるＤＮＡ調製法を用いる場合には、例えば、用いるプライマー
の量、ポリメラーゼ、およびアニーリング条件を調整する必要があり得る。同様
に、他のプライマーを選択する場合には、ＰＣＲ同定プロトコールに関して他の
最適条件が求められ得る。しかし、これらの調整は、当業者には自明であり、上
記に引用したものなどの一般に用いられているＰＣＲアプリケーションマニュア
ルにさらに詳述されている。
【００２６】 あるいは、特異的プライマーを使って、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１
を同定するための「特異的プローブ」として用い得る組込み断片を増幅すること
ができる。生物学的サンプルの核酸と特異的プローブとを、プローブと核酸中の
その対応断片とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下に接触させると、
核酸／プローブハイブリッドが生成する。ＧＡＴ−ＺＭ１の存在を示すこのハイ
ブリッドの生成は、（例えば、核酸またはプローブを標識して）検出することが
できる。（固相担体上または溶液中の）特異的プローブとのハイブリダイゼーシ
ョンに基づくそのような同定法は当該技術に記載されている。特異的プローブは
、最適化条件下に、エリートイベントの５′または３′フランキング領域内の、
好ましくは隣接する外来ＤＮＡの一部をさらに含む領域（以後「特定領域」と称
する）に特異的にハイブリダイズする配列であるのが好ましい。特異的プローブ
は、特定領域のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％
、より好ましくは８５〜９０％、特に好ましくは９０〜９５％、最も好ましくは
９５〜１００％同一である（またはそのような配列に相補的な）、５０〜５００
ｂｐ、好ましくは１００〜３５０ｂｐの配列を含むのが好ましい。特異的プロー
ブは、エリートイベントの特定領域と同一である（またはそのような領域に相補
的な）約１５〜約１００の隣接ヌクレオチド配列を含むのが好ましいであろう。
【００２７】 本明細書に用いられている限りにおいて、「キット」とは、本発明の方法を実
施するため、より特定的には、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−
ＺＭ１を同定するための試薬セットを表す。より特定的に言えば、本発明のキッ
トの好ましい実施形態は、上述のような、少なくとも１つまたは２つの特異的プ
ライマーを含む。場合により、キットは、ＰＣＲ同定プロトコールに、本明細書
記載の他の任意の試薬をさらに含み得る。あるいは、本発明の別の実施形態によ
れば、キットは、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１の存在を同定するために
、生物学的サンプルの核酸と特異的にハイブリダイズする上述のような特異的プ
ローブを含み得る。場合により、キットは、特異的プローブを用いて、生物学的
サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための（ハイブリダイゼーション緩衝液
、標識などを含むがそれらには限定されない）他の任意の試薬をさらに含み得る
。
【００２８】 本発明のキットは、品質管理（例えば、種子ロットの純度）、食品もしくは飼
料などを含むがそれらには限定されない、植物材料または植物材料を含むかもし
くは植物材料由来の材料中のエリートイベントを検出するために用いることが可
能であり、キットの構成成分はその目的に合わせて特異的に調整し得る。
【００２９】 本明細書に用いられている限りにおいて、ヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲ
ＮＡ）に関する「配列同一性」とは、２つの配列の短い方のヌクレオチドの数で
割った同一ヌクレオチドを有する位置の数を表す。２つのヌクレオチド配列の整
列は、２０ヌクレオチドのウィンドーサイズ、４ヌクレオチドの語長、および４
のギャップペナルティーを用いるウィルバーとリップマンのアルゴリズム（Wilb
ur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80 : 726）に従って実施す
る。上述の配列整列を含めた、コンピュータ援用解析および配列データの解釈は
、例えば、Intelligenetics TM Suite〔カリフォルニア州、インテリジェネティ
クス社（Intelligenetics Inc., CA）〕プログラムまたはジェネティクス・コン
ピュータ・グループ〔Genetics Computer Group（ＧＣＧ），ウィスコンシン・
バイオテクノロジー・センター大学（University of Wisconsin Biotechnology
center）〕の配列解析ソフトウエアを用いて実施すると便利なことがある。配列
は、少なくとも約７５％、特定的には少なくとも約８０％、より特定的には少な
くとも約８５％、極めて特定的には約９０％、特に約９５％、とりわけ約１００
％の配列同一性を有する場合に「実質的に類似である」と示される。ＲＮＡ配列
がＤＮＡ配列と実質的に類似であるとか、またはある程度の配列同一性を有する
と言われる場合に、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）がＲＮＡ配列中のウラシル（
Ｕ）に等しいと考えられることは明らかである。本明細書に用いられている限り
において「相補的」とは、ヌクレオチド配列中のＡとＴ（Ｕ）およびＧとＣヌク
レオチドの間の相補性を表す。
【００３０】 本明細書に用いられている限りにおいて、用語「プライマー」とは、ＰＣＲな
どの鋳型依存性プロセスにおける新生核酸の合成をプライミングし得る任意の核
酸を包含する。通常、プライマーは、１０〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドで
あるが、もっと長い配列を用いてもよい。プライマーは、二本鎖形態で得ること
もできるが、一本鎖形態が好ましい。プローブをプライマーとして用いることも
可能であるが、プローブは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計され
ており、増幅プロセスに用いる必要はない。
【００３１】 本明細書において特異的プライマーに関して用いられる限りにおいて、用語「
認識する」とは、特異的プライマーが、（ＰＣＲ同定プロトコール条件などの）
本発明の方法に記載されている条件下に、エリートイベント中の核酸配列に特異
的にハイブリダイズすることを表し、その特異性は、ポジティブおよびネガティ
ブコントロールの存在によって決定される。
【００３２】 本明細書において特異的プローブに関して用いられる限りにおいて、用語「ハ
イブリダイズする」とは、標準ストリンジェンシー条件下に、プローブがエリー
トイベントの核酸配列内の特定領域に結合することを表す。本明細書に用いられ
ている限りにおいて、標準ストリンジェンシー条件とは、本明細書記載のハイブ
リダイゼーション条件またはSambrookら，1989（Molecular Cloning : A Labora
tory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY）
により記載されているような慣用のハイブリダイゼーション条件を表し、ハイブ
リダイゼーションは、例えば、以下のステップを含み得る：（１）植物のゲノム
ＤＮＡ断片をフィルター上に固定するステップ、（２）フィルターを、４２℃で
１〜２時間、５０％ホルムアミド、５ Ｘ ＳＳＰＥ、２Ｘ デンハルトの（De
nhardt's）試薬および０．１％ＳＤＳ中、または６８℃で１〜２時間、６ Ｘ
ＳＳＣ、２Ｘ デンハルトの試薬および０．１％ＳＤＳ中で予備ハイブリダイズ
するステップ、（３）標識したハイブリダイゼーションプローブを添加するステ
ップ、（４）１６〜２４時間インキュベートするステップ、（５）フィルターを
、室温下に２０分間１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄するステップ、（６）
フィルターを、それぞれ６８℃で２０分間、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ
中で３回洗浄するステップ、および（７）フィルターを、−７０℃下に、増感板
を用い、Ｘ線フィルムに２４〜４８時間暴露するステップ。
【００３３】 本明細書に用いられている限りにおいて、生物学的サンプルは、植物、植物材
料または植物材料を含む製品のサンプルである。用語「植物」は、任意の成熟段
階のトウモロコシ（Zea mays）植物組織のほかに、任意の種子、葉、茎、花、根
、単細胞、配偶子、培養細胞、培養組織またはプロトプラストを含むがそれらに
は限定されない、任意の上記植物から採取されるかそのような植物由来の任意の
細胞、組織、または器官を包含するものとする。本明細書に用いられている限り
において、「植物材料」とは、植物から得られるか、または植物由来の材料を表
す。植物材料を含む製品とは、植物材料を用いて生産されるか、植物材料によっ
て混入汚染されている可能性がある食品、飼料または他の製品のことを言う。本
発明においては、そのような生物学的サンプルは、サンプル中の核酸の存在を示
唆する、ＧＡＴ−ＺＭ１に特異的な核酸の存在について試験されるものと了解さ
れる。したがって、本明細書記載の生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡ
Ｔ−ＺＭ１同定法は、生物学的サンプル中のエリートイベントを含む核酸の同定
に関する。
【００３４】 本明細書に用いられている限りにおいて、「含む」（comprising）とは、言及
されているような規定された特徴、整数、ステップ、試薬または成分の存在を指
定するが、１つ以上の特徴、整数、ステップもしくは成分、またはそのグループ
の存在または付加をも包含するものと解釈すべきである。したがって、例えば、
ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に列挙
されたものより多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含む、すなわち、より大き
な核酸またはアミノ酸中にはめ込まれていることがある。機能または構造が解明
されているＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子は、追加のＤＮＡ配列などを含み得る
。
【００３５】 以下の実施例は、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同
定するためのツールの作成を説明している。
【００３６】 特に断りのない限り、すべての組換えＤＮＡ法は、Sambrookら（1989）Molecu
lar Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour L
aboratory Press, NYならびにAusubelら（1994）Current Protocols in Molecul
ar Biology, Current Protocols, USAの第１および第２巻に記載されている標準
プロトコールに従って実施される。植物分子研究用の標準材料および方法は、BI
OS Scientific Publications Ltd（UK）およびBlackwell Scientific Publicati
ons, UKから出版されたR. D. D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax（
1993）に記載されている。
【００３７】 説明および実施例においては、以下の配列が参照される： 配列番号１： ベクターｐＵＣ／Ａｃの遺伝要素の配列 配列番号２： プライマーＭＤＢ２８６ 配列番号３： プライマーＭＤＢ３９１ 配列番号４： プライマーＭＤＢ４１１ 配列番号５： プライマーＭＤＢ４２０ 配列番号６： ＧＡＴ−ＺＭ１の５′フランキング領域を含むヌクレオチド配列
配列番号７： プライマーＭＤＢ４３９ 配列番号８： プライマーＶＤＳ４４ 配列番号９： プライマーＭＤＢ５２２ 配列番号１０： ＧＡＴ−ＺＭ１の３′フランキング領域を含むヌクレオチド配
列 配列番号１１： プライマーＣＯＲ１７ 配列番号１２： プライマーＣＯＲ１８ 配列番号１３： プライマーＣＯＲ１５ 配列番号１４： プライマーＣＯＲ１６ 本発明を、記載されている特定の実施形態に限定するものではない以下の実施
例は、参照として本明細書に組み込まれている添付図面と関連させるとより良く
理解されるであろう。
【００３８】 実施例 １． エリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１のフランキング領域の同定 カリフラワーモザイクウイルスからの構成３５Ｓプロモーターの制御下に、酵
素ホスフィノトリシン−アセチル−トランスフェラーゼをコードするｐａｔ遺伝
子のコート配列を含むｐＵＣ／Ａｃベクターを用いてトウモロコシを形質転換し
て、除草剤耐性トウモロコシを作出した。ｐＵＣ／Ａｃの遺伝要素の詳細な説明
は表１に示されている。ｐＵＣ／Ａｃの遺伝要素のヌクレオチド配列は配列番号
１で与えられている。
【００３９】
【表１】
【００４０】 エリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１は、除草剤耐性遺伝子の良好な発現および安
定性ならびにその最適な作物学特性との適合性を根拠にした広範囲な選択手順に
基づいて選択された。
【００４１】 ＧＡＴ−ＺＭ１事象中の外来ＤＮＡに隣接する領域の配列は、Liuら〔1995,Pl
ant J.8(3):457-463〕により記載されている熱非対称インターレース〔thermal
asymmetric interlaed〕（ＴＡＩＬ−）〕ＰＣＲ法を用いて決定した。この方法
は、特異的産物と非特異的産物の相対増幅効率を熱制御し得るように、連続反応
において、３つの重ね合わされたプライマーと共に任意の短い縮重プライマーを
利用する。特異的プライマーは、外来ＤＮＡのボーダーにアニールするために、
それらのアニーリング条件に基づいて選択された。１％アガロースゲル上で、少
量（５μl）の非精製二次および三次ＰＣＲ産物を分析した。予備増幅用には三
次ＰＣＲ産物を用い、精製し、DyeDeoxy Terminatorサイクルキットを用いて自
動シークエンサーで配列決定した。
【００４２】 １．１ 右側（５′）フランキング領域 用いたプライマーは以下の通りであった：
【００４３】
【表２】
【００４４】 ＭＤＢ２８６−ＭＤＢ４２０を用いて増幅した断片は約１１００ｂｐであり、
その完全配列が決定された（配列番号６）。ヌクレオチド１〜３４１の配列は、
物ＤＮＡに対応し、ヌクレオチド３４２〜１０４１の配列はＴ−ＤＮＡに対応す
る。
【００４５】 １．２ 左（３′）フランキング領域 用いたプライマーは以下の通りであった：
【００４６】
【表３】
【００４７】 ＭＤＢ２８６−ＭＤＢ５２２を用いて増幅した断片は約４５０ｂｐであり、そ
の完全配列が決定された（配列番号１０）。ヌクレオチド１〜３４２の配列はＴ
−ＤＮＡに対応し、ヌクレオチド３４３−４８４の配列は植物ＤＮＡに対応する
。
【００４８】 ２． ポリメラーゼ連鎖反応同定プロトコールの開発 ２．１ プライマー エリートイベント内の配列を認識する特異的プライマーを作成した。より特定
的に言えば、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′フランキング領域内の配列を認識するプライ
マーを作成した。次いで、プライマーが約２００ｂｐの配列にまたがるように外
来ＤＮＡの配列内の第２プライマーを選択した。以下のプライマーは、ＧＡＴ−
ＺＭ１ＤＮＡに関するＰＣＲ反応において特に明確かつ再現可能な結果を与える
ことが判明した： ＣＯＲ１７： ５′−ｇｇｇ．ＴｇＡ．ｇＣＴ．ＣｇＡ．ＡＴｇ．ＴＴｇ．ＴＴ
Ｃ．Ｔ−３′（配列番号１１） （標的： 植物ＤＮＡ） ＣＯＲ１８： ５′−ＴＣＴ．ＴＡｇ．ＡＣｇ．ＴＣＡ．ｇｇＴ．ｇｇＣ．ＡＣ
Ｔ．Ｔ−３′（配列番号１２） （標的： Ｔ−ＤＮＡ）
【００４９】 ＰＣＲカクテル中に、内在配列を標的とするプライマーを含めるのが好ましい
。これらのプライマーは、未知サンプルやＤＮＡのポジティブコントロールにお
いて内部コントロールとしての役を果たす。内在プライマー対を用いた場合の陽
性結果は、ゲノムＤＮＡサンプル中にＰＣＲ産物を生成させるのに十分な適切な
品質のＤＮＡが存在することを示している。トウモロコシ（Zea mays）中のハウ
スキーピング遺伝子を認識する内在プライマーを選択した： ＣＯＲ１５： ５′−ＡｇＣ．ｇＴＣ．ＡＡｇ．ｇＡＴ．ＣＡＴ．Ｔｇｇ．Ｔｇ
Ｔ．Ｃ−３′（配列番号１３） 〔Ｚｅａ Ｍａｙｓアルコールデヒロドロゲナーゼ１遺伝子（Ｘ０４０５０）中
に位置〕 ＣＯＲ１６： ５′−ｇｇＣ．ＣＡＡ．ｇＴＴ．ＣＡｇ．ＣＡＴ．ＡＡＧ．ＣＴ
ｇ．Ｔ−３′（配列番号１４） 〔Ｚｅａ Ｍａｙｓアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（Ｘ０４０５０）中に
位置〕
【００５０】 ２．２ 増幅断片 ＰＣＲ反応において予測される増幅断片は以下の通りである： プライマー対ＣＯＲ１５−ＣＯＲ１６の場合： ５１３ｂｐ（内在コントロール
） プライマー対ＣＯＲ１７−ＣＯＲ１８の場合： ２０２ｂｐ（ＧＡＴ−ＺＭ１エ
リートイベント）
【００５１】 ２．３ 鋳型ＤＮＡ 鋳型ＤＮＡは、Edwardsら（Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991）に従
ってリーフパンチ（leaf punch）から作成した。他の方法で作成したＤＮＡを用
いる場合には、種々の量の鋳型を利用するテストランを行う必要がある。通常、
５０ngのゲノム鋳型ＤＮＡで最上の結果が得られる。
【００５２】 ２．４ 割当てられたポジティブおよびネガティブコントロール 偽陽性または偽陰性を回避するために、以下のポジティブおよびネガティブコ
ントロールをＰＣＲランに含めるべきであると決定された。
【００５３】 − マスターミックスコントロール（ＤＮＡネガティブコントロール）。これは
、反応にＤＮＡを加えないＰＣＲである。予測された結果としてＰＣＲ産物が全
く観察されない場合、これは、ＰＣＲカクテルが標的ＤＮＡで混入汚染されてい
なかったことを示している。
【００５４】 − ＤＮＡポジティブコントロール（トランスジェニック配列を含むことが分っ
ているゲノムＤＮＡサンプル）。このポジティブコントロールが首尾良く増幅さ
れたことは、ＰＣＲが標的配列の増幅を可能にする条件下に実行されたことを示
している。
【００５５】 − 野生型ＤＮＡコントロール。これは、提供された鋳型ＤＮＡが非トランスジ
ェニック植物から作成されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測された結果
としてトランスジーンＰＣＲ産物の増幅がなく、内在ＰＣＲ産物の増幅が観察さ
れた場合、これは、ゲノムＤＮＡサンプル中に検出可能なトランスジーンバック
グラウンド増幅が存在しないことを示している。
【００５６】 ２．５ ＰＣＲ条件 以下の条件下に最適結果が得られた： − ２５μl反応用のＰＣＲミックスは以下を含む： ２．５μlの鋳型ＤＮＡ ２．５μlの１０ｘ増幅緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼ補充） ０．５μlの１０ｍＭ ｄＮＴＰ′ｓ ０．５μlのＣＯＲ１７（１０pmol／μl） ０．５μlのＣＯＲ１８（１０pmol／μl） ０．２５μlのＣＯＲ１５（１０pmol／μl） ０．２５μlのＣＯＲ１６（１０pmol／μl） ０．１μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μl） ２５μlまでの水 − 最適結果を得るために従うべきサーモサイクルプロフィールは以下の通りで
ある： ９５℃で４分 次いで： ９５℃で１分 ５７℃で１分 ７２℃で２分 以上を５サイクル 次いで： ９２℃で３０秒 ５７℃で３０秒 ７２℃で１分 以上を２５サイクル 次いで： ７２℃で５分
【００５７】 ２．６ アガロースゲル分析 ＰＣＲの結果を最適に視覚化するためには、適切な分子量マーカー（例えば、
１００ｂｐラダーＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を含む１．５％アガロースゲル（Ｔｒｉ
ｓ−ボレート緩衝液）上に１０〜２０μlのＰＣＲサンプルを適用すべきである
と決定された。
【００５８】 ２．７ 結果の検証 １回のＰＣＲランおよび単一のＰＣＲカクテル範囲内のトランスジェニック植
物ＤＮＡサンプルからのデータは、（１）ＤＮＡポジティブコントロールが予測
されたＰＣＲ産物（トランスジェニックおよび内在断片）を示し、（２）ＤＮＡ
ネガティブコントロールがＰＣＲ増幅に関して陰性である（無断片）であり、（
３）野生型ＤＮＡコントロールが予測された結果（内在断片の増幅）を示すので
ない限り、許容し得ないと決定された。
【００５９】 上述のようなＧＡＴ−ＺＭ１に関するＰＣＲ同定プロトコールの結果、可視量
の予測サイズのトランスジェニックおよび内在ＰＣＲ産物を示すレーンは、ゲノ
ム鋳型ＤＮＡを作成した対応植物がＧＡＴ−ＺＭ１エリートイベントを受け継い
でいることを示している。可視量のトランスジェニックＰＣＲ産物を示さず、可
視量の内在ＰＣＲ産物を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡを作成した対応植物が
エリートイベントを含んでいないことを示している。可視量の内在およびトラン
スジェニックＰＣＲ産物を示さないレーンは、ゲノムＤＮＡの質および／または
量がＰＣＲ産物を生成させ得なるのに十分でなかったことを示している。これら
の植物はスコアできない。ゲノムＤＮＡの作成を繰返し、適切なコントロールを
用いて新規なＰＣＲランを実施すべきである。
【００６０】 ２．８ ＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための識別ＰＣＲプロトコールの使用 未知サンプルをスクリーニングしようとする前に、すべての適切なコントロー
ルを用いたテストランを実施すべきである。開発されたプロトコールは、実験室
毎に異なり得る構成要素（鋳型ＤＮＡの作成、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、プ
ライマーの品質、ｄＮＴＰ′ｓ、サーモサイクラーなど）の最適化を必要とし得
る。
【００６１】 内在配列の増幅はこのプロトコールにおいて重要な役割を果たす。既知トラン
スジェニックゲノムＤＮＡ鋳型中の等モル量の内在配列とトランスジェニック配
列とを増幅するＰＣＲおよびサーもサイクリング条件を達成しなければならない
。標的内在断片が増幅されないか、またはアガロースゲル電気泳動で判断して、
標的配列が同じ臭化エチジウム染色度で増幅されないときはいつでも、ＰＣＲ条
件を最適化する必要があり得る。
【００６２】 ＧＡＴ−ＺＭ１を含むものもある多数の植物からのZea mays葉材料を上述のプ
ロトコールに従ってテストした。エリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１およびZea ma
ys野生型からのサンプルを、それぞれポジティブおよびネガティブコントロール
とした。
【００６３】 図１は、多数のトウモロコシサンプル（レーン１〜１４）に関するＧＡＴ−Ｚ
Ｍ１のエリートイベントＰＣＲ同定プロトコールで得られた結果を示している。
レーン１、２、５、６、７、８、１１、１３および１４のサンプルは、２０２ｂ
ｐのバンドが検出されるのでエリートイベントを含むと判定されたが、レーン４
、９、１０および１２のサンプルはＧＡＴ−ＺＭ１を含んでいない。レーン３は
、コントロールバンドが検出されないので、ＰＣＲの失敗を示している。レーン
１９および２０は、ＧＡＴ−ＺＭ１のポジティブコントロールサンプルを表し、
レーン２０および２２は、非トランスジェニックZea maysコントロールを表し、
レーン２３は、ネガティブコントロール（水）サンプルを表し、レーン２４は分
子量マーカー（１００ｂｐ）を表す。
【００６４】 ３． ＧＡＴ−ＺＭ１を含む材料の検出用プローブとしての特異的組込み断片の
使用 ＧＡＴ−ＺＭ１の特異的組込み断片は、特異的プライマーＣＯＲ１７（配列番
号１１）およびＣＯＲ１８（配列番号１２）を用いたＰＣＲ増幅または化学合成
によって得られ、標識される。この組込み断片は、生物学的サンプル中のＧＡＴ
−ＺＭ１を検出するための特異的プローブとして用いられる。標準手順に従って
サンプルから核酸を抽出する。次いで、この核酸を、ハイブリッドを形成させる
ように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させ
る。次いで、サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１核酸の存在を示すハイブリッド形成を
検出する。場合により、サンプル中の核酸を、特異的プローブと接触させる前に
特異的プライマーを用いて増幅させる。あるいは、核酸を、組込み断片の代わり
の特異的プローブと接触させる前に標識する。場合により、特異的プローブを、
サンプルと接触させる前に、（フィルター、ストリップまたはビーズなどを含む
がそれらには限定されない）固体担体に結合させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＡＴ−ＺＭ１用に開発されたＰＣＲ同定プロトコールを用いた未知サンプル
のスコアリング。ゲルの担荷配列：未知サンプル：レーン１、２、５、６、８、
１１、１３、１４、トランスジェニック事象ＧＡＴ−ＺＭ１を含むトウモロコシ
植物からのＤＮＡサンプル；レーン４、９、１０、１２、エリートイベントＧＡ
Ｔ−ＺＭ１を含まないトウモロコシ植物からのＤＮＡサンプル；レーン３、ＰＣ
Ｒ失敗。コントロールレーン：レーン１９、２１、エリートイベントＧＡＴ−Ｚ
Ｍ１を含むトウモロコシ植物からのコントロールＤＮＡサンプル；レーン２０、
２２、野生型トウモロコシ植物からのコントロールＤＮＡサンプル；レーン２３
、鋳型を含まないコントロール；レーン２４、分子量マーカー。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB03 CD03 CD07 CD10 4B024 AA07 AA11 CA01 CA09 HA14 4B063 QA13 QA18 QQ04 QQ42 QR55 QR62 QS25 QS34

Claims (27)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同
    定するための方法であって、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′または３′フランキング領域
    を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いてＧＡＴ−ＺＭ１の
    特定領域を検出することを含む方法。
  2. 【請求項２】 一方がＧＡＴ−ＺＭ１の５′または３′フランキング領域を
    認識し、他方が外来ＤＮＡ内の配列を認識する少なくとも２つのプライマーを用
    いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記生物学的サンプル中に存在する核酸か
    ら１００〜３５０ｂｐのＤＮＡ断片を増幅することを含む、請求項１記載の方法
    。
  3. 【請求項３】 前記プライマーの一方がＧＡＴ−ＺＭ１の５′フランキング
    領域内の配列を認識し、前記他方のプライマーが外来ＤＮＡ内の配列を認識する
    、請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記プライマーの一方が配列番号６の５′フランキング領域
    内の配列を認識し、他方が外来ＤＮＡ内の配列を認識する、請求項３記載の方法
    。
  5. 【請求項５】 前記プライマーが、それぞれ、配列番号１１および配列番号
    １２の配列を含む、請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 ＧＡＴ−ＺＭ１同定プロトコールを用いて、１５０〜２２０
    ｂｐの断片を増幅することを含み、前記プライマーの配列が、それぞれ、配列番
    号１１および配列番号１２のヌクレオチド配列に対応する、請求項２記載の方法
    。
  7. 【請求項７】 ＧＡＴ−ＺＭ１同定プロトコールを用いて、約２０２ｂｐの
    断片を増幅することを含む、請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同
    定するためのキットであって、ＧＡＴ−ＺＭ１の３′または５′ボーダーフラン
    キング領域内の配列を認識する少なくとも１つのＰＣＲプライマーを含むキット
    。
  9. 【請求項９】 ＧＡＴ−ＺＭ１の外来ＤＮＡ内の配列を認識する少なくとも
    第２のＰＣＲプライマーをさらに含む、請求項８記載のキット。
  10. 【請求項１０】 前記少なくとも１つのＰＣＲプライマーが、配列番号６の
    ５′フランキング領域内の配列を認識する、請求項８記載のキット。
  11. 【請求項１１】 前記少なくとも２つのＰＣＲプライマーが、それぞれ、配
    列番号１１および配列番号１２の配列を含む、請求項８記載のキット。
  12. 【請求項１２】 最適化されたＰＣＲ条件下で、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′また
    は３′フランキング領域内の配列を特異的に認識する配列を有する、ＧＡＴ−Ｚ
    Ｍ１ ＰＣＲ同定プロトコールに用いるためのプライマー。
  13. 【請求項１３】 配列番号６または配列番号１０内の配列と少なくとも８０
    ％の配列同一性を有する配列を有する、請求項１２記載のプライマー。
  14. 【請求項１４】 配列番号１１の配列を有するプライマー。
  15. 【請求項１５】 配列番号１２の配列を有するプライマー。
  16. 【請求項１６】 生物学的サンプルの核酸とＧＡＴ−ＺＭ１に特異的なプロ
    ーブとをハイブリダイズさせることを含む、請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記特異的プローブの配列が、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′フラ
    ンキング配列の一部およびそれに隣接する外来ＤＮＡの配列を含む配列と８０％
    の配列同一性を有する、請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記特異的プローブの配列が、配列番号６のヌクレオチド
    ２８６〜４８７と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１７記載の方
    法。
  19. 【請求項１９】 生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を
    同定するためのキットであって、ＧＡＴ−ＺＭ１の特定領域に特異的にハイブリ
    ダイズし得る特異的プローブを含むキット。
  20. 【請求項２０】 前記特異的プローブの配列が、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′フラ
    ンキング配列の一部およびそれに隣接する外来ＤＮＡの配列を含む配列と少なく
    とも８０％の配列同一性を有する、請求項１９記載のキット。
  21. 【請求項２１】 前記特異的プローブの配列が、配列番号６のヌクレオチド
    ２８６〜４８７、またはその相補配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する
    、請求項２０記載のキット。
  22. 【請求項２２】 生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を
    同定するための特異的プローブ。
  23. 【請求項２３】 ＧＡＴ−ＺＭ１の５′フランキング配列の一部およびそれ
    に隣接する外来ＤＮＡの配列を含む配列、またはその相補配列と少なくとも８０
    ％の配列同一性を有する、請求項２２記載のプローブ。
  24. 【請求項２４】 配列番号６のヌクレオチド２８６〜４８７、またはその相
    補配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項２３記載のプローブ。
  25. 【請求項２５】 生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を
    同定するための特異的プローブであって、その配列が、配列番号６のヌクレオチ
    ド２８６〜４８７、またはその相補配列と実質的に類似であるプローブ。
  26. 【請求項２６】 種子純度を確認するための方法であって、種子サンプル中
    のＧＡＴ−ＺＭ１の５′または３′フランキング領域を特異的に認識する特異的
    プライマーまたはプローブを用いてＧＡＴ−ＺＭ１の特定領域を検出することを
    含む方法。
  27. 【請求項２７】 種子をＧＡＴ−ＺＭ１の存在についてスクリーニングする
    方法であって、種子ロットのサンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１の５′または３′フラ
    ンキング領域を特異的に認識する特異的プライマーまたはプローブを用いてＧＡ
    Ｔ−ＺＭ１の特定領域を検出することを含む方法。
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