JP4623910B2 - 生物学的サンプル中のエリートイベントｇａｔ−ｚｍ１を同定する方法およびキット - Google Patents

Description

【０００１】
発明の背景
植物におけるトランスジーンの表現型発現は、遺伝子自体の構造とその植物ゲノム内の位置とによって決定される。同時に、ゲノム内の異なる位置に（外来ＤＮＡの）トランスジーンが存在すると、その植物の全表現型に様々な点で影響を与えるであろう。遺伝子操作によって、植物中に商業的に興味深い形質を農学的または工業的に首尾良く導入することは、種々の要素しだいで非常に長い手順になることがある。遺伝子形質転換植物の実際の形質転換および再生は、広範囲にわたる遺伝子特性決定、育種、および野外実験での評価を含めた一連の選択ステップの初めに過ぎず、その結果として、エリートイベント（elite event）の選択がもたらされる。
【０００２】
エリートイベントの明確な同定は、Novel Food/Feedに関する審議、ＧＭＯおよび非ＧＭＯ製品の分離、ならびに未公表材料の同定のために、ますます重要になっている。そのような同定法は、広範囲な実験設備を必要とせず、迅速かつ簡単に行われるのが理想的である。さらに、そのような同定法は、専門家の分析なしにエリートイベントを明確に同定し得る結果を提供しなければならないが、必要な場合には専門家の監督下に置かれる。
【０００３】
ホスフィノトリシン耐性をコードするｐａｔ遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ／Ａｃを用いてトウモロコシを形質転換することによる、除草剤Liberty（登録商標）耐性トウモロコシの作出におけるエリートイベントとしてＧＡＴ−ＺＭ１が選択された。このトウモロコシは、例えば、AgriGold/Akin Seed Companyが販売しているLiberty Link（登録商標） Ａ６４６０ＬＬなどのLiberby Link（登録商標）トウモロコシとして市販されている。本明細書では、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための簡単かつ明確な方法に使用するためのツールを記載する。
【０００４】
発明の概要
本発明は、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定する方法に関し、この方法は、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキング配列を特異的に認識するプライマーまたはプローブに基づく。
【０００５】
より特定的に言えば、本発明は、生物学的サンプル中に存在する核酸の配列を増幅することを含む方法に関し、この方法は、１００〜３５０ｂｐのＤＮＡ断片を得るために、一方がＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキング領域を認識し、他方が外来ＤＮＡ内の配列を認識する、少なくとも２つのプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を用いる。これらのプライマーは、それぞれ、好ましくはＧＡＴ−ＺＭ１の５′フランキング領域内の配列、最も好ましくは配列番号６の５′フランキング領域内の配列、および外来ＤＮＡ内の配列を認識する。５′フランキング領域を認識するプライマーが本明細書に記載の配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、外来ＤＮＡ内の配列を認識するプライマーが配列番号１２のヌクレオチド配列を含むのが特に好ましい。
【０００６】
本発明は、より特定的には、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定する方法に関し、この方法は、１８０〜２２０ｂｐ、好ましくは約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得るために、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２のヌクレオチド配列を有する２つのプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を用いて、生物学的サンプル中に存在する核酸配列を増幅することを含む。
【０００７】
さらに、本発明は、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１に特異的な同定法を開発するために用い得る、本明細書記載のＧＡＴ−ＺＭ１の特定フランキング配列に関する。より特定的に言えば、本発明は、特異的プライマーおよびプローブの作成に用い得るＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキング領域に関する。さらに、本発明は、そのような特異的プライマーまたはプローブを使用して、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１の存在を同定する方法に関する。
【０００８】
本発明は、さらに、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するためのキットに関し、これらのキットは、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′または３′フランキング領域を特異的に認識する少なくとも１つのプライマーまたはプローブを含む。
【０００９】
本発明のキットは、ＰＣＲ同定プロトコールに用いるために、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′または３′フランキング領域を特異的に認識するプライマーのほかに、ＧＡＴ−ＺＭ１の外来ＤＮＡ内の配列を特異的に認識する第２のプライマーを含むのが好ましい。本発明のキットは、一方が、好ましくは、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′フランキング領域内、最も好ましくは、配列番号６の５′フランキング領域内の配列を認識し、他方が、外来ＤＮＡ内の配列を認識する、２つの特異的プライマーを含む。５′フランキング領域を認識するプライマーが本明細書記載の配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、トランスジーンを認識するプライマーが配列番号１２のヌクレオチド配列を含むのが特に好ましい。
【００１０】
本発明はさらに、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するためのキットに関し、このキットは、本明細書記載のＧＡＴ−ＺＭ１ ＰＣＲ同定プロトコールに用いるために、配列番号１１および配列番号１２のヌクレオチド配列を有するＰＣＲプライマーを含む。
【００１１】
また、本発明は、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するためのキットに関し、このキットは、ＧＡＴ−ＺＭ１の特定領域と８０〜１００％の配列同一性を有する配列に対応する（またはそのような配列に相補的な）配列を有する特異的プローブを含む。このプローブの配列は、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′または３′フランキング領域の一部を含む特定領域に対応しているのが好ましい。この特異的プローブは、配列番号６のヌクレオチド２８６〜４６６の配列と８０〜１００％の配列同一性を有する配列を有する（またはそのような配列に相補的である）のが最も好ましい。
【００１２】
本発明により包含される方法およびキットは、植物、植物材料、または植物材料を含むかそれらに由来する（生鮮もしくは加工）食品もしくは飼料などを含むがそれらには限定されない製品におけるＧＡＴ−ＺＭ１の同定などを含むがそれらには限定されない種々の目的に用い得る。さらにまたはその代わりに、本発明の方法およびキットは、トランスジェニック材料と非トランスジェニック材料とを分離するためのトランスジェニック植物材料の同定に用い得る。さらにまたはその代わりに、本発明の方法およびキットは、ＧＡＴ−ＺＭ１を含む植物材料の品質（すなわち、純粋材料パーセント）の測定に用い得る。
【００１３】
本発明はさらに、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキング領域に加えて、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′および／または３′フランキング配列から作成した特異的プライマーおよびプローブに関する。
【００１４】
詳細な説明
組換えＤＮＡ分子の植物ゲノムへの組込みは、通常、細胞もしくは組織の形質転換（または別の遺伝子操作）の結果生じる。特定の組込み部位は、「ランダム」組込みによるか、または（標的向け組込みプロセスを用いた場合には）予定された位置にある。
【００１５】
組換えＤＮＡまたは「形質転換ＤＮＡ」を用いた植物細胞または組織の形質転換の結果として植物ゲノムに導入されたＤＮＡは、以後、１つ以上の「トランスジーン」を含む「外来ＤＮＡ」と称される。したがって、外来ＤＮＡは、組換えＤＮＡと共に、新たに挿入され、再配列された植物ＤＮＡを含み得る。しかし、本発明の状況では用語「植物ＤＮＡ」とは、対応する野生型植物中の同じ遺伝子座に見出される植物ＤＮＡを表す。外来ＤＮＡは、植物ゲノム内の組換えＤＮＡ分子の組込み部位の位置および配置によって特性決定し得る。植物ゲノム内の組換えＤＮＡ挿入部位は、「挿入部位」または「標的部位」とも称される。組換えＤＮＡの植物ゲノムへの挿入は、「標的部位欠失」（target site deletion）と称される、植物ＤＮＡの欠失と一体にさせ得る。本明細書に用いられている限りにおいて、「フランキング領域」または「フランキング配列」とは、外来ＤＮＡの直ぐ上流に位置して外来ＤＮＡと隣接しているか、または外来ＤＮＡの直ぐ下流に位置して外来ＤＮＡと隣接している、少なくとも２０ｂｐ、好ましくは少なくとも５０ｂｐ、最大５０００ｂｐの植物ゲノム配列を表す。外来ＤＮＡのランダム組込みをもたらす形質転換手順により、それぞれ特有かつ独自の、異なるフランキング領域を有する複数の形質転換細胞が生じる。組換えＤＮＡを慣用的な交配を介して植物に導入した場合、通常、植物ゲノム中のその挿入部位またはそのフランキング領域は変わらない。本明細書に用いられている限りにおいて、「挿入領域」とは、植物ゲノム内の外来ＤＮＡの上流および／もしくは下流のフランキング領域を含む配列を包含する、少なくとも４０ｂｐ、好ましくは少なくとも１００ｂｐ、最大１００００ｂｐの領域に相当する領域を表す。種内突然変異によるわずかな相違を考慮に入れれば、同種植物と交配させると、挿入領域は、初期に形質転換によって得られた植物中の外来ＤＮＡの上流および下流フランキング領域を含む配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の配列同一性を保持する。
【００１６】
イベントとは、遺伝子操作の結果として、目的遺伝子の少なくとも１つのコピーを含むトランスジーンを保有する（人工）遺伝子座と定義される。あるイベントの典型的なアレルの状態は、外来ＤＮＡの存在または不在である。事象は、表現型的にはトランスジーンの発現によって特性決定される。遺伝子レベルでは、事象は植物の遺伝子構成の一部である。分子レベルでは、事象は、（例えば、サザーンブロッティングにより決定されるような）制限酵素マップにより、トランスジーンの上流および／または下流フランキング配列、トランスジーンの分子マーカーおよび／または分子配置によって特性決定し得る。通常、少なくとも１つの目的遺伝子を含む形質転換ＤＮＡを用いて植物を形質転換すると、それぞれが独自の多数のイベントがもたらされる。
【００１７】
本明細書に用いられている限りにおいて、エリートイベントとは、トランスジーンの発現および安定性ならびにトランスジーンを含む植物の最適な作物学的特性との適合性に基づいて、同一形質転換ＤＮＡを用いた形質転換によるか、またはそのような形質転換によって得られた植物との戻し交配によって得られる一群の事象から選択される事象である。したがって、エリートイベントの選択基準は、以下の基準の１つ以上、好ましくは２つ以上、有利にはすべてである：
（ａ） 外来ＤＮＡの存在が、作物学的性能または商業的価値に関するものなどの、植物の他の所望の特性を弱めないこと；
（ｂ） その事象が安定に遺伝し、同一性制御用の適切なツールの開発が可能である明確に定義された分子配置によって特性決定されること；
（ｃ） １つまたは複数の目的遺伝子が、その事象のヘテロ接合（または半接合）状態においてもホモ接合状態においても、その事象を有する植物が正常な作物学的用途において暴露される環境条件範囲において商業的に許容し得るレベルで、正しく、適切、かつ安定した空間的、時間的表現型発現を示すこと。
【００１８】
外来ＤＮＡは、所望の商用遺伝子バックグラウンドに容易に遺伝子移入し得る植物ゲノム内の位置に結合しているのが好ましい。
【００１９】
エリートイベントとしてのある事象の状態は、エリートイベントを異なる関連遺伝子バックグラウンドに遺伝子移入すること、および上記基準、例えば、（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の１つ、２つまたはすべてに合致することを観察することによって確認される。
【００２０】
したがって、「エリートイベント」とは、上記基準に合致する、外来ＤＮＡを含む遺伝子座を表す。植物、植物材料または種子などの後代は、そのゲノム内に１つ以上のエリートイベントを含み得る。
【００２１】
エリートイベントまたは植物、エリートイベントを含む植物材料、またはエリートイベントを有する植物材料を含む製品を同定するべく開発されたツールは、外来ＤＮＡ、分子マーカーまたは外来ＤＮＡの一方もしくは両側のフランキング領域の配列を含むゲノム領域の特定の制限酵素マップなどの、エリートイベントの特定のゲノム特性に基づいている。
【００２２】
外来ＤＮＡの一方または両側のフランキング領域が配列決定されたら、分子生物学的方法を用いてサンプル中の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）のこの（これらの）配列を特異的に認識するプライマーおよびプローブを作成することができる。例えば、（植物、植物材料または植物材料を含む製品などの）生物学的サンプル中のエリートイベントを同定するＰＣＲ法を開発し得る。そのようなＰＣＲは、一方がエリートイベントの５′または３′フランキング領域を認識し、他方が外来ＤＮＡ内の配列を認識する、少なくとも２つの特異的「プライマー」に基づく。これらのプライマーは、エリートイベントを含む核酸サンプルから特定の断片（「組込み断片」）が増幅されるように、最適化ＰＣＲ条件下に、それぞれ、エリートイベントの５′または３′フランキング領域内およびエリートイベントの外来ＤＮＡ内の配列を「特異的に認識する」１５〜３５ヌクレオチドの配列を有するのが好ましい。これは、最適化ＰＣＲ条件下に、植物ゲノムまたは外来ＤＮＡ内の標的組込み断片のみが増幅され、他の配列は増幅されないことを意味する。
【００２３】
組込み断片は、５０〜５００ヌクレオチドの長さを有するのが好ましく、１００〜３５０ヌクレオチドが最も好ましい。特異的プライマーは、それぞれ、エリートイベントの５′または３′フランキング領域内およびエリートイベントの外来ＤＮＡ内の配列と８０〜１００％同一の配列を有するのが好ましいが、但し、ミスマッチがあっても、最適化ＰＣＲ条件下にこれらのプライマーを用いてエリートイベントを特異的に同定し得ることを条件とする。しかし、許容可能なミスマッチ範囲は、実験により容易に決定できるし、当業者には公知である。
【００２４】
特異的プライマーの配列およびゲノム内でのそれらの相対位置はエリートイベントに特有であるから、組込み断片の増幅は、エリートイベント（の核酸）を含む生物学的サンプル中でのみ生じる。未知サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１の存在を同定するためにＰＣＲを実施する際には、エリートイベントを有する植物種の「ハウスキーピング遺伝子」内の断片を増幅し得るプライマーセットにコントロールを加えるのが好ましい。ハウスキーピング遺伝子は、ほとんどの細胞型で発現し、すべての細胞に共通する基本代謝活性に関与する遺伝子である。ハウスキーピング遺伝子から増幅された断片は、増幅組込み断片より大きい断片であるのが好ましい。分析サンプルに応じて、他のコントロールを加え得る。
【００２５】
標準ＰＣＲプロトコールは、「PCR Application Manual」（Roche Molecular Biochemicals, 2nd Edition, 1999）におけるように、当該技術に記載されている。特異的プライマーの配列を含めた、ＰＣＲに最適な条件は、各エリートイベントに関する「ＰＣＲ同定プロトコール」に詳述されている。しかし、ＰＣＲ同定プロトコールにおける多くのパラメータは、特定の実験室条件に合わせて調整する必要があり、類似の結果が得られるように僅かに改変し得るものと了解される。例えば、異なるＤＮＡ調製法を用いる場合には、例えば、用いるプライマーの量、ポリメラーゼ、およびアニーリング条件を調整する必要があり得る。同様に、他のプライマーを選択する場合には、ＰＣＲ同定プロトコールに関して他の最適条件が求められ得る。しかし、これらの調整は、当業者には自明であり、上記に引用したものなどの一般に用いられているＰＣＲアプリケーションマニュアルにさらに詳述されている。
【００２６】
あるいは、特異的プライマーを使って、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための「特異的プローブ」として用い得る組込み断片を増幅することができる。生物学的サンプルの核酸と特異的プローブとを、プローブと核酸中のその対応断片とのハイブリダイゼーションを可能にする条件下に接触させると、核酸／プローブハイブリッドが生成する。ＧＡＴ−ＺＭ１の存在を示すこのハイブリッドの生成は、（例えば、核酸またはプローブを標識して）検出することができる。（固相担体上または溶液中の）特異的プローブとのハイブリダイゼーションに基づくそのような同定法は当該技術に記載されている。特異的プローブは、最適化条件下に、エリートイベントの５′または３′フランキング領域内の、好ましくは隣接する外来ＤＮＡの一部をさらに含む領域（以後「特定領域」と称する）に特異的にハイブリダイズする配列であるのが好ましい。特異的プローブは、特定領域のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、好ましくは８０〜８５％、より好ましくは８５〜９０％、特に好ましくは９０〜９５％、最も好ましくは９５〜１００％同一である（またはそのような配列に相補的な）、５０〜５００ｂｐ、好ましくは１００〜３５０ｂｐの配列を含むのが好ましい。特異的プローブは、エリートイベントの特定領域と同一である（またはそのような領域に相補的な）約１５〜約１００の隣接ヌクレオチド配列を含むのが好ましいであろう。
【００２７】
本明細書に用いられている限りにおいて、「キット」とは、本発明の方法を実施するため、より特定的には、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための試薬セットを表す。より特定的に言えば、本発明のキットの好ましい実施形態は、上述のような、少なくとも１つまたは２つの特異的プライマーを含む。場合により、キットは、ＰＣＲ同定プロトコールに、本明細書記載の他の任意の試薬をさらに含み得る。あるいは、本発明の別の実施形態によれば、キットは、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１の存在を同定するために、生物学的サンプルの核酸と特異的にハイブリダイズする上述のような特異的プローブを含み得る。場合により、キットは、特異的プローブを用いて、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための（ハイブリダイゼーション緩衝液、標識などを含むがそれらには限定されない）他の任意の試薬をさらに含み得る。
【００２８】
本発明のキットは、品質管理（例えば、種子ロットの純度）、食品もしくは飼料などを含むがそれらには限定されない、植物材料または植物材料を含むかもしくは植物材料由来の材料中のエリートイベントを検出するために用いることが可能であり、キットの構成成分はその目的に合わせて特異的に調整し得る。
【００２９】
本明細書に用いられている限りにおいて、ヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に関する「配列同一性」とは、２つの配列の短い方のヌクレオチドの数で割った同一ヌクレオチドを有する位置の数を表す。２つのヌクレオチド配列の整列は、２０ヌクレオチドのウィンドーサイズ、４ヌクレオチドの語長、および４のギャップペナルティーを用いるウィルバーとリップマンのアルゴリズム（Wilbur and Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80 : 726）に従って実施する。上述の配列整列を含めた、コンピュータ援用解析および配列データの解釈は、例えば、Intelligenetics TM Suite〔カリフォルニア州、インテリジェネティクス社（Intelligenetics Inc., CA）〕プログラムまたはジェネティクス・コンピュータ・グループ〔Genetics Computer Group（ＧＣＧ），ウィスコンシン・バイオテクノロジー・センター大学（University of Wisconsin Biotechnology center）〕の配列解析ソフトウエアを用いて実施すると便利なことがある。配列は、少なくとも約７５％、特定的には少なくとも約８０％、より特定的には少なくとも約８５％、極めて特定的には約９０％、特に約９５％、とりわけ約１００％の配列同一性を有する場合に「実質的に類似である」と示される。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と実質的に類似であるとか、またはある程度の配列同一性を有すると言われる場合に、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）がＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に等しいと考えられることは明らかである。本明細書に用いられている限りにおいて「相補的」とは、ヌクレオチド配列中のＡとＴ（Ｕ）およびＧとＣヌクレオチドの間の相補性を表す。
【００３０】
本明細書に用いられている限りにおいて、用語「プライマー」とは、ＰＣＲなどの鋳型依存性プロセスにおける新生核酸の合成をプライミングし得る任意の核酸を包含する。通常、プライマーは、１０〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドであるが、もっと長い配列を用いてもよい。プライマーは、二本鎖形態で得ることもできるが、一本鎖形態が好ましい。プローブをプライマーとして用いることも可能であるが、プローブは、標的ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するように設計されており、増幅プロセスに用いる必要はない。
【００３１】
本明細書において特異的プライマーに関して用いられる限りにおいて、用語「認識する」とは、特異的プライマーが、（ＰＣＲ同定プロトコール条件などの）本発明の方法に記載されている条件下に、エリートイベント中の核酸配列に特異的にハイブリダイズすることを表し、その特異性は、ポジティブおよびネガティブコントロールの存在によって決定される。
【００３２】
本明細書において特異的プローブに関して用いられる限りにおいて、用語「ハイブリダイズする」とは、標準ストリンジェンシー条件下に、プローブがエリートイベントの核酸配列内の特定領域に結合することを表す。本明細書に用いられている限りにおいて、標準ストリンジェンシー条件とは、本明細書記載のハイブリダイゼーション条件またはSambrookら，1989（Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY）により記載されているような慣用のハイブリダイゼーション条件を表し、ハイブリダイゼーションは、例えば、以下のステップを含み得る：（１）植物のゲノムＤＮＡ断片をフィルター上に固定するステップ、（２）フィルターを、４２℃で１〜２時間、５０％ホルムアミド、５ Ｘ ＳＳＰＥ、２Ｘ デンハルトの（Denhardt's）試薬および０．１％ＳＤＳ中、または６８℃で１〜２時間、６ Ｘ ＳＳＣ、２Ｘ デンハルトの試薬および０．１％ＳＤＳ中で予備ハイブリダイズするステップ、（３）標識したハイブリダイゼーションプローブを添加するステップ、（４）１６〜２４時間インキュベートするステップ、（５）フィルターを、室温下に２０分間１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄するステップ、（６）フィルターを、それぞれ６８℃で２０分間、０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３回洗浄するステップ、および（７）フィルターを、−７０℃下に、増感板を用い、Ｘ線フィルムに２４〜４８時間暴露するステップ。
【００３３】
本明細書に用いられている限りにおいて、生物学的サンプルは、植物、植物材料または植物材料を含む製品のサンプルである。用語「植物」は、任意の成熟段階のトウモロコシ（Zea mays）植物組織のほかに、任意の種子、葉、茎、花、根、単細胞、配偶子、培養細胞、培養組織またはプロトプラストを含むがそれらには限定されない、任意の上記植物から採取されるかそのような植物由来の任意の細胞、組織、または器官を包含するものとする。本明細書に用いられている限りにおいて、「植物材料」とは、植物から得られるか、または植物由来の材料を表す。植物材料を含む製品とは、植物材料を用いて生産されるか、植物材料によって混入汚染されている可能性がある食品、飼料または他の製品のことを言う。本発明においては、そのような生物学的サンプルは、サンプル中の核酸の存在を示唆する、ＧＡＴ−ＺＭ１に特異的な核酸の存在について試験されるものと了解される。したがって、本明細書記載の生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１同定法は、生物学的サンプル中のエリートイベントを含む核酸の同定に関する。
【００３４】
本明細書に用いられている限りにおいて、「含む」（comprising）とは、言及されているような規定された特徴、整数、ステップ、試薬または成分の存在を指定するが、１つ以上の特徴、整数、ステップもしくは成分、またはそのグループの存在または付加をも包含するものと解釈すべきである。したがって、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を含む核酸またはタンパク質は、実際に列挙されたものより多くのヌクレオチドまたはアミノ酸を含む、すなわち、より大きな核酸またはアミノ酸中にはめ込まれていることがある。機能または構造が解明されているＤＮＡ配列を含むキメラ遺伝子は、追加のＤＮＡ配列などを含み得る。
【００３５】
以下の実施例は、生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するためのツールの作成を説明している。
【００３６】
特に断りのない限り、すべての組換えＤＮＡ法は、Sambrookら（1989）Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NYならびにAusubelら（1994）Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, USAの第１および第２巻に記載されている標準プロトコールに従って実施される。植物分子研究用の標準材料および方法は、BIOS Scientific Publications Ltd（UK）およびBlackwell Scientific Publications, UKから出版されたR. D. D. CroyによるPlant Molecular Biology Labfax（1993）に記載されている。
【００３７】
説明および実施例においては、以下の配列が参照される：
配列番号１： ベクターｐＵＣ／Ａｃの遺伝要素の配列
配列番号２： プライマーＭＤＢ２８６
配列番号３： プライマーＭＤＢ３９１
配列番号４： プライマーＭＤＢ４１１
配列番号５： プライマーＭＤＢ４２０
配列番号６： ＧＡＴ−ＺＭ１の５′フランキング領域を含むヌクレオチド配列
配列番号７： プライマーＭＤＢ４３９
配列番号８： プライマーＶＤＳ４４
配列番号９： プライマーＭＤＢ５２２
配列番号１０： ＧＡＴ−ＺＭ１の３′フランキング領域を含むヌクレオチド配列
配列番号１１： プライマーＣＯＲ１７
配列番号１２： プライマーＣＯＲ１８
配列番号１３： プライマーＣＯＲ１５
配列番号１４： プライマーＣＯＲ１６
本発明を、記載されている特定の実施形態に限定するものではない以下の実施例は、参照として本明細書に組み込まれている添付図面と関連させるとより良く理解されるであろう。
【００３８】
実施例
１． エリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１のフランキング領域の同定
カリフラワーモザイクウイルスからの構成３５Ｓプロモーターの制御下に、酵素ホスフィノトリシン−アセチル−トランスフェラーゼをコードするｐａｔ遺伝子のコート配列を含むｐＵＣ／Ａｃベクターを用いてトウモロコシを形質転換して、除草剤耐性トウモロコシを作出した。ｐＵＣ／Ａｃの遺伝要素の詳細な説明は表１に示されている。ｐＵＣ／Ａｃの遺伝要素のヌクレオチド配列は配列番号１で与えられている。
【００３９】
【表１】

【００４０】
エリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１は、除草剤耐性遺伝子の良好な発現および安定性ならびにその最適な作物学特性との適合性を根拠にした広範囲な選択手順に基づいて選択された。
【００４１】
ＧＡＴ−ＺＭ１事象中の外来ＤＮＡに隣接する領域の配列は、Liuら〔1995,Plant J.8(3):457-463〕により記載されている熱非対称インターレース〔thermal asymmetric interlaed〕（ＴＡＩＬ−）〕ＰＣＲ法を用いて決定した。この方法は、特異的産物と非特異的産物の相対増幅効率を熱制御し得るように、連続反応において、３つの重ね合わされたプライマーと共に任意の短い縮重プライマーを利用する。特異的プライマーは、外来ＤＮＡのボーダーにアニールするために、それらのアニーリング条件に基づいて選択された。１％アガロースゲル上で、少量（５μl）の非精製二次および三次ＰＣＲ産物を分析した。予備増幅用には三次ＰＣＲ産物を用い、精製し、DyeDeoxy Terminatorサイクルキットを用いて自動シークエンサーで配列決定した。
【００４２】
１．１ 右側（５′）フランキング領域
用いたプライマーは以下の通りであった：
【００４３】
【表２】

【００４４】
ＭＤＢ２８６−ＭＤＢ４２０を用いて増幅した断片は約１１００ｂｐであり、その完全配列が決定された（配列番号６）。ヌクレオチド１〜３４１の配列は、物ＤＮＡに対応し、ヌクレオチド３４２〜１０４１の配列はＴ−ＤＮＡに対応する。
【００４５】
１．２ 左（３′）フランキング領域
用いたプライマーは以下の通りであった：
【００４６】
【表３】

【００４７】
ＭＤＢ２８６−ＭＤＢ５２２を用いて増幅した断片は約４５０ｂｐであり、その完全配列が決定された（配列番号１０）。ヌクレオチド１〜３４２の配列はＴ−ＤＮＡに対応し、ヌクレオチド３４３−４８４の配列は植物ＤＮＡに対応する。
【００４８】
２． ポリメラーゼ連鎖反応同定プロトコールの開発
２．１ プライマー
エリートイベント内の配列を認識する特異的プライマーを作成した。より特定的に言えば、ＧＡＴ−ＺＭ１の５′フランキング領域内の配列を認識するプライマーを作成した。次いで、プライマーが約２００ｂｐの配列にまたがるように外来ＤＮＡの配列内の第２プライマーを選択した。以下のプライマーは、ＧＡＴ−ＺＭ１ＤＮＡに関するＰＣＲ反応において特に明確かつ再現可能な結果を与えることが判明した：
ＣＯＲ１７： ５′−ｇｇｇ．ＴｇＡ．ｇＣＴ．ＣｇＡ．ＡＴｇ．ＴＴｇ．ＴＴＣ．Ｔ−３′（配列番号１１）
（標的： 植物ＤＮＡ）
ＣＯＲ１８： ５′−ＴＣＴ．ＴＡｇ．ＡＣｇ．ＴＣＡ．ｇｇＴ．ｇｇＣ．ＡＣＴ．Ｔ−３′（配列番号１２）
（標的： Ｔ−ＤＮＡ）
【００４９】
ＰＣＲカクテル中に、内在配列を標的とするプライマーを含めるのが好ましい。これらのプライマーは、未知サンプルやＤＮＡのポジティブコントロールにおいて内部コントロールとしての役を果たす。内在プライマー対を用いた場合の陽性結果は、ゲノムＤＮＡサンプル中にＰＣＲ産物を生成させるのに十分な適切な品質のＤＮＡが存在することを示している。トウモロコシ（Zea mays）中のハウスキーピング遺伝子を認識する内在プライマーを選択した：
ＣＯＲ１５： ５′−ＡｇＣ．ｇＴＣ．ＡＡｇ．ｇＡＴ．ＣＡＴ．Ｔｇｇ．ＴｇＴ．Ｃ−３′（配列番号１３）
〔Ｚｅａ Ｍａｙｓアルコールデヒロドロゲナーゼ１遺伝子（Ｘ０４０５０）中に位置〕
ＣＯＲ１６： ５′−ｇｇＣ．ＣＡＡ．ｇＴＴ．ＣＡｇ．ＣＡＴ．ＡＡＧ．ＣＴｇ．Ｔ−３′（配列番号１４）
〔Ｚｅａ Ｍａｙｓアルコールデヒドロゲナーゼ１遺伝子（Ｘ０４０５０）中に位置〕
【００５０】
２．２ 増幅断片
ＰＣＲ反応において予測される増幅断片は以下の通りである：
プライマー対ＣＯＲ１５−ＣＯＲ１６の場合： ５１３ｂｐ（内在コントロール）
プライマー対ＣＯＲ１７−ＣＯＲ１８の場合： ２０２ｂｐ（ＧＡＴ−ＺＭ１エリートイベント）
【００５１】
２．３ 鋳型ＤＮＡ
鋳型ＤＮＡは、Edwardsら（Nucleic Acid Research, 19, p1349, 1991）に従ってリーフパンチ（leaf punch）から作成した。他の方法で作成したＤＮＡを用いる場合には、種々の量の鋳型を利用するテストランを行う必要がある。通常、５０ngのゲノム鋳型ＤＮＡで最上の結果が得られる。
【００５２】
２．４ 割当てられたポジティブおよびネガティブコントロール
偽陽性または偽陰性を回避するために、以下のポジティブおよびネガティブコントロールをＰＣＲランに含めるべきであると決定された。
【００５３】
− マスターミックスコントロール（ＤＮＡネガティブコントロール）。これは、反応にＤＮＡを加えないＰＣＲである。予測された結果としてＰＣＲ産物が全く観察されない場合、これは、ＰＣＲカクテルが標的ＤＮＡで混入汚染されていなかったことを示している。
【００５４】
− ＤＮＡポジティブコントロール（トランスジェニック配列を含むことが分っているゲノムＤＮＡサンプル）。このポジティブコントロールが首尾良く増幅されたことは、ＰＣＲが標的配列の増幅を可能にする条件下に実行されたことを示している。
【００５５】
− 野生型ＤＮＡコントロール。これは、提供された鋳型ＤＮＡが非トランスジェニック植物から作成されたゲノムＤＮＡであるＰＣＲである。予測された結果としてトランスジーンＰＣＲ産物の増幅がなく、内在ＰＣＲ産物の増幅が観察された場合、これは、ゲノムＤＮＡサンプル中に検出可能なトランスジーンバックグラウンド増幅が存在しないことを示している。
【００５６】
２．５ ＰＣＲ条件
以下の条件下に最適結果が得られた：
− ２５μl反応用のＰＣＲミックスは以下を含む：
２．５μlの鋳型ＤＮＡ
２．５μlの１０ｘ増幅緩衝液（Ｔａｑポリメラーゼ補充）
０．５μlの１０ｍＭ ｄＮＴＰ′ｓ
０．５μlのＣＯＲ１７（１０pmol／μl）
０．５μlのＣＯＲ１８（１０pmol／μl）
０．２５μlのＣＯＲ１５（１０pmol／μl）
０．２５μlのＣＯＲ１６（１０pmol／μl）
０．１μlのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（５単位／μl）
２５μlまでの水
− 最適結果を得るために従うべきサーモサイクルプロフィールは以下の通りである：
９５℃で４分
次いで： ９５℃で１分
５７℃で１分
７２℃で２分
以上を５サイクル
次いで： ９２℃で３０秒
５７℃で３０秒
７２℃で１分
以上を２５サイクル
次いで： ７２℃で５分
【００５７】
２．６ アガロースゲル分析
ＰＣＲの結果を最適に視覚化するためには、適切な分子量マーカー（例えば、１００ｂｐラダーＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を含む１．５％アガロースゲル（Ｔｒｉｓ−ボレート緩衝液）上に１０〜２０μlのＰＣＲサンプルを適用すべきであると決定された。
【００５８】
２．７ 結果の検証
１回のＰＣＲランおよび単一のＰＣＲカクテル範囲内のトランスジェニック植物ＤＮＡサンプルからのデータは、（１）ＤＮＡポジティブコントロールが予測されたＰＣＲ産物（トランスジェニックおよび内在断片）を示し、（２）ＤＮＡネガティブコントロールがＰＣＲ増幅に関して陰性である（無断片）であり、（３）野生型ＤＮＡコントロールが予測された結果（内在断片の増幅）を示すのでない限り、許容し得ないと決定された。
【００５９】
上述のようなＧＡＴ−ＺＭ１に関するＰＣＲ同定プロトコールの結果、可視量の予測サイズのトランスジェニックおよび内在ＰＣＲ産物を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡを作成した対応植物がＧＡＴ−ＺＭ１エリートイベントを受け継いでいることを示している。可視量のトランスジェニックＰＣＲ産物を示さず、可視量の内在ＰＣＲ産物を示すレーンは、ゲノム鋳型ＤＮＡを作成した対応植物がエリートイベントを含んでいないことを示している。可視量の内在およびトランスジェニックＰＣＲ産物を示さないレーンは、ゲノムＤＮＡの質および／または量がＰＣＲ産物を生成させ得なるのに十分でなかったことを示している。これらの植物はスコアできない。ゲノムＤＮＡの作成を繰返し、適切なコントロールを用いて新規なＰＣＲランを実施すべきである。
【００６０】
２．８ ＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための識別ＰＣＲプロトコールの使用
未知サンプルをスクリーニングしようとする前に、すべての適切なコントロールを用いたテストランを実施すべきである。開発されたプロトコールは、実験室毎に異なり得る構成要素（鋳型ＤＮＡの作成、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、プライマーの品質、ｄＮＴＰ′ｓ、サーモサイクラーなど）の最適化を必要とし得る。
【００６１】
内在配列の増幅はこのプロトコールにおいて重要な役割を果たす。既知トランスジェニックゲノムＤＮＡ鋳型中の等モル量の内在配列とトランスジェニック配列とを増幅するＰＣＲおよびサーもサイクリング条件を達成しなければならない。標的内在断片が増幅されないか、またはアガロースゲル電気泳動で判断して、標的配列が同じ臭化エチジウム染色度で増幅されないときはいつでも、ＰＣＲ条件を最適化する必要があり得る。
【００６２】
ＧＡＴ−ＺＭ１を含むものもある多数の植物からのZea mays葉材料を上述のプロトコールに従ってテストした。エリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１およびZea mays野生型からのサンプルを、それぞれポジティブおよびネガティブコントロールとした。
【００６３】
図１は、多数のトウモロコシサンプル（レーン１〜１４）に関するＧＡＴ−ＺＭ１のエリートイベントＰＣＲ同定プロトコールで得られた結果を示している。レーン１、２、５、６、７、８、１１、１３および１４のサンプルは、２０２ｂｐのバンドが検出されるのでエリートイベントを含むと判定されたが、レーン４、９、１０および１２のサンプルはＧＡＴ−ＺＭ１を含んでいない。レーン３は、コントロールバンドが検出されないので、ＰＣＲの失敗を示している。レーン１９および２０は、ＧＡＴ−ＺＭ１のポジティブコントロールサンプルを表し、レーン２０および２２は、非トランスジェニックZea maysコントロールを表し、レーン２３は、ネガティブコントロール（水）サンプルを表し、レーン２４は分子量マーカー（１００ｂｐ）を表す。
【００６４】
３． ＧＡＴ−ＺＭ１を含む材料の検出用プローブとしての特異的組込み断片の使用
ＧＡＴ−ＺＭ１の特異的組込み断片は、特異的プライマーＣＯＲ１７（配列番号１１）およびＣＯＲ１８（配列番号１２）を用いたＰＣＲ増幅または化学合成によって得られ、標識される。この組込み断片は、生物学的サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１を検出するための特異的プローブとして用いられる。標準手順に従ってサンプルから核酸を抽出する。次いで、この核酸を、ハイブリッドを形成させるように最適化されたハイブリダイゼーション条件下に特異的プローブと接触させる。次いで、サンプル中のＧＡＴ−ＺＭ１核酸の存在を示すハイブリッド形成を検出する。場合により、サンプル中の核酸を、特異的プローブと接触させる前に特異的プライマーを用いて増幅させる。あるいは、核酸を、組込み断片の代わりの特異的プローブと接触させる前に標識する。場合により、特異的プローブを、サンプルと接触させる前に、（フィルター、ストリップまたはビーズなどを含むがそれらには限定されない）固体担体に結合させる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＧＡＴ−ＺＭ１用に開発されたＰＣＲ同定プロトコールを用いた未知サンプルのスコアリング。ゲルの担荷配列：未知サンプル：レーン１、２、５、６、８、１１、１３、１４、トランスジェニック事象ＧＡＴ−ＺＭ１を含むトウモロコシ植物からのＤＮＡサンプル；レーン４、９、１０、１２、エリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を含まないトウモロコシ植物からのＤＮＡサンプル；レーン３、ＰＣＲ失敗。コントロールレーン：レーン１９、２１、エリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を含むトウモロコシ植物からのコントロールＤＮＡサンプル；レーン２０、２２、野生型トウモロコシ植物からのコントロールＤＮＡサンプル；レーン２３、鋳型を含まないコントロール；レーン２４、分子量マーカー。
【配列表】

Claims (11)

1. 生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための方法であって、一方が配列番号６の１位のヌクレオチドから３４１位のヌクレオチド内の配列または配列番号１０の３４３位のヌクレオチドから４８４位のヌクレオチド内の配列を認識し、他方が配列番号１内の配列を認識する少なくとも２つのプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応を用いて、前記生物学的サンプル中に存在する核酸から１００〜３５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを増幅することを含む方法。
2. 前記プライマーの一方が配列番号６の１位のヌクレオチドから３４１位のヌクレオチド内の配列を認識し、前記他方のプライマーが配列番号１内の配列を認識する、請求項２記載の方法。
3. 前記プライマーが、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２の配列を含む、請求項２記載の方法。
4. 以下：
   ａ．９５℃で４分；次いで
   ｂ．９５℃で１分、５７℃で１分、７２℃で２分、以上を５サイクル；次いで
   ｃ．９２℃で３０秒、５７℃で３０秒、７２℃で１分、以上を２５サイクル；次いで
   ｄ．７２℃で５分
   のサーモサイクルプロフィールを用いる条件下でのポリメラーゼ連鎖反応を用いて、１５０〜２２０ｂｐのフラグメントを増幅することを含み、前記プライマーの配列が、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２のヌクレオチド配列に対応する、請求項１記載の方法。
5. ２０２ｂｐのフラグメントを増幅することを含む、請求項４記載の方法。
6. 生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するためのキットであって、配列番号６の１位のヌクレオチドから３４１位のヌクレオチド内の配列または配列番号１０の３４３位のヌクレオチドから４８４位のヌクレオチド内の配列を認識する第１のＰＣＲプライマー、および配列番号１内の配列を認識する第２のＰＣＲプライマーを含むキット。
7. 前記第１のＰＣＲプライマーが、配列番号６の１位のヌクレオチドから３４１位のヌクレオチド内の配列を認識する、請求項６記載のキット。
8. 前記ＰＣＲプライマーが、それぞれ、配列番号１１および配列番号１２の配列を含む、請求項７記載のキット。
9. 生物学的サンプル中のエリートイベントＧＡＴ−ＺＭ１を同定するための方法であって、配列番号６の１位のヌクレオチドから３４１位のヌクレオチド内の配列およびそれに隣接する配列番号１の外来ＤＮＡの一部、または配列番号１０の３４３位のヌクレオチドから４８４位のヌクレオチド内の配列およびそれに隣接する配列番号１の外来ＤＮＡの一部を認識する特異的プローブを用いて前記生物学的サンプル中の少なくとも１００ｂｐのＤＮＡフラグメントを検出することを含む方法。
10. 生物学的サンプルの核酸と、配列番号６のヌクレオチド２８６〜４８７と少なくとも９５％の配列同一性を有するプローブとをハイブリダイズさせることを含む、請求項９記載の方法。
11. 種子純度を確認するための請求項１または９記載の方法。

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