BRPI0107574B1

BRPI0107574B1 - Métodos e kit para identificar evento elite gat-zm1 em amostras biológicas

Info

Publication number: BRPI0107574B1
Application number: BRPI0107574-8A
Authority: BR
Inventors: De Beuckeleer Marc
Original assignee: Bayer Cropscience Nv
Priority date: 2000-01-11
Filing date: 2001-01-09
Publication date: 2018-02-27
Also published as: EP1250461B1; US6395485B1; US6951929B2; ATE350488T1; WO2001051654A3; CA2396778C; CN100400670C; US20010029014A1; WO2001051654A2; BR0107574A; JP4623910B2; CN1396957A; DE60125715D1; AU3541401A; AU2001235414B2; DE60125715T2; JP2003524416A; CA2396778A1; ES2277912T3; EP1250461A2

Abstract

"métodos e kits para identificar evento de elite gat-zm1 em amostras biológicas" a invenção refere-se a instrumentos que são fornecidos, os quais permitem rápida e inequívoca identificação de evento de elite gat-zm1 nas biológicas.

Description

(54) Título: MÉTODOS E KIT PARA IDENTIFICAR EVENTO ELITE GAT-ZM1 EM AMOSTRAS

BIOLÓGICAS (51) Int.CI.: C12Q 1/68 (30) Prioridade Unionista: 11/01/2000 US 09/481,049 (73) Titular(es): BAYER CROPSCIENCE NV (72) Inventor(es): MARC DE BEUCKELEER

1/21

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS E

KIT PARA IDENTIFICAR EVENTO ELITE GAT-ZM1 EM AMOSTRAS BIOLÓGICAS.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

A expressão fenotípica de um transgênico em uma planta é determinada igualmente pela estrutura do gene propriamente dito e pela sua localização no genoma da planta. Ao mesmo tempo a presença do transgênico (em um DNA estrangeiro) em diferentes localizações no genoma influenciará o fenótipo total da planta de diferentes modos. A introdução industri10 almente ou agronomicamente bem-sucedida de um traço comercialmente interessante em uma planta por manipulação genética pode ser um procedimento longo dependendo de diferentes fatores. A regeneração e transformação atual de plantas geneticamente transformadas são somente as primeiras de uma série de etapas de seleção, que inclui caracterização genéti15 ca extensiva, geração e avaliação em experiências de campo, eventualmente induzindo à seleção de um evento de elite.

A identificação inequívoca de um evento de elite está tornandose cada vez mais importante em vista de discussões sobre Novos Alimentos/ Gêneros Alimentícios, segregação de produtos GMO e não GMO e a identi20 ficação do material proprietário. Idealmente, tal método de identificação é igualmente rápido e simples, sem a necessidade de uma organização de laboratório extensiva. Além disso, o método deveria fornecer resultados que permitam a determinação inequívoca do evento de elite sem interpretação especializada, porém que adie o exame especializado se necessário.

GAT-ZM1 foi selecionado como um evento de elite no desenvolvimento de milho resistente ao herbicida Liberty^®, pela transformação do milho com plasmídeo pUC/Ac compreendendo a tolerância de codificação de gene pat para fosfinotricina. Ele é comercialmente vendido como milho Liberty Link®, tal como, por exemplo, Liberty Link® A6460LL vendido por Agr30 Gold/Akin Seed Company. Os instrumentos para uso em métodos inequívocos e simples para a identificação de evento de elite GAT-ZM1 em amostras biológicas são descritos aqui.

Petição 870170031595, de 12/05/2017, pág. 8/15

Sumário da Invenção ;··* · : : : : : : I”: ;* * ··· ·· ··· ·· · ·· ·

A presente invenção refere-se a métodos para a identificação do evento de elite GAT-ZM1 em amostras biológicas, cujos métodos são com base em primers e sondas que especificadamente reconhecem a seqüência de flanqueamento 3' e/ou 5' de GAT-ZM1.

Mais especificadamente, a invenção refere-se a um método compreendendo amplificar uma seqüência de um acido nucléico presente em amostras biológicas, empregando uma reação de cadeia de polimerase com pelo menos dois primers, um dos quais reconheça a região de flanqueamento 3' ou 5' de GAT-ZM1, o outro do qual reconheça uma seqüência no DNA estrangeiro, para obter um fragmento de DNA dentre 100 e 350 pares de base. Preferivelmente, os primers reconhecem uma seqüência na região de flanqueamento 5' de GAT-ZM1, mais preferivelmente na região de flanqueamento 5' da SEQ ID No 6, e uma seqüência no DNA estrangeiro, respectivamente. Especialmente preferivelmente, o primer reconhecendo a região de flanqueamento 5' compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID N° 11 e o primer reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeiro compreende a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID N² 12 descrita aqui.

A presente invenção mais especificadamente refere-se a um método para a identificação de evento de elite GAT-ZM1 em amostras biológicas, cujo método compreende amplificar uma seqüência de um ácido nucléico presente em uma amostra biológica, empregando uma reação de cadeia de polimerase com dois primers tendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID No 11 e SEQ ID No 12 respectivamente, para obter um fragmento de DNA dentre 180 e 220 pares de base, preferivelmente de cerca de 200 pares de base.

A presente invenção ainda refere-se às seqüências de flanqueamento específicas de GAT-ZM1 descritas aqui, que podem ser empregadas para desenvolver métodos de identificação específicos para GAT-ZM1 em amostras biológicas. Mais particularmente, a invenção refere-se à regiões de flanqueamento 3' ou 5' de GAT-ZM1 que podem ser empregadas para o desenvolvimento de sondas e primers específicos. A invenção ainda relaci30

- — ▼ V W V * v « v * w v * * • · · · · ·· · · · · · · ona-se com métodos de identificação quanto a:-presença dé GÁT:Zl\JT:eig*i ^:··· amostras biológicas com base no uso de tais sondas ou primers específicos.

A invenção ainda refere-se a kits para a identificação de evento de elite GAT-ZM1 em amostras biológicas, referidos kits compreendendo pelo menos um primer ou sonda que especificadamente reconhece a região de flanqueamento 3' ou 5' de GAT-ZM1.

Preferivelmente o kit da invenção compreende, além de um primer que especificadamente reconhece a região de flanqueamento 3' ou 5' de GAT-ZM1, um segundo primer que especificadamente reconhece uma seqüência no DNA estrangeiro de GAT-ZM1, para uso em um protocolo de identificação PCR. Preferivelmente, o kit da invenção compreende dois primers específicos, um dos quais reconhece uma seqüência na região de flanqueamento 5' de GAT-ZM1, mais preferivelmente na região de flanqueamento 5' da SEQ ID No 6, e o outro que reconhece uma seqüência no DNA estrangeiro. Especialmente preferivelmente, o primer reconhecendo a região de flanqueamento 5' compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No 11 e o primer reconhecendo o transgênico compreende a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID No 12 descrita aqui.

A invenção ainda refere-se a um kit para a identificação do evento de elite GAT-ZM1 em amostras biológicas, referido kit compreendendo os primers PCR tendo a seqüência de nucleotídeo de SEQ ID No 11 e SEQ ID No 12 para uso no protocolo de identificação PCR de GAT-ZM1 descrito aqui.

A invenção também refere-se a um kit para a identificação do evento de elite GAT-ZM1 em amostras biológicas, cujo kit compreende uma sonda específica tendo uma seqüência que corresponde a (ou é complementar a) uma seqüência tendo entre 80% e 100% de identidade de seqüência com uma região específica de GAT-ZM1. Preferivelmente a seqüência da sonda corresponde a uma região específica compreendendo parte da região de flanqueamento 3' ou 5' de GAT-ZM1. Mais preferivelmente a sonda específica tem (ou é complementar a) uma seqüência tendo entre 80% e 100% de identidade de seqüência para a seqüência entre 286

e 466 nucleotídeos da SEQ ID No 6. :··* ·: : : : : :

* ··· ♦· ··· ·· « ·· ·

Os métodos e kits abrangidos pela presente invenção podem ser empregados para diferentes propósitos tal como, porém não limitados aos seguintes: para identificar GAT-ZM1 em plantas, material de planta ou em produtos tais como, porém não limitados a produtos de gênero alimentício ou alimentos (frescos ou processados) compreendendo ou derivados de material de planta; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser empregados para identificar material de planta transgênica com propósito de segregação entre material transgênico ou não transgênico; adicionalmente ou alternativamente, os métodos e kits da presente invenção podem ser empregados para determinar a qualidade (isto é, percentual de material puro) de material de planta compreendendo GAT-ZM1.

A invenção ainda refere-se às regiões de flanqueamento 3' e/ou 5' de GAT-ZM1 bem como a sondas e primers específicos desenvolvidos a partir de seqüências de flanqueamento 3' e/ou 5' de GAT-ZM1.

Descrição Detalhada

A incorporação de uma molécula de DNA recombinante no genoma da planta tipicamente resulta da transformação de uma célula ou tecido (ou de outra manipulação genética). O sítio particular de incorporação é ou devido à integração aleatória ou está em uma localização predeterminada (se um processo de integração alvejado é empregado).

O DNA introduzido no genoma da planta como um resultado da transformação de um tecido ou célula de planta com um DNA recombinante ou DNA de transformação é mais adiante referido como DNA estrangeiro compreendendo um ou mais transgênicos. Desse modo, o DNA estrangeiro pode compreender igualmente DNA recombinante bem como recentemente introduzido, DNA reorganizado da planta. Entretanto, o termo DNA da planta no contexto da presente invenção estará se referindo ao DNA da planta que é encontrado na mesma localização genética na planta de tipo silvestre correspondente. O DNA estrangeiro pode ser caracterizado pela localização e a configuração no sítio de incorporação da molécula de DNA ·· * · recombinante no genoma da planta. O sítio no ^e‘nOrnâ_tda^lânt^ p’ncjfe*:urjí J··· DNA recombinante tem sido inserido é também referido como o sítio de inserção ou sítio alvo. A inserção do DNA recombinante no genoma da planta pode ser associada com uma anulação do DNA da planta, referindose como deleção do sítio alvo. Uma região de flanqueamento ou seqüência de flanqueamento como empregado aqui refere-se a uma seqüência de pelo menos 20 pares de base, preferivelmente pelo menos 50 pares de base, e até 5000 pares de base do genoma da planta que está localizado ou imediatamente a montante e contíguo com ou imediatamente a jusante e contíguo com o DNA estrangeiro. Os procedimentos da transformação induzindo à integração aleatória do DNA estrangeiro resultará em transformantes com regiões de flanqueamento diferentes, que são característicos e únicos para cada transformante. Quando o DNA recombinante é introduzido em uma planta por meio de um cruzamento tradicional, seu sítio de inserção no genoma da planta, ou suas regiões de flanqueamento geralmente não serão alteradas. Uma região de inserção como empregado aqui refere-se à região correspondente, à região de pelo menos 40 pares de base, preferivelmente pelo menos 100 pares de base, e até 10000 pares de base, abrangido pela seqüência que compreende a região de flanqueamento a montante e/ou a jusante de um DNA estrangeiro no genoma da planta. Levando em consideração menores diferenças devido às mutações em uma espécie, uma região de inserção reterá, no cruzamento em uma planta da mesma espécie, pelo menos 85%, preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95%, e ainda mais preferivelmente 100% de identidade de seqüência com a seqüência compreendendo as regiões de flanqueamento a montante e a jusante do DNA estrangeiro na planta originalmente obtidas a partir da transformação.

Um evento é definido como uma localização genética (artificial) que, como um resultado de manipulação genética, suporta um transgênico compreendendo pelo menos uma cópia de um gene de interesse. Os estados alélicos típicos de um evento são a presença ou ausência do DNA estrangeiro. Um evento é caracterizado fenotipicamente pela expressão do ··· ···· transgênico. A nível genético, um evento é partejdá CQmppsigãõ.çjeilétiç^dç uma planta. A nível molecular, um evento pode ser caracterizado pelo mapa de restrição (por exemplo, como determinado pelo manchamento do Sul), pelas seqüências de flanqueamento a montante e/ou a jusante do transgênico, a localização dos marcadores moleculares e/ou a configuração molecular do transgênico. Freqüentemente, a transformação de uma planta com um DNA de transformação compreendendo pelo menos um gene de interesse induz a uma multidão de eventos, cada do qual é único.

Um evento de elite, como empregado aqui, é um evento que é selecionado a partir de um grupo de eventos, obtido pela transformação com o mesmo DNA de transformação ou por cruzamento reversível com plantas obtidas por tal transformação, com base na expressão e estabilidade dos transgênicos e sua compatibilidade com características agronômicas ótimas da planta compreendendo-as. Desse modo os critérios para a seleção do evento de elite são um ou mais, preferivelmente dois ou mais, vantajosamente todos dos seguintes:

a) O qual a presença do DNA estrangeiro não compromete outras características desejadas da planta, tais como aquelas relacionadas ao valor comercial ou desempenho agronômico;

b) O qual o evento é caracterizado por uma configuração molecular bem definida que é estavelmente herdada e para que instrumentos apropriados para controle de identidade possam ser desenvolvidos;

c) O qual o(s) gene(s) de interesse mostra(m) uma expressão fenotípica temporal e espacial estável e apropriada, correta, igualmente na condição de heterozigoto (ou hemizigoto) e homozigoto do evento, a um nível comercialmente aceitável em uma faixa de condições ambientais na qual as plantas carregando o evento são prováveis de serem expostas no uso agronômico normal.

É preferido que o DNA estrangeiro seja associado com uma posição no genoma da planta que permita fácil introgressão nos fundamentos genéticos comerciais desejados.

O status de um evento como um evento de elite é confirmado

pela introgressão do evento de elite em fundamentos geciétÈçósÀejèvqptes diferentes e observando a complacência com um, dois ou todos dos critérios, por exemplo a), b) e c) acima.

Um evento de elite desse modo refere-se a uma localização genética compreendendo um DNA estrangeiro, que responde ao critério descrito acima. Uma planta, um material de planta ou descendências tal como sementes pode compreender um ou mais eventos de elite em seu genoma.

Os instrumentos desenvolvidos para identificar um evento de elite ou a planta, material de planta compreendendo um evento de elite, ou produtos que compreendem material de planta compreendendo o evento de elite são com base nas características genômicas específicas do evento de elite, tal como, um mapa de restrição específico da região genômica compreendendo o DNA estrangeiro, os marcadores moleculares ou a seqüência das regiões de flanqueamento do DNA estrangeiro.

Uma vez que uma ou ambas das regiões de flanqueamento do DNA estrangeiro tenham sido seqüenciadas, os primers e sondas podem ser desenvolvidos os quais especificadamente reconheçam esta(s) seqüência(s) no ácido nucléico (DNA ou RNA) de uma amostra por meio de uma técnica biológica molecular. Por exemplo, um método PCR pode ser desenvolvido para identificar o evento de elite nas amostras biológicas (tal como amostras de plantas, material de plantas ou produtos compreendendo material de planta). Um tal PCR é com base em pelo menos dois primers específicos, um reconhecendo uma seqüência na região de flanqueamento 3' ou 5' do evento de elite e o outro reconhecendo uma seqüência no DNA estrangeiro. Os primers preferivelmente têm uma seqüência dentre 15 e 35 nucleotídeos que sob condições PCR otimizadas especificadamente reconhecem uma seqüência na região de flanqueamento 3' ou 5' do evento de elite e o DNA estrangeiro do evento de elite respectivamente, de forma que um fragmento específico (fragmento de integração) seja amplificado a partir de uma amostra de ácido nucléico compreendendo o evento de elite. Isto significa que somente o fragmento de integração alvo, e nenhuma outra se........ j _β· . . · qüência no genoma da planta ou DNA estrangeiro’ é amjoÍifiôado sscíb oç.rtdò ”·* ções PCR otimizadas.

Preferivelmente, o fragmento de integração tem um comprimento dentre 50 e 5000 nucleotídeos, mais preferivelmente dentre 100 e 350 nucleotídeos. Preferivelmente os primers específicos têm uma seqüência que está entre 80 e 100% idêntica a uma seqüência na região de flanqueamento 3' ou 5' do evento de elite e o DNA estrangeiro do evento de elite, respectivamente, com a condição de que a má combinação ainda permita identificação específica do evento de elite com esses primers sob condições PCR otimizadas. As faixas de más combinações permitidas entretanto, podem facilmente ser determinadas experimentalmente e são conhecidas por uma pessoa versada na técnica.

Como a seqüência dos primers e sua relativa localização no genoma são únicas para o evento de elite, a amplificação do fragmento de integração ocorrerá somente nas amostras biológicas compreendendo (o ácido nucléico de) o evento de elite. Preferivelmente, quando realizando um PCR para identificar a presença de GAT-ZM1 em amostras desconhecidas, um controle é incluído de um grupo de primers com os quais um fragmento em um gene de manutenção (housekeeping gene) da espécie da planta do evento pode ser amplificado. Os genes de preparação são genes que são expressados na maioria dos tipos de células e que estão relacionados com atividades metabólicas básicas comuns a todas as células. Preferivelmente, o fragmento amplificado do gene de manutenção (housekeeping gene) é um fragmento que é maior do que o fragmento de integração amplificado. Dependendo das amostras à serem analisadas, outros controles podem ser incluídos.

Os protocolos PCR padrão são descritos na técnica, tal como no PCR Applications Manual (Roche Molecular Biochemicals, 2^a Edição, 1999). A condição ótima para o PCR, incluindo a seqüência dos primers específicos, é especificada em um protocolo de identificação PCR para cada evento de elite. Entende-se entretanto que vários parâmetros no protocolo de identificação PCR podem necessitar de ser ajustados às condições de

Κ laboratório específicas, e pode ser modificado leyemente jòarâ õbtert res.yttaj- *’·’ dos similares. Por exemplo, uso de um método diferente para a preparação de DNA pode requerer ajuste, por exemplo, da quantidade de primers, condições de recozimento e polimerase empregadas. Similarmente, a seleção de outros primers pode ditar outras condições ótimas para o protocolo de identificação PCR. Esses ajustes entretanto serão visíveis para uma pessoa versada na técnica, e são, além disso, detalhados nos manuais de pedido PCR correntes tal como o um citado acima.

Alternativamente, os primers específicos podem ser empregados para amplificar um fragmento de integração que pode ser empregado como uma sonda específica para a identificação de GAT-ZM1 em amostras biológicas. Contatando ácido nucléico de uma amostra biológica, com a sonda, sob condições que permitam a hibridização da sonda com seu fragmento correspondente no ácido nucléico, resulta na formação de um híbrido de sonda/ ácido nucléico. A formação deste híbrido pode ser detectada (por exemplo, rotulação do ácido nucléico ou sonda), de acordo com o qual a formação deste híbrido indica a presença de GAT-ZM1. Tais métodos de identificação com base na hibridização com uma sonda específica (ou em um veículo de fase sólida ou em solução) têm sido descritos na técnica. A sonda específica é preferivelmente uma seqüência que, sob condições otimizadas, hibridiza especificadamente a uma região na região de falnqueamento 3' ou 5' do evento de elite e preferivelmente também compreendendo parte do DNA estrangeiro contíguo com este (à seguir, referindo-se como região específica). Preferivelmente, a sonda específica compreende uma seqüência dentre 50 e 500 pares de base, preferivelmente de 100 a 350 pares de base que é pelo menos 80%, preferivelmente entre 80 e 85%, mais preferivelmente entre 85 e 90%, especialmente preferivelmente entre 90 e 95%, ainda mais preferivelmente entre 95 e 100% idêntica (ou complementar) à seqüência de nucleotídeo de uma região específica. Preferivelmente, a sonda específica compreenderá uma seqüência de cerca de 15 a cerca de 100 nucleotídeos contíguos idênticos (ou complementares) a uma região específica do evento de elite.

•· ···«

Um kit como empregado aqui refçré-sé.ã. □mjgêupofde/rèa’/ gentes com o propósito de realizar o método da invenção, mais particularmente, a identificação do evento de elite GAT-ZM1 em amostras biológicas. Mais particularmente, uma modalidade preferida do kit da invenção compreende pelo menos um ou dois primers específicos, como descrito acima. Opcionalmente, o kit pode ainda compreender qualquer outro reagente descrito aqui no protocolo de identificação PCR. Alternativamente, de acordo com outra modalidade desta invenção, o kit pode compreender uma sonda específica, como descrito acima, que especificadamente hibridiza com ácido nucléico das amostras biológicas para identificar a presença de GAT-ZM1 neste. Opcionalmente, o kit pode ainda compreender qualquer outro reagente (tal como porém não limitando à rótulo, tampão de hibridização) para a identificação de GAT-ZM1 em amostras biológicas, empregando a sonda específica.

O kit da invenção pode ser empregado, e seus componentes podem ser especificadamente ajustados, com o propósito de controle de qualidade (por exemplo, pureza dos lotes de sementes), detecção do evento de elite no material da planta ou material compreendendo ou derivado do material da planta, tal como porém não limitado a produtos de gênero alimentício e alimentos.

Como empregado aqui, identidade de seqüência com respeito a seqüências de nucleotídeos (DNA ou RNA), refere-se as várias posições com nucleotídeos idênticos divididos pelo número de nucleotídeos na menor das duas seqüências. O alinhamento das duas seqüências de nucleotídeos é realizado pelo algoritmo Wilbur e Lipmann (Wilbur e Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 80: 726) empregando um tamanho de janela de 20 nucleotídeos, um comprimento de palavra de 4 nucleotídeos, e uma abertura de penalidade de 4. A análise assistida por computador e a interpretação dos dados da seqüência, incluindo o alinhamento da seqüência como descrito acima, pode, por exemplo, ser convenientemente realizada empregando os programas do IntelligeneticsR Suíte (Intelligenetics Inc., CA) ou a embalagem do programa de análise da seqüência do Genetics Computer

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Group (GCG, University of Wisconsin BiotechnoÇegy ceetQr)_;jA$_#seqüèí]día$ são indicadas como essencialmente similar quando tais seqüências têm uma identidade de seqüência de pelo menos cerca de 75%, particularmente pelo menos cerca de 80%, mais particularmente pelo menos cerca de 85%, muito particularmente cerca de 90%, especialmente cerca de 95%, mais especialmente cerca de 100%. É claro que quando as seqüências de RNA são referidas para serem essencialmente similares ou têm um certo grau de identidade de seqüência com seqüências de DNA, timidina (T) na seqüência de DNA é considerada igual à uracila (U) na seqüência de RNA. Complementar como empregado aqui refere-se à complementariedade entre os nucleotídeos G e C e, A e T (U) em seqüências de nucleotídeos.

O termo primer como empregado aqui abrange qualquer ácido nucléico que seja capaz de preparar a síntese de um ácido nucléico nascente em um processo dependente de modelo, tal como PCR. Tipicamente, os primers são oligonucleotídeos de 10 a 30 pares de base, porém seqüências mais longas podem ser empregadas. Os primers podem ser fornecidos na forma de duplo filamento, embora a forma de filamento único seja preferida. As sondas podem ser empregadas como primers, porém são designadas para unir-se ao RNA ou DNA alvo e não necessitam ser empregadas em um processo de amplificação.

O termo reconhecimento como empregado aqui quando referindo-se a primers, refere-se ao fato de que os primers específicos especificadamente hibridizam com uma seqüência de ácido nucléico no evento de elite sob as condições apresentadas no método (tal como as condições do protocolo de identificação PCR), de acordo com o qual a especificidade é determinada pela presença de controles negativos e positivos.

O termo hibridização como empregado aqui quando referindose às sondas específicas, refere-se ao fato de que a sonda une-se à região específica na seqüência de ácido nucléico do evento de elite sob condições de rigorosidade padrão. As condições de rigorosidade padrão como empregado aqui refere-se às condições para hibridização descritas aqui ou às condições de hibridização convencionais como descrito por Sambrook e

Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY) que por exemplo pode compreender as seguintes etapas: 1) imobilizar os fragmentos de DNA genômico da planta em um filtro, 2) pré-hibridizar o filtro durante 1 à 2 horas a 42°C em 50% de formamida, 5 X de SSPE, 2 X de reagente Denhardt e 0,1% de SDS, ou durante 1 à 2 horas a 68°C em 6 X SSC, 2 X de reagente Denhardt e 0,1% de SDS, 3) adicionar a sonda de hibridização que foi rotulada, 4) incubar durante 16 à 24 horas, 5) lavar o filtro durante 20 minutos em temperatura ambiente em 1X de SSC, 0,1% de SDS, 6) lavar o filtro três vezes durante 20 minutos, cada a 68°C em 0,2 X de SSC, 0,1% de SDS, e 7) expor o filtro durante 24 à 48 horas à película de raio-X a -70°C com uma peneira de intensificação.

Como empregado aqui, uma amostra biológica é uma amostra de uma planta, material de planta ou produtos compreendendo o material de planta. O termo planta é entendido abranger tecidos de planta do milho (Zea mays), em qualquer estágio de maturidade, bem como qualquer célula, tecido, ou órgãos tirados ou derivados de qualquer tal planta, incluindo sem limitação, quaisquer sementes, folhas, caules, flores, raízes, células únicas, gametas, culturas de células, culturas de tecidos ou protoplastos. Material da planta, como empregado aqui refere-se ao material que é obtido ou derivado de uma planta. Os produtos compreendendo material de planta referem-se a alimento, gêneros alimentícios ou outros produtos que são produzidos empregando material de planta ou que pode ser contaminado pelo material da planta. Entende-se que, no contexto da presente invenção, tais amostras biológicas são testadas quanto à presença de ácidos nucléicos específicos para GAT-ZM1, implicando na presença de ácidos nucléicos nas amostras. Desse modo os métodos referidos aqui para a identificação de evento de elite GAT-ZM1 em amostras biológicas, relaciona-se com a identificação nas amostras biológicas de ácidos nucléicos que compreendem o evento de elite.

Como empregado aqui compreendendo é para ser interpretado quando especificando a presença das características, números inteiros,

»· ···· • · • ··· ··· ·ζ·· · · · ζ ·..· · etapas, reagentes ou componentes determinados quantio fSferidos, porém não impede a presença ou adição de uma ou mais características, números inteiros, etapas ou componentes, ou grupos destes. Desse modo, por exemplo, um ácido nucléico ou proteína compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ou aminoácidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que alguns atualmente citados, isto é, ser implantado em uma proteína ou ácido nucléico maior. Um gene quimérico compreendendo uma seqüência de DNA que é funcionalmente ou estruturalmente definida, pode compreender seqüências de DNA adicionais, etc.

Os seguintes exemplos descrevem a identificação do desenvolvimento de instrumentos para a identificação do evento de elite GAT-ZM1 em amostras biológicas.

A menos que de outra forma determinado, todas técnicas de DNA recombinantes são realizadas de acordo com os protocolos padrão como descrito em Sambrook e outros. (1989) Molecular Cloning·. A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbour laboratory Press, NY e nos Volumes 1 e 2 de Ausubel e outros (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Protocolos Correntes, EUA. Os métodos e materiais padrão para trabalho molecular da planta são descritos em Plant Molecular Biology Labfax (1993) R.D.D. Croy publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (UK) e Blackwell Scientific Publications, UK.

Na descrição e exemplos, a referência é feita às seguintes se-

qüências:
SEQ ID No 1:	seqüência dos elementos genéticos de vetor pUC/Ac
SEQ ID No 2:	primer MDB286
SEQ ID No 3:	primer MDB391
SEQ ID No 4:	primer MDB411
SEQ ID No 5:	primer MDB420
SEQ ID No 6:	seqüência de nucleotídeo compreendendo uma região de flanqueamento 5' de GAT-ZM1
SEQ ID No 7:	primer MDB439
SEQ ID No 8:	primer VDS 44

SEQ ID No 9:	primer MDB522 ^; ·’·· ’··* ’......
SEQ ID No 10:	seqüência de nucleotídeo compreendendo uma região de flanqueamento 3' de GAT-ZM1
SEQ ID No 11:	primer COR17
SEQ ID No 12:	primer COR18
SEQ ID No 13:	primer COR15
SEQ ID No 14:	primer COR16

Breve Descrição dos Desenhos

Os seguintes Exemplos, não entendidos limitar a invenção à modalidades específicas descritas, podem ser entendidos em conjunção com a figura de acompanhamento, incorporado aqui por referência, no qual: Fig.1: Classificação de desconhecidos empregando o protocolo de identificação PCR desenvolvido para GAT-ZM1.

Seqüência de carregamento do gel: Desconhecidos: faixas 1, 2,

5, 6, 8, 11, 13, 14, amostras de DNA de plantas de milho compreendendo o evento transgênico GAT-ZM1; faixas 4, 9, 10, 12, amostras de DNA de uma planta de milho não compreendendo evento de elite GAT-ZM1; faixa 3, falha de PCR. Faixas de controle: faixas 19, 21, amostras de DNA de controle de plantas de milho compreendendo evento de elite GAT-ZM1; faixas 20, 22, amostras de DNA de controle de plantas de milho tipo silvestre; faixa 23, nenhum controle modelo; faixa 24, marcador de peso molecular.

Exemplos

1. Identificação das regiões de flanqueamento do evento de elite GAT-ZM1

O milho resistente à herbicida foi desenvolvido pela transforma25 ção do milho com vetor pUC/Ac compreendendo a seqüência de codificação de um gene pat codificando a enzima de transferase de fosfinotricinacetila, sob o controle do promotor constitutivo 35S do vírus Cauliflower Mosaic.

Uma descrição detalhada dos elementos genéticos de pUC/Ac é fornecida na Tabela 1. A seqüência de nucleotídeo dos elementos genéticos de pUC/Ac é fornecida na SEQ ID No 1.

·· ···· ···· • · · · • · · ··· • · · ! • · ·

Tabela: elementos genéticos do ^etonpUcZAc** ’*

Número de nucleotídeo	Elemento genético
412-618	Terminador 35S de Vírus Cauliflower Mosaic do vetor dDH51 (Pietrzak M. e outros, Nucl. Acids Res. 14, (1986), pp. 58575868)
619-636	Seqüências de poliligantes sintéticos
637-1188	Gene pat sintético (seqüência de aminoácido de Streptomyces viridochromogenes) (Strauch e outros (1993) patente Européia 275957 B1)
1189-1216	Seqüências de poliligantes sintéticos
1217-1746	Promotor 35S de Vírus Cauliflower Mosaic do vetor dDH51 (Pietrzak M. e outros, 1986)
1747-411	Seqüência do vetor pUC18, incluindo o gene β-Iactamase (pos. 2923-3783) e a origem da replicação em pos. 2164. (Yanisch Perron e outros, (1985), Gene 33, pp. 103-119)

O evento de elite GAT-ZM1 foi selecionado com base em um procedimento de seleção extensivo com base na boa estabilidade e expressão do gene de resistência herbicida e sua compatibilidade com características agronômicas ótimas.

A seqüência das regiões flanqueando o DNA estrangeiro no evento GAT-ZM1 foi determinada empregando o método PCR entrelaçado assimétrico térmico (TAIL-) descrito por Liu e outros (1995, Plant J. 8(3): 457-463). Este método utiliza três primers aninhados em reações sucessivas junto com um primer degenerado arbitrário menor de forma que a eficiência da amplificação relativa de produtos não específicos e específicos possa ser termicamente controlada. Os primers específicos foram selecionados para recozimento com a borda do DNA estrangeiro e com base em suas condições de recozimento. Uma pequena quantidade (5 μΙ) de produtos PCR secundários e terciários não purificados foi analisada em um gel de agarose de 1%. O produto PCR terciário foi empregado para amplificação preparativa, purificado e seqüenciado em um seqüenciador mecanizado • · · empregando o kit de ciclo DyeDeoxy Terminator.^:

1.1. Região de flanqueamento direita (5‘)

Os primers empregados foram:

	Seqüência (5' —* 3')	Posição em pUC/Ac
Primer degenerado MDB286	NgT.CgA.SWg.ANA.WgA.A (SEQ ID No. 2)	-
Cauda primária MDB391	Tgg.ATA.CAA.gCA.Tgg.Tgg.ATg.g (SEQ ID No. 3)	715<—736
Cauda secundária MDB411	Agg.CAT.gCC.gCT.gAA.ATC.ACC (SEQ ID NO. 4)	606<—626
Cauda terciária MDB420	GgT.TTC.gCT.CAT.gTg.TTg.AgC (SEQ ID No. 5)	507^527

De acordo com o qual: N= A, C, T ou g; S = C ou g; W = A ou T O fragmento amplificado empregando MDB286-MDB420 foi aproximadamente 1100 pares de base, a seqüência completa da qual foi determinada (SEQ ID No 6). A seqüência entre 1 e 341 nucleotídeos corresponde ao DNA da planta, ao mesmo tempo que a seqüência entre 342 e 1041 nucleotídeos corresponde ao T-DNA.

1.2. região de flanqueamento esquerdo (3')

Os primers empregados foram:

	Seqüência (5' —> 3')	Posição em pUC/Ac
Primer degenerado MDB286	NgT.CgA.SWg.ANA.WgA.A (SEQ ID No. 2)	-
Cauda primária MDB439	CTC.ATg.gTT.ATg.gCA.gCA.CTg.C (SEQ ID No. 7)	3401-3422
Cauda secundária VDS44	CTg.TCA.TgC.CAT.CCg.TAA.gAT.gC (SEQ ID No. 8)	3435-3457
Cauda terciária MDB522	TgC.TTT.gAA.gAC.gTg.gTT.gg (SEQ ID No. 9)	1326-1345

De acordo com o qual: N= A, C, T ou g; S = C ou g; W = A ou T O fragmento amplificado empregando MDB286-MDB522 foi

··· · · · φ ···· · » aproximadamente 450 pares de base, a seqüêrfcia oomp1etâ*tlcf’quâl fóí determinada (SEQ ID No 10). A seqüência entre 1 e 342 nucleotídeos corresponde ao T-DNA, ao mesmo tempo que a seqüência entre 343 e 484 nucleotídeos corresponde ao DNA da planta.

2. Desenvolvimento de um protocolo de identificação de reação de Cadeia de Polimerase

2.1. Primers

Os primers específicos foram desenvolvidos os quais reconheçam as seqüências no evento de elite. Mais partieularmente, o primer foi desenvolvido o qual reconheça uma seqüência na região de flanqueamento 5' de GAT-ZM1. Um segundo primer foi então selecionado na seqüência do DNA estrangeiro de forma que os primers ampliem uma seqüência de cerca de 200 pares de base. Os seguintes primers foram constatados para produzir resultados reproduzíveis e partieularmente claros em uma reação PCR no DNA GAT-ZM1:

COR17: 5'-ggg.TgA.gCT.CgA.Atg.TTg.TTC.T-3' (SEQID11) (alvo: DNA da planta)

COR 18: S^TCT.TAg.ACg.TCA.ggT.ggC.ACT.T-S' (SEQ ID 12) (alvo: T-DNA)

Os primers alvejando uma seqüência endógena são preferivelmente incluídos no coquetel de PCR. Esses primers servem como um controle interno e amostras desconhecidas e no controle positivo de DNA. Um resultado positivo com par de primer endógeno demonstra que existe um DNA amplo de qualidade adequada na preparação de DNA genômico para um produto PCR ser gerado. Os primers endógenos foram selecionados para reconhecer um gene de manutenção (housekeeping gene) no Zea mays:

COR15: 5'-AgC.gTC.AAg.gAT.CAT.Tgg.TgT.C-3' (SEQ ID 13) (localizado no gene de dehidrogenase 1 de álcool Zean Mays (X04050))

COR16: 5'-ggC.CAA.gTT.CAg.CAT.AAg.CTg.T-3' (SEQ ID 14) (localizado no gene de dehidrogenase 1 de álcool Zean Mays (X04050))

2.2. Fragmentos amplificados

Os fragmentos amplificados esperados na reação PCR foram: Para par de primer COR15-COR16: 513 pares de base (controle endógeno)

Para par de primer COR17-COR18: 202 pares de base (Evento de elite de GAT-ZM1)

2.3. DNA modelo

O DNA modelo foi preparado a partir de uma punção de folha de acordo com Edwards e outros (Nucleic Acid Research, 19, p 1349, 1991).

Quando empregando DNA preparado com outros métodos, um funcionamento teste utilizando diferentes quantidades de modelo seria feito. Freqüentemente 50 ng de DNA modelo genômico produz os melhores resultados.

2.4. Controles negativos e positivos determinados

Para evitar falsos positivos e negativos, foi determinado que os seguintes controles negativos e positivos seriam incluídos em um funcionamento PCR:

- Controle Master Mix (controle de DNA negativo). Este é um PCR no qua! nenhum DNA é adicionado à reação. Quando o resultado esperado, nenhum produto de PCR, é observado, isto indica que o coquetel de PCR não foi contaminado com o DNA alvo.

- Controle positivo de DNA (amostra de DNA genômico conhecido por conter seqüências transgênicas). A amplificação bem sucedida deste controle positivo demonstra que o PCR foi funcionado sob condições que levam em conta a amplificação das seqüências alvo.

- Controle de DNA tipo silvestre. Este é um PCR no qual o DNA modelo fornecido é DNA genômico preparado a partir de uma planta não transgênica. Quando o resultado esperado, nenhuma amplificação de um produto PCR transgênico porém a amplificação do produto PCR endógeno, é observado isto indica que não há nenhuma amplificação de fundamento trasngênico detectável em uma amostra de DNA genômico.

2.5. Condições de PCR s ·^:· ...........

Ótimos resultados foram obtidos sob as seguintes condições:

- a mistura de PCR para 25 μΙ de reações contém:

2,5 μΙ de DNA modelo

2,5 μΙ de 10x Tampão de Amplificação (abastecido com polimerase Taq)

0,5 μΙ de 10 mM de dNTP's 0,5 μΙ de COR17 (10 pmoles/ μΙ)

0,5 μΙ de COR18(10 pmoles/ μΙ)

0,25 μΙ de COR15 (10 pmoles/μΙ)

0,25 μΙ de COR16 (10 pmoles/ μΙ)

0,1 μΙ de polimerase de DNA Taq (5 unidades/ μΙ) água até 25 μΙ

- o perfil de termociclagem a ser seguido para resultados ótimos é o seguinte:

min. a 95°C

Seguido por:

min. a 95°C min. a 57°C min. a 72°C

Durante 5 ciclos

Seguido por:

seg. a 92°C seg. a 57°C min. a 72°C

Durante 25 ciclos

Seguido por:

min. a 72°C

2.6. Análise do gel de aqarose

Para de modo mais eficiente visualizar os resultados do PCR foi determinado que entre 10 e 20 μΙ das amostras de PCR seria aplicado em um gel de agarose de 1,5% (tampão de tris-borato) com um marcador de peso molecular apropriado (por exemplo, 100 pares de base de PHARMA30

CIA progressiva) : ·’· ’··* ·· * ’

2.7. Validação dos resultados

Foi determinado que os dados das amostras de DNA de planta transgênica em um único funcionamento de PCR e um único coquetel de PCR não seriam aceitáveis a menos que 1) o controle positivo de DNA mostre os produtos PCR esperados (fragmentos endógenos e transgênicos), 2) o controle negativo de DNA seja negativo para a amplificação de PCR (nenhum fragmento) e 3) o controle de DNA tipo silvestre mostre o resultado esperado (amplificação de fragmento endógeno).

Quando seguindo o Protocolo de Identificação PCR para GATZM1 como descrito acima, as faixas mostrando quantidades visíveis dos produtos PCR endógenos e transgênicos do tamanho esperado, indicam que a planta correspondente a partir da qual o DNA de modelo genômico foi preparado, tem herdado o evento de elite GAT-ZM1. As faixas não mostrando quantidades visíveis de quaisquer dos produtos PCR transgênicos e mostrando quantidades visíveis do produto PCR endógeno, indica que a planta correspondente a partir da qual o DNA de modelo genômico foi preparado, não compreende o evento de elite. As faixas não mostrando quantidades visíveis dos produtos PCR transgênicos e endógenos, indicam que a qualidade e/ou quantidade do DNA genômico não permitiu a um produto PCR ser gerado. Essas plantas não podem ser classificadas. A preparação do DNA genômico deveria ser repetida e um novo funcionamento PCR, com os controles apropriados, teria que ser realizado.

2.8. Uso do protocolo PCR de discriminação para identificar GAT-ZM1

Antes de tentar classificar desconhecidos, um funcionamento teste, com todos controles apropriados, tem que ser realizado. O protocolo desenvolvido pode requerer otimização para componentes que podem diferenciar entre laboratórios (preparação de DNA modelo, polimerase de DNA Taq, qualidade dos primers, dNTP's, termociclo, etc.).

A amplificação da seqüência endógena desempenha um papel principal no protocolo. Alguém tem que alcançar condições de termociclagem e PCR que amplifiquem quantidades equimolares de ambas as se30 qüências transgênicas e endógenas em unô..mo£te3o: de DNA.^génômncd.:.

transgênico conhecido. Quando o fragmento endógeno alvejado não é amplificado ou quando as seqüências alvejadas não são amplificadas com a mesma intensidade de manchamento de brometo de etídio, como julgado por eletroforese de gel de agarose, a otimização das condições PCR pode ser requerida.

Os materiais de folha Zea mays de várias plantas, algumas das quais compreendendo GAT-ZM1, foram testados de acordo com o protocolo descrito acima. As amostras do evento de elite GAT-ZM1 e do tipo silvestre Zea mays foram tomadas como controles positivos e negativos respectivamente.

A figura 1 ilustra o resultado obtido com o protocolo de identificação PCR de evento de elite para GAT-ZM1 em várias amostras de planta de milho (faixas 1 a 14). As amostras nas faixas 1, 2, 5, 6, 7, 8, 11, 13 e 14 foram constatadas conter o evento de elite quando a banda de 202 pares de base é detectada, ao mesmo tempo que as amostras nas faixas 4, 9, 10 e 12 não compreendem GAT-ZM1. A faixa 3 indica uma falha de PCR, quando a banda de controle não é detectada. As faixas 19 e 20 representam amostras de controle positivo GAT-ZM1, as faixas 20 e 22 representam controles Zea mays não transgênicos; a faixa 23 representa a amostra de controle negativo (água), e a faixa 24 o Marcador de Peso Molecular (100 pares de base).

3. Uso de um fragmento de integração específico como uma sonda para detecção de material compreendendo GAT-ZM1

Um fragmento de integração específico de GAT-ZM1 é obtido por amplificação de PCR empregando primers específicos COR17 (SEQ ID No 11) e COR 18 (SEQ ID No 12) ou por síntese química e é rotulado. Este fragmento de integração é empregado como uma sonda específica para a detecção de GAT-ZM1 em amostras biológicas. O ácido nucléico é extraído das amostras de acordo com os procedimentos padrão. Este ácido nucléico é então contatado com a sonda específica sob condições de hibridização que são otimizadas para permitir a formação de um híbrido. A formação do híbrido é então detectada para indicar a preseríça dè ácido:niàcLéícb’GA’T-:.:.

ZM1 na amostra. Opcionalmente, o ácido nucléico nas amostras é amplificado empregando os primers específicos antes de contatar com a sonda específica. Alternativamente, o ácido nucléico é rotulado antes de contatar com a sonda específica ao invés do fragmento de integração. Opcionalmente, a sonda específica é ligada a um portador sólido (tal como, porém não limitado a um filtro, espremedor ou contas), antes do contato com as amostras.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para identificar evento elite GAT-ZM1 em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de que compreende a amplificação de um fragmento de DNA dentre 100 e 350 pares de base de um ácido nucléico

5 presente nas referidas amostras biológicas empregando uma reação de cadeia de polimerase com pelo menos dois iniciadores oligonucleotídicos consistindo em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende a amplificação de um fragmento de DNA dentre 510

10 e 220 pares de base de um ácido nucleico presente nas referidas amostras biológicas empregando uma reação de cadeia de polimerase com pelo menos dois iniciadores, de acordo com o qual a sequência dos referidos iniciadores corresponde à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 respectivamente.

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3. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que compreende a amplificação de um fragmento de DNA de 202 pares de base de um ácido nucleico presente nas referidas amostras biológicas empregando uma reação de cadeia de polimerase com pelo menos dois iniciadores, de acordo com o qual a sequência dos referidos

20 iniciadores corresponde à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12 respectivamente.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida amostra biológica é uma amostra de uma semente.
5. Kit para realização do método como definido na reivindicação

25 1, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos dois iniciadores oligonucleotídicos consistindo em SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12.
6. Método para identificar evento elite GAT-ZM1 em amostras biológicas, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção de um fragmento de DNA de pelo menos 100 pares de base nas referidas amostras

30 biológicas com uma sonda específica por meio da hibridização de um ácido nucleico das amostras biológicas com uma sonda consistindo em SEQ ID

NO: 6, do nucleotídeo 286 até 487.

Petição 870170075762, de 06/10/2017, pág. 4/8

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7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que que a referida amostra biológica é uma amostra de uma semente.

Petição 870170075762, de 06/10/2017, pág. 5/8

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