KR101845256B1

KR101845256B1 - 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 snp 마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101845256B1
Application number: KR1020170033401A
Authority: KR
Inventors: 박응준; 한무호; 최미나; 이효련; 이효신
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2017-03-16
Filing date: 2017-03-16
Publication date: 2018-04-04

Abstract

본 발명에서는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커, 상기 SNP 마커를 포함하는 마이크로 어레이, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 키트, 및 내건성 사시나무 유전자형의 선별 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 신규 SNP 마커, 조성물, 및 이를 포함하는 마이크로 어레이 또는 키트를 이용하면, 내건성이 강한 사시나무의 유전자형을 용이하면서도 정확하게 선별할 수 있다. 뿐만 아니라 이와 같이 선별된 사시나무의 유전자형을 이용하여 내건성 사시나무의 우량목 육종 및 품종개량이 가능하다. 또한 사시나무 품종별 변이연구에도 그 활용성이 높아서, 사시나무 품종의 순도유지나 품종 보호, 그리고 재배지 환경요인에 따라 가장 적합한 수종을 선발 및 식재하여 현지 맞춤식 육성을 가능케 한다.

Description

내건성 사시나무 유전자형의 판별용 SNP 마커 및 이의 용도 {SNP markers associated with drought tolerance of Populus davidiana Dode and its use}

본 발명은 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 SNP 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 더 상세하게는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 SNP(single nucleotide polymorphism) 마커, 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 조성물, 상기 SNP 마커를 포함하는 마이크로 어레이, 상기 조성물을 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 키트, 및 내건성 사시나무 유전자형의 선별 방법에 관한 것이다.

사시나무(Populus davidiana Dode)는 포플러속 수종의 하나로서 한국, 중국, 시베리아 동부지역에 분포하고 있으며 백양나무라고도 한다. 사시나무는 자연 상태에서 주로 근맹아에 의하여 번식되며, 종자에 의한 번식은 다른 포플러류와 마찬가지로 종자의 수명이 짧아 거의 이루어지지 못한다. 특히 근계형성능력이 우수하여 다른 포플러류와는 달리 환경적응력이 강하고 속성수에 속하기 때문에 산지조림을 통한 단벌기 재배에 적합한 특성을 갖는다.

최근 전세계적으로 경제성 높은 바이오연료의 생산에 관한 관심이 고조되면서 단벌기 바이오매스의 유망 수종의 중요성이 다시 대두되고 있으며, 우리나라에서도 저탄소 녹색성장의 정책 추진에 따라 목재 바이오매스 활용 요구가 높아지고, 특히 온실가스 목표 관리제 도입에 따라 목재에너지 원료의 수요가 많아질 것으로 예상되어 목질계 에너지용 자원으로서 사시나무의 안정적인 공급원 확보가 필요한 실정이다.

우리나라의 산림자원의 경우 전 국토에 대한 녹화 사업을 목적으로 제한된 수종을 이용하여 단기간에 조성되어 유전 다양성이 부족하고 가계에 대한 정확한 연구 자료가 부족하다. 또한 자가불화합성이 매우 높은 특성으로 인하여 형질이 고정된 순계 라인의 확보 및 품종화가 어려운 특성을 보인다. 게다가 목본류는, 초본류에 비하여, 단일 개체간 넓은 재배 공간을 필요로 하며 긴 생장 기간 및 벌기령 등으로 시공간상의 재배 효율성이 낮아서 우수 품종의 육성까지 수십 년이 걸리는 어려움이 있었다. 최근 육종기간을 단축시킬 수 있는 방편으로 SSR(simple sequence repeat), RAPD(random amplified polymorphic DNAs), RFLP(restriction fragment length polymorphism), SNP(single nucleotide polymorphisms), AFLP(amplified fragment length polymorphism) 등 분자마커를 이용한 분자육종(molecular breeding)이 대두되고 있다. SNP는 여러 분자마커 중 종내 또는 개체별 유전적인 변이를 가장 잘 나타낼 수 있는 분자마커이며, 목본류의 육종에도 활용되고 있으나, 초본류에 비하면 활발하지 않은 편이며, 그 일례로서 등록특허 제1409012호는 소나무류 구별용 SNP 프라이머, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 소나무 구별방법을 개시하고 있다.

한편 기후변화로 인해 우리나라의 기온은 지구평균보다 2배 이상 빠르게 온난화가 진행되고 있고, 최근에는 특히 강수량이 적거나 거의 없는 건조기후의 기간이 길어지고 가뭄 현상이 빈번하게 발생하고 있다. 또한 사시나무는 건조 스트레스에 대한 개체들 간의 생장 및 생리 반응에 변이가 높은 것으로 조사되어 건조 스트레스와 관련된 유전자의 종내 변이가 높은 것으로 예측되어 왔다 (한국농림기상학회지, 제7권 제4호(2005), 296~302쪽).

따라서 이러한 사시나무 내건성에 관련된 DNA 염기서열 변이를 확인할 수 있는 SNP 마커의 발굴과 이를 이용한 내건성 사시나무 유전자형의 선별 등에 이용할 필요성이 높아지고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 종래 기술에서의 요구에 부응하기 위해 지속적으로 연구한 결과, 내건성을 가진 사시나무 품종(유전자형)을 판별할 수 있는 신규한 SNP들을 발굴하고, 이들을 용도를 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 SNP 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 선별용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 선별용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP 마커 또는 이의 cDNA를 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 선별용 마이크로 어레이를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 SNP 마커를 이용하여 내건성이 우수한 사시나무 유전자형을 선별하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 목적은 서열번호 1 내지 10의 염기서열로 이루어진 다형성 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 어느 하나의 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 SNP 마커 조성물을 제공한다.

상기 SNP 마커 조성물은 바람직하게는, 서열번호 1 또는 2로 이루어진 다형성 폴리뉴클레오티드에서, 각 SNP 위치인 66번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는

서열번호 3 또는 4로 이루어진 다형성 폴리뉴클레오티드에서, 각 SNP 위치인 189번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는

서열번호 5 또는 6로 이루어진 다형성 폴리뉴클레오티드에서, 각 SNP 위치인 106번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는

서열번호 7 또는 8로 이루어진 다형성 폴리뉴클레오티드에서, 각 SNP 위치인 380번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드; 또는

서열번호 9 또는 10로 이루어진 다형성 폴리뉴클레오티드에서, 각 SNP 위치인 399번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드로부터 선택되는 하나 이상의 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

상기 서열번호 1 내지 10은 각각의 SNP 부위를 포함하는 다형성 폴리뉴클레오티드이다.

본 발명에서 '다형성 폴리뉴클레오티드'는 폴리뉴클레오티드 서열 중에 SNP를 나타내는 다형성 부위(polymorphic site)를 포함하는 서열을 말한다.

본 발명에 따른 SNP 마커에서 상기 SNP (다형성 염기) 정보(위치/종류)는 도 11에 나타낸 바와 같다.

본 발명의 실시예에 의하면, 내건성 및 민감성 유전자형을 포함하는 사시나무 22 품종을 대상으로 핵 DNA에 대한 염기서열 분석 및 비교를 통해, 내건성 품종 그룹과 민감성 품종 그룹을 정확하게 구별할 수 있는 5가지 SNP를 확인하였으며 (서열번호 1, 2의 66번째 염기, 서열번호 3, 4의 189번째 염기, 서열번호 5, 6의 106번째 염기, 서열번호 7, 8의 380번째 염기, 서열번호 9, 10의 399번째 염기), 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 내성과 민감성의 품종 간에는 특이적인 염기변이가 존재함을 확인하였다 (도 11).

본 발명은 또한 상기 SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제를 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 조성물을 제공한다.

'SNP 마커를 검출 또는 증폭할 수 있는 제제'란, 상기와 같은 유전자의 다형성 부위를 증폭을 통해 확인하여 내건성을 갖는 사시나무 유전자형을 선별할 수 있는 조성물을 의미하며, 바람직하게는 상기 SNP 마커의 폴리뉴클레오티드를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머(primer)를 의미한다.

상기 SNP 마커 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있으나, 통상 15 내지 30 뉴클레오티드이다. 상기 프라이머 서열은 상기 SNP 마커와 완전하게 상보적일 필요는 없으나, 상기 SNP 마커와 혼성화할 정도로 충분히 상보적이어야 하고, 바람직하게는 서열번호 11 내지 20으로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 조성물은 또한, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약과 조합되어 내건성을 갖는 사시나무 유전자형 선별용 키트로서 제공될 수 있다. 본 발명의 키트에서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 서열번호 1 내지 10의 염기서열의 SNP 다형성 폴리뉴클레오티드, 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 내건성을 갖는 사시나무 유전자형 선별용 마이크로 어레이를 제공한다.

바람직하게는, 상기 다형성 폴리뉴클레오티드는 아미노-실란, 폴리-L-라이신 또는 알데히드의 활성기가 코팅된 기판에 고정될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 상기 기판은 실리콘 웨이퍼, 유리, 석영, 금속 또는 플라스틱일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 다형성 폴리뉴클레오티드를 기판에 고정화시키는 방법으로는 피에조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting) 법, 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로어레이는 본 발명에 따른 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 그의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드, 그에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 그의 cDNA를 이용하여 본 분야의 당업자에게 알려져 있는 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한,

(a) 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 상기 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하는, 내건성을 갖는 사시나무 유전자형 선별 방법을 제공한다.

여기서 SNP 마커는 본 발명에 따른 신규한 SNP 마커를 의미한다.

본 발명의 용어 '개체'란, 내건성을 확인하고자 하는 대상인 사시나무를 의미하며, 상기 사시나무로부터 얻어진 검체를 이용하여, 상기 SNP 마커의 유전자형을 분석함으로써 상기 내건성을 판단할 수 있다.

상기 (a) 단계의 DNA 시료로부터 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용가능하다. 예를 들면, 표적 핵산을 PCR을 통하여 증폭하고 이를 정제하여 얻을 수 있다. 그 외 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭 및 자가유지 서열 복제 및 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA)이 사용될 수 있다.

바람직하게는 (a) 단계에서 증폭은 서열번호 11 내지 20으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열(프라이머)를 사용하여 행하여질 수 있다.

상기 (b)단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 방법은 시퀀싱 분석, 마이크로 어레이에 의한 혼성화, 대립유전자 특이적인 PCR, 다이나믹 대립유전자 혼성화 기법(DASH), PCR 연장 분석, PCR-SSCP, PCR-RFLP 분석, HRM 분석 또는 TaqMan 기법, SNPlex 플랫폼, 미니-시퀀싱(mini-sequencing) 방법, Bio-Plex 시스템, CEQ and SNPstream 시스템(Beckman), Molecular Inversion Probe 어레이 기술(예를 들면, Affymetrix GeneChip), 및 BeadArray Technologies(예를 들면, Illumina GoldenGate 및 Infinium 분석법) 등을 이용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 따른 신규 SNP 마커, 조성물, 및 이를 포함하는 마이크로 어레이 또는 키트를 이용하면, 내건성이 강한 사시나무의 유전자형을 용이하면서도 정확하게 선별할 수 있다. 뿐만 아니라 이와 같이 선별된 사시나무의 유전자형을 이용하여 내건성 사시나무의 우량목 육종 및 품종개량이 가능하다.

또한 사시나무 품종별 변이연구에도 그 활용성이 높아서, 사시나무 품종의 순도유지나 품종 보호, 그리고 재배지 환경요인에 따라 가장 적합한 수종을 선발 및 식재하여 현지 맞춤식 육성을 가능케 한다.

도 1은 본 발명에 따른 사시나무의 건조 스트레스 내성에 대한 형질을 고감도로 판별하는 과정을 보여주는 공정도이다.
도 2는 건조 스트레스 처리된 각각의 사시나무 품종의 잎을 DAB 염색 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 건조 스트레스에 대한 각각의 사시나무 품종 잎의 활성산소(H₂O₂) 축적량을 나타내고, 내건성 순위에 따른 사시나무 품종을 서열화한 그래프이다.
도 4는 NGS 방법을 이용한 사시나무 유전체 분석 모식도이다.
도 5는 사시나무 품종들의 유전체를 de novo assembly 분석을 통한 SNP 확인 과정을 보여주는 모식도이다.
도 6은 Contig169993 (서열번호 1, 서열번호 2)의 SNP 및 사시나무 품종들 간의 다형성 부위의 비교배열을 보여주는 사진이다.
도 7은 Contig90419 (서열번호 3, 서열번호 4)의 SNP 및 사시나무 품종들 간의 다형성 부위의 비교배열을 보여주는 사진이다.
도 8은 Contig25781 (서열번호 5, 서열번호 6)의 SNP 및 사시나무 품종들 간의 다형성 부위의 비교배열을 보여주는 사진이다.
도 9는 Contig22888 (서열번호 7, 서열번호 8)의 SNP 및 사시나무 품종들 간의 다형성 부위의 비교배열을 보여주는 사진이다.
도 10은 Contig8 (서열번호 9, 서열번호 10)의 SNP 및 사시나무 품종들 간의 다형성 부위의 비교배열을 보여주는 사진이다.
도 11은 내건성의 품종인 소광9, 팔공2에서 5가지의 SNP 및 이를 포함하는 다형성 폴리뉴클레오티드들을 나타낸다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 구체적인 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 보다 상세히 설명하기로 한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 명확하게 이해시키기 위하여 예시한 것일 뿐이며, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 내건성 및 민간성 사시나무 품종 선별

<사시나무 근맹아 유발>

하기 표 1에 나열된, 경상북도 영주시의 산림과학원 유전자원 보존림에 식재된 25년생 한국 토종 사시나무와 중국 사시나무 유전자형 22가지 품종의 근맹아를 유발하였다:

품종
오대19	쌍전9
팔공1	태백1-1
봉현4	태백1-3
대화6	대현7
소광9	소광13-1
운두2	소광13-3
대화18	소광15
팔공3	중국6-1
팔공2	중국6-2
대현9	중국6-3
방동1	중국6-5

구체적으로는 오대19를 포함한 22개 사시나무 품종 각각의 지상과 경계한 측근을 톱으로 30cm 가량 절단하고 주변 흙과 함께 수집한 후, 수분 증발이 최소화되도록 비닐팩에 담은 후 저온실(4℃)에 넣어두고, 약 30일 경과 후 직사광선을 피하여 배수가 잘되는 토양에 이식하고, 물을 충분히 준 후 근맹아가 유도되어 자라도록 하였다 (도 1 참조).

<기내 도입>

품종별로 유도된 근맹아의 본 줄기를 제외한 줄기에서 5번째 잎이 자라기 시작하면 잎은 제거하고 정단부를 약 2cm 가량 절단하여 10% 락스와 70% 에틸알코올에 각각 10분간 침종하여 소독 후 멸균수로 10회 이상 충분히 세척하여 WPM 생장 배지(McCown's Woody Plant Medium 1.3g/L, Sucrose 30g/L, IBA 0.2mg/L, pH 5.7)가 있는 시험관에 치상하여 항온 항습실 (온도 25℃, 습도 30~35%)에서 배양하였다. 치상된 근맹아로부터 잘 자란 잎이 4개 정도 되는 개체로 자라면 다시 정단부를 1cm 정도로 절단하여 WPM 생장 배지가 담긴 시험관으로 계대배양하여 약 한달 후 충분히 자란 잎들을 갖는 최종 기내배양 개체를 얻었다 (도 1 참조).

<스트레스 처리>

사시나무 품종 22종의 기내배양 개체로부터 충분히 자란 잎을 각각 처리 전을 포함하여 10분 간격으로 총 4회 수집하여(0, 10, 20, 30분) 온도와 습도가 각각 25℃, 30~35%인 항온·항습실에 30분간 노출하여 자연 건조시켜 건조 스트레스를 처리하였다.

<활성산소 측정 및 정량화>

건조 스트레스 처리된 잎들의 활성산소의 축적량은 DAB 염색을 통하여 확인하고 정량화 하였다.

구체적으로는 건조 스트레스 처리된 잎들을 12구 플레이트로 옮겨 담은 후 0.05% (w/v) DAB (3,3'-Diaminobenzidine, sigma-D5637) 수용액을 첨가하고 650 mmHg 이하의 진공을 3회 이상 처리하면서 DAB 수용액이 사시나무 잎 조직에 충분히 스며들게 하고, 암실에서 약 2~3시간 동안 충분히 염색되도록 하였다. DAB 염색이 끝난 시료(잎)는 95% 에틸알코올에 담가 엽록소를 탈색시킨 후, 흰 종이에 탈색된 잎들을 순서대로 배열 후 셀로판 테잎으로 고정시키고, 고정된 잎들은 두꺼운 책 사이에 끼워 건조시킨 후 스캔으로 이미지화하였고 또한 그 이미지를 도 2에도 나타냈다.

ImageJ 프로그램으로 분석할 스캔 이미지 파일을 불러와서 건조 스트레스 처리 전(0분) 잎의 이미지를 기준으로 하여 10분, 20분, 30분 경과된 각각의 이미지들을 보정된 면적(DAB 염색 세기)을 수치화하였고, 품종별로 건조 처리 후 30분 경과된 수치를 건조처리 전의 수치로 나눈 값들(작은 값은 건조 스트레스 처리시 H₂O₂축적량이 적음을 의미한다)을 구하여 서열화한 결과를 도 3에 나타냈다 (1위부터 22위까지 나열함; 붉은색 내성, 파란색 민감성, 초록색 보통).

도 3 및 도 2에 도시된 바에 의하면, 태백1-1, 중국6-5, 오대19, 소광9, 팔공2, 소광13-1, 쌍전9, 중국6-3, 태백1-3의 순서로 내건성이 우수한 품종임을 확인할 수 있고(내건성 유전자형), 소광15, 중국6-2, 대화6 순서로 건조 스트레스에 민감한 품종임을 알 수 있다.

실시예 2: NGS(Next Generation Sequencing)를 이용한 사시나무 품종의 핵DNA 염기서열의 분석

실시예 1로부터 얻은 사시나무 22 품종들의 내건성 순위비교(서열화) 결과를 바탕으로(도 3), 건조 스트레스에 내성(2품종; 팔공2, 대화18), 보통(3품종; 팔공3, 봉현4, 운두2) 혹은 민감성(2품종; 팔공1, 대화6) 그룹에 대한 대표 품종를 선발하여 NGS(Next Generation Sequencing) 방법을 이용한 핵 DNA 염기서열을 분석하였다 (도 4).

구체적으로는, 기내도입 후 배양된 사시나무 건조 내성, 보통 및 민감성 그룹별 대표 품종(표 2)를 이용하여 Hiseq2500 기반의 핵DNA 염기서열 분석을 진행하였다. 라이브러리 제작에는 Illumina TruSeq Nano DNA sample preparation Kit를 이용하여 인서트 크기(insert size) 500 bp의 라이브러리를 제작한 후, HiSeq 2500/illumina을 이용하여 재시퀀싱(resequencing)을 하였다. 각 품종(유전자형)별 약 500 bp 크기의 인서트에 대한 100 bp paired-end 시퀀싱을 수행한 결과, 사시나무 유전체 크기의 30배 이상인 평균 18 Gbp에 해당하는 원시 시퀀스 데이터를 생산하였으며, 염기서열의 87.5% 이상의 Quality score가 30이상(≥Q30)인 것을 확인하였으며, 분석된 결과를 표 2에 나타냈다.

품종 (Genotype)	순위	Trait	No.of raw reads	Total bases of raw reads (bp)	GC (%)	≥Q30
팔공1	17	민감성	170,250,712	17,025,071,200	34.73%	88.67%
봉현 4	11	보통	171,400,284	17,140,028,400	34.86%	88.66%
대화6	20	민감성	163,057,146	16,305,714,600	34.65%	87.99%
소광9	4	내성	214,998,194	21,499,819,400	34.80%	86.09%
운두2	14	보통	167,539,830	16,753,983,000	34.69%	88.99%
대화18	10	보통	164,555,474	16,455,547,400	34.64%	87.36%
팔공3	15	보통	168,241,384	16,824,138,400	34.79%	88.04%
팔공2	5	내성	215,650,424	21,565,042,400	34.56%	85.41%
		평균	179,461,681	17,946,168,100	34.72%	87.65%

팔공1 유전자형(품종)에서 생산된 핵DNA NGS 결과를 바탕으로, 팔공1을 하기 실시예들에서 타 품종의 내건성 연관 SNP 분석에 대한 표준 유전체로 활용하였다.

또한 K-mer 분석을 통하여 표 2에서 NGS로 분석된 사시나무 품종들의 유전체의 크기를 측정하여 분석결과를 검정하였다.

구체적으로는 표 2에 나타낸 데이터를 하기 유전체 크기예측 계산식:

Genome size = (Total no. of K-mer at peak) / (Depth of K-mer at pek) 으로 유전체 크기를 추정하여 그 결과를 표 3에 나타냈다.

품종 (Genotype)	순위	Depth of k-mer at peak	Total No. of k-mer	Estimated genome size (Mbp)
팔공1	17	28	13,150,342,265	469.655
봉현 4	11	30	13,772,068,737	459.069
대화6	20	30	13,888,366,538	462.946
소광9	4	29	13,583,160,471	468.385
운두2	14	28	13,217,214,600	472.043
대화18	10	29	13,561,161,179	467.626
팔공3	15	37	17,322,128,894	468.166
팔공2	5	37	17,324,627,485	468.233
		31	14,477,383,771	467.015

표 3에 나타낸 바와 같이, 평균 유전체 크기는 467 Mbp인 것으로 추정되어, 미국에너지성에서 분석·완료된 포플러 수종(Populus trichocarpa)의 전장 유전체 크기와 유사하게 460Mbp 전후의 데이터 생산되었으며, NGS로 생산된 유전자 염기서열 분석량은 사시나무 유전체 전체를 충분히 반영하는 것으로 확인되었다.

실시예 3: de novo assembly 분석을 통한 SNP 확인

표 2의 각 품종별로 생산된 핵DNA 유전자 염기서열 분석 결과들을 바탕으로 각각의 유전체 조각들을 조합(de novo assembly) 하였으며, 팔공1의 유전체를 표준유전체(reference genome)로 하여 SNP 분석에 활용하였다.

구체적으로는 도 5에 도시한 바와 같이, 팔공1의 유전체 염기서열과 타 품종들의 유전체 염기서열의 비교를 통하여 118,484개의 SNV(Single Nucleotide Variants)로 부터, 내건성이 가장 약한 하위 4개의 품종들(팔공1, 대화6, 봉현4, 운두2)에서 공통적으로 확인되는 8,040여개의 SNP들을 확인하였다. 그리고 나서 내건성이 강한 소광9, 팔공2와 비교하여 52개의 SNP(cDNA: 35개, upsteam: 17개)를 확인하였다.

52개 핵심 SNP들을 바탕으로 내건성과 민감성 개체의 구분에 유용할 것으로 판단되는 5개의 SNP (cDNA: 3개, upsteam: 2개)들을 최종 선발하였고, 그 결과를 표 4에 요약하였다:

Contig #	SNP	내성	민감성
169993	서열번호 1, 2의 66번째 염기	티민 (T)	구아딘(G)
90419	서열번호 3, 4의 189번째 염기	아데닌(A)	티민 (T)
25781	서열번호 5, 6의 106번째 염기	구아딘(G)	아데닌(A)
22888	서열번호 7, 8의 380번째 염기	티민 (T)	구아딘(G)
8	서열번호 9, 10의 399번째 염기	티민 (T)	사이토신(C)

실시예 4: 생어 시퀀싱(Sanger Sequencing)을 통한 SNP 검정

실시예 3에서와 같이 de novo assembly 분석으로 염기서열의 변이가 확인된 5개의 SNP 부위별(다양성 부위별) 증폭이 가능하며, 또한 다양성 부위의 서열변이를 검출할 수 있는 프라이머(primer)를 제작하였다 (표 5).

Contig #	Forward sequence (5'→3') [서열번호]	Reverse sequence (5'→3') [서열번호]
169993	GAGGGCAAGAAGGATGAGTATG [11]	CTTCTCCTGGATCTGTGGATAC [12]
22888	CACAAATCCTCTCCTCTCAGAC [13]	CATATCCATACCTCGCCAGTAG [14]
90419	GTGTACCGGAGTCCTAAGGTTT [15]	GTAGCATCTTCCTACATGCCTC [16]
25781	CTTAGGGTCAATTAGGGGTTCC [17]	AGAGAAGCGATGTCTGCTCTAC [18]
8	CCCCTCCCCAAGATAGATAA [19]	CAGACGTTGTACTCCTTCTTCC [20]

제작된 프라이머들을 사용하여 유전자형별(소광9(내건성순위:4위), 팔공2(5위), 대화18(10위), 운두2(14위), 팔공3(15위), 팔공1(17위), 대화6(20위)) 7가지 사시나무 유전자형의 게놈 DNA의 5개 SNP 지역을 PCR 분석하였고, 그 중에서 소광9(4), 팔공2(5)을 선발하여 이들의 5가지의 SNP를 각각 포함하는 다형성 폴리뉴클레오티드들의 염기서열을 서열번호 1 내지 10 및 도 11에 나타내었다.

< Contig# 169993>

서열번호 11 및 12의 프라이머 세트를 이용하여 상기 7가지 사시나무 유전자형의 게놈 DNA에 대한 PCR 분석결과를 비교배열하여 SNV를 확인한 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 서열번호 1 및 2의 66번째 염기가 민감성 유전자형에서는 구아닌(G)이었으나 내성 유전자형에서는 티민(T)으로 변이 즉, SNP가 존재함을 확인할 수 있었다.

서열번호 1 또는 2의 다형성 폴리뉴클레오티드에서 SNP 위치 정보는, Populus trichocarpa의 oxidoreductase로의 기능이 예상되는 Cytochrome P450의 mRNA (서열번호 21)를 기준으로 할 때 302번째의 아미노산인 메티오닌(ATG)의 마지막 염기서열인 구아닌이 티민으로 변이되어 아미노산이 이소류신으로 변화된 것으로 추정된다.

< Contig# 90419>

서열번호 15 및 16의 프라이머 세트를 이용하여 상기 7가지 사시나무 유전자형의 게놈 DNA에 대한 PCR 분석결과를 비교배열하여 SNV를 확인한 결과, 도 7에 도시된 바와 같이, 서열번호 3, 4의 189번째 염기가 민감성 유전자형에서는 아데닌(A)이었으나 내성 유전자형에서는 티민(T)으로 변이 즉, SNP가 존재함을 확인할 수 있었다.

서열번호 3 또는 4의 경우는 O-fucosyltransferase family protein의 mRNA를 기준으로 할 때 161번째의 아미노산의 첫번째 염기의 위치로 추정된다.

< Contig# 25781>

서열번호 17 및 18의 프라이머 세트를 이용하여 상기 7가지 사시나무 유전자형의 게놈 DNA에 대한 PCR 분석결과를 비교배열하여 SNV를 확인한 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 서열번호 5, 6의 106번째 염기가 민감성 유전자형에서는 아데닌(A)이었으나 내성 유전자형에서는 구아닌(G)으로 변이 즉, SNP가 존재함을 확인할 수 있었다.

서열번호 5 또는 6의 경우는 calmodulin-like 41 유전자 프로모터 부위의 변이로 추정된다.

< Contig# 22888>

서열번호 13 및 14의 프라이머 세트를 이용하여 상기 7가지 사시나무 유전자형의 게놈 DNA에 대한 PCR 분석결과를 비교배열하여 SNV를 확인한 결과, 도 9에 도시된 바와 같이, 서열번호 7, 8의 380번째 염기가 민감성 유전자형에서는 구아닌(G) 이었으나 내성 유전자형에서는 티민(T)으로 변이 즉, SNP가 존재함을 확인할 수 있었다.

서열번호 7 또는 8의 경우는 alpha/beta-Hydrolases superfamily 유전자의 mRNA 기준으로 528번째 아미노산의 마지막 염기의 위치로 추정된다.

< Contig# 8>

서열번호 19 및 20의 프라이머 세트를 이용하여 상기 7가지 사시나무 유전자형의 게놈 DNA에 대한 PCR 분석결과를 비교배열하여 SNV를 확인한 결과, 도 10에 도시된 바와 같이, 서열번호 9, 10의 399번째 염기가 민감성 유전자형에서는 사이토신(C) 이었으나 내성 유전자형에서는 티민(T)으로 변이 즉, SNP가 존재함을 확인할 수 있었다.

서열번호 9 또는 10의 경우는 syntaxin of plants 32 유전자 프로모터 부위의 변이로 추정된다.

<110> National Institute of Forest Science <120> SNP markers associated with drought stress tolerance of Populus davidiana Dode and its use <130> P-10180 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 172 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 1 ccatgttgat cgctgctgga tctgcaactt cctggtgaga aaagaaagct taatgagatc 60 gaaattgtta ctttatgcat cgagttcctt gctgcaggtg tagatactac taccacagcc 120 ttgcagtgga tcatggcaaa tttggttaag tatccacaga tccaggagaa ga 172 <210> 2 <211> 172 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 2 tgtatgttga tcgctgctgg atctgcactt cctggtgaga aaagaaagct taatgagatc 60 gaaattgtta ctttatgcat cgagttcctt gctgcaggtg tagatactac taccacagcc 120 ttgcagtgga tcatggcaaa tttggttaag tatccacaga tccaggagaa ga 172 <210> 3 <211> 264 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 3 ggggctgaag agcaatggca gtcacaatgc ggtagcgttt cttccctttt cttttctttt 60 ctcttctgat atttatagct cttgctgttt agtaaaagct tgacggcgaa gaatggaagc 120 gtgttattag gtttgagttt tggtttaagg ttaaacagtc tttacactga gtgtagatga 180 tggagtgaag tgtcttatct gttaagttta attgctatgt tttgccatac gaaaggaagg 240 aggcatgtag aaaagatgct aaaa 264 <210> 4 <211> 264 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 4 ggggcttgag agcaatggca gtcacaatgc ggtagcgttt cttccctttt cttttctttt 60 ctcttctgat atttatagct cttgctgttt agtaaaagct tgacggcgaa gaatggaagc 120 gtgttattag gtttgagttt tggtttaagg ttaaacagtc tttacacaga gtgtagatga 180 tggagtgaag tgtcttatct gttaagttta attgctatgt tttgccatac gaaaggaagg 240 aggcatgtag gaaaggatgc taca 264 <210> 5 <211> 617 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 5 ccattctacg ctctcagtct gtcctagtat tttagagcca aaaaagaact caaacactat 60 tcattatctt cttaattttt tcttaaaaaa tatggtctga ttacctactt tgcagctgca 120 tttaatgtac ctaccagcca ttaaatttga caaatcttgc acgccaatga tccactgcag 180 tttccctaca gcttcaagta agcaattcag tttgaatggt agcgagacgg cgccggtgcc 240 aaacattcca actcatacag ctttttctac aaatttgaca gtgcatcatg cgtactttga 300 gtcaacggtt ggaatccttc ccaactgaat caagggctga aattttaccc cggtgtagac 360 gagattgccc tcttccaccg cctataaata taggcgaagt tatggcctaa cggaggagaa 420 aatccagtcc aaattcagcc aaaagacaag tttttttcag tttctgcaca tttcttattt 480 ttttttctct ccaccgtggt cttcaaccac caccaccacc ataactggtc ttaccaccat 540 cagctccacc acaaaaacct ttttcctgca ccaataaatg tttaccagtg gtagagcaga 600 catcgcttcc ttgagcc 617 <210> 6 <211> 617 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 6 cggggtttta aggtggagga ctgaatataa tttggccaaa aaagaactca gcactgttca 60 tcatcttcat tttttctgaa aaaatctggt ctgattacct actttgcagc tgcatttaat 120 gtacctacca gccactaaat ttgacaaatc ttgcacgaca atgatccact gcagtttccc 180 tataacttca agtaaacagt ctagtttgaa tggtagcgag acggagttgt cgccgaccta 240 aacatgccaa ctcatgcagc tttttctgta gatttgacaa tgcatcatgc ctactttgag 300 ccaacgattg acatccttcc caattgaatc aagggctgaa attttatccc ggtgtagacg 360 agattgctct cttccaccgc ctataaatat aggtgaactt tatggcctaa cggaggagaa 420 aatccagtcc aaagttagcc aaaaaataag tttttttttt cagtttctac acatttcttc 480 tttttttctc tccatcgggg tcttcagcca ccatcaccac cataactgat cttcccacca 540 tcagctccac cacaaaaacc tttctcctgc accaatagat gtttaccgat ggtagagcaa 600 actccccttt cttctga 617 <210> 7 <211> 502 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 7 cacctctcgt cgtgaacgtt gatgatagca gttgtccttt cagctcataa aaacctattt 60 ctttttctac aatttaattc ataaagagag aaaaataaat attagatcta ttcttacacc 120 atagaaagat gcaatccagc ggttccgact cacagccaca acaagagcag aataaacggc 180 aacagcagca aggacaacaa ccgccgcctc caccgcaaca acaacagtgg atgcctatgc 240 agtacccggc ggcggctatg gtaatgcagc acatgccgcc tcaacattat ggattgccgc 300 ctccacaaca ctacatggct gctactgcgt accaccagta ccagcatcac caccatctcc 360 cgcatgtaca gcagcagcat cagcaaagag aaggatccag tggagataat aaaactatat 420 ggattggtga cttgcatcac tggatggatg aaagttattt acatacctgc tttgcttcta 480 ctggcgagga atgggaatat ga 502 <210> 8 <211> 503 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 8 taggaaaatg ttcagattcc gtttcctttc agctcataaa aacctatttc tttttctaca 60 atttaattca taaagagaga aaaataaata ttagatctat tcttacacca ttattatcta 120 atagaaagat gcaatccagc ggttccgact cacagccaca acaagagcag aataaacggc 180 aacagcagca aggacaacaa ccgccgcctc caccgcaaca acaacagtgg atgcctatgc 240 agtacccggc ggcggctatg gtaatgcagc acatgccgcc tcaacattat ggattgccgc 300 ctccacaaca ctacatggct gctactgcgt accaccagta ccagcatcac caccatctcc 360 cgcatgtaca gcagcagcat cagcaaagag aaggatccag tggagataat aaaactatat 420 ggattggtga cttgcatcac tggatggatg aaagttattt acatacctgc tttgcttcta 480 ctggcgatat atgggattat gga 503 <210> 9 <211> 708 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 9 ccctttggcg acgtctgcac gtgtgcagcc tcgctcattg gatgcatact ctgggtatca 60 tcaaatcctt atacatctag ttgatgaaga gaaagcatcc ttcattactg aaaaagggac 120 ctactgctac aaggttatgc cttttggtct aaagaataca ggggcaacat actagaggat 180 gatggacaag gtgtttaaac atcagttggg caggatcatg gaagaatata tggatgcatg 240 ttggtaaaaa ttatgacttt taaacaacat ctacaagacc tcaaagaagt cttccaagta 300 agccataata tgaatctgaa ccccttcaag tgcatgttcg ccatccggag gggagttctt 360 ggggttttct ggtcaaccat aaagggattg agcccaatta aaaaaaaatt caagtactgt 420 tgggcatgaa tccccctaag acagtgaggg aggttagcaa ctttgagtgg attcataact 480 agaccggggg aacgaagttt gatatttttt aaagctctaa ggaataccct caacttttag 540 tggacacttg agtgtcagaa atcctttgaa gagctgaagg tttacctctt ctccccaaat 600 gttctctttt agcttaaaga ggaagagact ttgtttttgt atttaggggt ggcagaccag 660 gctgtcagtg ctggtcaggg aggaagaagg tcacaaacag gtctgaaa 708 <210> 10 <211> 708 <212> DNA <213> Populus davidiana <400> 10 aaggtatacg cgaggtatga gttctcactc attggatgca tactctgggt atcatcaaat 60 ccttatacat ctagttgatg aagagaaagc atccttcatt actgaaaaag ggacctactg 120 ctacaaggtt atgccttttg gtctaaagaa tacaggggca acatactaga ggatgatgga 180 caaggtgttt aaacatcagt tgggcaggat catggaagaa tatatggatg catgttggta 240 aaaattatga cttttaaaca acatctacaa gacctcaaag aagtcttcca agtattaaag 300 agccataata tgaatctgaa ccccttcaag tgcatgttcg ccatccggag gggagttctt 360 ggggttttct ggtcaaccat aaagggattg agcccaatta aaaaaaaatt caagtactgt 420 tgggcatgaa tccccctaag acagtgaggg aggttagcaa ctttgagtgg attcataact 480 agaccggggg aacgaagttt gatatttttt aaagctctaa ggaataccct caacttttag 540 tggacacttg agtgtcagaa atcctttgaa gagctgaagg tttacctctt ctccccaaat 600 gttctctttt agcttaaaga ggaagagact ttgtttttgt atttaggggt ggcagaccag 660 gctgtcagtg ctggtcaggg aggaagaagg tacccaacgc tctctgga 708 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 gagggcaaga aggatgagta tg 22 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 cttctcctgg atctgtggat ac 22 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cacaaatcct ctcctctcag ac 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 catatccata cctcgccagt ag 22 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 gtgtaccgga gtcctaaggt tt 22 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gtagcatctt cctacatgcc tc 22 <210> 17 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 cttagggtca attaggggtt cc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 agagaagcga tgtctgctct ac 22 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cccctcccca agatagataa 20 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cagacgttgt actccttctt cc 22 <210> 21 <211> 1548 <212> RNA <213> Populus trichocarpa <220> <221> mRNA <222> (1)..(1548) <223> Cytochrome P450 89A2 family protein (POPTR_0013s07380g) mRNA, complete cds <400> 21 atggagatct ggttcctcat cctcgtctct ctgtccctgt ctgcattcct tatagccttc 60 ttcaacctct tcttcccttg caaaactcac aaactccctc caggccccct agcctttcca 120 attatcggca acatcttatg gctctccaaa tccttcgccg acctcgagcc cacccttcgt 180 tccctcaccc aaaagctcgg cccgatggtc accctccata tcttctcgcg cccggctatc 240 tttatttccg atcgctccct agcttaccaa gccttgatcc tgaacggttc tgtttttggt 300 aaccgcccat ctgctcttgc tactagcaga gtgcttaata gcaatcagca gactatcagc 360 tcttcatttt acggtccgac ttggcgcctc ctccgtcgaa acctcacatc agaaatcctc 420 cattcttcgc gggttaaaac atttggtcat gcgcgtaaat gggtgctgca aatcttgaag 480 aatcaatttg acttgttgtc caggtctgga gatcctgttc gtgttgtgga tcatgttcag 540 tttgccatgt tttgtctatt agtactcatg tgtttcggtg acaagttaga ggagaaacag 600 gttaaggaga tcgaacgagt cgagcgtcgc atgattgaga atatgcgtag attcaatata 660 cttaatttct ggccaagttt gagcaagata gtgcttcgta agcaatgggc agagttcttg 720 cagcttcgca aggaccaaga agatgtaatc attccattga taagagcaag aaagaagttg 780 aaggaagaga agttgggaaa atcaaatgtg gaggggaaga aggatgagta tgtcgtgtct 840 tatgttgata cgctgctgga tctgcaactt cctggtgaga aaagaaagct taatgagatc 900 gaaatggtta ctttatgcat cgagttcctt gcagcaggtg tagatactac taccacagcc 960 ttgaagtgga tcatggcaaa tttggtcaag tatccacaga ttcaggagaa gctattttcg 1020 gaaatgaaag aggtcgttgg agaaggagag ggagaggtga aggaagatga tctgcaaaag 1080 atgccgtatt taaaagcaat aattctggaa ggtctacgga gacacccacc tgggcatttt 1140 gtgctgccac atgctgtgac tgaagatacg gtgttgggtg ggtatctgat tcctaaaaac 1200 gggacagtaa atttcatggt ggctgatatg gggtgggatc caaaggtgtg ggaggatccc 1260 atggctttca agcctgaaag gtttctaaat ggtgaagggg aagcatttga tataacagga 1320 agcagggaga tcaagatgat gcctttcgga gttggaagga gaatttgccc tggatatggc 1380 ttagccatgc ttcatttgga gtattttgtg gctaatttag tctggaattt tgagtggaag 1440 gctgtggatg gagatgttat tgatttgtct gagaagcaac agcttgctgt gaccatgaag 1500 aatccattgc acgcccacat atctcgcagg tcgagaagca aggtgtag 1548

Claims

서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치인 66번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적 다형성 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 SNP 마커 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 66번째 염기는 티민(T)인 것을 특징으로 하는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 SNP 마커 조성물.
제 1항에 따른 SNP 마커 조성물을 검출 또는 증폭할 수 있는 15 내지 30 뉴클레오티드 길이의 프라이머를 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 조성물.
제 3항 또는 제 4항에 따른 조성물을 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 판별용 키트.
서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치인 66번째 염기를 포함하는 10개 이상의 연속 염기로 구성되는 다형성 폴리뉴클레오티드, 또는 이에 의해 코딩되는 폴리펩티드 또는 이의 cDNA를 포함하는 내건성 사시나무 유전자형의 선별용 마이크로 어레이.
a) 사시나무 개체로부터 분리된 시료의 DNA로부터 SNP 마커 부위를 증폭시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 증폭된 SNP 마커 부위의 염기를 결정하는 단계를 포함하고,
상기 SNP 마커 부위는 서열번호 1의 염기서열에서 SNP 위치인 66번째 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 내건성 사시나무 유전자형의 선별 방법.
제 7항에 있어서, (a) 단계에서 증폭은 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트로 행하여지는 것을 특징으로 하는 내건성 사시나무 유전자형의 선별 방법.