BR112020025726A2 - métodos e ferramentas para avaliação de patógeno de planta - Google Patents

Abstract

MÉTODOS E FERRAMENTAS PARA AVALIAÇÃO DE PATÓGENO DE PLANTA. São descritos no presente documento métodos, produtos e ferramentas para avaliação e gerenciamento de patógenos de plantas. Também são descritos coleções, kits e pacotes que compreendem reagentes (por exemplo, oligonucleotídeos) e seus usos, por exemplo, para avaliação de patógenos de plantas. Em uma modalidade, o patógeno é um patógeno Phytophthora, em uma modalidade adicional Phytophthora sojae. Em uma modalidade, a planta é soja.

Description

“MÉTODOS E FERRAMENTAS PARA AVALIAÇÃO DE PATÓGENO DE PLANTA” REFERÊNCIA CRUZADA A APLICAÇÕES RELACIONADAS

[001] O presente pedido reivindica o benefício da Patente Provisória dos EUA nº 62/686.242 protocolada em 18 de junho de 2018, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[002] Este pedido contém uma Listagem de Sequências no formulário legível do computador intitulado "G11229_399_SeqList.txt", criado em 18 de junho de 2019 e com um tamanho de cerca de 33.873 KB. O formulário legível do computador é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

[003] A presente invenção diz respeito em geral à avaliação do patógeno vegetal, e mais particularmente à avaliação dos patógenos Phytophthora.

ANTECEDENTE TÉCNICO

[004] A Phytophthora sojae (Kauf. & Gerd.), um oomiceto hemibiotrófico que causa podridão no caule e na raiz da soja, está entre os dez principais oomicetos/fungos fitopatogênico de importância científica e econômica (Kamoun et al. 2015). A gestão de P. sojae depende principalmente do desenvolvimento de cultivares com genes de maior resistência (Rps). O desenvolvimento de podridão no caule e na raiz causada por P. sojae é determinada pela relação gene-para-gene entre genes de resistência (Rps) na soja e seus genes de avirulência (Avr) correspondentes no patógeno. Tipicamente, os genes Rps codificam proteínas com nucleotídeos (NBS) e repetições ricas em leucina (LRR), enquanto os genes Avr de P. sojae codificam pequenas proteínas efetoras principalmente com motivos de aminoácidos RXLR e DEER. As proteínas NBS-LRR da soja reconhecem os efetores RXLR codificados pelos genes Avr de P. sojae, induzindo uma resposta de defesa apropriada (Sahoo et al. 2017; Song et al. 2013). O patógeno pode evitar o reconhecimento conferido pelos genes Rps através de várias mutações, como substituições, mutações por deslocamento, exclusões parciais ou completas, grandes inserções, recombinações ou alterações na expressão dos genes Avr (Tyler e Gijzen 2014; Goss et al. 2013).

[005] Até o momento, mais de 27 genes principais de Rps foram identificados em soja (Sahoo et al. 2017) e cerca de 12 genes Avr foram identificados e caracterizados em P. sojae (Gijzen et al. 1996; May et al. 2002; MacGregor et al. 2002; Whisson 1995; Tyler et al. 1995). A maioria dos genes Avr estão agrupados nos cromossomos da P. sojae, e muitos deles são parálogos candidatos. Por exemplo, Avr1a e Avr1c têm sequências muito semelhantes (Na et al. 2014). Além disso, alguns dos pares genéticos anteriormente considerados como genes diferentes, como Avr3alAvr5 e Avr6IAvr4, acabaram sendo alelos diferentes do mesmo gene (Dong et al. 2011; Dou et al. 2010). No caso da Avr1a, foi descoberto que a exclusão de duas das quatro cópias quase idênticas do gene causa virulência. Da mesma forma, algumas cepas de P. sojae têm até quatro parálogos de Avr3a, e alguns têm apenas um (Qutob et al. 2009). Tais altos níveis de similaridade, duplicações em tandem e variação no número de cópias tornam muito difícil desenvolver marcadores de diagnóstico baseados em sequência.

[006] Os genes de avirulência (Avr) estão localizados principalmente em áreas de genoma altamente dinâmicas contendo duplicações e sequências repetitivas que são propensas a rearranjos cromossômicos. Altos níveis de variação de sequência, duplicações, interdependência de genes Avr e evolução rápida complicam a tarefa de caracterizar cepas recém-evoluídas. Ferramentas eficientes para identificar com rapidez e precisão as características de virulência em P. sojae tornaram-se essenciais para prevenir surtos de doenças. O objetivo é identificar assinaturas de variação (haplótipos) associadas a fatores de virulência. Os haplótipos que representam a variação alélica de um determinado gene também foram fortemente ligados à variação do número de cópias e à expressão do mesmo gene (Kadam et al. 2016; Verta, Landry e MacKay 2016; Zeng, Zhou e Huang 2017).

[007] A fenotipagem precisa das interações entre os patótipos e diferenciais continua sendo um componente essencial para avaliar a funcionalidade dos genes Avr ou Rps. Para isso, vários métodos de fenotipagem foram desenvolvidos e propostos (Haas e Buzzell 1976; Kilen, Hartwig e Keeling 1974; Ward et al. 1979; Morrison e Thorne 1978; Wagner e Wilkinson 1992; Pazdernik et al. 2007). Com o passar dos anos, o teste de inoculação de hipocótilo tornou-se o teste padrão, particularmente devido à sua facilidade de uso (Dorrance, Jia e Abney 2004). No entanto, por mais conveniente que seja o método de inoculação de hipocótilo, ele tem limitações que levam à identificação de falsos positivos ou negativos (Schmitthenner, Hobe e Bhat 1994), o que pode trazer confusão sobre a presença e/ou funcionalidade dos genes Avr em P. sojae isolados. Recentemente, Lebreton et al. (2018) propôs o uso de um ensaio hidropônico simplificado como forma de caracterizar de forma mais robusta os fenótipos, inoculando o sistema radicular das plantas de soja diretamente com zoósporos de P. sojae.

[008] Há, portanto, a necessidade de um maior desenvolvimento de métodos e ferramentas para avaliação de patógeno vegetal.

[009] A presente descrição refere-se a uma série de documentos, cujo o conteúdo é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente invenção diz respeito à avaliação e manejo do patógeno vegetal, como a avaliação e o manejo de patógenos Phytophthora.

[0011] Em vários aspectos e modalidades, a presente divulgação fornece os seguintes itens:

1. Um método para avaliar se um patógeno Phytophthora é virulento ou avirulento, compreendendo: (a) determinar, em uma amostra composta por ácido nucleico de Phytophthora, a presença ou ausência de uma ou mais variações em um ou mais genes Avr ou uma região flanqueadora dos mesmos no ácido nucleico de Phytophthora; e (b) determinar se o patógeno Phytophthora é virulento ou avirulento com base na presença ou ausência de uma ou mais variações.

2. O método do item 1, no qual os genes Avr ou mais são um ou mais de Avr1a, Avr1b, Avr1c, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6.

3. O método do item 1 ou 2, em que as variações de uma ou mais são cada uma independentemente uma substituição, exclusão ou inserção de um ou mais nucleotídeos.

4. O método do item 3, em que uma ou mais variações são um polimorfismo nucleotídeo único (SNP).

5. O método de qualquer um dos itens 1 a 4, em que as variações são um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs estabelecidos nas Figuras 1 (Avr1a), 3 (Avr1b), 5 (Avr1c), 7 (Avr1d), 9 (Avr1k), 11 (Avr3a) e/ou 12 (Avr6), 16-23 e/ou Tabela 4 e/ou 5.

6. O método de qualquer um dos itens 1 a 5, em que a presença ou ausência de uma ou mais variações é determinada através da avaliação de uma região diferente do ácido nucleico de Phytophthora que está em desequilíbrio de ligação com uma ou mais variações.

7. O método de qualquer um dos itens 1 a 6, em que a presença ou ausência de uma ou mais variações é determinada por meio de um método de amplificação.

8. O método do item 7, em que o método de amplificação é a reação em cadeia de polimerase (PCR).

9. O método do item 7 ou 8, no qual a reação de amplificação é realizada utilizando sequências de inicadores compostas dentro das sequências estabelecidas em uma ou mais nas figuras 16-22.

10. O método de qualquer um dos itens 7 a 9, em que a amplificação é realizada como uma ou mais amplificações multiplex para determinação da presença ou ausência de duas ou mais variações em cada reação de amplificação.

11. O método do item 10, no qual uma ou mais amplificações multiplex compreendem ou consistem em duas amplificações multiplex.

12. O método do item 11, no qual as duas amplificações multiplex compreendem (a) uma primeira amplificação multiplex para determinar a presença ou ausência de um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1a mostrados nas Figuras 1, 16 e/ou 23, e/ou Tabela 4 e/ou 5 um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1b, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6 mostrados nas Figuras 3, 7, 9, 11, 13 e/ou 17 e 19-23, e/ou Tabela 4 e/ou 5; e (b) uma segunda amplificação para determinar a presença ou ausência de um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1c mostrados na Figura 5, 18, e/ou 23, e/ou Tabela 4 e/ou 5.

13. O método de qualquer um dos itens 7 a 12, em que a amplificação é realizada utilizando um ou mais pares de inicadores apresentados na Tabela 2, ou equivalentes funcionais dos seus que são direcionados a uma sequência de até 200 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões direcionados por um ou mais primersestabelecidos na Tabela 2.

14. O método do item 13, no qual a amplificação é realizada utilizando um ou mais pares de primer direcionados a uma sequência de até 150 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões visadas por um ou mais primers estabelecidos na Tabela 2.

15. O método do item 13 ou 14, no qual a amplificação é realizada utilizando um ou mais pares de primer direcionados a uma sequência de até 100 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões alvo por um ou mais primers estabelecidos na Tabela 2.

16. O método de qualquer um dos itens 13 a 15, em que a amplificação é realizada utilizando um ou mais pares de primer direcionados a uma sequência de até 50 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões visadas pelo um ou mais primers estabelecidos na Tabela 2.

17. O método de qualquer um dos itens 1 a 16, em que o patógeno Phytophthora é Phytophthora sojae.

18. Um método para avaliar o risco de infecção por patógeno Phytophthora de uma planta de soja: (a) Avaliar, em uma amostra obtida da planta, do solo, da água, das sementes, do ar ou de qualquer cultura contendo um ou vários isolados do patógeno Phytophthora, se a amostra compreende um patógeno Phytophthora virulento ou avirulento utilizando o método de qualquer um dos itens 1 a 17; e (b) Avaliar o risco de infecção por patógeno Phytophthora da planta de soja com base na avaliação feita em (a), em que a presença de um patógeno Phytophthora virulento na amostra é indicativo de um risco elevado de infecção por patógeno Phytophthora da planta de soja.

19. O método do item 19, que compreende ainda mais o tratamento da planta com um agente antifúngico se o risco de infecção por patógeno Phytophthora for elevado.

20. Um método para selecionar uma cultivar de soja para plantio em uma área agrícola, compreendendo: (a) Avaliar, em uma amostra obtida da planta, do solo, da água, das sementes, do ar ou de qualquer cultura contendo um ou vários isolados de patógeno Phytophthora, se a amostra compreende um patógeno Phytophthora virulento ou avirulento utilizando o método de qualquer um dos itens 1 a 17; (b) Se a amostra for composta por um patógeno

Phytophthora virulento, selecionar um cultivar de soja composta por um ou mais genes de resistência (Rps) que conferem resistência aos genes Avr identificados na amostra que conferem virulência, para plantio na área agrícola.

21. Uma coleção, kit ou pacote composto por um ou mais oligonucleotídeos para determinar a presença ou ausência de uma ou mais variações em um ou mais genes Avr ou uma região flanqueadora dos mesmos no ácido nucleico de um patógeno Phytophthora.

22. Uma coleção, kit ou pacote do item 21, em que os genes Avr ou mais são um ou mais de Avr1a, Avr1b, Avr1c, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6.

23. Uma coleção, kit ou o pacote do item 21 ou 22, em que as variações de uma ou mais são cada uma independentemente uma substituição, exclusão ou inserção de um ou mais nucleotídeos.

24. Uma coleção, kit ou pacote do item 23, em que uma ou mais variações são um polimorfismo nucleotídeo único (SNP).

25. Uma coleção, kit ou pacote de qualquer um dos itens 21 a 24, em que as variações são uma ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs estabelecidos nas Figuras 1 (Avr1a), 3 (Avr1b), 5 (Avr1c), 7 (Avr1d), 9(Avr1k), 11 (Avr3a) e/ou 12 (Avr6), 16- 23 e/ou Tabela 4 e/ou 5.

26. Uma coleção, kit ou pacote de qualquer um dos itens 21 a 25, em que a presença ou ausência de uma ou mais variações é determinada através da avaliação de uma região diferente do ácido nucleico de Phytophthora que está em desequilíbrio de ligação com uma ou mais variações.

27. Uma coleção, kit ou pacote de qualquer um dos itens 21 a 26, em que a presença ou ausência de uma ou mais variações é determinada por meio de um método de amplificação.

28. Uma coleção, kit ou pacote do item 27, em que o método de amplificação é a reação em cadeia de polimerase (PCR).

29. Uma coleção, o kit ou o pacote do item 27 ou 28, em que um ou mais oligonucleotídeos compreendem sequências de primers compostas dentro das sequências estabelecidas em uma ou mais nas figuras 16-22 para uso em uma ou mais reações de amplificação.

30. Uma coleção, kit ou pacote de qualquer um dos itens 27 a 29, em que o um ou mais oligonucleotídeos são para uso em uma ou mais amplificações multiplex para determinação da presença ou ausência de duas ou mais variações em cada reação de amplificação.

31. Uma coleção, kit ou pacote do item 30, em que uma ou mais amplificações multiplex compreendem ou consistem em duas amplificações multiplex.

32. Uma coleção, o kit ou o pacote do item 31, no qual as duas amplificações multiplex compreendem (a) uma primeira amplificação multiplex para determinar a presença ou ausência de um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1a mostrados nas Figuras 1, 16 e/ou 23, e/ou Tabela 4 e/ou um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1b, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6 mostrados nas Figuras 3, 7, 9, 11, 13 e/ou 17 e 19-23, e/ou Tabela 4 e/ou 5; e (b) uma segunda amplificação para determinar a presença ou ausência de um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1c mostrados na Figura 5, 18, e/ou 23, e/ou Tabela 4 e/ou 5.

33.Uma coleção, o kit ou o pacote de qualquer um dos itens 27 a 32, em que os um ou mais oligonucleotídeos compreendem um ou mais pares de primer estabelecidos na Tabela 2, ou equivalentes funcionais dos dois que são direcionados a uma sequência de até 200 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões alvos de uma ou mais primers estabelecidos na Tabela 2.

34. Uma coleção, kit ou pacote do item 33, em que um ou mais oligonucleotídeos compreendem um ou mais pares de primer direcionados a uma sequência de até 150 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões alvo por um ou mais primers estabelecidos na Tabela 2.

35. Uma coleção, kit ou pacote do item 33 ou 34, em que um ou mais oligonucleotídeos compreendem um ou par de primer direcionados a uma sequência de até 100 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões alvos de um ou mais primers estabelecidos na Tabela 2.

36. A coleção, o kit ou o pacote de qualquer um dos itens 33 a 35, em que o um ou mais oligonucleotídeos compreendem um ou mais pares de primer direcionados a uma sequência de até 50 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões alvo por um ou mais primers estabelecidos na Tabela 2.

37. Uma coleção, kit ou pacote de qualquer um dos itens 21 a 36, em que o patógeno Phytophthora é Phytophthora sojae.

38. Uma coleção, o kit ou o pacote de qualquer um dos itens 21 a 36, em que o um ou mais oligonucleotídeos estão ligados ou vinculados a um suporte sólido.

[0012] Outros objetos, vantagens e características da presente invenção se tornarão mais evidentes após a leitura da seguinte descrição não restritiva de modalidades específicas da mesma, dada a título de exemplo apenas com referência aos desenhos anexados.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0013] Nos desenhos anexados:

[0014] Figura 1: A diversidade estrutural e nucleotídea no locus Avr1a entre 31 isolados de Phytophthora sojae revelam haplótipos distintos associados aos fenótipos de virulência. a Variante nas proximidades do gene Avr1a de P. sojae. A caixa amarela representa a região de codificação do gene. A caixa laranja mostra a localização da exclusão. Asteriscos (*) indicam posições aproximadas dos SNPs. Esses SNPs são representativos de um conjunto de SNPs que definem um haplótipo. b Gráfico esquemático da posição dos SNPs para cada isolado, agrupados por haplótipos. Os SNPs em fundo cinza são diferentes do genoma de referência (isolado P6497). c Resposta fenotípica dos outliers (quando o fenótipo não corresponde ao genótipo baseado no teste de hipocótilo) do ensaio hidropônico. As respostas mostradas neste documento são representativas de todos os isolados testados. *CNV do gene Avr1a para o genoma de referência (P6497) é baseada em dados de Qutob et al. (Qutob et al. 2009).

[0015] Figura 2: Eletroforese em gel de agarose da reação de PCR para o gene Avr1a. O fenótipo de avirulência (A) ou virulência (V) em Rps1a para cada isolado selecionado é indicado na parte superior do gel. Os primers foram projetados para obter uma amplificação somente quando os isolados são avirulentos em Rps1a.

[0016] Figura 3: A diversidade de nucleotídeos no locus Avr1b entre 31 isolados de Phytophthora sojae revelam haplótipos distintos associados aos fenótipos de virulência. a Variantes dentro da região de codificação do gene Avr1b de P. sojae. A caixa amarela representa a região de codificação do gene e as barras cinzas, 5' e 3' UTR. Asteriscos (*) indicam posições aproximadas dos SNPs e pequenos indels. Essas variantes são representativas de um conjunto de variantes que definem um haplótipo. b Gráfico esquemático da posição dos SNPs para cada isolado, agrupados por haplótipos. As variantes em fundo cinza são diferentes do genoma de referência (isolado P6497). c Resposta fenotípica dos outliers (quando o fenótipo não correspondia ao genótipo baseado no teste de hipocótilo) do ensaio hidropônico. As respostas mostradas neste documento são representativas de todos os isolados testados.

[0017] Figura 4: Eletroforese em gel de agarose da reação de PCR para o gene Avr1b. O fenótipo de avirulência (A) ou virulência (V) em Rps1b para cada isolado selecionado é indicado na parte superior do gel. Os primers foram projetados para obter uma amplificação somente quando os isolados são avirulentos em Rps1b.

[0018] Figura 5: A diversidade estrutural e nucleotídea no locus Avr1c entre 31 isolados de Phytophthora sojae revelam haplótipos distintos associados aos fenótipos de virulência. a Variantes dentro da região de codificação do gene Avr1c de P. sojae. A caixa amarela representa a região de codificaçãodo gene e as barras cinza, 5' e 3' UTR. Asteriscos (*) indicam posições aproximadas dos SNPs. Esses SNPs são representativos de um conjunto de SNPs definindo um haplótipo. b Gráfico esquemático da posição dos SNPs para cada isolado, agrupado por haplótipos. Os SNPs em fundo cinza são diferentes do genoma de referência (isolado P6497). c Resposta fenotípica dos outliers (quando o fenótipo não corresponde ao genótipo baseado no teste de hipocótilo) do ensaio hidropônico. As respostas mostradas neste documento são representativas de todos os isolados testados.

[0019] Figura 6: Eletroforese em gel de agarose da reação de PCR para gene Avr1c. O fenótipo de avirulência (A) ou virulência (V) em Rps1c para cada isolado selecionado é indicado na parte superior do gel. Os primers foram projetados para obter uma amplificação somente quando os isolados são avirulentos em Rps1c.

[0020] Figura 7: A diversidade estrutural e nucleotídea no locus Avr1d entre 31 isolados de Phytophthora sojae revelam haplótipos distintos associados aos fenótipos de virulência. a Exclusão nas proximidades do locus P. sojae Avr1d. A caixa amarela representa o exon e as barras cinza, 5' e 3' UTR. As caixas laranjas mostram a posição das exclusões em isolados virulentos. b Gráfico esquemático dos genótipos com base na exclusão. Os genótipos em fundo cinza são diferentes do genoma de referência (isolado P6497). c Resposta fenotípica dos outliers (quando o fenótipo não corresponde ao genótipo com base no teste de hipocótilo) do ensaio hidropônico. As respostas mostradas neste documento são representativas de todos os isolados testados.

[0021] Figura 8: Eletroforese em gel de agarose da reação PCR para gene Avr1d. O fenótipo de avirulência (A) ou virulência (V) em Rps1d para cada isolado selecionado é indicado na parte superior do gel. Os primers foram projetados para obter uma amplificação somente quando os isolados são avirulentos em Rps1d.

[0022] Figura 9: A diversidade de nucleotídeos no locus Avr1k entre 31 isolados de Phytophthora sojae revelam haplótipos distintos associados a fenótipos de virulência. a Variante dentro da região de codificação do gene Avr1k de Phytophthora sojae. A caixa amarela representa a região de codificação do gene e as barras cinza, 5' e 3' UTR. Asteriscos (*) indicam posições aproximadas dos SNPs e do indel pequeno. Essas variantes são representativas de um conjunto de variantes que definem um haplótipo. b Gráfico esquemático da posição das variantes para cada isolado, reagrupadas por haplótipos. As variantes em fundo cinza são diferentes do genoma de referência (isolado P6497). c Resposta fenotípica dos outliers (quando o fenótipo não correspondia ao genótipo baseado no teste de hipocótilo) do ensaio hidropônico. As respostas mostradas neste documento são representativas de todos os isolados testados.

[0023] Figura 10: Eletroforese em gel de agarose da reação de PCR para o gene Avr1k. O fenótipo de avirulência (A) ou virulência (V) em Rps1k para cada isolado selecionado é indicado na parte superior do gel. Os primers foram projetados para obter uma amplificação somente quando os isolados são avirulentos em Rps1k.

[0024] Figura 11: A diversidade estrutural e nucleotídea no locus Avr3a entre 31 isolados de Phytophthora sojae revelam haplótipos distintos associados aos fenótipos de virulência. a Variante na região de codificação da região Avr3a de P. sojae. A caixa amarela representa a região de codificação do gene e as barras cinza, 5' e 3' UTR. Asterisco (*) indica posições aproximadas dos SNPs e indel pequenos. Essas variantes são representativas de um conjunto de variantes que definem um haplótipo. b Gráfico esquemático da posição das variantes para cada isolado, reagrupadas por haplótipos. As variantes em fundo cinza são diferentes do genoma de referência (isolado P6497). Os resultados do fenótipo foram confirmados por um reteste de vários isolados com o ensaio hidropônico) * A CNV do gene Avr3a para o genoma de referência (P6497) é baseada em dados de Qutob et al. (2009).

[0025] Figura 12: Eletroforese em gel de agarose da reação de PCR para o gene Avr3a. O fenótipo de avirulência (A) ou virulência (V) em Rps3a para cada isolado selecionado é indicado na parte superior do gel. Os primers foram projetados para obter uma amplificação somente quando os isolados são avirulentos em Rps3a.

[0026] Figura 13: A diversidade estrutural e nucleotídea no locus Avr6 entre 31 isolados de Phytophthora sojae revelam haplótipos distintos associados aos fenótipos de virulência. a Variante na região a montante do gene Avr6 de P. sojae. A caixa amarela representa o exon e as barras cinzas, 5' e 3' UTR. Asteriscos (*) indicam posições aproximadas dos SNPs e do indel pequeno. b Gráfico esquemático da posição das variantes para cada isolado, reagrupadas por haplótipos. As variantes em fundo cinza são diferentes do genoma de referência (isolado P6497). c Resposta fenotípica dos outliers (quando o fenótipo não corresponde ao genótipo baseado no teste de hipocótilo) do ensaio hidropônico. As respostas mostradas neste documento são representativas de todos os isolados testados.

[0027] Figura 14: Eletroforese em gel de agarose da reação de PCR para o gene Avr6. O fenótipo de avirulência (A) ou virulência (V) em Rps6 para cada isolado selecionado é indicado na parte superior do gel. Os primers foram projetados para obter uma amplificação somente quando os isolados são avirulento em Rps6.

[0028] Figura 15: Imagens em gel de amplificações por PCR multiplex de regiões discriminantes associadas a alelos de avirulência para sete genes Avr em Phytophthora sojae. (A-B) Resultados obtidos com 31 isolados com um patótipo conhecido, como indicado na parte inferior do gel, para Avr1a, 1b, 1d, 1k, 3a e 6. O tamanho esperado do amplicon para cada gene Avr é indicado à direita. (C) Gel complementar de amplificação PCR da região discriminante associada ao alelo de avirulência para Avr1c (direita) juntamente com os resultados obtidos para os 31 isolados (A = avirulento e V = virulento) onde A ou V indica presença ou ausência do amplicon, respectivamente. Para cada isolado, o patótipo deve corresponder à ausência de um amplicon para cada gene correspondente.

[0029] Figura 16: Alinhamento de sequências que abrangem o gene Avr1a de P. sojae e regiões associadas, incluindo SNPs e/ou indels associados à Avr1a descrito neste documento (16A-16E: genomaref, consenso: SEQ ID NO: 1, haplótipos A-E: SEQ ID NOs: 2-6; 16F-16J: genomaref: SEQ: ID NO: 7, haplótipos A-E: SEQ ID NOs: 8-11, consenso SEQ ID NO: 12; 16K-16N: genomaref: SEQ ID NO: 13, haplótipos A-E: SEQ ID NOs: 14-18, consenso SEQ ID NO: 19; 160-16S: genomaref, consenso: SEQ ID NO: 20, haplótipos A-E: SEQ ID NOs: 21-25; 16T-16X: genomaref, consenso: SEQ ID NO: 26, haplótipos A-E: SEQ: SEQ ID NOs: 27-31 ; 16Y-16CC: genomaref: SEQ ID NO: 32, haplótipos A-E: SEQ ID NOs: 33-37, consenso SEQ ID NO: 38; 16DD-16HH: genomaref, consenso: SEQ ID NO: 39, haplótipos A-E: SEQ ID NOs: 40-44).

[0030] Figura 17: Alinhamento das sequências que abrangem o gene Avr1b de P. sojae e regiões associadas, incluindo SNPs e/ou indels associados aoAvr1b descritos neste documento (genomaref: SEQ ID NO: 45, haplótipos A-C: SEQ ID NOs: 46-48, SEQ consensus ID NO: 49).

[0031] Figura 18: Alinhamento das sequências que abrangem o gene Avr1c de P. sojae e regiões associadas, incluindo SNPs e/ou indels associados ao Avr1c descritas neste documento (genomaref: SEQ ID NO: 50, haplótipos A-E: SEQ ID NOs: 51-55, SEQ consensus ID NO: 56).

[0032] Figura 19: Alinhamento das sequências que abrangem o gene Avr1d de P. sojae e regiões associadas, incluindo SNPs e/ou indels associados ao Avr1d descritos neste documento (genomaref, consenso: SEQ ID NO: 57, haplótipos A-C: SEQ ID NOs: 58-60).

[0033] Figura 20: Alinhamento das sequências que abrangem o gene Avr1k de P. sojae e regiões associadas, incluindo SNPs e/ou indels associados ao Avr1k descritos neste documento (genomaref: SEQ ID NO: 61, haplótipos A-C: SEQ ID NOs: 62-64).

[0034] Figura 21: Alinhamento das sequências que abrangem o gene Avr3a de P. sojae e regiões associadas, incluindo SNPs e/ou indels associados ao Avr3a descritos neste documento (genomaref, consenso: SEQ ID NO: 65, haplótipos A-B: SEQ ID NOs: 66-67).

[0035] Figura 22: Alinhamento das sequências que abrangem o gene Avr6 de P. sojae e regiões associadas, incluindo SNPs e/ou indels associados ao Avr6 descritos neste documento (genomaref, consenso: SEQ ID NO: 68, haplótipos A-B: SEQ ID NOs: 69-70).

[0036] Figura 23: Haplótipos discriminantes associados a fenótipos distintos em sete genes de avirulência de Phytophthora sojae usados para construir primers discriminantes. (A) Avr1a, (B) Avr1b, (C) Avr1c, (D) Avr1d, (E) Avr1k, (F) Avr3a e (G) Avr6. A = avirulento e V = virulento.

[0037] Figura 24: Comparação de ensaios moleculares e fenotítipos para determinar os patótipos dos isolados de Phytophthora sojae. (A) Imagem em gel de amplificações por PCR multiplex de regiões discriminantes associadas com alelos de avirulência para sete genes Avr no isolado 2012-82 de P. sojae. Presença de amplicons para Avr1b, 1d e 1k prevê um patótipo 1a, 1c, 3a e 6. (B) Os resultados de fenotipagem para o isolado 2012-82 indicam uma interação compatível com Harosoy (sem Rps), Rps1a, Rps1c, Rps3a e Rps6 e uma interação incompatível com Rps1b, Rps1d e Rps1k, avaliando assim um patótipo 1a, 1c, 3a e 6, semelhante ao ensaio molecular. (C) Imagem em gel de amplificações por PCR multiplex de regiões discriminantes associadas com alelos de avirulência para sete genes Avr no isolado 2012-156 de P. sojae. A presença de amplicons para Avr1b, 1k, 3a, 6 e todos os três amplicons para Avr1a prevê um patótipo 1c e 1d. (D) Os resultados de fenotipagem para o isolado 2012-156 indicam uma interação compatível com Harosoy (sem Rps), Rps1c, Rps1d e Rps3a e uma interação incompatível com Rps1a, Rps1b, Rps1k e Rps6, avaliando assim um patótipo 1c, 1d e 3a, sendo 3a a única interação em desacordo com o ensaio molecular.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO

[0038] Nos estudos descritos neste documento, um conjunto diversificado de 31 isolados de P. sojae representando a gama de patótipos comumente observados nos campos de soja foram sequenciados utilizando sequenciamento do genoma completo (WGS). Para entender a evolução e a constituição genética de cepas de P.sojae, análises de haplótipos utilizando os dados do WGS foram realizadas para os sete genes Avr mais importantes encontrados em populações P. sojae: 1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 3a, 6. Os dados descritos neste documento fornecem novas percepções sobre a complexidade dos genes Avr e sua funcionalidade associada e revelam que suas assinaturas genômicas podem ser usadas como preditores precisos de fenótipos para interação com genes Rps na soja. Em modalidades, com base nessas assinaturas genômicas, foi desenvolvido um teste de PCR multiplex que permite caracterizar precisamente o perfil de virulência de qualquer isolado de P. sojae, superando a limitação dos métodos de fenotipagem atualmente utilizados. Este teste terá, por exemplo, aplicações úteis para produtores e criadores de soja, permitindo a seleção e implantação de genes Rps em germoplasma de soja que permitem uma resistência específica contra os perfis de virulência de P. sojae presentes em um determinado campo ou em uma determinada região. Considerando que P. sojae pode causar perdas anuais de US $ 1-2 bilhões de dólares em todo o mundo (Tyler, 2007), o teste potencialmente resultará em reduções significativas de perdas para os produtores de soja, prevenindo a infecção contra isolados virulentos deP. sojae.

DEFINIÇÕES

[0039] A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente dos termos na aplicação instantânea, são fornecidas as seguintes definições.

[0040] Títulos, e outros identificadores, por exemplo, (a), (b), (i), (ii), etc., são apresentados apenas para facilitar a leitura da especificação e das reivindicações. O uso de títulos ou outros identificadores na especificação ou reivindicações não requer necessariamente que as etapas ou elementos sejam realizados em ordem alfabética ou numérica ou na ordem em que são apresentados. Todos os métodos descritos neste documento podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que indicado de outra forma neste documento ou claramente contradito pelo contexto.

[0041] Na presente descrição, uma série de termos são amplamente utilizados. A fim de fornecer uma compreensão clara e consistente da especificação e das reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, são fornecidas as seguintes definições.

[0042] As sequências nucleotídeas são apresentadas neste documento por uma única vertente, na direção de 5' para 3', da esquerda para a direita, utilizando os símbolos de nucleotídeos de uma letra como comumente utilizados na técnica e de acordo com as recomendações da Comissão de Nomenclatura Bioquímica do IUPAC IUB. Uma "molécula de ácido nucleico isolado", como é geralmente entendida e usada neste documento, refere-se a um polímero de nucleotídeos, e inclui, mas não deve se limitar ao DNA e ao RNA. A molécula de ácido nucleico "isolado" não está em seu estado natural in vivo, obtida por clonagem ou quimicamente sintetizada. Por "isolado" significa que uma amostra contendo um ácido nucleico alvo é retirada de seu meio natural, mas o termo não conota qualquer grau de purificação.

[0043] O uso da palavra "um" ou "uma" quando usado em conjunto com o termo "compreendendo" nas reivindicações e/ou na especificação pode significar "um", mas também é consistente com o significado de "um ou mais", "pelo menos um" e "um ou mais de um".

[0044] Como usado na especificação e nas reivindicações, as palavras "compreendendo" (e qualquer forma de incluir, como "compreende" e "compreender"), "ter" (e qualquer forma de ter, como "ter" e "tem"), "incluir" (e qualquer forma de incluir, como "inclui" e "incluindo") ou "contendo" (e qualquer forma de conter, como "contém" e "conter") são inclusivas ou abertas e não excluem elementos adicional, não recitados ou etapas do método.

[0045] Ao longo desta aplicação, o termo "sobre" é usado para indicar que um valor inclui o desvio padrão de erro para o dispositivo ou método que está sendo empregado para determinar o valor. Em geral, a terminologia "sobre" destina-se a designar uma possível variação de até 10%. Portanto, uma variação de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10% de um valor está incluída no termo "sobre".

[0046] O termo molécula ou sequência "DNA" ou "RNA" (bem como às vezes o termo "oligonucleotídeo") refere-se a uma molécula composta geralmente pelos desoxirribonucleotídeos adenina (A), guanina (G), timina (T) e/ou citosina (C). Em "RNA", T é substituído por uracila (U).

[0047] A recitação de faixas de valores neste documento é meramente destinada a servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que se enquadra na faixa, a menos que indicado de outra forma neste documento, e cada valor separado é incorporado na especificação como se fosse individualmente citado neste documento. Todos os subconjuntos de valores dentro das faixas também são incorporados na especificação como se fossem individualmente citados neste documento. Por exemplo, para a citação de faixas numéricas neste documento, cada número intermediário entre o mesmo grau de precisão é explicitamente contemplado. Por exemplo, para a faixa de 18-20, os números 18, 19 e 20 são explicitamente contemplados, e para a faixa 6.0-7.0, os números 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6,

6.7, 6.8, 6.9 e 7.0 são explicitamente contemplados.

[0048] O uso de todos e quaisquer exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "como") fornecida neste documento, destina- se apenas a ilustrar melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, a menos que seja reivindicada de outra forma.

[0049] Toda e qualquer combinação e subcombinações das modalidades e características divulgadas neste documento são englobadas pela presente invenção.

[0050] A menos que definido de outra forma neste documento, os termos científicos e técnicos utilizados em relação à presente divulgação terão os significados comumente compreendidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, quaisquer nomenclaturas utilizadas em conexão com, e técnicas de, cultura células e tecidos, biologia molecular, imunologia, microbiologia, genética e proteína e química de ácido nucleico e hibridização descritas neste documento são aquelas que são bem conhecidas e comumente utilizadas na técnica. O significado e o escopo dos termos devem ser claros; entretanto, no casode qualquer ambiguidade latente, as definições fornecidas neste documento prevalecem sobre qualquer dicionário ou definição extrínseca. Além disso, a menos que seja exigido de outra forma pelo contexto, os termos singulares incluirão pluralidades e termos plurais incluirão o singular.

[0051] A prática dos métodos, bem como a preparação e uso dos produtos e composições divulgados neste documento empregam, salvo indicação de outra forma, técnicas convencionais em biologia molecular, bioquímica, estrutura e análise de cromatina, química computacional, cultura de células, DNA recombinante e campos relacionados como estão dentro da habilidade da técnica. Essas técnicas são totalmente explicadas na literatura. Veja, por exemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 e terceira edição, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nova York, 1987 e atualizações periódicas; a série METHODS IN ENZYMOLOGY, Imprensa Acadêmica, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, terceira edição, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman e A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; e MÉTODOS IN BIOLOGIA MOLECULAR, Vol. 119, "Protocolos Chromatin" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

[0052] Como usado neste documento, "polinucleotídeo" ou "molécula de ácido nucleico" refere-se a um polímero de nucleotídeos e inclui DNA (por exemplo, DNA genômico, cDNA), moléculas de RNA (por exemplo,

mRNA) e quimeras dos mesmos. A molécula de ácido nucleico pode ser obtida por técnicas de clonagem ou sintetizada. O DNA pode ser de fita dupla ou de fita simples (fita de codificadora ou fita não codificadora [antisense]). O ácido desoxirribonucleico (DNA) convencional e o ácido ribonucleico (RNA) estão incluídos nos termos "molécula de ácido nucleico" e "polinucleotídeo" como sendo seus análogos (por exemplo, gerados usando análogos nucleotídeos, por exemplo, inosina ou nucleotídeos fosforotioato). Esses análogos de nucleotídeos podem ser usados, por exemplo, para preparar polinucleotídeos que tem habilidades de emparelhamento de base alteradas ou resistência aumentada a nucleases. Uma estrutura de ácido nucleico pode incluir uma variedade de ligações conhecidas na técnica, incluindo uma ou mais ligações açúcar- fosfodiéster, ligações de ácidos-peptídeos nucleicos (chamados de "ácidos nucleicos de peptídeos" (PNA); Hydig-Hielsen et al., PCT Int'l Pub. nº WO 95/32305), ligações de fosforotioato, ligações de metilfosfonato ou suas combinações. As porções de açúcar do ácido nucleico podem ser ribose ou desoxirribose, ou compostos similares com substituições conhecidas, por exemplo, substituições de 2' metoxi (contendo uma porçãode 2'-0- metilribofuranosil; ver PCT nº WO 98/02582) e/ou substituições de 2' haleto. Bases nitrogenadas podem ser bases convencionais (A, G, C, T, U), seus análogos conhecidos (por exemplo, inosina ou outras; ver em " The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36", Adams et al., ed, 11 ed, 1992), ou derivados conhecidos de bases purina ou pirimidina (ver, Cook, PCT Int'l Pub. WO nº 93/13121) ou resíduos "abásicos" em que a estrutura não inclui base nitrogenada para um ou mais resíduos (Arnold et al., U.S. Pat. nº 5.585.481). Um ácido nucleico pode incluir apenas açúcares, bases e ligações convencionais, como encontrado no RNA e no DNA, ou pode incluir componentes convencionais e substituições (por exemplo, bases convencionais ligadas através de uma estrutura metoxi, ou um ácido nucleico, incluindo bases convencionais e um ou mais análogos de base).

[0053] Os termos "ácido nucleico", "polinucleotídeo" e

"oligonucleotídeo" são usados intercambiavelmente e referem-se a um polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo, em conformação linear ou circular, e na forma de fita simples ou dupla. Para efeitos da presente divulgação, estes termos não devem ser interpretados como limitantes em relação ao comprimento de um polímero. Os termos podem abranger análogos conhecidos de nucleotídeos naturais, bem como nucleotídeos que são modificados nas porções de base, açúcar e/ou fosfato (por exemplo, estruturas de fosforotioato). Em geral, um análogo de um nucleotídeo específico tem a mesma especificidade de emparelhamento de base; ou seja, um análogo de A irá parear com T.

[0054] Como usado neste documento, os termos "gene" e "gene recombinante" referem-se a moléculas de ácido nucleico que podem ser isoladas do DNA cromossômico, e muitas vezes incluem uma estrutura de leitura aberta codificando uma proteína. Um gene pode incluir sequências de codificação, sequências não codificadoras, íntrons e sequências regulatórias, bem conhecidas.

[0055] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados intercambiavelmente para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. O termo também se aplica aos polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais aminoácidos são análogos químicos ou derivados modificados de aminoácidos de ocorrência natural correspondentes.

[0056] Como usado neste documento, o termo "mutação não consertativa" ou "substituição não consertativa" no contexto de polipeptídeos refere-se a uma mutação em um polipeptídeo que altera um aminoácido para um aminoácido diferente com diferentes propriedades bioquímicas (ou seja, carga, hidrofobicidade e/ou tamanho). Embora existam muitas maneiras de classificar aminoácidos, eles são frequentemente classificados em seis grupos principais com base em sua estrutura e nas características químicas gerais de seus grupos R, (i) Alifático (Glicina, Alanina, Valina, Leucina, Isoleucina); (ii) Hidroxila ou Enxofre/Selênio (também conhecidos como aminoácidos polares) (serina, cisteína, selenocisteína, treonina, metionina); (iii) Cíclico (Prolina); (iv) Aromático

(Fenilalanina, Tirosina, Triptofano); (v) Básico (Histidina, Lisina, Arginina) e (vi) Ácido e sua Amida (Aspartato, Glutamato, Asparagina, Glutamina). Assim, uma substituição não consertativa inclui uma que altera um aminoácido de um grupo com outro aminoácido de outro grupo (por exemplo, um aminoácido alifático para um aminoácido básico, cíclico, aromático ou polar; um aminoácido básico para um aminoácido ácido, um aminoácido negativamente carregado (ácido aspártico ou glutâmico) para um aminoácido positivamente carregado (lisina, arginina ou histidina) etc.

[0057] Por outro lado, uma "substituição consertativa" ou "mutações consertativas" no contexto dos polipeptídeos são mutações que alteram um aminoácido para um aminoácido diferente com propriedades bioquímicas similares (por exemplo, carga, hidrofobicidade e tamanho). Por exemplo, uma leucina e uma isoleucina são hidrofóbicas, alifáticas e ramificadas. Da mesma forma, o ácido aspártico e o ácido glutâmico são resíduos pequenos e carregados negativamente. Portanto, mudar uma leucina por uma isoleucina (ou vice-versa) ou mudar um ácido aspártico por um ácido glutâmico (ou vice- versa) são exemplos de substituições consertativas. "Sequência de codificação" ou "codificação de ácido nucleico" como usado neste documento significa os ácidos nucleicos (RNA ou molécula de DNA) que compõem uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína. A sequência de codificação pode incluir ainda sinais de iniciação e terminação operacionalmente ligados a elementos regulatórios, incluindo um promotor e um sinal de poliadenilização capaz de direcionar a expressão nas células de um indivíduo ou mamífero ao qual o ácido nucleico é administrado. A sequência de codificação pode ser otimizada por códons, por exemplo, para uso em células eucarióticas, de mamíferos e/ou humanas.

[0058] O termo "variante" refere-se neste documento a um ácido nucleico ou polipeptídeo, que difere de uma sequência de referência correspondente em virtude de uma mutação ou modificação, incluindo uma inserção, substituição ou exclusão de um ou mais nucleotídeos ou aminoácidos,

em comparação com a sua molécula de referência correspondente. Em uma modalidade, a sequência de referência é Phytophthora sojae genoma de referência P6497 (http://protists.ensembl.org/Phytophthora_sojae/lnfo/lndex). As inserções e exclusões são comumente referidas coletivamente como "indels". Em modalidades, a mutação ou modificação é um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) ou um indel.

[0059] Um "polimorfismo de nucleotídeo único" ou "SNP" refere-se a uma posição específica em uma sequência (por exemplo, em um genoma) onde há uma substituição de um nucleotídeo em relação a uma sequência de referência. Em modalidades, o SNP está localizado em uma região de codificação de um gene, em outras modalidades o SNP está localizado em uma região não codificadora de um gene ou em uma região intergênica. Em modalidades, os SNPs da invenção compreendem um ou mais SNPs descritos neste documento, tais como um ou mais SNPs correspondentes a um ou mais SNPs estabelecidos nas Figuras 1 (Avr1a), 3 (Avr1b), 5 (Avr1c), 8 (Avr1d),10 (Avr1k), 12 (Avr3a), 14 (Avr6), 16-23, e/ou Tabela 4 e/ou 5. Em modalidades, vários SNPs podem ser determinados simultaneamente, enquanto em outras modalidades os SNPs podem ser determinados separadamente.

[0060] Em algumas modalidades, um ou mais SNPs ou indels descritos neste documento podem ser detectados ou determinados através da detecção de uma região diferente ou SNP que está em ligação com um ou mais SNPs ou indels descritos neste documento encontrados associados à virulência ou à avirulência de um patógeno Phytophthora. "Desequilíbrio de ligação" conforme usado neste documento refere-se à associação não aleatória de alelos em diferentes l, por exemplo, dois SNPs. Métodos para medir a desequilíbrio de ligação são conhecidos na técnica. Duas dessas regiões, por exemplo, SNPs, estão em desequilíbrio de ligação se forem herdadas juntas, e, nesse caso, sua presença está correlacionada com um grau relativamente elevado de certeza.

[0061] Determinar o genótipo, por exemplo, um SNP ou indel, pode incluir genotipagem direta, por exemplo, determinando a identidade do nucleotídeo de cada alelo no locus de SNP ou indel, e/ou genotipagem indireta, por exemplo, determinando a identidade de cada alelo em um ou mais loci que estão em desequilíbrio de ligação com o SNP ou indel em questão e que permitem inferência da identidade de cada alelo no locus do SNP em questão com um grau substancial de confiança, nas modalidades com uma probabilidade de pelo menos 85%, 90%, 95% ou 99% de certeza.

[0062] Em modalidades, um SNP ou indel é detectado através de um método de amplificação, por exemplo, amplificação por PCR, ou por sequenciamento de nucleotídeos da região que compreende o SNP ou indel. Em modalidades, um SNP ou indel é detectado usando uma sonda específica para o SNP ou indel, em modalidades via amplificação por PCR na presença da sonda específica para o SNP ou indel.

[0063] Em modalidades, SNPs ou indels descritos neste documento podem ser detectados usando microarranjos de DNA. Tais microarranjos compreendem oligonucleotídeos ou sondas ligadas ou fixadas a um suporte ou substrato sólido, como uma esfera, chip, lâmina de vidro ou membrana. Os oligonucleotídeos ou sondas podem ser organizados em regiões discretas no substrato, e por sua vez seu arranjo ou organização no substrato facilita a identificação de um SNP ou indel através de interações específicas de sonda alvo.

[0064] Em modalidades, a detecção de variação genética como um SNP ou indel é via hibridização para sequências específicas que reconhecem o mutante e alelos de referência em um fragmento de ácido nucleico de uma amostra de teste. Em modalidades, o fragmento foi amplificado, por exemplo, por PCR, e em uma nova modalidade rotulada com um marcador detectável, como uma molécula fluorescente. Em modalidades, a reação de amplificação pode ser realizada no próprio microarranjo.

[0065] Uma mutação missense é uma substituição de nucleotídeo que resulta em um códon que codifica um aminoácido diferente.

Uma mutação sem sentido resulta na introdução de um códon de terminação. Uma mutação readthrough resulta na troca de um códon de terminação por um códon de aminoácido. Mutações missense, nonsense readthrough são tipos de substituições não sinônimos, ou seja, que resultam em uma modificação da sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado. Uma substituição sinônima em uma sequência de codificação é aquela que não modifica a sequência de aminoácidos codificados. Substituições de sinônimos também podem ocorrer em regiões não codificadoras. Em modalidades, uma modificação, alteração ou mutação descrita neste documento é sinônima ou não sinônima. Em outras modalidades, uma modificação, alteração ou mutação descrita neste documento é missense, nonsense ou readthrough.

[0066] "Complemento" ou "complementar" como usado neste documento refere-se a Watson-Crick (por exemplo, A-T/U e C-G) ou o pareamento de bases hoogsteen entre nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos de moléculas de ácido nucleico. "Complementaridade" refere-se a uma propriedade compartilhada entre duas sequências de ácido nucleico, de tal forma que quando elas estiverem alinhadas antiparalelas uma à outra, as bases de nucleotídeos em cada posição serão complementares.

SEMELHANÇA DE SEQUÊNCIA

[0067] Os termos "identidade" e "percentagem de identidade" são usados intercambiavelmente neste documento. Para efeitos desta invenção, está definido neste documento que, a fim de determinar a identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou de duas sequências de ácido nucleico, as sequências estão alinhadas para fins de comparação ideal (por exemplo, lacunas podem ser introduzidas na sequência de um primeiro aminoácido ou sequência de ácido nucleico para alinhamento ideal com uma segunda sequência de aminoácido ou ácido nucleico). Os resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em posições de aminoácidos correspondentes ou posições de nucleotídeos são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência é ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácidos ou nucleotídeos que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nessa posição.

A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (ou seja, % identidade = número de posições idênticas/número total de posições (ou seja, posições sobrepostas) x 100). De preferência, as duas sequências têm o mesmo comprimento.

Assim, de acordo com a presente invenção, o termo "idêntico" ou "percentagem de identidade " no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou aminoácidos, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são as mesmas, ou que têm uma porcentagem especificada de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são os mesmos (por exemplo, 60% ou 65% de identidade, preferencialmente, 70-95% identidade, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou sobre uma região designada como medido usando um algoritmo de comparação de sequências como conhecido na técnica, ou por alinhamento manual e inspeção visual.

Sequências que têm, por exemplo, 60% a 95% ou maior identidade sequencial são consideradas substancialmente idênticas.

Tal definição também se aplica ao complemento de uma sequência de teste.

Preferencialmente, a identidade descrita existe sobre uma região que tem pelo menos cerca de 15 a 25 aminoácidos ou nucleotídeos no comprimento, mais preferencialmente, sobre uma região que tem cerca de 50 a 100 aminoácidos ou nucleotídeos no comprimento.

Aqueles que têm habilidade na técnica saberão como determinar porcentagem de identidade no meio/entre sequências usando, por exemplo, algoritmos como aqueles baseados no programa de computador CLUSTALW (Thompson Nucl.

Ácidos Res. 2 (1994), 4673-4680) ou FASTDB (Brutlag Comp.

App.

Biosci. 6 (1990), 237-245), como se sabe na técnica.

Embora o algoritmo FASTDB normalmente não considere exclusões internas não correspondentes ou adições em sequências, ou seja, lacunas, em seu cálculo, isso pode ser corrigido manualmente para evitar uma superestimação da % de identidade.

O

CLUSTALW, no entanto, leva em conta lacunas de sequência em seus cálculos de identidade. Também disponíveis para quem tem habilidade nesta técnica são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0 (Altschul Nucl. Ácidos Res. 25 (1977), 3389- 3402). O programa BLASTN para sequências de ácido nucleico usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 3, e uma expectativa (E) de 10. A matriz de pontuação BLOSUM62 (Henikoff, Proc. Natl. Acad. Scid. USA, 89, (1989), 10915) usa alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as fitas. Além disso, a presente invenção também diz respeito a moléculas de ácido nucleico, da qual a sequência é degenerada em comparação com a sequência de uma molécula de hibridização acima descrita. Quando usado de acordo com a presente invenção, o termo "ser degenerado como resultado do código genético" significa que, devido à redundância do código genético diferentes sequências de nucleotídeos codificam para o mesmo aminoácido. A presente invenção também se refere a moléculas de ácido nucleico que compõem uma ou mais mutações ou exclusão, e para moléculas de ácido nucleico que hibridizam com uma das moléculas de ácido nucleico descritas, que mostram (uma) mutação(ões) ou (uma) exclusão(ões). A pessoa qualificada apreciará que todos esses diferentes algoritmos ou programas produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a identidade percentual geral de duas sequências não é significativamente alterada ao usar algoritmos diferentes.

[0068] De forma relacionada, os termos "homologia" ou "percentual de homologia", referem-se a uma semelhança entre duas sequências de polipeptídeos, mas levam em conta mudanças entre aminoácidos (sejam conservador ou não). Como bem conhecido na técnica, os aminoácidos podem ser classificados por carga, hidrofobicidade, tamanho, etc. Também é bem conhecido na técnica que as alterações de aminoácidos podem ser conservadoras (por exemplo, elas não afetam significativamente, ou não afetam de todo, a função da proteína). Uma infinidade de mudanças conservadoras são conhecidas na técnica, serina para treonina, isoleucina para leucina, arginina para lisina etc., Assim, o termo homologia introduz noções evolucionistas (por exemplo, pressão da evolução para uma função de retenção de regiões essenciais ou importantes de uma sequência, ao mesmo tempo em que permite uma certa deriva de regiões menos importantes).

[0069] A pessoa qualificada estará ciente do fato de que vários programas de computador diferentes estão disponíveis para determinar a homologia entre duas sequências. Por exemplo, uma comparação de sequências e determinação da porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, o percentual de identidade entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software Accelrys GCG (disponível em http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando uma matriz BLOSUM62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A pessoa qualificada apreciará que todos esses parâmetros diferentes produzirão resultados ligeiramente diferentes, mas que a identidade percentual geral de duas sequências não é significativamente alterada ao usar algoritmos diferentes.

[0070] Em outra modalidade, a identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos é determinada usando o programa GAP no pacote de software Accelrys GCG (disponível em http://www.accelrys.com/products/gcg/), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso gap de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Em outra modalidade, a porcentagem de identidade de dois aminoácidos ou sequência de nucleotídeo é determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4: 1 1 -17 (1989) que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0) (disponível na Consulta ALIGN usando dados sequenciais do servidor Genestream IGH Montpellier France http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-

guess.cgi) usando uma tabela de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4.

[0071] As sequências de ácido nucleico e proteína da presente invenção podem ainda ser usadas como uma "sequência de consulta" para realizar uma busca em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar outros membros da família ou sequências relacionadas. Essas pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de nucleotídeos BLAST podem ser realizadas com o programa NBLAST, pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogos às moléculas de ácido nucleico da invenção. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogos às moléculas proteicas da invenção. Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997) Ácidos Nucleicos Res. 25(17): 3389-3402. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Veja a página inicial do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.

[0072] Como usado neste documento, as expressões "correspondentes", "correspondentes às posições", e "em uma posição ou posições correspondentes", e variações gramaticais, referem-se a uma ou mais posições de nucleotídeos ou aminoácidos que são determinadas a corresponder umas às outras com base em sequência e/ou alinhamentos estruturais com uma sequência genética de referência especificada, sequência de codificação ou proteína. Por exemplo, uma posição "correspondente" a uma posição de aminoácido de uma determinada proteína pode ser determinada empiricamente alinhando a sequência de aminoácidos dessa proteína dada com a de um polipeptídeo de interesse que compartilha um nível de identidade sequencial com ela. As posições correspondentes podem ser determinadas comparando e alinhando sequências para maximizar o número de nucleotídeos ou resíduos correspondentes, por exemplo, de tal forma que a identidade entre as sequências seja superior a 95%, 96%>, 97%, 98% ou 99% ou mais. As posições correspondentes também podem ser baseadas em alinhamentos estruturais, por exemplo, utilizando alinhamentos simulados por computador da estrutura proteica. A recitação de que aminoácidos de um polipeptídeo correspondem a aminoácidos em uma sequência divulgada refere-se a aminoácidos identificados no alinhamento do polipeptídeo com a sequência divulgada para maximizar a identidade ou a homologia (onde os aminoácidos conservados estão alinhados) usando um algoritmo de alinhamento padrão, como o algoritmo GAP. Por exemplo, a Tabela 5 apresenta as posições correspondentes em NOs SEQ ID: 1 -70 para certos SNPs e indels descritos neste documento.

[0073] Por "suficientemente complementar" significa uma sequência de bases de ácido nucleico contígua que é capaz de hibridizar para outra sequência por ligação de hidrogênio entre uma série de bases complementares. As sequências de bases complementares podem ser complementares em cada posição em sequência usando o emparelhamento de base padrão (por exemplo, emparelhamento G:C, A:T ou A:U) ou podem conter um ou mais resíduos (incluindo resíduos abásico) que não são complementares usando o emparelhamento de base padrão, mas que permitem que toda a sequência hibridize especificamente com outra sequência de base em condições de hibridização apropriadas. As bases contíguas de um oligômero são preferencialmente cerca de 80% (81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100%), mais preferencialmente cerca de 90% complementar à sequência à qual o oligômero se hibridiza especificamente. As condições adequadas de hibridização são bem conhecidas pelos versados na técnica, podem ser previstas prontamente com base na composição e condições da sequência, ou podem ser determinadas empiricamente usando testes de rotina (ver Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ªnd ed.

(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) em §§

1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 e 11.47-11.57, particularmente em §§ 9.50-9.51,

11.12-1 1.13, 11.45-1 1.47 e 11.55-11.57).

[0074] A presente invenção refere-se a uma série de unidades ou percentuais que são frequentemente listados em sequências. Por exemplo, quando se refere a "pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%...", ou "pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%...", cada unidade não está listada, por uma questão de brevidade. Por exemplo, algumas unidades (por exemplo, 81, 82, 83, 84, 85, ... 91, 92%....) podem não ter sido especificamente recitadas, mas são consideradass englobadas pela invenção atual. A não listagem dessas unidades específicas deve, portanto, ser considerada no escopo da presente invenção.

[0075] As sequências de ácido nucleico podem ser detectadas usando hibridização com uma sequência complementar (por exemplo, sondas de oligonucleotídeo) (ver Patente dos EUA nº 5.503.980 (Cantor), 5.202.231(Drmanac et al.), 5.149.625 (Church et al.), 5.112.736 (Caldwell et al.), 5.068.176 (Vijg et al.), e 5.002.867 (Macevicz). Os métodos de detecção de hibridização podem usar uma série de sondas (por exemplo, em um chip de DNA) para fornecer informações sequenciais sobre o ácido nucleico alvo que hibridiza seletivamente para uma sequência de sonda exatamente complementar em um conjunto de quatro sequências de sondas relacionadas que diferem um nucleotídeo (ver Patente dos EUA nº 5.837.832 e 5.861.242 (Chee et al.)).

[0076] Uma etapa de detecção pode usar qualquer uma das várias variedades de métodos conhecidos para detectar a presença de ácido nucleico por hibridização a uma sonda de oligonucleotídeo. Os tipos de métodos de detecção nos quais as sondas podem ser usadas incluem Southern blots (detecção de DNA), dot-blot (DNA, RNA) e Northern blots (detecção de RNA). Proteínas marcadas também podem ser usadas para detectar uma sequência de ácido nucleico particular à qual se liga (por exemplo, detecção de proteínas por tecnologia distante do oeste: Guichet et al., 1997, Nature 385(6616): 548- 552; e Schwartz et al., 2001, EMBO 20(3): 510-519). Outros métodos de detecção incluem kits contendo reagentes da presente invenção em uma configuração de vareta e afins. Claro, pode ser preferível usar um método de detecção que seja aceitável para a automação. Um exemplo não limitante inclui um chip ou outro suporte que inclua um ou mais (por exemplo, uma matriz) de diferentes sondas.

[0077] Um "marcador" refere-se a um meio molecular ou composto que pode ser detectado ou pode levar a um sinal detectável. Um marcador é juntado, direta ou indiretamente, por exemplo a um oligonucleotídeo, uma sonda de ácido nucleico ou o ácido nucleico a ser detectado (por exemplo, uma sequência amplificada) ou a um polipeptídeo a ser detectado. A marcação direta pode ocorrer através de ligações ou interações que vinculem o marcador ao polinucleotídeo ou polipeptídeo (por exemplo, ligações covalentes ou interações não covalentes), enquanto a marcação indireta pode ocorrer através do uso de um "ligante" ou meio de ponte, como nucleotídeos adicionais, aminoácidos ou outros grupos químicos, que são marcados direta ou indiretamente. Meios de ponte podem amplificar um sinal detectável. Os marcadores podem incluir qualquer meio detectável (por exemplo, um radionuclídeo, ligante como biotina ou avidina, enzima ou substrato enzimático, grupo reativo, cromóforo como corante ou partícula colorida, composto luminescente incluindo um composto bioluminescente, fosforescente ou quemioluminescente, e composto fluorescente).

[0078] "Amplificação" refere-se a qualquer procedimento in vitro para obtenção de múltiplas cópias ("amplicons" ou "produtos de amplificação") de uma sequência de ácido nucleico alvo ou seu complemento ou fragmentos. A amplificação in vitro refere-se à produção de um ácido nucleico amplificado que pode conter menos do que a sequência completa da região alvo ou seu complemento. Os métodos de amplificação in vitro incluem, por exemplo, amplificação mediada por transcrição, amplificação mediada por replicase,

amplificação de reação em cadeia de polimerase (PCR), amplificação de reação em cadeia de ligase (LCR) e amplificação de deslocamento de fita (SDA, incluindo o método de amplificação de deslocamento de fita múltipla (MSDA)). A amplificação mediada por replicase usa moléculas de ácido nucleico autorreplicante, e uma replicase como Qβ-replicase (por exemplo, Kramer et al., Patente dos EUA nº 4.786.600). A amplificação do PCR é bem conhecida e usa o DNA polimerase, primers e ciclos térmicos para sintetizar múltiplas cópias dos duas fitas complementares de DNA ou cDNA (por exemplo, Mullis et al., Patente dos EUA n° 4.683, 195, 4.683.202 e 4.800, 159). A amplificação LCR usa pelo menos quatro oligonucleotídeos separados para amplificar um alvo e sua cadeia complementar usando múltiplos ciclos de hibridização, ligação e desnaturação (por exemplo, Patente EP. App. Pub. n° 0 320 308). SDA é um método no qual um primer contém um local de reconhecimento para uma endonuclease de restrição que permite que o endonuclease corte uma fita de um duplex de DNA hemimodificado que inclui a sequência alvo, seguido de amplificação em uma série de etapas de extensão de primer e deslocamento de fitas (por exemplo, Walker et al., Patente dos EUA nº 5.422.252). Dois outros métodos conhecidos de amplificação por deslocamento de fita não exigem corte de endonuclease (Dattagupta et al., Patente dos EUA nº 6.087, 133 e Patente dos EUA nº 6, 124, 120 (MSDA)). Aqueles habilitados na técnica entenderão que as sequências de primer de oligonucleotídeos da presente invenção podem ser facilmente usadas em qualquer método de amplificação in vitro baseado na extensão do primer por uma polimerase, (ver em geral Kwoh et al., 1990, Am. BioTechnology. Lab. 8: 14 25 e (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Scid. USA 86, 1 173 1 177; Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6: 1 197 1202; Malek et al., 1994, Methods Mol. Biol., 28:253 260; e Sambrook et al., 2000, Molecular Cloning – A Laboratory, Third Edition, CSH Laboratories). Como comumente conhecido na técnica, os oligos são projetados para se ligarem a uma sequência complementar em condições selecionadas.

[0079] Como usado neste documento, um "primer"

define um oligonucleotídeo capaz de se emparelhar com uma sequência alvo, criando assim uma região de cadeia dupla que pode servir como ponto de iniciação para a síntese de ácido nucleico em condições adequadas. A região 5' do primer pode ser não complementar à sequência de ácido nucleico alvo e incluir bases adicionais, como uma sequência promotora (que é referida como um "primer promotor"). Aqueles qualificados na técnica apreciarão que qualquer oligômero que possa funcionar como um primer pode ser modificado para incluir uma sequência promotora de 5', e assim funcionar como um primer promotor. Da mesma forma, qualquer primer promotor pode servir como um primer, independentemente de sua sequência promotora funcional. As faixas de tamanho para os primers incluem aquelas que têm cerca de 10 a 50 nt de comprimento e contêm pelo menos cerca de 10 bases contíguas, ou mesmo pelo menos 12 bases contíguas que são complementares a uma região da sequência de ácido nucleico alvo (ou uma cadeia complementar do mesmo). As bases contíguas são pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou completamente complementares à sequência alvo à qual o oligômero de amplificação se liga. Um oligômero de amplificação pode incluir opcionalmente nucleotídeos modificados ou análogos, ou nucleotídeos adicionais que participam de uma reação de amplificação, mas não são complementares ou contidos no ácido nucleico alvo, ou sequência modelo. Entende-se que, ao se referir a faixas para o comprimento de um oligonucleotídeo, amplicon ou outro ácido nucleico, a faixa inclui todos os números inteiros (por exemplo, 19-25 nucleotídeos contíguos em comprimento incluem 19, 20, 21, 22, 23, 24 e 25). A terminologia "par de amplificação" ou "par de primer" refere-se neste documento a um par de oligonucleotídeos (oligos) da presente invenção, que são selecionados para serem usados juntos na amplificação de uma sequência de ácido nucleico selecionada por um dos vários tipos de processos de amplificação.

[0080] Em uma modalidade, a reação de amplificação é uma reação de amplificação de ácido nucleico dependente de primer. A reação de amplificação pode proceder por uma duração (por exemplo, número de ciclos)

e em condições que geram uma quantidade suficiente de produto de amplificação. Mais convenientemente, a reação em cadeia da polimerase (PCR) será usada, embora a pessoa qualificada esteja ciente de outras técnicas.

[0081] Muitas variações de PCR foram desenvolvidas, por exemplo, PCR em Tempo Real (também conhecido como PCR quantitativo, qPCR), PCR de início quente, PCR competitivo, e assim por diante, e todos eles podem ser empregados quando apropriados para as necessidades da pessoa qualificada.

[0082] Em uma modalidade básica usando uma amplificação baseada em PCR, os primers de oligonucleotídeos são colocados em contato com uma mistura de reação contendo a sequência alvo e nucleotídeos livres em um tampão adequado. O ciclagem térmica da mistura resultante na presença de uma DNA polimerase resulta na amplificação da sequência entre os primers.

[0083] O desempenho ideal do processo de PCR é influenciado pela escolha da temperatura, tempo na temperatura e tempo entre as temperaturas para cada etapa do ciclo. Um perfil típico de ciclo para amplificação por PCR é (a) cerca de 5 minutos de fusão do DNA (desnaturação) a cerca de 95°C; (b) cerca de 30 segundos de fusão do DNA (desnaturação) a cerca de 95°C; (c) cerca de 30 segundos de anelamento do primer a cerca de 50-65°C; (d) cerca de 30 segundos de extensão do primer a cerca de 68°C-72°C, preferencialmente 72°C; e as etapas (b)-(d) são repetidas quantas vezes forem necessárias para obter o nível desejado de amplificação. Uma etapa final de extensão do primer também pode ser realizada. A etapa final de extensão do primer pode ser realizada em cerca de 68°C-72°C, preferencialmente 72°C. Em certas modalidades, a etapa de anelamento é realizada a 50-60°C, por exemplo, 50-58°C, 52-58°C, 54-58°C, 53-57°C, ou 53-55°C. Em outras modalidades, a etapa de anelamento é realizada a cerca de 55°C (por exemplo, 55°C±4°C, 55°C±3°C, 55°C±2°C 55°C±1 °C ou 55°C±0,5°C). Em outras modalidades, a etapa de anelamento é realizada a 40-60°C, por exemplo, 45-55°C, 46-54°C, 47-

53°C, 48-52°C, ou 49-51 °C. Em outras modalidades, a etapa de anelamento é realizada a cerca de 50°C (por exemplo, 50°C ± 4°C, 50°C ± 3°C, 50°C ± 2°C 50°C ± 1 °C ou 50°C ± 0,5°C). A etapa de anelamento de outras reações de amplificação também pode ser realizada em qualquer uma dessas temperaturas.

[0084] Em modalidades, os primers podem ser usados, cada um independentemente, em uma concentração de cerca de 0,05µM - cerca de 0,50µM - em uma outra modalidade cerca de 0,05µM - cerca de 0,40µM, em uma outra modalidade 0,05µM - cerca de 0,30µM, em uma outra modalidade 0,05µM - cerca de 0,20µM, em uma outra modalidade 0,05µM – cerca de 0,15µM, em outras modalidades cerca de 0,05µM, 0,075µM, 0,10µM, 0,125µM, 0,15µM, 0,175µM, ou cerca de 0,20µM.

[0085] O método de detecção da presente invenção pode ser realizado com qualquer uma das misturas padrão Master e enzimas disponíveis. Por exemplo, pode ser usado o mix PCR comercialmente disponível, como o QUANTITEC® PCR Master Mix (QIAGEN®) ou o MAXIMA® qPCR master mix (Thermo-Scientific®). Além disso, qualquer instrumento/sistema convencional de PCR (qPCR) pode ser usado, como, por exemplo, o sistema ® LightCycler® (Roche), SLAN® Sistemas de Detecção de PCR em Tempo Real (Daan Diagnostics® Ltd.), Bio-Rad® Sistemas de PCR em tempo real e afins.

[0086] Foram desenvolvidas modificações do método básico de PCR, como qPCR (PCR em Tempo Real), que podem fornecer informações quantitativas sobre o modelo que está sendo amplificado. Numerosas abordagens foram tomadas, embora as duas técnicas mais comuns usem corantes fluorescentes de ligação de DNA de dupla fita ou sondas repórter fluorescentes seletivas.

[0087] Os corantes fluorescentes de ligação de DNA de dupla fita, por exemplo, SYBR Green, se associam ao produto de amplificação à medida que ele é produzido, e quando associados o corante apresenta fluorescência. Assim, medindo a fluorescência após cada ciclo de PCR, a quantidade relativa de produto de amplificação pode ser monitorada em tempo real. Através do uso de padrões e controles internos, essas informações podem ser traduzidas em dados quantitativos sobre a quantidade de modelo no início da reação.

[0088] As sondas repórter fluorescentes usadas no qPCR são oligonucleotídeos específicos de sequência, normalmente RNA ou DNA, que têm uma molécula repórter fluorescente em uma extremidade e uma molécula quencher na outra (por exemplo, a molécula repórter está na extremidade d’ e uma molécula quencher na estremidade 3' ou vice-versa). A sonda é projetada para que o repórter seja extinta pela quencher. A sonda também é projetada para hibridizar seletivamente para regiões específicas de sequência complementar que podem estar no modelo. Se essas regiões estiverem entre os primers PCR de anelados, a polimerase, se houver atividade exonuclease, irá degradar (despolimerizar) a sonda ligada à medida que estende a cadeia de ácido nucleico nascente que está polimerizando. Isso irá se beneficiar da extinçãoe a fluorescência aumentará. Assim, medindo a fluorescência após cada ciclo de PCR, a quantidade relativa de produto de amplificação pode ser monitorada em tempo real. Através do uso de padrão controles internos, essas informações podem ser traduzidas em dados quantitativos.

[0089] O produto de amplificação pode ser detectado e as quantidades de produto de amplificação podem ser determinadas por qualquer meio conveniente. Um grande número de técnicas é rotineiramente empregado como técnicas laboratoriais padrão e a literatura tem descrições de abordagens mais especializadas. No sua forma mais simples, o produto de amplificação pode ser detectado pela inspeção visual da mistura de reação no final da reação ou em um ponto de tempo desejado. Normalmente, o produto de amplificação será resolvido com o auxílio de um marcador que pode ser preferencialmente vinculado ao produto de amplificação. Normalmente, é usada uma substância corante, por exemplo, um corante colorimétrico, cromomérico fluorescente ou luminescente (por exemplo, brometo de etídio ou SYBR Green).

Em outras modalidades é utilizada uma sonda de oligonucleotideo marcada que se liga preferencialmente ao produto de amplificação.

[0090] Em uma modalidade, a reação de amplificação é uma reação de amplificação multiplex (por exemplo, PCR multiplex). "PCR Multiplex" significa que um PCR realiza várias sequências alvo (ou uma única sequência alvo e uma ou mais sequências de referência) simultaneamente na mesma mistura de reação. Normalmente, conjuntos distintos de primers são empregados para cada sequência sendo amplificada. Normalmente, o número de sequências de alvo em um PCR multiplex está na faixa de 2 a 10, ou de 2 a 8, ou mais tipicamente, de 3 a 6.

[0091] Uma "sonda" destina-se a incluir um oligômero ácido nucleico que hibridiza especificamente uma sequência alvo em um ácido nucleico ou seu complemento, sob condições que promovem a hibridização, permitindo assim a detecção da sequência alvo ou seu ácido nucleico amplificado. A detecção pode ser direta (ou seja, resultante de uma sonda que hibridiza diretamente com o alvo ou a sequência amplificada) ou indireta (ou seja, resultante de uma sonda que hibridiza com uma estrutura molecular intermediária que liga a sonda ao alvo ou a sequência amplificada). O "alvo" de uma sonda geralmente se refere a uma sequência dentro de uma sequência de ácido nucleico amplificado (ou seja, um subconjunto da sequência amplificada) que hibridiza especificamente para pelo menos uma parte da sequência da sonda por uma ligação de hidrogênio padrão ou "pareamento de base". As equências que "suficientemente complementares" permitem a hibridização estável de uma sequência de sonda com uma sequência alvo, mesmo que as duas sequências não sejam completamente complementares. Uma sonda pode ser marcada ou não marcada. Uma sonda pode ser produzida por clonagem molecular de uma sequência de DNA específica ou também pode ser sintetizada. Em uma modalidade, a sonda definida neste documento é uma sonda de hidrólise (por exemplo, sonda TaqMan®) e compreende um fluoróforo e um arrefecedor ligado a ela.

[0092] Em um aspecto, a invenção atual diz respeito a avaliar se um patógeno vegetal é virulento ou avirulento. Em uma modalidade, o patógeno é um oomiceto. Em outra modalidade, o patógeno é de Phytophthora spp. (principalmente patógenos de dicotiledôneas; produz mofo), por exemplo, Phytophthora sojae (podridão do caule e da raiz da soja), Phytophthora infestans (requeima da batata; destruição de plantações de solanáceas como tomate e batata). Em uma modalidade, o patógeno é Phytophthora sojae (podridão do caule e da raiz da soja). Em modalidades, as plantas de interesse incluem vegetais, plantas de sementes de oleaginosas e plantas leguminosas. Em uma modalidade, a planta de interesse é a soja (Glycine max).

[0093] A determinação do patógeno vegetal, por exemplo, um patógeno Phytophthora, ser virulento ou avirulento é realizado com base na determinação do patótipo do patógeno, por exemplo, a presença ou ausência de uma ou mais variações, por exemplo, um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs descritos neste documento, em um ou mais genes Avr ou uma região flanqueadora dos mesmos, que em modalidades podem ser determinadas identificação direta da presença ou ausência de um ou mais SNPs ou indels ou identificando indiretamente a presença ou ausência de um ou mais SNPs ou indels em virtude da avaliação de outra região ou loci que está em desequilíbrio de ligação com um ou mais SNPs ou indels. Em modalidades, os genes Avr são um ou mais de Avr1a, Avr1b, Avr1c, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6. Em outra modalidade, os genes Avr são um ou mais de Avr1a, Avr1b, Avr1c, Avr1d, Avr1k e Avr6. Em uma modalidade, um ou mais genes Avr não são Avr3a.

[0094] Em modalidades, as variações são um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs estabelecidos nas Figuras 1 (Avr1a), 3 (Avr1b), 5 (Avr1c), 7 (Avr1d), 9 (Avr1k), 11 (Avr3a), 13 (Avr6) e/ou 16-23, Tabela 4 e/ou Tabela 5, e uma ou mais posições discriminantes estabelecidas na Tabela 2. Em modalidades, qualquer SNP ou indel pode ser usado para avaliar virulência ou avirulência. Em modalidades,

qualquer combinação de 2 ou mais, SNP(s) e/ou indel(s) (SNP(s), indel(s) ou combinação(ões) deles, por exemplo, 2 ou mais SNPs, 2 ou mais indels, 1 SNP + 1 indel, 1 SNP + 2 ou mais indels, 2 ou mais SNPs + 1 indel, 2 ou mais SNPs + 2 ou mais indels) podem ser usados para avaliar virulência ou avirulência. Em outras modalidades, qualquer combinação de 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, ou 10 ou mais SNP(s) e/ou indel(s) pode ser usada para avaliar virulência ou avirulência.

[0095] A presença de um patógeno virulento, por exemplo, um patógeno Phytophthora, é indicativo de um alto risco de infecção da planta de interesse. Nesse caso, em outro aspecto, a presente invenção também se relaciona com métodos de controle da infecção por patógenos.

[0096] Em uma modalidade tais métodos incluem o tratamento da planta ou da área agrícola (por exemplo, para o solo, plantas ou ar dos mesmos) com um agente antipatagênico. Em uma modalidade, o agente antipatogênico é um fungicida, que combate infecções e doenças causadas por fungos ou organismos semelhantes a fungos (por exemplo, oomiceto), inibindo especificamente ou matando o fungo ou organismo semelhante ao fungo que causa a doença. Os fungicidas são aplicados na maioria das vezes na forma líquida, mas também como pó, grânulos e gás. No campo, eles são, por exemplo, aplicados ao (1) solo, seja no sulco no plantio, após o plantio como uma rega do solo (por exemplo, irrigação por gotejamento), ou como um spray direcionado ao redor da base da planta; (2) folhagens e outras partes acima do solo das plantas via pulverização; (3) em forma gasosa no ar em áreas fechadas, como estufas e solo coberto. Após a colheita, eles podem ser aplicados a produtos colhidos, por exemplo, por imersão ou pulverização. Em modalidades, o fungicida é um fungicida de fosfonato, que é eficaz, por exemplo, contra oomicetos. Inúmeros fungicidas para vários patógenos e doenças associadas à plantas são bem conhecidos na técnica.

[0097] Em outra modalidade, os métodos de controle da infecção por patógenos incluem a seleção de uma planta resistente ao patógeno de uma planta em particular. Por exemplo, o desenvolvimento de podridão no caule e na raiz causada por P. sojae é determinada pela relação gene-para-gene entre genes de resistência (Rps) na soja e seus genes de avirulência (Avr) do patógeno correspondente. Assim, no caso da identificação de um patógeno virulento, por exemplo, um patógeno Phytophthora, ou um alto ou alto risco de infecção de tal patógeno, uma cultivar (por exemplo, uma cultivar de soja) pode ser selecionada para o plantio que compreende um ou mais genes de resistência (Rps) que conferem resistência ao um ou mais genes Avr identificados no patógeno, conferindo assim resistência a ele.

[0098] Em modalidades, tais avaliações de risco de patógenos de plantas podem ser utilizadas para o desenvolvimento e fornecimento de cultivares e sementes resistentes para o plantio.

[0099] A presente invenção fornece ainda uma coleção, kit ou pacote compreendendo um ou mais reagentes para a avaliação da virulência do patógeno, por exemplo, um ou mais oligonucleotídeos (por exemplo, primers, sondas) para tal uso. Em uma modalidade, o kit ou pacote compreende ainda reagentes adicionais para avaliação da virulência do patógeno (por exemplo, tampões, soluções, reagentes de PCR, como polimerase). Em outra modalidade, o kit ou pacote inclui ainda instruções para uso, como para avaliação da virulência do patógeno. Em modalidades, vários reagentes, por exemplo, oligonucleotídeos, podem ser fixados ou ligados a um suporte sólido.

[00100] Também é fornecido um nucleotídeo isolado compreendendo um ou mais SNPs ou indels descritos neste documento, em uma forma que não ocorre naturalmente. MODO(S) PARA A REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO

[00101] A presente invenção é ilustrada em mais detalhes pelos seguintes exemplos não limitativos. Exemplo 1: Métodos Material vegetal e isolados Phytophthora sojae

[00102] Todos os isolados de P. sojae utilizados neste estudo (incluindo 31 isolados de Phytophthora sojae, representando 12 perfis de patótipos diferentes (raças), mostrados por exemplo na Tabela 1) foram amostrados em Ontário (Canadá). Cada isolado foi caracterizado por seu perfil de patótipo/virulência utilizando a técnica de inoculação de feridas no hipocótilo (Xue et al. 2015) onde foram utilizadas oito linhas diferenciais de soja, cada uma contendo um único gene Rps de resistência (Rps1a, Rps1b, Rps1c, Rps1d, Rps1k, Rps3a, Rps6 e Rps7) e 'Williams' (rps) como uma verificação suscetível universal.

[00103] Tabela 1: Raças e patótipos associados de isolados Phytophthora sojae caracterizados neste estudo, conforme determinado pela inoculação de ferida no hipocótilo (Xue et al. 2015).

[00104] Os isolados foram subcultivados primeiro em meio de ágar V8 (V8 20% clarificado) coberto com papel de cera para facilitar a colheita de hifas e esporos. Após uma semana, as culturas foram raspadas do papel com um bisturi e colocadas em tubos de 1,5 ml com tampas de parafuso (OMNI International inc., Kennesaw, Gerorgia, Estados Unidos). Os tubos foram então mantidos no congelador a -80°C por 2-3 horas, e liofilizados durante a noite. As amostras liofilizadas foram esmagadas com um Omni Bead Ruptor 24 (OMNI International). Em seguida, o DNA foi extraído das amostras esmagadas usando o E.Z.N.A Plant DNA kit (Norcross, Geórgia, Estados Unidos) seguindo o protocolo do fabricante para amostras secas com pequenas modificações. Extração e sequenciamento de DNA

[00105] O DNA foi extraído para cada um dos 31 isolados usando o E.N.Z.A Plant DNA Kit. (Omega Bio-Tek Inc., Norcross, Geórgia, EUA). A quantidade e a qualidade do DNA foram avaliadas utilizando um espectofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop technologies). Cada amostra foi normalizada para 10 ng/µL para a construção da biblioteca de sequenciamento usando o NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit para lllumina (New England BioLabs Inc, Ipswich, Massachusets, EUA). A qualidade da biblioteca foi determinada utilizando o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Observou-se um tamanho médio de fragmento de aproximadamente 650 bp entre todas as 31 amostras individuais. O sequenciamento de 250 bp emparelhado foi realizado em um lllumina HiSeq 2500 (CHU, Quebec, Canadá). Alinhamento de leituras com o genoma de referência

[00106] A qualidade das leituras obtidas do sequenciamento foi verificada usando o FastQC (Babraham Institute, Cambridge, Reino Unido). As leituras foram processadas usando Trimmomatic (Bolger et al. 2014) para remover adaptadores de sequência ebases com uma pontuação Phred abaixo de 20 (usando a pontuação de qualidade Phred +33). As leituras cortadas foram alinhadas contra o genoma de referência V3.0 de Phytophthora sojae (Tyler et al. 2006) usando o pacote de software Burrows- Wheeler Transform Alignment (BWA) vO.7.13 (Li e Durbin 2009). Polimorfismos de presença/ausência e variação de número de cópias

[00107] Para detectar a perda de genes de avirulência em alguns isolados do genoma de referência (polimorfismos de presença/ausência), calculamos a amplitude da cobertura para cada gene, correspondente à porcentagem de nucleotídeos com pelo menos uma leitura mapeada (cobertura 1x), conforme Raffaele et al. (2010). Se o valor da amplitude da cobertura foi inferior a 80%, o gene foi considerado ausente. Para detecção da variação do número de cópia (CNV), foi comparada a profundidade média de cobertura para cada locus em cada isolado e foi normalizada as contagens utilizando a cobertura média da região gênica em cada isolado. Detecção de variantes

[00108] A chamada variante foi feita usando o Genome Analysis Toolkit (GATK) (DePristo et al. 2011), um pipeline de chamada variante baseado nas melhores práticas do GATK. O arquivo vcf bruto resultante foi filtrado de qualidade usando o pacote vcfR (Knaus e Gmnwald 2017). Para a visualização do haplótipo, uma inspeção visual simples foi suficiente na maioria dos casos, mas um script personalizado desenvolvido na Universite Laval foi usado em outros casos, baseado em um processo de halotipagem centrado no gene que visa selecionar apenas marcadores nas proximidades de um gene que se encontra em forte desequilíbrio de ligação (LD) (Tardivel et al. 2014). Triagem de virulência usando o ensaio hidropônico

[00109] Sempre que um isolado tinha um fenótipo previsto pelo ensaio de hipocótilo (Xue et al. 2015) discordante dos outros isolados dentro de um determinado haplótipo, este isolado era refenotipado usando o ensaio hidropônico desenvolvido por Lebreton et al. (2018), no qual os zoósporos são inoculados diretamente na solução nutritiva hidropônica. Para isso, o isolado foi testado contra a linha diferencial adequada com três a seis plantas para cada repetição, juntamente com uma cultivar controle suscetível não carregando o gene Rps apropriado, uma cultivar controle resistente e um número de isolados controle. Respostas fenotípicas para resistência ou suscetibilidade foram registradas em 14 dias após a inoculação. Análise de expressão

[00110] O RNA total foi extraído de raízes de soja infectadas com P. sojae com sete dias de idade usando o reagente Trizol seguido de purificação usando o Qiagen RNeasy Mini Kit (Valência, Califórnia, EUA). As amostras de RNA foram tratadas com enzima DNase I para remover qualquer

DNA contaminante. Um total de 3 µg de RNA de cada amostra foram usados para sintetizar o cDNA de fita simples usando transcrição reversa de oligo-dT e transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen™, Carlsbad, Califórnia, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. Os primers para a análise quantitativa de PCR de transcrição reversa (qPCR) foram projetados usando a ferramenta PrimerQuest e a opção de modelo de corantes intercalantes (Coralville, Iowa, EUA). Foram utilizadas quatro replicações biológicas para a análise de expressão. A análise de expressão foi realizada para genes Avr em isolados avirulentos e virulentos usando o iQ™ SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, Hércules, Califórnia, EUA) e uma máquina termocicladora MIC qPCR (Bio Molecular Systems, Upper Coomera, Queensland, Austrália). O perfil de PCR consistiu em uma ativação inicial de 95°C por 3 min, seguido por 40 ciclos de 95°C por 15 s e 60°C por 45 segundos. Após o ciclagem, foi realizada a análise da curva de dissociação (com uma deserção inicial de 95°C por 10 segundos seguido de aumento subsequente da temperatura de 55 a 95°C a 0,5 °C/s) para confirmar a ausência de amplificação não específica. A actina foi usada como uma transcrição de referência expressa constitutivamente. A análise relativa de quantificação foi realizada utilizando-se o software MIC-qPCR que utiliza o método LinRegPCR desenvolvido por Ruijter et al. (2009) e a Ferramenta de Software de Expressão Relativa (REST) para significância estatística (Pfaffl et al. 2002). Confirmação da variação do haplótipo usando sequenciamento Sanger

[00111] Os isolados foram recentemente cultivados em meio de ágar V8 por sete dias sob condições controladas, seguidos pela extração de DNA. Regiões que abrangem os genes Avr foram amplificadas usando conjuntos específicos de primers. O perfil de PCR foi desnaturação inicial de 98°C por 30 segundos seguido por 35 ciclos de desnaturação a 98°C por 10 segundos, anelamento a 60°C por 30 segundos e extensão a 72°C por 2 min, e a extensão final a 72°C por 10 min. Os produtos de PCR foram purificados usando o QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, Califórnia, EUA) seguido de sequenciamento em um sequenciador Applied Biosystems (ABI 3730x1 DNA Analyze) localizado no CHU, Quebec, Canadá. Os resultados de sequenciamento foram analisados usando o programa SeqMan implementado no software DNASTAR Lasergene (Madison, Wisconsin, EUA). Variações de sequência e modelo de primer específico para alelo

[00112] Para a concepção de primers específicos de alelo, as variações discriminatórias nas sequências dos diferentes genes Avr de 31 isolados foram estudadas e identificadas com base nas sequências genômicas disponíveis no repositório NCBI SRA, sob o bioprojeto PRJNA434589, conforme relatado por Arsenault-Labrecque et al. (2018). Em todos os casos, procuramos obter amplicons apenas a partir dos alelos avirulentos e de diferentes tamanhos, de modo que os primers poderiam ser usados em um ensaio multiplex e o amplicons facilmente resolvidos via eletroforese em gel. As variações discriminantes mais convenientes para o desenvolvimento de marcadores foram selecionadas para projetar os pares de primer para os sete genes Avr em estudo (Avr1a,1b, 1c, 1d, 1k, 3a e 6). Nos casos em que as deleções estavam presentes, pelo menos um primer estava posicionado na exclusão de tal forma que o alelo avirulento (ou seja, sem a exclusão) pudesse ser amplificado. Se apenas os SNPs diferenciassem os alelos virulentos e avirulentos, os primers foram projetados de tal forma que essas posições variantes estivessem localizadas na extremidade 3' para maximizar a especificidade da amplificação. Regiões com dois ou mais SNPs foram preferencialmente selecionadas para aumentar a especificidade do alelo. Os primers foram então sintetizados pela Thermo-Fisher Scientific (Waltham, Mass., EUA). Os detalhes dos nove pares de primers são apresentados na Tabela 1. Projeto primer para PCR multiplex

[00113] Os primers foram projetados com base nos diferentes haplótipos dos sete genes de avirulência (Avr1a, Avr1b, Avr1c, Avr1d,

Avr1k, Avr3a e Avr6) de P. sojae, interagindo com os sete genes de resistência, respectivamente Rps1a, Rps1b, Rps1c, Rps1d, Rps1k, Rps3a e Rps6, de soja. Se um indel estava presente na sequência do gene da avirulência, os primers foram projetados neste indel para discriminar os isolados avirulentos dos virulentos. Se nenhum indel estivesse presente, pelo menos dois SNPs vizinhos foram usados para projetar os primers para aumentar a especificidade dos primers. O DNA dos 31 isolados de Phytophthora sojae foi extraído e usado para testar os primers projetados.

[00114] Cada primer foi testado primeiro em uma reação de PCR individual para validar sua especificidade. A reação de PCR foi realizada com um volume de reação de 20 µI e cada primer foi diluído na uma concentração de 0,25 µM. O One Taq NEB (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EUA) foi usado como enzima a 0,025U/µI com 2µI de DNA extraído de P. sojae a uma concentração de 10 ng/µI, 5X One Taq Standard Reaction Buffer (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EUA), 0,2 mM de dNTPs e 2,5% de DMSO. Para cada gene de isolados de avirulência de P. sojae avirulentos e virulentos aos genes Rps correspondentes (ver Tabela 1) foram escolhidos para caracterizar a especificidade de cada primer. As condições de reação de PCR foram as seguintes: uma desnaturação inicial de 94°C por 5 minutos, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 60°C por 30 segundos, alongamento a 68°C por 1 minuto e alongamento final a 68°C por 5 minutos. A migração das amostras de PCR foi realizada em gel de agarose a 1,5% com tampão TAE 1X, contendo 2,5 µI/ml de coloração em gel de DNA seguro para SYBR (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA). Uma escala de 1-1000 kb foi usada. A análise de fragmentos de DNA também foi realizada utilizando um Sistema Avançado QIAxcel em um cartucho de DNA de alta resolução, baseado no método OH500 com marcadores de alinhamento de 15 e 3000 bp de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen, Hilden, Alemanha). Foi realizada um PCR em cada um dos 31 isolados de P. sojae com um patótipo conhecido para validar que a presença do amplicon esperado estava associada a uma resposta avirulenta. Otimização de PCR multiplex

[00115] Uma vez validada a especificidade de cada primer, todos os primers foram testados juntos em um PCR multiplex, para verificar a compatibilidade de todos os primers em uma única reação de PCR. Diferentes parâmetros foram testados para otimizar a reação. Em primeiro lugar, a concentração de cada primer foi ajustada de acordo com a intensidade dos grupos para obter faixas claras para todos os genes de avirulência detectados. O número de ciclos para a reação aumentou de 30 para 40 ciclos para obter faixas mais distintas. Além disso, um gradiente de temperatura foi testado para determinar que a temperatura ideal era de 55°C. A concentração de dNTPs foi aumentada para 2,5 mM. As concentrações dos outros produtos de PCR permaneceram as mesmas. Os produtos finais de PCR foram analisados pelo QIAxcel Advanced System (Qiagen, Hilden, Alemanha).

[00116] Após a otimização da concentração do primer, a temperatura de anelamento e concentração de dNTP, os primers foram misturados em uma única reação de PCR para verificar sua compatibilidade em um PCR multiplex. Verificou-se que os primers que amplificam o gene Avr1c não eram compatíveis com os outros primers, uma vez que, quando colocados juntos, os dímeros de primer foram formados. As tentativas de projetar conjuntos alternativos de primers não foram bem sucedidas, por isso foi decidido que os primers para Avr1c seriam usados em um ensaio separado em paralelo com o ensaio multiplex. O PCR multiplex, portanto, contém os seguintes oito conjuntos de primer: Avr1a-indel, Avr1a-snp1, Avr1a-snp2, Avr1b, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6.

[00117] O número ideal de ciclos para a reação foi de 40 ciclos. Além disso, um gradiente de temperatura revelou que a temperatura que permitia a obtenção das faixas mais escuras e distintas foi de 55°C para a reação de PCR multiplex e 60°C para o PCR uniplex. A concentração dNTP escolhida foi de 0,25 mM. Os produtos finais de PCR foram analisados com o QIAxcel

Advanced System (Qiagen, Hilden, Alemanha).

[00118] As reações do PCR foram realizadas em um volume de reação de 20 µI. Cada primer foi diluído na concentração ideal detalhada na Tabela 1. The One Taq NEB (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, Etats-Unis) foi usado a 0,025 U/µI com 2 µI de DNA em uma concentração de 10 ng/µI, 5X One Taq Standard tampão de reação (New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, EUA), 0,25 mM de dNTPs e 2,5% de DMSO (Sigma, Saint-Louis, Missouri, Estados Unidos). As condições de PCR multiplex consistiam em uma desnaturação inicial de 94°C por 5 min, seguida por 40 ciclos de desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 30 segundos, alongamento de 68°C por 1 min, e um alongamento final de 68°C por 5 min. Para a reação de PCR uniplex (Avr1c), as condições consistiam em uma desnaturação inicial de 94°C por 5 min, seguida por 30 ciclos de desnaturação a 94°C para 30 s, anelamento a 60°C por 30 segundos, alongamento de 68°C por 1 min, e um alongamento final de 68°C para 5 min. Limites de detecção do PCR multiplex

[00119] Para determinar a menor concentração de DNA em que o PCR multiplex e uniplex funcionavam, diluições de 0,01 pg a 20 ng foram testadas com as duas condições do PCR descritas acima. Foi determinado que o PCR multiplex poderia detectar uma concentração de DNA de até 0,2 ng, enquanto os primers testados individualmente poderiam detectar uma concentração de DNA de 0,2 pg. Especificidade da ferramenta molecular e fenotipagem

[00120] Uma vez otimizadas as condições de PCR multiplex, os 31 isolados com haplótipos conhecidos, previamente sequenciados por Arsenault-Labrecque et al. (2018), foram analisados para testar a eficiência da ferramenta molecular. Posteriormente, 15 isolados não característicos foram ambos analizados com o PCR multiplex e os fenotipados utilizando o ensaio hidropônico desenvolvido por Lebreton et al. (2018). Para o ensaio, os zoósporos foram inoculados em um sistema hidropônico contendo uma solução de nutritiva diluída em água. Sete linhagens diferenciais de soja foram cultivadas no sistema hidropônico com controle suscetível (cultivar Harosoy), e o perfil de virulência do isolado testado foi determinado com base nos quais os genes Rps resultaram em imunidade. As respostas fenotípicas (resistência ou suscetibilidade) foram registradas 14 dias após a inoculação. Os resultados de fenotipagem foram então comparados com os resultados obtidos com o ensaio PCR multiplex. Validação PCR multiplex

[00121] Uma vez otimizadas as condições de PCR, os 31 isolados com haplótipos conhecidos (Tabela 1) foram analisados para testar a eficácia da ferramenta molecular. Posteriormente, foram analisados isolados com haplótipos desconhecidos e os resultados foram comparados com os resultados de fenotipagem realizados com o ensaio hidropônico (Lebreton et al., 2018). EXEMPLO 2: RESULTADOS Sequenciamento e mapeamento

[00122] Um total de 852.950.094 leituras foram obtidas a partir do sequenciamento pareado de 31 isolados de P. sojae no sequenciador Illumina HiSeq 2500. O número de leituras de sequência bruta classificada por isolado variou de 15 a 52 M leituras com uma média de 27 M leituras por isolado, com uma pontuação média Phred de 32,4. As leituras foram processadas usando Trimmomatic e as leituras processadas foram mapeadas para o genoma de referência. Para cada isolado, mais de 96% das leituras foram mapeadas com precisão para o genoma de referência e a profundidade média da cobertura foi de 68x. Cobertura, distribuição e impacto funcional previsto de SNPs

[00123] O pipeline HaplotypeCaller da GATK manteve

260.871 variantes entre os 31 isolados. A filtragem rigorosa das variantes baseadas na profundidade de sequência e na qualidade de mapeamento usando vcfR reteve um total de 204.944 variantes de alta qualidade. A análise de variantes com a ferramenta SnpEff (Cingolani et al. 2012) identificou 172.143 polimorfismos de nucleotídeos único (SNPs), 14.627 inserções e 18.174 pequenos indels no número total de variantes. As variantes nas regiões de codificação foram categorizadas como substituições sinônimas e não sinônimas; 61,1% dos SNPs resultaram em um códon que codifica um aminoácido diferente (mutação missense; 59,5%) ou a introdução de um códon de terminação (mutação nonsense: 1,6%), enquanto os 38,9% restantes dos SNPs foram considerados mutações sinônimas. As ligações entre os sete genes Avr foram então investigadas com base na análise do haplótipo. Haplotipos para Avr1a

[00124] Para todos os 31 isolados, a CNV foi analisada com base na profundidade de cobertura e, para Avr1a, variou entre zero e três exemplares (Figura 1b). Entre os isolados com cópia zero, todos eram virulentos em Rps1a. Para os demais isolados, não foram observados SNPs ou indels dentro da região de codificação de Avr1a (Figura 1a). Entretanto, foi observado SNPs flanqueando Avr1a que estavam em LD alto (R2≥0,7) e foi definido quatro haplótipos distintos (Figura 1b). Variantes adicionais também foram encontradas, mas não ofereceram maior nível de discriminação. Todos os isolados que compartilhavam três destes (B, C e D) eram virulentos em Rps1a, enquanto entre os isolados com haplótipo A, todos exceto o isolado 3A, eram incompatíveis com base no ensaio de hipocótilo. Após refenotipar este isolado com o bioensaio hidropônico, ele foi caracterizado como incapaz de infectar o diferencial que carregava o Rps1a confirmando que o haplótipo A era o único associado a uma interação incompatível com Rps1a (Figura 1c).

[00125] Com base nesses haplótipos, três primers discriminantes foram projetados para obter uma amplificação quando os isolados são avirulentos para Rps1a. O primeiro par de primers está localizado dentro do gene Avr1a (PHYSOscaffold_7:2042431-2042664), permitindo primeiro identificar isolados virulentos mostrando uma exclusão completa do gene (haplótipo E). As sequências de primer são apresentadas na Tabela 2. O tamanho do produto obtido é de 234 bp como mostrado na Figura 2.

[00126] Tabela 2: Sequências de primer para cada gene de avirulência e seu tamanho do produto após a amplificação

[00127] Para discriminar os isolados virulentos de avirulentos com os haplótipos restantes (A vs B, C e D), dois outros pares de primers foram projetados. Estes primers foram baseados nos SNPs 2046815 e 2067663, permitindo obter uma amplificação quando o haplótipo A está presente, identificando apenas os isolados avirulentos. Esses dois SNPs foram escolhidos por causa do LD com SNPs 2046815 e 2067663 e a presença de SNPs vizinhos, permitindo uma maior especificidade. Estes primers estão localizados nas proximidades do gene Avr1a (PHYSOscaffold_7: 2263667-2263879 e

PHYSOscaffold_7: 1799519-1799796). O tamanho do produto obtido é de 213 bp para o primeiro par de primers e 278 bp para o segundo, como mostrado na Figura 2. A sequência de cada primer é mostrada na Tabela 2. Haplotipos para Avr1b

[00128] Não foram observados CNVs ou exclusões para Avr1b (Figura 3a). Dentro da região de codificação do gene, foram observadas 17 variantes: 14 variantes missense (SNPs), dois pequenos indels de três nucleotídeos cada e um SNP sinônimo. Nenhuma dessas variantes foi prevista para ter um alto impacto funcional. Com base no LD entre essas variantes, duas variantes de tag foram retidas e definidas três haplótipos (Figura 3b). A maioria dos isolados dos haplótipos A e B eram avirulentos, enquanto todos os isolados com haplótipo C eram virulentos. Entre os haplótipos A e B, quatro isolados com fenótipo discordante foram retestados com o ensaio hidropônico e foram encontrados avirulentos para Rps1b (Figura 3c), confirmando os haplótipos A e B como sendo consistentemente associados a uma interação incompatível com Rps1b (Figura 3b). Para verificar se o genótipo desses quatro isolados não havia mudado ao longo do tempo, reequenciamos a região de Avr1b desses isolados juntamente com isolados representativos de cada grupo de haplótipos e confirmamos as mesmas mutações. Curiosamente, o isolado utilizado para o genoma de referência (P6497) que é relatado como virulento para Rps1b tem um genótipo associado à incompatibilidade em nosso estudo (haplótipo A; Figura 3b).

[00129] Com base nos haplótipos discriminantes entre os isolados avirulentos e virulentos (A e B vs C), um par de primers foi projetado dentro dos dois indels de quatro nucleotídeos para obter uma amplificação quando os isolados são avirulentos (PHYSOscaffold_6:3146464-3146866). Suas sequências são mostradas na Tabela 2 e o tamanho do produto é de 403 pb. O resultado da amplificação é mostrado na Figura 4. Haplotipos para Avr1c

[00130] A variação do número da cópia foi observada para Avr1c; a exclusão completa do gene Avr1c foi observada em três isolados, enquanto outros apresentaram uma ou duas cópias do gene (Figura 5b). Curiosamente, esta exclusão é a mesma relatada anteriormente para o gene Avr1a que imediatamente flanqueia Avr1c (Figura 5b e Figura 1b). Os demais isolados apresentaram um total de 24 variantes dentro da região de codificação do gene; dois eram sinônimos enquanto o resto eram mutações missense, nenhuma das quais era prevista para ter um alto impacto funcional. Após a remoção de marcadores redundantes (com base em LD), um total de quatro variantes de tags definiu quatro haplótipos (A a D; Figura 5b). Os haplótipos C e D foram compartilhados por isolados que apresentavam um fenótipo consistente, avirulento e virulento, respectivamente (Figura 5b). O haplótipo C também foi o único haplótipo a apresentar a maioria dos SNPs heterozigotos. Em contraste, o haplótipo A foi compartilhado por cinco isolados anteriormente fenotipados como avirulentos para Rps1c e quatro fenotipadós como virulentos. Todos os nove isolados foram refenotipados no ensaio hidropônico e os resultados mostraram clara associação com a virulência com a Rps1c (Figura 5c). Para o haplótipo B, a maioria dos isolados foi fenotipada como avirulenta para Rps1c, com exceção de três isolados (5B, 5C e 45B) originalmente marcados como virulentos. Variantes dentro de uma região de 1-kb a montante ou a jusante do gene não poderiam definir novos haplótipos para esses três anexos. Estes três isolados foram refenotipados usando o bioensaio hidropônico e ainda caracterizados como virulentos (Figura 5c). Para investigar melhor a causa dessa discrepância, a região Avr1c para isolados representativos de cada grupo de haplótipos, incluindo anexos iniciais do haplotipo A, foram resequenciadas usando sequenciamento Sanger e confirmaram as mesmas mutações.

[00131] Para discriminar os haplotipos avirulentos B e C dos haplotipos virulentos A e D (Figura 5) para o gene Avr1c, dois SNPs (2046037, 2046038) foram utilizados na extremidade 3' dos primers dianteiros e outros quatro SNPs (2046815, 2046817, 2046819, 2046821) foram utilizados na extremidade 5' do primer reverso. As sequências de primer são mostradas na

Tabela 2 e o tamanho do produto é de 802 bp (PH YSOscaffold_7:2046020- 2046821). A Figura 6 mostra a especificidade desses primers para discriminar avirulento de isolados virulentos. Haplotipos para Avr1d

[00132] Observou-se exclusão completa do gene Avr1d para sete isolados (Figura 7b). A exclusão abrangeu tanto as regiões a montante quanto a jusante do gene para um tamanho total de exclusão de 2,3 kb, com outra exclusão a montante de 0,8 kb, separada por um segmento de 177 bp (Figura 7a). Os demais isolados apresentaram uma cópia do gene e 21 variantes foram observadas dentro da região de codificação: uma era sinônima, enquanto as outras eram variantes missense, nenhuma das quais estava prevista para ter um alto impacto funcional. Com base em LD, uma variante de tag foi mantida e dois haplótipos (A e B) puderam ser definidos. Os dados genômicos coincidiram com os fenótipos originais baseados no ensaio de hipocótilo em 25 das 31 interações. Entretanto, do fenotipagem original de Xue et al. (2015), dois isolados previstos para ser avirulento com base no genótipo foram fenotipados como virulentos e quatro isolados previstos como virulentos foram fenotipados como avirulentos. Quando esses isolados foram fenotipados com o ensaio hidropônico, todos os isolados com um genótipo previsto de virulência foram consistentemente associados à virulência, enquanto o isolado que se esperava ser avirulento com base no haplótipo foi fenoticamente avirulento, confirmando que a exclusão de Avr1d é consistentemente ligada à virulência (Figura 7).

[00133] Para discriminar isolados avirulentos dos virulentos (haplótipos A e B vs C), um par de primers foi projetado no gene Avr1d para obter uma amplificação na presença de isolados avirulentos e nenhuma amplificação quando os isolados são virulentos, devido à exclusão completa do gene para os isolados (PH YSOscaffold_5: 5919385-5919881). As sequências de primer são mostradas na Tabela 2 e a amplificação é apresentada na Figura

8. O tamanho do produto da amplificação é de 497 bp. Haplótipos para Avr1k

[00134] Não foram observados CNVs ou exclusões para Avr1k (Figura 9). Dentro da região gênica, foram encontradas 16 variantes: uma variante sinônimo, 14 variantes missense e uma exclusão de oito nucleotídeos causando uma mudança de quadro na ORF e levando a um códon de terminação na extremidade de 3' do gene. Esta última variante é a única considerada com alto impacto na funcionalidade do gene. As três variantes de tag dentro do gene (baseadas em LD) formaram três haplótipos distintos (Figura 9b). Como observado anteriormente para Avr1b, os dois primeiros haplótipos (A e B) continham todos os isolados avirulentos para Rps1k mais quatro isolados previamente fenotipados como virulentos para Rps1k com o teste de hipocótilo. Curiosamente, os mesmos outliers deram um fenótipo inicial de virulência com Avr1b. Para verificar se o genótipo desses outliers não havia mudado ao longo do tempo, a região genética de Avr1k foi resequenciada para esses isolados e apresentou as mesmas mutações observadas pelo WGS. O haplótipo C continha apenas isolados virulentos a Rps1k. O refenotipagem dos quatro outliers confirmou sua incompatibilidade com Rps1k, como mostrado na Figura 9c. A mutação de mudança de quadro de oito nucleotídeos que levou a um códon de terminação foi encontrada em ambos os haplótipos B e C, embora o primeiro tenha sido associado a um fenótipo avirulento e o segundo com um virulento.

[00135] Baseado no haplótipo A e B avirulento, um par de primers foi projetado usando dois SNPs, baseado no haplótipo de SNP 3142827. Os dois SNPs foram separados por seis nucleotídeos e discriminaram entre os isolados avirulentos e virulentos. A sequência de primer é mostrada na Tabela

2. A posição dos primers está em PFIYSOscaffold_6:3142499-3142801 e permitem discriminar os isolados avirulento (haplótipo A e B) dos virulentos (haplótipo C). Os resultados da amplificação são mostrados na Figura 10 e o tamanho do produto é de 303 bp. As sequências para cada primer são mostradas na Tabela 2. Haplótipos para Avr3a

[00136] Observou-se variação no número de cópias entre isolados, variando de uma a quatro cópias; todos os isolados virulentos a Rps3a continham uma cópia do gene, enquanto todos os isolados avirulentos tinham de duas a quatro cópias (Figura 11b). Além disso, observamos 15 variantes na região de codificação do gene Avr3a, incluindo uma exclusão de interna de seis nucleotídeos e 14 SNPs, das quais duas eram variantes sinônimos, 11 eram variantes missense, e uma causou a perda do códon de terminação. Apenas a última variante é considerada com alto impacto na funcionalidade do gene. Todas essas variantes eram homozigotos sugerindo que para isolados com múltiplas cópias do gene Avr3a, cada cópia compartilha o mesmo alelo. Com base na variante de tag retida, foram observados dois haplótipos distintos. O haplótipo A foi consistentemente associado a uma interação incompatível com rps3a, enquanto o haplótipo B foi associado a um compatível (Figura 11 b).

[00137] Com base nesses resultados, um par de primers foi projetado com base no indel de seis nucleotídeos para discriminar o haplótipo A (avirulento) do haplótipo B (virulento). Desta forma, todos os isolados avirulentos se amplificarão devido à presença dos seis nucleotídeos na sequência da cartilha dianteira. A posição dos primers está em PFIYSOscaffold_9: 615324-615930 e o tamanho do produto é de 607 bp conforme mostrado na Figura 12. As sequências de cada primer são mostradas na Tabela 2. Haplótipos para Avr6

[00138] Não foram observadas CNVs ou exclusões para o gene Avr6 (Figura 13a). Além disso, não foram encontradas variantes na região de codificação de Avr6, mas cinco foram encontradas na região a montante do gene. Destes, quatro eram SNPs, e um era uma exclusão de 15 nucleotídeos, mas nenhum deles foi previsto para ter um alto impacto funcional. Uma inspeção visual dessas variantes revelou dois haplótipos distintos, representados por uma variante de marca na Figura 13b. Todos os isolados incompatíveis com Rps6 com base no teste de hipocótilo foram associados ao haplótipo A, bem como quatro isolados inicialmente fenotipados como virulentos. Estes quatro isolados foram encontrados como avirulentos para Rps6 através do ensaio hidropônico (Figura 13c). Isolados correspondentes ao haplótipo B foram consistentemente associados a uma interação compatível.

[00139] Com a presença de um indel de 15bp no gene Avr6 que é discriminante entre os isolados avirulento (haplótipo A) e virulentos (haplótipo B), foi projetado um par de primers contendo esses 15 nucleotídeos. Dessa forma, a amplificação foi obtida quando os isolados são avirulentos. A amplificação tem um tamanho de produto de 726 bp (Figura 14) e está em PFIYSOscaffold_4: 7223071-7223796. Suas sequências são mostradas na Tabela 2. Marcadores genéticos específicos baseados em PCR para sete genes Avr em Phytophthora sojae

[00140] Para todos os sete genes Avr em estudo, todos os primers foram projetados para amplificar sequências associadas ao alelo avirulento dos genes (Figura 23). Nos casos em que as variantes discriminantes estavam localizadas fora da região de codificação, os primers foram desenvolvidos com base no haplótipo específico ligado ao alelo avirulento. As posições de todas as regiões amplificadas estão mostradas na Tabela 2.

[00141] Para o gene Avr1a, várias variantes distinguiam alelos conferindo virulência ou avirulência em linhas de soja que carregam o gene Rps1a (Figura 23A). Uma dessas variantes foi uma exclusão de 18 bp conferindo virulência a todos os isolados que a carregavam. Para aqueles isolados que não tinham a exclusão, eles foram distinguidos com base em dois SNPs adjacentes, encontrados em duas regiões separadas (Avr1a-snp1 e Avr1a-snp2), associados a uma diferença na virulência.

[00142] No caso da Avr1b, uma combinação de SNPs e indels, localizadas dentro de 15 bp uns dos outros, foi encontrada para discriminar o alelo de avirulência (Figura 23B). Assim, foi projetada uma cartilha naquela região para abranger todas as cinco variantes. O alelo avirulento Avr1c poderia ser discriminado da forma virulenta com base em dois SNPs situados no final de 3' do primer dianteiro, e quatro SNPs posicionados no final de 5' oa primer reverso (Figura 23C). Este projeto permitiu atingir especificamente os haplótipos avirulento contra vários outros haplotipos ligados à virulência.

[00143] No caso dos isolados de P. sojae que transportam Avr1d, eles foram facilmente distinguidos daqueles com patótipo 1d com base em uma exclusão completa do gene (Figura 23D). Os primers foramsimplesmente projetados para amplificar uma região dentro do gene.

[00144] Para Avr1k, dois SNPs foram selecionados dentro de 7 bp um do outro que discriminava o alelo avirulento do virulento para projetar os primers (Figura 23E).

[00145] Baseado em dois haplótipos distintos, o alelo avirulento de Avr3a apresentou uma sequência extra de seis nucleotídeos (Figura 23F). Esta área foi, portanto, selecionada para projetar primers discriminadores.

[00146] Finalmente, uma exclusão de 15 bp a montante de Avr6 foi consistentemente observada em todos os isolados virulentos (Figura 23G). Como foi consistentemente associado a um fenótipo de virulência, foi usado para o design de primer. Amplificação e especificidade do PCR Uniplex

[00147] Os resultados mostraram que a amplificação bem sucedida da versão funcional dos genes Avr correspondeu perfeitamente ao fenótipo esperado para cada um dos sete genes Avr, confirmando assim a especificidade dos primers para a região alvo (Figuras 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14). Para seis dos sete genes, um único conjunto de primers foi suficiente para discriminar os hapóotipos que levaram a uma reação virulenta ou avirulenta. No caso de Avr1a, quatro haplótipos diferentes foram explorados, de modo que três pares diferentes de primers foram projetados e incluídos simultaneamente no ensaio molecular para cobrir o espectro de possíveis haplótipos: Avr1a-indel, Avr1a- snp1 e Avr1a-snp2 (Figura 2). Como tal, a presença combinada dos três amplicons indica avirulência.

Ferramenta de diagnóstico PCR multiplex

[00148] Uma vez que todos os primers foram testados individualmente por sua capacidade de discriminar entre isolados virulentos e avirulentos para cada gene de avirulência, eles foram misturados em uma única reação de PCR para verificar sua compatibilidade em uma ferramenta de diagnóstico do PCR multiplex. Após a otimização das condições de PCR, o ensaio molecular foi realizado em duas corridas paralelas: um ensaio multiplex para detecção de Avr1a, Avr1b, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6, e um ensaio para Avr1c. A presença de uma faixa de tamanho específico como descrito na Tabela 1 indica que o isolado testado carrega o alelo avirulento associado ao amplicon do gene Avr desse tamanho. Por outro lado, a ausência de um amplicon para um determinado gene indica que o isolado carrega o patótipo correspondente. Por exemplo, a figura 15 apresenta resultados do ensaio de PCR multiplex nos 31 isolados conhecidos com seu patótipo correspondente baseado em um ensaio fenotípico. Os resultados mostram que o patótipo, expresso pela ausência de um amplicon para um determinado gene, é precisamente previsto pelo ensaio molecular. Como ilustração, isolar 1A mostra amplicons para Avr1a, 1b, 1k, 3a e 6 (Figura 15A) e nenhum para 1d e 1c (Figura 15C), que se traduz em patótipo 1c e 1d. Genotipagem e fenotipagem de isolados com patótipo desconhecido

[00149] Após a validação do ensaio de PCR multiplex com os 31 isolados conhecidos, 15 isolados não característicos foram selecionados aleatoriamente para confirmar a eficácia do ensaio. Os resultados representativos obtidos após os ensaios moleculares e hidropônicos são apresentados para dois isolados (Figura 24). Como visto na Figura 24A, a presença de amplicons para Avr1b, Avr1d e Avr1k no gel é um indicativo de que o isolado 2012-82 deve ter patótipo 1a, 1c, 3a, 6. Quando comparados com o bioensaio (Figura 24B), os fenótipos obtidos corroboraram claramente o ensaio molecular onde observava-se uma interação compatível entre o isolado e os diferenciais Rps1a,1c, 3a e 6. No outro exemplo com isolado 2012-156 (Figura 24C), o ensaio molecular mostrou amplificação para Avr1a (Avr1a-snp1, Avr1a- indel, Avr1a-snp2), 1b, 1k, 3a e 6, o que leva a um diagnóstico de patótipo 1c, 1d para esse isolado. Curiosamente, o ensaio fenotípico mostrado na Figura 24D confirmou a interação compatível com diferenciais Rps1c e 1d, mas também sugeriu um com Rps3a, apesar do ensaio molecular claramente mostrando um amplicon para Avr3a. De fato, quando os resultados foram combinados para todos os 15 isolados e sete genes Avr (105 interações), houve apenas uma única e semelhante discrepância quando o ensaio molecular e os fenótipos não corresponderam perfeitamente (Tabela 3). De fato, em quatro casos, observou- se interação compatível com Rps3a no ensaio hidropônico, apesar da presença de um amplicon para o alelo avirulento de Avr3a. Todas as outras interações geraram uma combinação perfeita entre o ensaio molecular e o ensaio de fenotipagem para uma precisão de previsão de 96% (101/105).

[00150] Tabela 3. Resultados comparativos de patótipos previstos entre o ensaio molecular e o ensaio hidropônico para 15 isolados de Phytophthora sojae

[00151] Os estudos descritos neste documento apresentam o primeiro ensaio molecular destinado a identificar genes Avr com o objetivo de diagnosticar o perfil de virulência de um patógeno vegetal. Até este ponto, a única maneira de determinar o patótipo de um determinado isolado era através de procedimentos pesados e longos de fenotipagem, cada um com suas próprias deficiências (Dorrance et al., 2008, Lebreton et al., 2018). Através deste ensaio molecular único, baseado em haplótipos discriminantes em sete genes Avr de P. sojae, agora deve ser possível obter uma identificação rápida e precisa do perfil de virulência dos isolados, a fim de selecionar precisamente o material de soja que carrega os genes Rps apropriados.

[00152] Desde a implantação do primeiro gene Rps na soja, Rps1a, P. sojae demonstrou uma resiliência muito forte e capacidade de se adaptar à pressão de seleção através de mutações rápidas de genes Avr (Drenth et al., 1996, Kaitany et al., 2001, Keeling, 1984, Layton et al., 1986). Como resultado, o patógeno evoluiu uma impressionante diversidade de patótipos (Dorrance, 2018, Dorrance et al., 2016, Dorrance et al., 2003, Sugimoto et al., 2012) que ameaça os esforços atuais para controlar sua disseminação através de abordagens genéticas. Por exemplo, em uma pesquisa de diversidade de isolados de P. sojae no Canadá, Xue et al. (2015) reportaram uma importante mudança na virulência ao longo do tempo, enquanto a maioria dos isolados agora supera Rps1k, o gene Rps mais recentemente introduzido, enquanto este patótipo estava completamente ausente nos campos canadenses há 20 anos. Essa capacidade de alterar os genes Avr parece ser baseada em mutações que vão desde a exclusão completa do gene ou variação de número de cópia, até a presença de indels ou mutações de ponto único dentro ou perto do gene (Qutob et al., 2009, Tyler e Gijzen, 2014).

[00153] Fornecido neste documento uma descrição exaustiva e comparação da diversidade de haplótipos em sete genes Avr (1a, 1b, 1c, 1d, 1k, 3a, 6) de P. sojae através de sequenciamento de genoma inteiro de 31 isolados com diferentes patótipos. Seus resultados oferecem um projeto preciso de variação de sequência e conservação em cada gene, resultados que exploramos para identificar regiões discriminantes associadas a diferentes fenótipos.

[00154] No processo de tentar desenvolver um ensaio molecular baseado nos haplótipos discriminantes, vários desafios foram encontrados em diferentes estágios do estudo. Em primeiro lugar, a aquisição de virulência para um patógeno é muitas vezes devido a uma exclusão parcial ou completa do gene Avr. Nos estudos descritos neste documento, esse fenômeno só foi sistematicamente observado no caso de Avr1d, o que significava que tínhamos que realizar uma análise exaustiva das regiões a montante e a jusante dos outros genes Avr para encontrar SNPs/indels que segregassem os haplótipos associados à avirulência daqueles associados à virulência. Em certos casos, como para Avr1a, 1c e 6, as regiões discriminantes estavam localizadas fora da região de codificação do gene.

[00155] Quando o ensaio molecular foi aplicado aos 31 isolados que também haviam sido fenotipados, pudemos mostrar uma perfeita adequação entre as duas abordagens. Isso confirma que o ensaio molecular constitui um substituto válido para os ensaios de fenotipagem longos e oferece uma abordagem muito mais prática para determinar os patótipos isolados de P. sojae. Assim, pode encontrar aplicações em delinear com precisão a implantação de linhas de soja carregando os genes Rps adequados para superar os patótipos presentes em um determinado ambiente. Além disso, à medida que novos genes de resistência são descobertos e introgredidos na soja, o teste pode ser adaptado para incluir novos genes Avr e acompanhar a evolução de novos patótipos ao longo do tempo. Finalmente, pode ser usado para avaliar outras interações gene-para-gene dependentes de patógenos vegetais.

[00156] Ao testar a precisão do ensaio molecular com 15 isolados de virulência desconhecida, observamos notavelmente um nível significativo de validação do ensaio molecular, ou seja, um nível de concordância de 96% entre os ensaios moleculares e fenótipos (os únicos quatro casos de discrepância das 105 interações testadas estavam relacionados com Avr3a). Em resumo, descrito neste documento é um ensaio molecular abrangente capaz de definir os patótipos dos patógenos de Phytophthora, baseados em genes Avr, com facilidade e precisão sem precedentes. Suas outras vantagens podem ser encontradas na eliminação das deficiências dos diferentes procedimentos de fenotipagem, reduzindo tempo e recursos envolvidos no processo. Também pode ter aplicações práticas para criadores e produtores no manejo da doença com uma implantação personalizada do uso de genes de Rps com base em uma determinação precisa e rápida de patótipos presentes em uma determinada área.

[00157] Tabela 4: SNPs e indels descritos neste documento

[00158] Tabela 5: Correspondência de posição SNP/lndel(s) com posições em SEQ n°s: 1-70

[00159] Tabela 6: Sequências descritas neste documento

[00160] Embora a presente invenção tenha sido descrita neste documento acima por meio de modalidades específicas, ela pode ser modificada, sem se afastar do espírito e natureza da invenção do sujeito, conforme definido nas alegações anexadas.

Nas alegações, a palavra "compreendendo" é usada como um termo aberto, substancialmente equivalente à frase "incluindo, mas não se limitando a". As formas singulares "a", "a" e "o" incluem referências plurais correspondentes, a menos que o contexto dite claramente o contrário. Referências Bolger, A.M., Lohse, M., e Usadel, B. 2014. Trimmomatic: um trimmer flexível para dados de sequência Illumina.Bioinformática. 30:2114-

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Claims (38)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para avaliar se um patógeno Phytophthora é virulento ou avirulento, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) determinar, em uma amostra que compreende ácido nucleico de Phytophthora, a presença ou ausência de uma ou mais variações em um ou mais genes Avr ou uma região flanqueadora dos mesmos no ácido nucleico de Phytophthora; e (b) determinar se o patógeno Phytophthora é virulento ou avirulento com base na presença ou ausência de uma ou mais variações.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes Avr são um ou mais de Avr1a, Avr1b, Avr1c, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que uma ou mais variações são, cada uma, independentemente, uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que uma ou mais variações são um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP).

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as variações são um ou mais indels e/ou SNPs que correspondem a um ou mais indels e/ou SNPs estabelecidos nas Figuras 1 (Avr1a), 3 (Avr1b), 5 (Avr1c), 7 (Avr1d), 9 (Avr1k), 11 (Avr3a) e/ou 12 (Avr6), 16 a 23 e/ou Tabela 4 e/ou 5.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a presença ou ausência de uma ou mais variações é determinada por meio da avaliação de uma região diferente do ácido nucleico de Phytophthora que está em desequilíbrio de ligação com uma ou mais variações.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 6, caracterizado pelo fato de que a presença ou ausência de uma ou mais variações é determinada com o uso de um método de amplificação.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o método de amplificação é a reação em cadeia da polimerase (PCR).

9. Método, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a reação de amplificação é realizada com o uso de sequências de iniciador compreendidas dentro das sequências estabelecidas em uma ou mais das Figuras 16 a 22.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a amplificação é realizada como uma ou mais amplificações multiplex para determinação da presença ou ausência de duas ou mais variações em cada reação de amplificação.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que uma ou mais amplificações multiplex compreendem ou consistem em duas amplificações multiplex.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as duas amplificações multiplex compreendem(a) uma primeira amplificação multiplex para determinar a presença ou ausência de um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1a mostrados nas Figuras 1, 16 e/ou 23 e/ou Tabela 4 e/ou 5 um ou mais indels e/ou SNPs que correspondem a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1b, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6 mostrados nas Figuras 3, 7, 9, 11, 13 e/ou 17 e 19 a 23, e/ou Tabela 4 e/ou 5; e (b) uma segunda amplificação para determinar a presença ou ausência de um ou mais indels e/ou SNPs que correspondem a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1c mostrado na Figura 5, 18 e/ou 23 e/ou Tabela 4 e/ou 5.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 12, caracterizado pelo fato de que a amplificação é realizada com o uso de um ou mais pares de iniciadores estabelecidos na Tabela 2, ou seus equivalentes funcionais que são direcionados a uma sequência de até 200 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões direcionados por um ou mais iniciadores estabelecidos na Tabela 2.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a amplificação é realizada com o uso de um ou mais pares de iniciadores direcionados a uma sequência de até 150 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões direcionadas por um ou mais iniciadores estabelecidos na Tabela 2.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a amplificação é realizada com o uso de um ou mais pares de iniciadores direcionados a uma sequência de até 100 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões direcionadas por um ou mais iniciadores estabelecidos na Tabela 2.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que a amplificação é realizada com o uso de um ou mais pares de iniciadores direcionados a uma sequência de até 50 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões direcionadas por um ou mais iniciadores estabelecidos na Tabela 2.

17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o patógeno Phytophthora é Phytophthora sojae.

18. Método caracterizado pelo fato de que avalia o risco de infecção do patógeno Phytophthora de uma planta de soja: (a) ao avaliar, em uma amostra obtida da planta, o solo, a água, as sementes, o ar ou qualquer cultura contendo um ou vários isolados do patógeno Phytophthora, se a amostra compreende um patógeno Phytophthora virulento ou avirulento com o uso do método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17; e (b) ao avaliar o risco de infecção do patógeno Phytophthora da planta de soja com base na avaliação feita em (a), em que a presença de um patógeno Phytophthora virulento na amostra é indicativo de um risco elevado de infecção do patógeno Phytophthora da planta da soja.

19. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o tratamento da planta com um agente antifúngico se o risco de infecção do patógeno Phytophthora for elevado.

20. Método para selecionar um cultivar de soja para plantio em uma área agrícola, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) avaliar, em uma amostra obtida da planta, o solo, a água, as sementes, o ar ou qualquer cultura que contém um ou vários isolados do patógeno Phytophthora, se a amostra compreende um patógeno Phytophthora virulento ou avirulento usando o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17; (b) se a amostra compreende um patógeno Phytophthora virulento, selecionar um cultivar de soja que compreende um ou mais genes de resistência (Rps) que conferem resistência a um ou mais genes Avr identificados na amostra que conferem virulência para plantio na área agrícola.

21. Coleção, kit ou embalagem caracterizado pelo fato de que compreende um ou mais oligonucleotídeos para determinar a presença ou ausência de uma ou mais variações em um ou mais genes Avr ou uma região flanqueadora dos mesmos no ácido nucleico de um patógeno Phytophthora.

22. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes Avr são um ou mais de Avr1a, Avr1b, Avr1c, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6.

23. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que uma ou mais variações são, cada uma, independentemente, uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais nucleotídeos.

24. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que uma ou mais variações são um polimorfismo de nucleotídeo único (SNP).

25. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 24, caracterizado pelo fato de que as variações são um ou mais indels e/ou SNPs correspondentes a um ou mais indels e/ou SNPs estabelecidos nas Figuras 1 (Avr1a), 3 (Avr1b), 5 (Avr1c), 7 (Avr1d), 9 (Avr1k), 11 (Avr3a) e/ou 12 (Avr6), 16 a 23 e/ou Tabela 4 e/ou 5.

26. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, caracterizado pelo fato de que a presença ou ausência de uma ou mais variações é determinada por meio da avaliação de uma região diferente do ácido nucleico de Phytophthora que está em desequilíbrio de ligação com uma ou mais variações.

27. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 26, caracterizado pelo fato de que a presença ou ausência de uma ou mais variações é determinada com o uso de um método de amplificação.

28. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o método de amplificação é a reação em cadeia da polimerase (PCR).

29. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado pelo fato de que um ou mais oligonucleotídeos compreendem sequências de iniciador compreendidas nas sequências estabelecidas em uma ou mais das Figuras 16 a 22 para uso em uma ou mais reações de amplificação.

30. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que um ou mais oligonucleotídeos são para uso em uma ou mais amplificações multiplex para determinação da presença ou ausência de duas ou mais variações em cada reação de amplificação.

31. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que uma ou mais amplificações multiplex compreendem ou consistem em duas amplificações multiplex.

32. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que (a) uma primeira amplificação multiplex para determinar a presença ou ausência de um ou mais indels e/ou SNPs que correspondem a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1a mostrado nas Figuras 1, 16 e/ou 23 e/ou Tabela 4 e/ou 5 um ou mais indels e/ou SNPs que correspondem a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1b, Avr1d, Avr1k, Avr3a e Avr6 mostrado nas Figuras 3, 7, 9, 11, 13 e/ou 17 e 19 a 23 e/ou Tabela 4 e/ou 5; e (b) uma segunda amplificação para determinar a presença ou ausência de um ou mais indels e/ou SNPs que correspondem a um ou mais indels e/ou SNPs em Avr1c mostrados na Figura 5, 18 e/ou 23 e/ou Tabela 4 e/ou 5.

33. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 32, caracterizado pelo fato de que um ou mais oligonucleotídeos compreendem um ou mais pares de iniciadores estabelecidos na Tabela 2, ou seus equivalentes funcionais que são direcionados a uma sequência de até 200 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões direcionadas por um ou mais iniciadores estabelecidos na Tabela 2.

34. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o um ou mais oligonucleotídeos compreendem um ou mais pares de iniciadores direcionados a uma sequência de até 150 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões direcionadas por um ou mais iniciadores estabelecidos na Tabela 2.

35. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que o um ou mais oligonucleotídeos compreendem um ou pares de iniciadores direcionados a uma sequência de até 100 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões direcionadas por um ou mais iniciadores estabelecidos na Tabela 2.

36. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com qualquer uma das reivindicações 33 a 35, caracterizado pelo fato de que um ou mais oligonucleotídeos compreendem um ou mais pares de iniciadores direcionados a uma sequência de até 50 nucleotídeos a montante ou a jusante das regiões direcionadas por um ou mais iniciadores estabelecido na Tabela 2.

37. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 36, caracterizado pelo fato de que o patógeno Phytophthora é Phytophthora sojae.

38. Coleção, kit ou embalagem, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 36, caracterizado pelo fato de que um ou mais oligonucleotídeos são fixados ou ligados a um suporte sólido.