BRPI0712398A2

BRPI0712398A2 - minicromossomo artificial de planta, planta de milho, polinucleotìdeo isolado, construção recombinante, planta transgênica de milho e método para produzir uma planta transgênica de milho compreendendo um minicromossomo artificial de planta tendo centrÈmero funcional

Info

Publication number: BRPI0712398A2
Application number: BRPI0712398-1A
Authority: BR
Inventors: Ananiev Evgeni; A. Chamberlim Mark; J. Gordon-Kamm William; Svitashev Sergei; Wu Chengcang
Original assignee: Pioneer Hi-Bred International
Priority date: 2006-05-17
Filing date: 2007-05-17
Publication date: 2012-10-16
Also published as: PL2018435T3; WO2007137114A3; CN101490267A; EP2308986B1; WO2007137114A8; US20070271629A1; EP2018435A2; WO2007137114A2; CN101490267B; EP2308986A1; CN103215304A; EP2018435B1; CA2652598A1; MX2008014615A

Abstract

MINICROMOSSOMO ARTIFICIAL DE PLANTA, PLANTA DE MILHO, POLINUCLEOTìDEO ISOLADO, CONSTRUçãO RECOMBINANTE, PLANTA TRANSGêNICA DE MILHO E MéTODO PARA PRODUZIR UM PLANTA TRANSGêNICA DE MILHO COMPREENDENDO UM MINICROMOSSOMO ARTIFICIAL DE PLANTA TENDO UM CENTRÈMERO FUNCIONAL. São descritos minicromossomos artificiais de planta compreendendo um centrómero funcional o qual se liga especificamente à proteína centromérica C (CENPC) e métodos para produzir tais minicromossomos.

Description

MINICROMOSSOMO ARTIFICIAL DE PLANTA, PLANTA DE MILHO, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, CONSTRUÇÃO RECOMBINANTE, PLANTA TRANSGÊNICA DE MILHO E MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANS GÊNICA DE MILHO COMPREENDENDO UM MINICROMOSSOMO ARTIFICIAL DE PLANTA TENDO UM CENTRÔMERO FUNCIONAL

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção é no campo de biotecnologia vegetal, em particular, ela pertence à minicromossomos artificiais e aos métodos de fazer tais minicromossomos em uma planta.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Recentes avanços na engenharia de cromossomos têm feito ser possível alterar o genoma da planta, então, alterando seu fenótipo. Quando um transgene é integrado dentro do genoma da planta, geralmente é de caráter aleatório e em um número de cópia imprevisível. Assim sendo, esforços de pesquisa têm sido direcionados em direção ao melhor controle da integração do transgene.

Dada esta necessidade, pesquisadores têm imaginado se a resposta pode ser encontrada no uso de minicromossomos artificiais. Estas são moléculas de DNA linear ou circular, feitas pelo homem construídas de elementos de seqüência de DNA agindo de forma eis que provê replicação e particionamento dos minicromossomos construídos.

Acredita-se que a produção de cromossomos artificiais possa reduzir ou eliminar algumas questões associadas com integrações genômicas ao acaso dentro de um cromossomo de plana nativo, por exemplo, uma ligação de arraste para associação do transgene com o material genômico da planta hospedeira. Cromossomos artificiais podem também prover meios para liberar 10-100 vezes mais genes do que vetores de transformação padrões, e para prover grandes segmentos cromossômicos para complementação e/ou clonagem baseada em mapa.

Três componentes têm sido identificados para replicação, estabilidade e manutenção/herança de cromossomos artificiais: (i) seqüências de replicação autônomas que funcionam como origem de replicação; (ii) telômeros que funcionam para estabilizar e manter a extremidade de cromossomos lineares; e, (iii) centrômeros que são o sitio de cinetócoro reunido para a segregação cromossômica própria na mitose e meiose. Centrômeros isolados de organismo unicelulares, tais como levedura, não funcionam em eucariotos desenvolvidos.

A patente americana US 5.270.201, emitida por Richards et al. em 14 de dezembro de 1993, descreve cromossomos de planta artificiais baseados em telômeros e, opcionalmente, um centrômero.

A patente americana US 7.119.250, emitida por Luo et al. em 10 de outubro de 2006, descreve composições de centrômeros vegetais.

A patente americana US 7.132.240, emitida por Richards et al. em 7 de novembro de 2006, descreve um método para isolar um centrômero metilado de DNA potencialmente de qualquer centrômero em um organismo. A patente americana US 7.193.128, emitida por Copenhaver et al. em 20 de março de 2007, descreve um método para gerar ou aumentar rendimento de cultivares usando seqüências de ácido nucléico de centrômeros de planta.

0 pedido PCT tendo número de publicação WO 2007/030510 que foi publicado em 15 de março de 2007 descreve métodos de fazer plantas transformadas com minicromossomos autônomos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um minicromossomo de planta compreendendo um centrômero funcional contendo: (a) pelo menos duas matrizes de repetições em tandem de CentC em uma orientação invertida onde a primeira matriz compreende pelo menos cinqüenta cópias de CentC e a segunda matriz compreende pelo menos cinqüenta cópias de CentC; e,

(b) pelo menos uma cópia de um elemento retrotransponivel, onde o elemento retrotransponivel está situado entre a primeira e a segunda matriz.

Em uma segunda concretização, um minicromossomo artificial de planta da invenção compreende um elemento retrotransponivel selecionado do grupo consistindo de CentA, CRMl, e CRM2.

Em uma terceira concretização, o minicromossomo artificial de planta da invenção também compreende pelo menos um telômero funcional.

Em uma quarta concretização, o centrômero funcional, compreendido pelo minicromossomo artificial de planta, se liga especificamente à proteína C centromérica (CENPC).

Em uma quinta concretização, uma planta de milho pode compreender qualquer dos minicromossomos artificiais da invenção.

Em uma sexta concretização, a presente invenção diz respeito a um minicromossomo artificial de planta compreendendo um centrômero funcional, onde o centrômero se liga especificamente à proteína centromérica C (CENPC).

Em uma sétima concretização, a invenção diz respeito a um polinucleotídeo isolado compreendendo: (a) pelo menos duas matrizes de repetição em tandem de CentC em uma orientação invertida onde a primeira matriz compreende pelo menos dez cópias de CentC e a segunda matriz compreende pelo menos dez cópias de CentC; e, (b) pelo menos uma cópia de um elemento retrotransponível, onde o elemento retrotransponível está situado entre a primeira e a segunda matriz.

Em uma oitava concretização, o polinucleotídeo isolado da invenção compreende um elemento retrotransponível que é selecionado do grupo consistindo de CentA, CRMl, e CRM2. Em uma nona concretização, a invenção diz respeito a um polinucleotideo isolado compreendendo: (a) pelo menos uma matriz de repetições em tandem de CentC, a matriz compreendendo pelo menos 10 cópias de CentC; e, (b) pelo menos uma cópia de um elemento retrotransponivel selecionado do grupo consistindo de CentA, CRMl, e CRM2.

Em uma décima concretização, a invenção diz respeito a um polinucleotideo isolado compreendendo: (a) pelo menos uma matriz de repetições em tandem de CentC, a matriz compreendendo pelo menos 10 cópias de CentC; e, (b) pelo menos uma cópia de cada um dos CentA, CRMl, e CRM2.

Em uma décima primeira concretização, a invenção diz respeito a uma construção recombinante compreendendo qualquer dos polinucleotideos isolados da invenção bem como planta de milho transgênica compreendendo tais construções recombinantes.

Em uma décima segunda concretização, a invenção diz respeito a um método para fazer uma planta transgênica de milho compreendendo um minicromossomo artificial de planta tendo um centrômero funcional sendo o método compreendendo:

(a) contactar pelo menos uma célula vegetal de milho com uma mistura compreendendo uma construção recombinante da invenção;

(b) identificar pelo menos uma célula vegetal de milho da etapa (a) compreendendo um minicromossomo artificial de planta tendo um centrômero funcional; e

(c) regenerar uma planta de milho fértil da célula vegetal de milho da etapa (b) onde a dita planta de milho compreende um minicromossomo de planta artificial tendo um centrômero funcional. A mistura pode também compreender um polinucleotideo codificando um polipeptideo para estimular o crescimento celular onde o polipeptideo é selecionado do grupo consistindo de um wuschel, a baby boom, a RepA, ou uma Lecl.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Esta patente ou pedido de patente contém pelo menos um desenho executado em cor. Cópias desta patente ou pedido de patente com desenhos coloridos serão providos pelo escritório mediante um pagamento da taxa necessária.

A invenção pode ser melhor entendida através da seguinte descrição detalhada e desenhos e listagem de seqüências acompanhantes, que formam uma parte deste pedido.

Figura 1. Hibridização fluorescente in situ (FISH) em uma distribuição cromossômico mitótica de calos embriogênicos de milho da transformação Hi-II CMC3 grupo 1 evento #14. Calos foram derivados de embriões imaturos transformados com grupo 1 do clone BAC linearizado readaptado com Tn5-3. Núcleos na prometáfase (esquerda) e metáfase (direita) mostram os 20 cromossomos nativos mais 1 minicromossomo (setas e insertos). Ambos minicromossomos são positivos para o CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza) especifica para repetição centrômero e a sonda de marcador único 23715 (vermelho - colorido; branco escala de cinza) especifica para transformação da construção, com ambos os CentC e 23715 sendo essencialmente co-localizados no minicromossomo (insertos).

Figura 2. FISH em uma distribuição cromossômico mitótica de calos embriogênicos de milho da transformação Hi-II CMC3 grupo 1 evento #14. Calos foram derivados de embriões imaturos transformados com grupo 1 do clone BAC linearizado readaptado com Tn5-3. Painel A mostra um núcleo em metáfase mostrando os 20 cromossomos nativos mais .2 minicromossomos (quadro). Ambos os minicromossomos são positivos para o CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza) especifica para repetição centrômero e a sonda marcadora única 23715 (vermelho - colorido; branco - escala de cinza) especifica para a transformação da construção. Painéis B-D têm uma ampliação do quadro mostrando os minicromossomos (seta) com: B - DAPI apenas; C - DAPI + sonda 23715 (vermelho - colorido; branco - escala de cinza); e D - DAPI + sonda CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza).

Figura 3. Imunofluorescência em uma distribuição cromossômico mitótica de calos embriogênicos de milho da transformação Hi-II CMC3 grupo 1 evento #14. Calos foram derivados de embriões imaturos transformados com grupo 1 do clone BAC linearizado readaptado com Tn5-3. Painel A mostra um núcleo em metáfase mostrando os 20 cromossomos nativos mais 1 minicromossomo (seta). Todos os centrômeros dos cromossomos nativos e minicromossomos são positivos para a proteína centromérica C, CENPC (vermelho - colorido; branco - escala de cinza), uma proteína específica de centrômero/cinetócoro. Painéis B-C mostram ampliação do minicromossomo com: B - DAPI apenas; e C - DAPI + CENPC (vermelho - colorido; branco - escala de cinza). A morfologia e imunolocalização de CENPC indicam que o minicromossomo é composto de duas cromátides irmãs cada uma tendo um centrômero funcional.

Figura 4. Painel A - Imunof luorescência em uma distribuição cromossômico mitótica de calos embriogênicos de milho da transformação Hi-II CMC3 grupo 1 evento #14. Calos foram derivados de embriões imaturos transformados com grupo 1 do clone BAC linearizado readaptado com Tn5-3. A separação das cromátides irmãs dos cromossomos nativos e o minicromossomo (quadro) foram observados durante a anáfase. Todos os centrômeros dos cromossomos nativos e o minicromossomo são positivos para a proteína centromérica C, CENPC (vermelho - colorido; branco - escala de cinza) uma proteína específica de centrômero/cinetócoro. Painel B é uma imagem amplificada do quadro em A, mostrando a separação das cromátides irmãs do minicromossomo (seta dupla) indicando que o minicromossomo, como cromossomos normais, pode segregar durante a mitose. Figura 5. FISH em uma distribuição cromossômico mitótica de calos embriogênicos de milho da transformação Hi-II CMC3 grupo 3 evento #12. Calos foram derivados de embriões imaturos transformados com grupo 3 do clone BAC linearizado readaptado com Tn5-3. Um núcleo metafásico tetra-aneuploide (39 cromossomos, perdendo uma cópia do cromossomo 6) mostrando os cromossomos nativos mais 1 minicromossomo (seta) é apresentado. 0 minicromossomo é positivo para a CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza) especifica para repetição centrômero e a sonda marcadora única 23715 (vermelho - colorido; branco - escala de cinza) especifica para a transformação da construção. Painéis B-D são uma amplificação da área do quadro mostrando o minicromossomo (ponta da seta) e um cromossomo nativo com: A - DAPI apenas; B - DAPI + sonda CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza) ; e D - DAPI + sonda 。23715 (vermelho - colorido; branco - escala de cinza). Localização bipolar de repetições CentC como revelado por coloração FISH no minicromossomo indicam que ele é composto de duas cromátides irmãs similares aquelas observadas nos cromossomos nativos.

Figura 6.FISH em uma distribuição cromossômico mitótica de calos embriogênicos de milho da transformação Hi-II CMC3 grupo 3 evento #12. Calos foram derivados de embriões imaturos transformados com grupo 3 do clone BAC linearizado readaptado com Tn5-3. Painel A - cromossomos tetra-aneuploides (39 cromossomos, perdendo uma cópia do cromossomo 6) de um núcleo metafásico mostrando os cromossomos nativos mais 2 minicromossomos (setas). Minicromossomos são positivos para ambos CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza) específica para repetição centrômero e a sonda marcadora única 23715 (vermelho - colorido; branco - escala de cinza) específica para a transformação da construção. Painel B é uma amplificação da imagem dos 2 minicromossomos mostrando a variação em abundância das repetições CentC e o marcador único 23715.

Figura 7. FISH em uma distribuição cromossômico mitótica de calos embriogênicos de milho da transformação Hi-II CMC3 grupo 3 evento #12. Calos foram derivados de embriões imaturos transformados com grupo 3 do clone BAC linearizado readaptado com Tn5-3. Painel A - cromossomos tetra-aneuploides (39 cromossomos, perdendo uma cópia do cromossomo 6) de um núcleo mostrando a separação das cromátides irmãs dos cromossomos nativos e dois minicromossomos (quadro) no início da anáfase. As cromátides irmãs de ambos os minicromossomos são positivas para o CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza) específica para repetição centrômero e a sonda marcadora única 23715 (vermelho - colorido; branco - escala de cinza) específica para a transformação da construção. Painéis B-C são uma ampliação das imagens dos 2 minicromossomos (seta dupla) mostrando: B - DAPI + sonda CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza); e C - DAPI + sonda 23715 (vermelho - colorido; branco - escala de cinza). Separação das cromátides irmãs do minicromossomo na anáfase sugere a presença de centrômeros funcionais, permitindo a segregação durante a mitose.

Figura 8. Imunofluorescência em uma distribuição cromossômico mitótica de calos embriogênicos de milho da transformação Hi-II CMC3 grupo 3 evento #12. Calos foram derivados de embriões imaturos transformados com grupo 3 do clone BAC linearizado readaptado com Tn5-3. Painel A mostra um núcleo metafásico tetra-aneuplóide (39 cromossomos, perdendo uma cópia do cromossomo 6) mostrando 39 cromossomos nativos mais 2 minicromossomos (setas). Todos os centrômeros dos cromossomos nativos e os minicromossomos são positivos para a proteína centromérica C, CENPC (vermelho - colorido; branco - escala de cinza) uma proteína específica de centrômero/cinetócoro. Painéis B-C são imagens amplificadas dos minicromossomos. O padrão de imunolocalização de CENPC, dois Ioci por minicromossomo, indica que o minicromossomo é composto de duas cromátides irmãs e cada uma tem um centrômero funcional hábil para formar um complexo cinetócoro.

Figura 9. FISH em uma distribuição cromossômico mitótica da extremidade da raiz de uma planta regenerada de um evento de transformação de milho Hi-II. Plantas foram derivadas de embriões imaturos transformados com bacm.pkl28.j21 linearizados readaptado com Tn5-3. Painel A mostra um núcleo metafásico aneuplóide apresentando 19 cromossomos nativos mais 1 minicromossomo (seta). O minicromossomo é positivo para o CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza) especifica para repetição centrômero e a sonda marcadora única 23715 (vermelho - colorido; branco - escala de cinza) especifica para a transformação da construção. Painéis B-D são amplificações do minicromossomo com: B - DAPI apenas; C - DAPI + sonda CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza) ; e D - DAPI + sonda 23715 (vermelho - colorido; branco - escala de cinza).

Figura 10. Imunofluorescência em uma distribuição cromossômico mitótica da extremidade da raiz de uma planta regenerada de um evento de transformação de milho Hi-II. Plantas foram derivadas de embriões imaturos transformados com bacm.pkl28.j21 linearizados readaptado com Tn5-3. Painel A mostra um núcleo metafásico aneuplóide apresentando 19 cromossomos nativos mais 1 minicromossomo (seta). Todos os centrômeros dos cromossomos nativos e os minicromossomos são positivos para a proteína centromérica C, CENPC (vermelho - colorido; branco - escala de cinza), uma proteína específica de centrômero/cinetócoro. Painéis B-C são amplif icações do minicromossomo com: B - DAPI apenas; e C - DAPI + CENPC. 0 padrão de imunolocalização CENPC, dois Ioci por minicromossomo, indica que o minicromossomo é composto de duas cromátides irmãs e cada uma tem um centrômero funcional hábil para formar um complexo cinetócoro.

Figura 11. Fina estrutura de centrômeros de milho revelados por fibra-FISH. Quatro repetições centroméricas, CentC (verde - colorido; branco - escala de cinza) e uma soma de CentA, CRMl, e CRM2 (vermelho - colorido; verde - escala em cinza) foram usadas em FISH multicolorido em fibras de DNA estendidas de linhagens adicionais de aveia- milho contendo cromossomos individuais de milho. Isto revelou estiramentos de hibridização megabase-alongada, que são únicas para cada cromossomo.

Figura 12. Modelo de um centrômero de milho. Organização centromérica é mostrada usando nomenclatura repetida centromérica de milho. Arranjos ininterruptos de CentC podem ser compostos de várias centenas a milhares de elementos repetidos. Outros elementos retrotransponiveis específicos de centrômero de milho tais como CentA, CRMl, e/ou CRM2 podem ser integrados dentro de um arranjo CentC, entre si, e/ou nele mesmo em regiões centroméricas. Em adição aos retrotransposons específicos de centrômeros, outros retrotransposons podem ser integrados no arranjo, em elementos como CentA, CentC, CRM1, e CRM2, e/ou nele mesmo para formar insertos que interrompam arranjos repetidos em tandem CentC. Esta figura mostra um modelo de organização dos elementos CentC de milho (extremidade da seta) formando dois arranjos de repetições cabeça-para-cauda em tandem. Os arranjos CentC podem ser encontrados em uma orientação invertida para formar um grande segmento do DNA centromérico. Fibra-FISH alongada com FISH nos cromossomos na anáfase meiótica e análises de hibridização-blot de segmentos de DNA centroméricos clonados indicam que regiões com alta densidade de todas as quatro repetições centroméricas (CentC, CRM1, CentA, e CRM2) estão envolvidas na formação do cinetócoro.

Figura 13. Reequipamento e conversão in vitro de um clone BAC em um minicromossomo artificial linear. Clone BAC de DNA é readaptado com transposon Tn5-3 feito como de costume compreendendo gene de resistência à ampicilina (APr), origem de replicação (ori), marcadores de seleção (MO-PAT) e visual (DS-RED2) sob o promotor da ubiquitina (UBI1ZM PRO), seqüências teloméricas (TEL) na orientação reversa separadas por um gene de resistência à canamicina (gene KANr), e sítios para enzimas de restrição da fonte I- Ppo I, I-Ceu I, e PI-Sce I. Suporte ME para extremidade em mosaico de transposon. Digestão da construção BAC com enzimas de restrição da fonte I-Ceu I converte um BAC circular em uma molécula de DNA linear flanqueada com seqüências teloméricas.

Figura 14. Núcleo metafásico de calos de CMC3 grupo 1 evento #14 marcado para os elementos centrômero e telômeros. Análises FISH foram feitas usando sondas marcadas fluorescentemente para a repetição específica para centrômero CentC (verde - colorido; branco - escala em cinza) e repetições específicas para telômeros telo-31 (vermelho - colorido; branco - escala em cinza) . Localização dessas sondas é notada para um cromossomo nativo, CentC é indicada por asteriscos (*), e telo-31 indicada por setas duplas. Painéis B-E mostram uma amplificação do minicromossomo. Painel B - DAPI + Cent C + telo31 (verde/vermelho - colorido; branco - escala em cinza) ; C - DAPI apenas; D - DAPI + sonda CentC (verde - colorido; branco - escala em cinza); e E - DAPI + sonda .23715 (vermelho - colorido; branco - escala em cinza). 0 padrão da hibridi zação telo—31 sugere que o minicromossomo (seta) tem telômeros funcionais similares aos cromossomos nativos.

Figura 15. Núcleo metafásico de calos CMC3 subgrupo 1.3 evento #27 marcados para os elementos de centrômero e telômeros. Análises FISH foram feitas usando sondas marcadas fluorescentemente para repetições especificas de centrômero CentC (verde - colorido; branco - escala em cinza) e repetições especificas para telômeros telo-31 (vermelho - colorido; branco - escala em cinza) . Localização dessas sondas é notada para um cromossomo nativo, CentC é indicada por asteriscos (*), e telo-31 indicada por setas duplas. Painéis B-E mostram amplificação do minicromossomo. Painel B - DAPI + Cent C + telo-31 (verde/vermelho - colorido; branco - escala em cinza); C - DAPI apenas; D - DAPI + sonda CentC (verde - colorido; branco - escala em cinza) e E - DAPI + sonda 23715 (vermelho - colorido; branco - escala em cinza). O padrão da hibridização telo-31 sugere que o minicromossomo (seta) tem telômeros funcionais similares a cromossomos nativos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A revelação de cada referência descrita aqui é por meio desta incorporada por referência em sua totalidade.

Como usado aqui nas reivindicações anexadas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências no plural a menos que o contexto claramente indique de outra forma. Então, por exemplo, a referência para "uma planta" inclui uma pluraridade de tais plantas, a referência para "uma célula" inclui uma ou mais células e equivalentes das mesmas conhecidas para os especialistas no estado da técnica, e assim por diante.

No contexto desta revelação, um número de termos e abreviações é usado. As seguintes definições são providas.

"Fase aberta de leitura" é abreviada como ORF.

"American Type Culture Collection" é abreviada como ATCC.

O termo "minicromossomo artificial de planta" como usado aqui refere-se a qualquer cromossomo criado artificialmente compreendendo um centrômero e telômeros que possuam propriedades comparáveis com aquelas de um cromossomo nativo, tais como replicação e segregação durante a mitose e meiose e conseqüentemente autonomia e transmissibilidade na divisão celular. Os termos minicromossomo artificial, minicromossomo, e cromossomo artificial são usados alternadamente aqui. O termo "centrômero funcional" refere-se a uma região de ligação ao fuso de um cromossomo eucariótico que funciona de uma maneira comparável a centrômeros em um cromossomo nativo. É a região mais condensada e contraída de um cromossomo, para a qual a fibra do fuso é fixada durante a mitose. Durante a mitose em uma planta ou célula animal típica, cada cromossomo divide-se longitudinalmente em dois cromossomos irmãos que eventualmente separam e migram para pólos opostos do fuso mitótico. No início da mitose, quando os cromossomos irmãos estiverem divididos, mas estiverem ainda pareados, cada cromossomo fixa ao fuso em um ponto específico ao longo de seu comprimento. Esse ponto é referido como o centrômero ou região de fixação do fuso. Centrômeros são compostos de DNA altamente repetitivo, isto é, seqüências de DNA que estão presentes em um genoma em muitas cópias.

O termo "arranjo" refere-se a um arranjo ordenado de elementos.

O termo "repetição em tandem" refere-se a múltiplas cópias da mesma seqüência base na mesma orientação. Então, essas são cópias de seqüências de nucleotídeos, que são repetidas uma e outra vez um número de vezes em tandem, por exemplo, ao longo do cromossomo. Qualquer arranjo de repetições em tandem pode compreender múltiplas cópias de um simples elemento, ou pode ter pelo menos um outro elemento intercalado dentro do arranjo, ou dentro de um elemento do arranjo. O termo "orientação invertida" refere-se a duas ou mais cópias da mesma seqüência presente de uma forma invertida.

Os termos "elemento retrotransponível" e "retrotransposon" são usados alternadamente aqui e referem- se a um elemento genético que transpõe para um novo local no DNA através de fazer primeiro uma cópia de RNA dele mesmo, depois fazer uma cópia de DNA deste RNA com uma transcriptase reversa, e então inserir a cópia de DNA dentro do DNA alvo. Retrotransposons são elementos genéticos que podem amplificar-se em um genoma e são componentes ubíquos do DNA de muitos organismos eucariotas. Eles são uma subclasse de transposon. Eles são particularmente abundantes em plantas, onde eles são freqüentemente um componente principal do DNA nuclear.

O termo "telômero funcional" refere-se a estruturas encontradas nas extremidades dos cromossomos nas células de eucariotos. Telômeros funcionam através da proteção das extremidades dos cromossomos de recombinação, fusão com outros cromossomos, ou degradação por nucleases. Eles permitem às células distinguir entre quebras aleatórias de DNA e extremidades de cromossomo. Eles também desempenham uma significante função na determinação do número de vezes que uma célula normal pode dividir. Um telômero é uma região de DNA altamente repetitiva na extremidade de um cromossomo linear que funciona como um tampão disponível. Cada vez que cromossomos eucariotos lineares são replicados durante a fase S o complexo DNA polimerase é incapaz de replicar todo o caminho até a extremidade do cromossomo; se não fosse pelos telômeros, isso poderia rapidamente resultar na perda da informação genética vital, que é necessária para sustentar uma atividade celular.

Como usado aqui, o termo "ácido nucléico" significa um polinucleotideo e inclui polímeros de fita simples ou dupla de bases de deoxiribonucleotídeo ou ribonucleotideo. Ácidos nucléicos podem também incluir fragmentos e nucleotídeos modificados. Então, os termos "polinucleotideo", "seqüência de ácido nucléico", "seqüência de nucleotídeo" ou "fragmento de ácido nucléico" são usados de forma substituível para indicar um polímero de RNA ou DNA que é fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases de nucleotídeo sintéticas, não naturais ou alteradas. Nucleotídeos (usualmente encontrados na sua forma 5'- monofosfato) são referidos por sua designação de letras simples como segue: "A" para adenosina ou deoxiadenosina (para RNA ou DNA, respectivamente) , "C" para citosina ou deoxicitosina, "G" para guanosina ou deoxiguanosina, "U" para uridina, "T" para deoxitimidina, "R" para purinas (A ou G), "Y" para pirimidinas (C ou Τ) , "K" para G ou Τ, "H" para A ou C ou Τ, "I" para inosina, e "N" para qualquer nucleotídeo.

Os termos "subfragmento que é funcionalmente equivalente" e "subfragmento funcionalmente equivalente" são usados alternadamente aqui. Esses termos referem-se a uma porção ou subseqüência de um fragmento de ácido nucléico isolado onde a habilidade para alterar a expressão gênica ou produzir um certo fenótipo é retida se ou não o fragmento ou subfragmento codificar uma enzima ativa. Por exemplo, o fragmento ou subfragmento pode ser usado na construção de genes quiméricos para produzir o fenótipo desejado em uma planta transformada. Genes quiméricos podem ser construídos para uso na supressão através de ligação de um fragmento de ácido nucléico ou subfragmento dos mesmos, se ou não ele codificar uma enzima ativa, na orientação senso ou antisenso com relação à seqüência promotora vegetal.

0 termo "domínio conservado" ou "motivo" significa um grupo de aminoácidos conservados em posições específicas ao longo de uma seqüência alinhada de proteínas relacionadas evolutivamente. Enquanto aminoácidos em outras posições podem variar entre proteínas homólogas, aminoácidos que são altamente conservados em posições específicas indicam aminoácidos que são essenciais na estrutura, estabilidade, ou atividade de uma proteína. Porque eles são identificados pelo seu alto grau de conservação em seqüências alinhadas de uma família de proteínas homólogas, eles podem ser usados como identificadores, ou "assinaturas", para determinar se uma proteína com uma seqüência recentemente determinada pertence a uma família de proteínas previamente identificada.

Os termos "homologia", "homólogo", "substancialmente similar", "substancialmente idêntico", e "substancialmente correspondente" são usados alternadamente aqui. Eles referem-se a fragmentos de ácido nucléico onde mudanças em uma ou mais bases de nucleotideos não afetam a habilidade do fragmento de ácido nucléico de mediar a expressão gênica ou produzir um certo fenótipo. Esses termos também referem- se a modificações dos fragmentos de ácido nucléico da presente invenção tais como deleção ou inserção de um ou mais nucleotideos que não alteram substancialmente as propriedades funcionais do fragmento de ácido nucléico resultante relativo ao fragmento não modificado inicial. Esses termos também referem-se a seqüências de aminoácidos, polipeptideos, ou fragmentos de peptideos com ou sem modificações, deleções, inserções, ou substituições que não alteram substancialmente as propriedades funcionais relacionadas a uma seqüência não modificada inicial. É, portanto, entendido, como os especialistas no estado da técnica irão apreciar, que a invenção engloba mais do que as seqüências exemplares especificas.

Mais ainda, um especialista na área reconhece que seqüências de ácido nucléico substancialmente similares englobadas por esta invenção são também definidas por sua habilidade de hibridizar (sob condições moderadamente estringentes, pex., 0. 5X SSC, 0.1% SDS, 60 °C) com as seqüências exemplificadas aqui, ou para qualquer porção das seqüências de nucleotideo reveladas aqui e que são funcionalmente equivalentes a qualquer das seqüências de ácido nucléico reveladas aqui. Condições de estringência podem ser ajustadas para rastrear fragmentos moderadamente similares, tais como seqüências homólogas de organismos distancialmente relacionados, para fragmentos altamente similares, tais como genes que duplicam enzimas funcionais de organismos intimamente relacionados. Lavagens pós- hibridização determinam condições de estringência.

0 termo "hibridiza seletivamente" inclui referência a hibridização, sob condições estringentes de hibridização, de uma seqüência de ácido nucléico para uma seqüência alvo de ácido nucléico especificada a um grau altamente detectável (pex., pelo menos 2 vezes sobre o background) do que sua hibridização a seqüências de ácido nucléico não alvo e a exclusão substancial de ácidos nucléico não alvo. Seqüências hibridizando seletivamente tipicamente têm cerca de pelo menos 80% de identidade de seqüência, ou 90% de identidade de seqüência, até e incluindo 100% de identidade de seqüência (i.e., totalmente complementar) umas com as outras.

O termo "condições estringentes" ou "condições estrigentes de hibridização" faz referência a condições sobre as quais uma sonda hibridizará seletivamente com sua seqüência alvo. Condições estringentes são seqüência- dependente e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Através do controle da estringência de hibridização e/ou condições de lavagem, seqüências alvo podem ser identificadas que sejam 100% complementares à sonda (marcação homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir algum mal emparelhamento nas seqüências de modo que baixos graus de similaridade sejam detectados (marcação heteróloga). Geralmente, uma sonda tem menos do que cerca de 1000 nucleotideos em comprimento, opcionalmente menos do que 500 nucleotideos em comprimento.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas onde a concentração de sal é menor do que cerca de 1.5 M de ion Na, tipicamente cerca de 0.01 a 1.0 M de concentração de ion Na (ou outros sais) empH 7.0 a 8.3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 0C para sondas curtas (pex., 10 a 50 nucleotideos) e pelo menos cerca de 60 0C para sondas longas (pex., maior do que 50 nucleotideos). Condições estringentes podem também ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores tais como formamida. Baixas condições de estringência exemplares incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, 1 M de NaCl, SDS 1% (dodecil sulfato de sódio) a 37 0C, e uma lavagem em IX a 2X SSC (20X SSC = 3.0 M NaCl/0.3 M de citrato de trisódio) de 50 a 55 0C. Condições de estringência moderadas exemplares incluem hibridização em formamida de 40 a 45%, 1 M de NaCl, SDS 1% a 37 °C, e uma lavagem em 0. 5X a IX de SSC de 55 a 60 °C. Condições de alta estringência exemplares incluem hibridização em formamida 50%, 1 M de NaCl, SDS 1% a 37 °C, e uma lavagem em SSC 0.1X de 60 a 65 °C.

Especificidade é tipicamente a função de lavagens pós hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e a temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA- DNA, a Tm pode ser aproximada da equação de Meinkoth et al. ((1984) Anal Biochem 138:267-284): Tm = 81.5 0C + 16.6 (log

M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (% form) - 500/L; onde M é a

molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem dos nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares de base. A Tm é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) onde 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza com uma sonda pareada perfeitamente. Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de mal pareamento; então, Tm, condições de hibridização e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridizar com seqüências de identidade desejada. Por exemplo, se seqüências com >90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída 10 °C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5°C mais baixas do que o ponto de fusão termal (Tm) para a seqüência específica e seu complemento em uma força iônica e pH definidos. No entanto, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4 0C mais baixos do que o ponto de fusão termal (Tm) ; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9, ou 10C mais baixos do que o ponto de fusão termal (Tm); condições mais ba ixas de estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, ou 20 0C mais baixos do que o ponto de fusão termal (Tm). Usando a equação, composições de hibridização e lavagem, e Tm desejadas, os especialistas na área entenderão que variações na estringência das soluções de hibridização e/ou lavagens são inerentemente descritas. Se o grau desejado de mal pareamento desejado resulta em uma Tm menor do que 45 0C (solução aquosa) ou 32℃(solução de formamida) é preferível aumentar a concentração de SSC de tal modo que uma temperatura maior possa ser utilizada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-- Hybridization with Nucleic Aeid Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); e Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) . Condições de hibridização e/ou lavagem podem ser aplicadas por pelo menos 10, 30, 60, 90, 120, ou 240 minutos.

0 termo "identidade de seqüência" ou "identidade" no contexto de seqüências de ácido nucléico ou polipeptídeos referem-se a bases de ácidos nucléicos ou resíduos de aminoácidos em duas seqüências que são as mesmas quando alinhadas para um máximo de correspondência sobre uma janela de comparação especificada. 0 termo "porcentagem de identidade de seqüência" refere-se ao valor determinado pela comparação de duas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, onde a porção da seqüência de polinucleotídeo ou polipeptídeo na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (i.e., gaps) quando comparada com a seqüência referência (que não compreende adições ou deleções) para um alinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada pela determinação do número de posições onde a base de ácido nucléico idêntica ou resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as seqüências para produzir o número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando os resultados por 100 para produzir a porcentagem de identidade de seqüência. Exemplos úteis de porcentagem de identidade de seqüência incluem, mas não estão limitados a, .50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, ou qualquer porcentagem inteira de 50% a 100%. Essas identidades podem ser determinadas usando qualquer dos programas descritos aqui.

Alinhamentos de seqüência e cálculos de porcentagem de identidade ou similaridade podem ser determinados usando uma variedade de métodos de comparação designados para detectar seqüências homólogas incluindo, mas não limitado ao, programa MegAlign™ do grupo de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Dentro do contexto deste pedido é entendido que onde o programa de computador de análise de seqüências é utilizado para análise, os resultados das análises serão baseados nos "valores padrões" do programa referenciado, a menos que seja especificado de outra forma. Como usado aqui "valores padrões" significarão qualquer grupo de valores ou parâmetros que originalmente carregam com o programa de computador quando da primeira inicialização. 0 termo "método de alinhamento Clustal V" corresponde ao método de alinhamento classificado como Clustal V (descrito por Higgins & Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Higgins et al. (1992) Comput Appl Biosci 8:189-191) e encontrado no programa MegAlign™ do grupo de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI). Para múltiplos alinhamentos, os valores padrões correspondem ao Gap Penalty = 10 E Gap Length Penalty = 10. Parâmetros padrões para alinhamentos emparelhados e cálculo da porcentagem de identidade das seqüências de proteína usando o método Clustal são KTUPLE=I, GAP PENALTY=3, WIND0W=5 e DIAGONALS SAVED=5. Para ácidos nucléicos esses parâmetros são KTUPLE=2, GAP PENALTY=5, WIND0W=4 e DIAGONALS SAVED=4. Depois do alinhamento de seqüências usando o programa Clustal V, é possível obter uma "porcentagem de identidade" através da observação da tabela "distâncias de seqüências" no mesmo programa. 0 termo "método de alinhamento Clustal W" corresponde ao método de alinhamento classificado Clustal W (descrito por Higgins & Sharp (1989) CABIOS .5:151-153; Higgins et al. (1992) Comput Appl Biosci 8:189- .191) e encontrado no programa MegAlign™ v6.1 do grupo de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) . Parâmetros padrões para alinhamento múltiplo são GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=0.2, Delay Divergen Seqs(%)=30, DNA Transition Weight = O. 5, Protein Weight Matrix=Gonnet Series, DNA Weight Matrix=IUB. Após o alinhamento das seqüências usando o programa Clustal W, é possível obter uma "porcentagem de identidade" através da observação da tabela "distâncias de seqüência" no mesmo programa. 0 termo "método de alinhamento BLASTN" é um algoritmo provido pelo Centro Nacional para Informação Biotecnológica (NCBI) para comparar seqüências de nucleotídeo usando parâmetros padrões.

É bem conhecido por um especialista no estado da técnica que muitos níveis de identidade de seqüência são úteis na identificação de polipeptídeos, de outras espécies, onde tais polipeptídeos têm a mesma ou similar função ou atividade. Exemplos úteis de porcentagem de identidades incluem, mas não estão limitados, 50%, 55%, .60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%, ou qualquer porcentagem inteira de 50% a 100%. De fato, qualquer identidade de aminoácido inteiro de 50% a 100% pode ser útil na descrição da presente invenção, tais como 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, .65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, .77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, .89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%.

O termo "gene" refere-se a um fragmento de ácido nucléico que expressa uma proteína específica, incluindo seqüências regulatórias precedentes (seqüências 5' não codificadoras) e seguintes (seqüências 3'não codificadoras) à seqüência codificadora. "Gene nativo" refere-se a um gene como encontrado na natureza com suas próprias seqüências regulatórias. "Gene quimérico" refere-se a qualquer gene que não é um gene nativo, compreendendo seqüências regulatórias e codificadoras que não são encontradas juntas na natureza. Portanto, um gene quimérico pode compreender seqüências regulatórias e seqüências codificadoras que são derivadas de diferentes origens, ou seqüências regulatórias e seqüências codificadoras derivadas da mesma origem, mas arranjadas de uma maneira diferente do que aquela encontrada na natureza. Um gene "exógeno" refere-se a um gene normalmente não encontrado no organismo hospedeiro, mas que é introduzido dentro do organismo hospedeiro através de transferência gênica. Genes exógenos podem compreender genes nativos inseridos dentro de um organismo não nativo, ou genes quiméricos. Um "transgene" é um gene que tem sido introduzido dentro do genoma através do procedimento de transformação.

0 termo "genoma" como é aplicado a células vegetais engloba "não apenas DNA cromossômico encontrado dentro do núcleo, como DNA de organelas encontrado dentro de componentes subcelulares (pex., mitocôndria, ou plastideo) da célula.

Um "gene códon-otimizado" ou "gene códon-preferencial" é um gene tendo sua freqüência de uso de códon designada para imitar a freqüência do uso preferencial de códon da célula hospedeira.

Um "alelo" é uma das várias formas alternativas de um gene ocupando um dado locus em um cromossomo. Quando todos os alelos presentes em um dado locus em um cromossomo são os mesmos, aquela planta é homozigota naquele locus. Se os alelos presentes em um dado locus em um cromossomo diferem, aquela planta é heterozigota naquele locus.

0 termo "seqüência codificadora" refere-se a uma seqüência de polinucleotideo que codifica para uma seqüência de aminoácido especifica. "Seqüências regulatórias" referem-se a seqüências de nucleotideo localizadas acima (seqüências 5' não codificadoras), dentro, ou abaixo (seqüências 3' não codificadoras) de uma seqüência codificadora, e que influencia a transcrição, processamento ou estabilidade de RNA, ou tradução da seqüência codificadora associada. Seqüências regulatórias podem incluir, mas não estão limitadas a: promotores, seqüências lideres de tradução, introns, seqüências de reconhecimento de poliadenilação, sítios de processamento de RNA, sítios de ligação efetores e estruturas de haste- volta.

0 termo "promotor" refere-se a uma seqüência de DNA capaz de controlar a expressão de uma seqüência codificadora ou RNA funcional. A seqüência promotora consiste de elementos acima proximais ou mais ditais, os elementos tardios freqüentemente referenciados como "potenciadores". Portanto, um "potenciador" é uma seqüência de DNA que pode estimular atividade do promotor, e pode ser um elemento inato do promotor ou um elemento heterólogo inserido para potencializar o nível ou tecido- especificidade de um promotor. Promotores podem ser derivados na sua totalidade de um gene nativo, ou ser compostos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores encontrados na natureza, ou ainda compreender segmentos de DNA sintéticos. É entendido pelos especialistas na área que promotores diferentes podem dirigir a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos celulares, ou em estágios diferentes do de senvolvimento, ou em resposta a diferentes condições ambientais. É ainda reconhecido que desde que na maioria dos casos os limites das seqüências regulatórias não tenham sido completamente definidos, fragmentos de DNA de alguma variação podem ter atividade promotora idêntica. Promotores que possibilitam a um gene ser expresso na maioria dos tipos celulares na maioria das vezes são comumente referenciados como "promotores constitutivos". Novos promotores de vários tipos úteis em células vegetais estão constantemente sendo descobertos; numerosos exemplos podem ser encontrados na compilação de Okamuro & Goldberg (1989) Biochemistry of Plants 15:1-82.

0 termo "seqüência lider de tradução" refere-se a uma seqüência de polinucleotideo localizada entre a seqüência do promotor de um gene e a seqüência codif icadora. A seqüência lider de tradução está presente no mRNA totalmente processado acima da seqüência de inicio da tradução. A seqüência lider de tradução pode afetar o processamento do transcrito primário para mRNA, estabilidade do mRNA ou eficiência de tradução. Exemplos de seqüência líderes de tradução têm sido descritas (Turner & Foster (1995) Mol Biotechnol 3:225-236).

Os termos "seqüências 3' não codificadoras", "terminador de transcrição" ou "seqüências de terminação" referem-se a seqüências de DNA localizadas abaixo de uma seqüência codificadora e inclui seqüências de reconhecimento de poliadenilação e outras seqüências codificando sinais regulatórios capazes de afetar o processamento de mRNA ou expressão gênica. O sinal de poliadenilação é usualmente caracterizado por afetar a adição de tratos de ácido poliadenílico para a extremidade .3' do precursor do mRNA. O uso de diferentes seqüências 3' não codificadoras é exemplificado por Ingelbrecht et al. (1989) Plant Cell 1:671-680.

0 termo "transcrito de RNA" refere-se ao produto resultante da transcrição catalisada pela RNA polimerase de uma seqüência de DNA. Quando o transcrito de RNA é uma cópia complementar perfeita da seqüência de DNA, ele é referenciado como transcrito primário. Um transcrito de RNA é referido como RNA maduro quando ele é uma seqüência de RNA derivada de um processamento pós transcricional do transcrito primário. "RNA mensageiro" ou "mRNA" refere-se ao RNA que está sem íntrons e que pode ser traduzido em proteína pela célula. "cDNA" refere-se a um DNA que é complementar a, e sintetizado de, a mRNA molde usando a enzima transcriptase reversa. 0 cDNA pode ser de fita simples ou convertido na forma de fita dupla usando o fragmento Klenow da DNA polimerase I. RNA "senso" refere-se ao transcrito de RNA que inclui o mRNA e pode ser traduzido em proteína dentro de uma célula ou in vitro. "RNA antisenso" refere-se a um transcrito de RNA que é complementar ao todo ou parte de um transcrito primário alvo ou mRNA, e que bloqueia a expressão de um gene alvo (patente americana US 5.107.065). A complementariedade de um RNA antisenso pode ser com qualquer parte do transcrito gênico específico, i.e., na seqüência 5' não codificadora, seqüência 3' não codificadora, íntrons, ou a seqüência codificadora. "RNA funcional" refere-se ao RNA antisenso, RNA ribozima, ou outro RNA que não pode ser traduzido mas até o momento tem um efeito nos processos celulares. Os termos "complemento" e "complemento reverso" são usados de forma substituível aqui com relação aos transcritos de mRNA, e são meios para definir o RNA antisenso da mensagem.

0 termo "ligado operacionalmente" refere-se à associação de seqüências de ácido nucléico em um fragmento de ácido nucléico simples tanto que a função de uma é regulada pela outra. Por exemplo, um promotor é operacionalmente ligado com uma seqüência codificadora quando ele é capaz de regular a expressão daquela seqüência codificadora (i.e., a seqüência codificadora está sob controle transcricional do promotor). Seqüências codificadoras podem estar operacionalmente ligadas a seqüências regulatórias na orientação senso ou antisenso. Em outro exemplo, as regiões de RNA complementares da invenção podem estar operacionalmente ligadas, diretamente ou indiretamente cada, 5' para o mRNA alvo, ou 3'para mRNA alvo, ou dentro do RNAm alvo, ou uma primeira região complementar é 5' e seu complemento é 3' para o RNAm alvo.

DNA recombinante padrão e técnicas de clonagem molecular usadas aqui são bem conhecidas no estado da técnica e são descritas mais completamente em Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989). Métodos de transformação são bem conhecidos no estado da técnica para os especialistas na área e são descritos infra.

" PC R" ou "reação de polimerase em cadeia" é uma técnica para síntese de segmentos específicos de DNA e consiste de uma série de repetitivos ciclos de desnaturação, anelamento, e extensão. Tipicamente, um DNA de fita dupla é desnaturado por calor, os dois iniciadores complementares às extremidades 3' do segmento alvo são anelados a baixa temperatura, e então estendido em uma temperatura intermediária. Um grupo dessas três etapas consecutivas é referido como um "ciclo".

O termo "recombinante" refere-se a uma combinação artificial de dois segmentos separados de outra forma da seqüência, pex., através de síntese química ou através de manipulação de segmentos isolados de ácidos nucléicos através de técnicas de engenharia genética.

Os termos "plasmídeo", "vetor" e "cassete" referem-se a um elemento extra-cromossômico freqüentemente carregando genes que não são parte do metabolismo central da célula, e usualmente na forma de fragmentos de DNA de fita dupla circular. Tais elementos podem ser seqüências replicando autonomamente, seqüências integrando genomas, seqüências de nucleotideo ou fago, lineares ou circulares, de um DNA ou RNA simples ou fita dupla, derivadas de qualquer origem, onde um número de seqüências de nucleotideos tem sido unidas ou recombinadas dentro de uma única construção que é capaz de introduzir um fragmento de promotor e seqüência de DNA para um produto gênico selecionado adiante com seqüência 3' não traduzida apropriada dentro da célula. "Cassete de transformação" refere-se a um vetor especifico contendo um gene exógeno e tendo elementos em adição ao gene exógeno que facilitam a transformação de uma célula hospedeira particular. "Cassete de expressão" refere-se a um vetor especifico contendo um gene exógeno e tendo elementos em adição ao gene exógeno que permitem a expressão daquele gene em um hospedeiro exógeno.

Os termos "construção recombinante", "construção de expressão", "construção quimérica", "construção", e "construção de DNA recombinante" são usadas de forma substituivel aqui. Uma construção recombinante compreende uma combinação artificial de fragmentos de ácido nucléico, pex., seqüência regulatórias e codificadoras que não são encontradas juntas na natureza. Por exemplo, uma construção quimérica pode compreender seqüências regulatórias e seqüências codificadoras que são derivadas de diferentes origens, ou seqüências regulatórias e seqüências codificadoras derivadas da mesma origem, mas arranjadas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza. Tal construção pode ser usada sozinha ou pode ser usada em conjunto com um vetor. Se um vetor é utilizado, então a escolha do vetor é dependente do método que será usado para transformar as células hospedeiras como são bem conhecidos por especialistas na área. Por exemplo, um vetor plasmidial pode ser usado. Um especialista na área é bem informado dos elementos genéticos que devem estar presentes no vetor a fim de transformar com sucesso, selecionar e propagar as células hospedeiras compreendendo qualquer dos fragmentos de ácido nucléico isolados da invenção. O especialista na área também reconhecerá que diferentes eventos de transformação independentes podem resultar em diferentes níveis e padrões de expressão (Jones et al. (1985) EMBO J 4:2411-2418; De Almeida et al. (1989) Mol Gen Genet 218:78-86), e então que múltiplos eventos devem ser rastreados a fim de obter linhagens apresentando o nível de expressão e padrão desejado. Tal rastreamento pode ser acompanhado por análises de Southern de DNA, análises de Northern da expressão do mRNA, análises de immunoblotting da expressão de proteína, ou análises fenotípicas, entre outras.

O termo "expressão", como usado aqui, refere-se à produção de um produto final funcional (pex., um mRNA ou uma proteína, no precursor ou forma madura). O termo "introduzido" significa prover um ácido nucléico (pex., construção de expressão) ou proteína dentro de uma célula. Introduzido faz referência à incorporação de um ácido nucléico dentro de uma célula eucariota ou procariota onde o ácido nucléico pode ser incorporado dentro do genoma da célula, e faz referência à provisão transiente de um ácido nucléico ou proteína na célula. Introduzido faz referência a métodos de transformação transientes ou estáveis, bem como cruzamento sexual. Então, "introduzido" no contexto de inserir um fragmento de ácido nucléico {pex. , uma construção de DNA recombinante/construção de expressão) em uma célula, significa "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e faz referência à incorporação de um fragmento de ácido nucléico em uma célula eucariota ou procariota onde o fragmento de ácido nucléico pode ser incorporado dentro do genoma da célula (pex., cromossomo, plasmídeo, plastídio ou DNA mitocondrial), convertido em um replicon autônomo, ou expresso transientemente (pex.,mRNA transfectado).

0 termo proteína "madura" refere-se a um polipeptídeo processado pós transcricionalmente (i.e., a partir dos quais qualquer pré ou pró peptídeos presentes no produto primário de tradução tenha sido removido). Proteína "precursora" refere-se a um produto primário de tradução de mRNA (i.e., com pré e pró peptídeos ainda presentes). Pré e pró peptídeos podem ser, mas não estão limitados a, sinais de localização intracelulares. O termo "transformação estável" refere-se a transferência de um fragmento de ácido nucléico para dentro do genoma de um organismo hospedeiro, incluindo ambos os genomas nuclear e de organelas, resultando em uma herança estável geneticamente. Em contraste, "transformação transiente" refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucléico para dentro do núcleo, ou uma organela contendo DNA, de um organismo hospedeiro resultando em expressão gênica sem integração ou herança estável. Organismos hospedeiros contendo os fragmentos de ácido nucléico transformado são referenciados como organismos "transgênicos".

0 termo "transgênico" refere-se a uma planta ou uma célula, que compreende dentro de seu genoma um polinucleotideo heterólogo. Preferencialmente, o polinucleotideo heterólogo é estavelmente integrado dentro do genoma de tal modo que o polinucleotideo é transferido para gerações sucessivas. 0 polinucleotideo heterólogo pode ser integrado dent ro do genoma sozinho ou como parte de uma construção de expressão. Transgênico é usado aqui para incluir qualquer célula, linhagem celular, calo, tecido, parte de planta ou planta, onde o genótipo do mesmo tenha sido alterado pela presença de ácidos nucléicos heterólogos incluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados bem como aqueles criados através de cruzamento sexual ou propagação assexuada transgênica inicial. O termo "transgênico" como usado aqui não engloba a alteração do genoma (cromossômico ou extra cromossômico) através de métodos convencionais de melhoramento genético de planta ou através de eventos ocorrendo naturalmente tais como fertilização cruzada ao acaso, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante, ou mutação espontânea.

0 termo "planta" refere-se a plantas inteiras, órgãos vegetais, tecidos vegetais, sementes, células vegetais, sementes e progênies das mesmas. Células vegetais incluem, sem limitação, células de sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos. Partes de planta incluem tecidos diferenciados e não diferenciados incluindo, mas não limitado aos seguintes: raízes, caules, brotos, folhas, pólen, sementes, tecido tumoral e várias formas de células e culturas (pex., células simples, protoplastos, embriões e tecido de calo) .0 tecido vegetal pode estar na planta ou em um órgão vegetal, tecido ou cultura celular. 0 termo "órgão vegetal" refere- se ao tecido vegetal ou a um grupo de tecidos que constituem uma parte de uma planta distinta morfologicamente e funcionalmente. 0 termo "genoma" refere- se ao seguinte: (1) o complemento inteiro do material genético (genes e seqüências não codificadoras) que está presente em cada célula de um organismo, ou vírus ou organela; e/ou (2) um grupo completo de cromossomos herdados como uma unidade (haplóide) de um parental. "Progênie" compreende qualquer geração subseqüente de uma planta. A presente invenção diz respeito a um minicromossomo artificial de uma planta compreendendo um centrômero funcional contendo: (a) pelo menos dois arranjos de repetições em tandem de CentC em uma orientação invertida onde o primeiro arranjo compreende pelo menos 50 cópias de CentC e o segundo arranjo compreende pelo menos 50 cópias de CentC; e, (b) pelo menos uma cópia de um elemento retrotransponivel, onde o elemento retrotransponivel está situado entre o primeiro e o segundo arranjo. Preferencialmente, o elemento retrotransponivel é selecionado do grupo consistindo de CentA, CRMl, e CRM2.

O cromossomo artificial compreende um centrômero funcional tendo arranjos de repetições em tandem de CentC. Cada arranjo de repetições CentC pode compreender pelo menos 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 150, 160, .180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, .400, 450, ou 500 cópias de CentC. Além do mais, cada arranjo de repetições em tandem de CentC pode ser interrompido por outro elemento seqüência, incluindo mas não limitado a retrotransposon, que é inserido entre cópias de CentC, ou dentro de um elemento CentC, ou dentro de um retrotransposon, ou qualquer outro elemento de seqüência no arranjo. Retrotransposons incluem, mas não estão limitados a, CentA, CRMl, CRM2.

Na maioria dos eucariotos o centrômero, que é o sitio para formação do cinetócoro e fuso fixado nos cromossomos, é embebido na heterocromatina. Cromossomos de S. cerevisiae carecem de seqüências satélites e têm pequenos centrômeros precisamente localizados que especificam fixação do fuso com -125 bp de DNA (Blackburn & Szostak (1984) Ann Rev Biochem 53:163-194).

No entanto, centrômeros de outras linhagens de fungo incluem arranjos de repetições mais similares para aqueles encontrados em plantas e animais (Fishel et al. (1988) Mol Cell Biol 8:754-763). Em eucariotos desenvolvidos, estudos citológicos e bioquímicos demonstraram uma associação física entre DNAs satélites repetidos tandemicamente, regiões de centrômeros, e proteínas específicas associadas centrômero (Henikoff et al. (2001) Science 293:1098-1102; Yu & Dawe (2000) J Cell Biol 151:131-142).

Apesar da ausência dos motivos de seqüência universais, a maioria das repetições satélites centroméricas tem notavelmente comprimento de unidade similar entre organismos, por exemplo, a unidade satélite básica é 171 bp em primatas, 186 bp no peixe Sparus aurata, e 155 bp no inseto Chironomus pallidivittatus (Henikoff et al. (2001) Science 293:1098-1102).

Centrômeros vegetais possuem repetições de comprimento de unidade similares, por exemplo, repetições de 156 bp em milho (Ananiev et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA .95:13073-13078), repetições de 168 bp em arroz (Dong et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:8135-814 0), e repetições de 180 bp em Arabidopsis (Copenhaver (2003) Chromosome Res .11:255-262). Em Arabidopsis, centrômeros contém tipicamente .2.8-4 Mb tratos de repetições em tandem 178 bp de seqüências satélites (Hall et al. (2004) Curr Opin Plant Biol 7:108-114). Em milho, um centrômero de cromossomo B supranumerário totalmente funcional contém cerca de 500 kb de repetições em tandem, onde deleções parciais reduzem transmissão (Alfenito & Birchler (1993) Genetics 135:589- .597). Extensões de cromossomo de milho contendo o cromossomo B supranumerário foram hibridizadas com sondas de vários elementos repetitivos incluindo CentC, C RM, e CentA, que localizaram as regiões centroméricas nos cromossomos A. Esses elementos repetitivos,

predominantemente encontrados próximos aos centrômeros do cromossomo A, hibridizaram com muitos sitios distintos do centrômero no cromossomo B (Lamb et al. (2005) Chromosoma .113:337-349).

Pelo menos dois exemplos divergiram da regra geral da formação do centrômero na base do DNA satélite centromérico. Primeiro, o funcionamento aparentemente normal dos centrômeros estranhos em híbridos somáticos ou em introgressão de linhagens cevada-milho (Ananiev et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:13073-13078) é indicativo da conservação da função do centrômero e correspondentes complexos de proteínas. Todas as proteínas centroméricas que auxiliam a função de um centrômero estranho compreendendo DNA satélite centromérico não relacionado são aparentemente providas pelo hospedeiro (Jin et al. (2004) Plant Cell 16:571-81). Segundo, neocentrômeros são uma nova classe de centrômeros baseados em DNA não repetitivo recentemente descritos em humanos e Drosophila (Williams (1998) Nat Genet 18:30-37; Choo (1997) Am J Hum Genet .61:1225-1233). Encontrados como derivativos de cromossomos normais resultantes de múltiplos rearranjos cromossômicos, neocentrômeros são formados em regiões aparentemente de DNA eucromáticas livres das repetições tipicamente associadas com a função do centrômero. Cromossomos com neocentrômeros tem estabilidade mitótica ou meiótica variável.

A natureza e o funcionamento do centrômero ainda não estão completamente entendidas e requerem análises adicionais. Até o momento, a maioria dos cromossomos artificiais têm centrômeros funcionais baseados dos DNAs satélites centroméricos nativos. É possível que repetições knob, tais como 180 bp e 350 bp (TRI) , possam ser usadas como um componente de um neocentrômero. Foi mostrado que alguns knobs poderiam adquirir função de centrômero em cromossomos de milho meióticos, esses neocentrômeros compreendiam 180 bp e 350 bp repetições em tandem apenas. 0 estudo de neocentrômeros em humanos e organismos menores, têm desvendado um fenômeno insuspeito a respeito da natureza dinâmica do DNA centromérico (Choo et al. (1997) Am J Hum Genet. 61:1225-33). No centro desse fenômeno, não parece haver requerimento de seqüência de DNA específica para função do centrômero; além disso, uma variedade de seqüências que podem responder a uma influência epigenética apropriada parece prover essa função. Extensivas caracterizações de seqüências de centrômero vieram de estudos em leveduras, por exemplo S. cerevisaie e S. pombe, e têm definido elementos e organização de centrômero em levedura funcionais. Por exemplo, em centrômeros de S. cerevisaie a estrutura e função das três regiões essenciais, CDEI, CDEII, e CDEIII, totalizando apenas 125 bp, ou 0.006 - 0.06% de cada cromossomo foram descritas (Carbon et al. (1990) New Biologist 2:10-19; Bloom (1993) Cell 73:621-624).

Centrômeros de S. pombe estão entre 40-100 kb e consistem de elementos repetitivos que compreendem 1-3% de cada cromossomo (Baum et al. (1994) Mol Cell Biol 5:747- .7 61) . Estudos subseqüentes demonstraram que menos do que .1/3 do centrômero de S. pombe nativo é suficiente para a função do centrômero (Baum et al. (1994) Mol Cell Biol .5:747-761). Em S. pombe, foi mostrado que uma região repetida invertida foi essencial para a função centromérica, mas nem o núcleo central nem o braço da repetição invertida sozinha conferiram função. Deleção de uma porção de seqüências repetidas que flanqueiam o núcleo central não tiveram efeito nas funções de segregação mitótica, ou segregação meiótica de um minicromossomo para a progênie haplóide, mas drasticamente prejudicada a manutenção mediada pelo centrômero de cromátides irmãs de homólogos pareando na meiose I. Existe variabilidade significante entre cada um dos três cromossomos diferentes em S. pombe, e o centrômero de qualquer cromossomo particular pode conter variabilidade significante através de diferentes linhagens de S. pombe. No entanto, o motivo estrutural de DNA básico, nominalmente, as repetições invertidas, é um parâmetro comum do centrômero de S. pombe (Clarke et al. (1993) Cold Spring Harb Symp Quant Biol .58:687-695) .

Centrômeros de eucariotos desenvolvidos são menos caracterizados. Fragmentos de DNA que hibridizam com regiões centroméricas em eucariotos desenvolvidos têm sido identificados, entretanto geralmente pouco é conhecido sobre a estrutura, organização, e/ou funcionalidade dessas seqüências. No entanto, arroz é uma exceção por causa de seus tamanhos de centrômeros diferentes. Embora alguns cromossomos de arroz tenham centrômeros similares em tamanho àqueles em outras espécies (>1 Mb) , os centrômeros de vários cromossomos são surpreendentemente pequenos e podem estar totalmente cobertos pelos contigs BAC construídos usando técnicas padrões. Seqüenciamento completo do centrômero e arroz 4 e 8 revelaram a presença de blocos invertidos de repetições em tandem centroméricas dentro do segmento cromossômico considerado o centrômero, similar à estrutura repetida invertida observada em leveduras (Zhang et al. (2004) Nucl Acids Res 32:2023-2030; Wu et al. (2004) Plant Cell 16:967-976).

Em muitos casos sondas para repetições em centrômero correlacionam com localização no centrômero ambos citologicamente e geneticamente, com muitas dessas seqüências presentes como elementos satélite repetidos em tandem e seqüências repetidas dispersas em arranjos de variando de 300 - 5000 kb em comprimento (Willard (1990) Trends Genet 6:410-416). Hibridização in situ tem mostrado que a repetição satélite alfóide de 171 bp está presente em cada centrômero humano (Tyler-Smith et al. (1993) Curr Biol .390-397) . Se essas repetições constituem centrômeros funcionais não está ainda determinado, e parece que outro DNA genômico é necessário para conferir hereditariedade ao DNA. Transfecção de linhagens celulares com satélites alfóides produziu novos cromossomos, no entanto esses novos cromossomos também contém DNA hospedeiro, que poderiam contribuir para atividade do centrômero (Haaf et al. (1992) Cell 70:681-696; Willard (1997) Nat Genet 15:345-354). Adicionalmente, os novos cromossomos podem mostrar DNA alfóide distribuídos ao longo de seu comprimento total tendo apenas uma constricção centromérica, indicando que um bloco de DNA alfóide pode ser insuficiente para conferir função de centrômero.

Caracterização genética de centrômeros de plantas tem usado análises de segregação de fragmentos de cromossomo, incluindo análises de linhagens trissômicas carregando um fragmento telocêntrico marcado geneticamente (pex., Koornneef (1983) Genetica 62:33-40). Elementos repetitivos de centrômero de planta que são geneticamente (Richards et al. (1991)) ou fisicamente (Alfenito et al. (1993) Genetics .135:589-597; Maluszynska et al. (1991) Plant J 1:159-166) ligados a um centrômero têm sido identificados, no entanto a importância dessas seqüências em relação à função do centrômero não tem sido totalmente caracterizada funcionalmente.

Estudos citológicos em Arabidopsis thaliana têm correlacionado estrutura de centrômero com seqüências repetidas. Marcações com um agente de ligação ao DNA fluorescente não especifico, tal como 4' , 6-diamidino-2- fenilindole (DAPI), permite visualização de domínios de cromatina centroméricas em cromossomos na metáfase. Uma hibridização fluorescente in situ (FISH) marca para seqüências repetidas de 180 bp pALI co-localizadas com a assinatura DAPI próxima aos centrômeros de todos os cinco cromossomos de Arabidopsis (Maluszynska et al. (1991) Plant J 1:159-166; Martinez-Zapater et al. (1986) Mol Gen Genet .204:417-423). Um papel funcional para pALI foi proposto, no entanto estudos mais recentes não têm detectado esta seqüência próxima aos centrômeros de espécies intimamente relacionadas a Arabidopsis (Maluszynska et al. (1993) Ann Botany 71:479-484). Uma espécie testada, A. pumila acredita-se ser um afidiplóide derivado de um cruzamento de A. thaliana com outro parente próximo (Maluszynska et al. (1991) Plant J 1:159-166; Price et al. (1995) in Arabidopsis, Somerville & Meyerowitz (eds) Cold Spring Harbor Press, NY). Outras seqüência repetitiva, pAtl2, mapeia geneticamente para dentro de 5cM do centrômero do cromossomo 1, e a região central do cromossomo 5 (Richards et al. (1991) Nucl Acids Res 19:3351-3357), mas seu papel na função do centrômero continua a ser estabelecida. Regiões centroméricas vegetais são compostas predominantemente de repetições cetroméricas especificas, retrotransposons centroméricos, e um pouco de outros elementos repetitivos que são mais dispersos ao longo do genoma da planta. Por exemplo, repetições centroméricas tais como CentO e CRR são conhecidas de arroz. Quatro elementos repetitivos de centrômero têm sido descritos em milho: CentA, CentC, CRM1, e CRM2 (SEQ ID NOS: 1-4). Em milho, o primeiro elemento especifico de centrômero repetido em tandem descoberto foi CentC (Ananiev et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:13073-13078). CentC forma múltiplos arranjos em tandem de comprimento variável, com alguns arranjos em tandem compreendendo até mil cópias de repetição CentC. A repetição em tandem CentC interage com a proteína CENH3 no nucleossoma centromérico.

O elemento específico de centrômero de milho, CentA, parece ser um retrotransposon baseado na sua estrutura e propriedades (Ananiev et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA .95:13073-13078; GenBank AF078917). Outro retrotransposon específico de centrômero altamente conservado de milho, CRM2, foi encontrado em 2003 (Nagaki et al. (2003) Genetics .163:759-770; GenBank AY129008). Um quarto retrotransposon específico de centrômero, CRMl (SEQ ID NO: 3), foi identificado at ravés de análises comparativas de seqüências de DNA publicadas de dois clones BAC centroméricos de milho (Nagaki et al. (2003) Genetics 163:759-770) e seqüências de DNA genômico proprietárias de milho (Ananiev (2005) não publicado). Alguma homologia pode ser detectada entre os elementos repetidos centroméricos das espécies proximamente relacionadas, tais como sorgo e cana-de-açúcar (Miller et al. (1998) Genetics 150:1615-1623; Nagaki et al. (1998) Chromosome Res 6:295-302; Zwick et al. (2000) Am J Bot .87:1757-1764); e milho e arroz (Ananiev et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:13073-13078); Cheng et al. (2002) Plant Cell 14:1691-17 04).

Em adição, centrômeros de planta contém abundantes retrotransposons (CR), em cereais muitos dos elementos CR se inserem dentro de um ciado filogenético altamente conservado de elementos Ty3/gypsy (Miller et al. (1998) Theor Appl Genet 96:832-839; Presting et al. (1998) Plant J .16: 721-728; Langdon et al. (2000) Genetics 156:313-325). A homologia de DNA é suficiente para que sondas CR de sorgo ou Brachypodium sylvaticum identifiquem centrômeros na maioria ou todos os cromossomos em cereais significantes agronomicamente tais como arroz, milho, trigo, sorgo, cevada e centeio (Aragon-Alcaide et al. (1996) Chromosoma .105:261-268; Jiang et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA .93:14210-14213; Miller et al. (1998) Theor Appl Genet .96:832-839) .

Retrotransposons, também conhecidos como elementos transponiveis de classe I, consistem de dois subtipos, a repetição terminal longa (LTR) e os retrotransposons não- LTR. Os subtipos de repetição terminal longa tem LTRs diretas que variam de -100 bp a acima de 5 kb em tamanho. Retrotransposons LTR são ainda classificados dentro dos grupos Tyl-copia-like (Pseudoviridae) e Ty3-gypsy-like (Metaviridae) baseados em ambos os graus de similaridade de seqüência e ordem de produtos gênicos codificados. Os grupos Tyl-copia e Ty3-gypsy de retrotransposons são comumente encontrados em alto número de cópias (até poucos milhões de cópias por núcleo haplóide) em plantas com grandes genomas. 0 retrotransposons Tyl-copia são abundantes em espécies variando de algas de célula simples a briófitas, gimnospermas, e angiospermas. Retrotransposons Ty3-gypsy são também amplamente distribuídos, incluindo ambas gimnospermas e angiospermas. Retrotransposons LTR perfaz em aproximadamente 8% do genoma humano. Retrotransposons não-LTR consistem de dois subtipos, elementos nucleares intercalados longos (LINEs) e elementos nucleares intercalados curtos (SINEs). Eles também podem ser encontrados em altos números de cópias (até 250,000) em espécies vegetais. Transposons de planta, incluindo retrotransposons, são revisados por Feschotte et al. (2002) Nat Rev Genet 3:329-341. Retrotransposons de planta são revisados por Kumar & Bennetzen (1999) Ann Rev Genet .33:479-532.

Retrotransposons centroméricos são identificáveis baseados na classificação unificada de elementos transcrição-reversa usada para estudos de filogenia e taxonomia. Retroelementos completos e retrovírus incluem duas ou mais fases abertas de leitura (ORFs) que codificam proteínas simples ou poliproteínas. A ordem dos genes nos elementos varia, mas são classificadas com base no alinhamento de aminoácidos e resíduos chaves conservados ou domínios dentro da transcriptase reversa (RT), RNase H 15 (RH), integrase (INT) e genes da protease aspártica (PR) e em um domínio tipo zinc-finger da cisteína-histidina conservada (CH). Os retroelementos também compreendem seqüências de repetições terminais longas (LTR) que flanqueiam a região interna do retroelemento. Cada família de retrotransposons tem diferentes, LTRs hibridizando não- cruzados, e componentes dentro de uma família que pode variar (0-50%) nas suas seqüências LTR. No processo de transposição, os dois LTRs são usualmente idênticos no momento da inserção, mas com o passar do tempo substituições podem causar divergência de seqüência. Muitos retroelementos são conhecidos, incluindo retrotransposons específicos de centrômeros (ver, por exemplo, SanMiguel et al. (1998) Nat Genet 20:43-45; Turcotte et al. (2001) Plant J 25:169-179; Feng et al. (2002) Nature 420:316; Nagaki et al. (2004) Nat Genet 36:138; Nagaki et al. (2003) Genetics .163:750-770: Wu et al. (2004) Plant Cell 16:967-976; Hansen & Haslop-Harrison (2004) Adv Bot Res 41:165-193).

Existe variação significativa entre centrômeros de diferentes cromossomos de milho com relação ao seu tamanho relativo e a composição da repetição. Clusters CentC de milho podem ser tão pequenos quanto cerca de 100 kb, ou mais do que cerca de 2000 kb em diferentes cromossomos, mas comumente na variação de cerca de 200 kb a cerca de 300 kb. Dado o intervalo de tamanho pequeno, é possível que uma porção central inteira da região centromérica de milho possam ser encontrada dentro de um simples clone BAC. 0 polimorfismo estrutural observado sugere que um centrômero de milho é composto de blocos funcionais redundantes, cada um dos quais pode ser capaz de suportar função de centrômero. Uma variação significante (pelo menos 10 vezes) no tamanho de centrômeros como definido pelo comprimento e/ou número de cópia das repetições em tandem centroméricas CentC é observada entre os diferentes cromossomos de milho. Existe também uma variação significante no tamanho do centrômero entre cromossomos homólogos de diferentes inbreds.

Em outro aspecto, o minicromossomo artificial de planta da invenção pode compreender pelo menos um telômero funcional.

Telômeros são caps de nucleoproteina na extremidade dos cromossomos eucarióticos lineares essenciais para a manutenção da extremidade cromossômico. A síntese de DNA do tel ômero é feita pela telomerase, uma ribonucleoproteína com atividade transcriptase reversa (McKnight et al. (2002) Plant Mol Biol 48:331-337). A telomerase adiciona DNA telomérico colocado na extremidade 3' dos cromossomos através da cópia de uma seqüência molde curta dentro de sua subunidade de RNA. Os telômeros da maioria dos organismos consistem de seqüências curtas altamente conservadas repetidas assimetricamente.

Muitas seqüências repetidas teloméricas são conhecidas, incluindo CCCCAA (C4A2, Tetrahymena & Paramecium); C4A4 (Oxytricha & Euplotes); C3TA (Trypanosoma, Leishmaniaf & Physa rum) ; C]__3A (Saccharomyces); C1-8T {Dictyostelium); e C3TA3 (Arabidopsis, humano, rato, Caenrhabditis). 0 número de repetições observado em cromossomos nativos varia amplamente entre os organismos, pex. Alguns ciliados têm cerca de 50 repetições, menos que 350 repetições tem sido observado em Arabidopsis, e repetições totalizando cerca de .300-500 bp observadas em Saccharomyces.

O comprimento do telômero em plantas, que tipicamente varia de cerca de 2-75 kb, é controlado por fatores genéticos e de desenvolvimento. Regiões teloméricas têm sido isoladas de Arabidopsis, e mostram repetições em tandem heterogêneas em tamanho (Richards & Ausubel (1988) Cell 53:127-136). Uma diferença de 25 vezes nos comprimentos de telômeros entre linhagens puras de milho foi encontrada, variando menos do que 2 kb para a linhagem WF9 para cerca de 40 kb para a linhagem CM37 (Burr et al. (1992) Plant Cell 4:953-960). Mais próximo em direção ao centrômero, a repetição telomérica canônica é freqüentemente encontrada misturada com outros elementos repetitivos do genoma vegetal. Em contraste, Drosophila usa transposons nas extremidades de seus cromossomos. Os transposons, elementos HeT-A e TART, são encontrados em múltiplas cópias na extremidade de cada cromossomo. Gradual encurtamento dos telômeros pode ser invertido através de transposição de novas repetições de transposons nas extremidades. Similar à manutenção do telômero pela telomerase, o modelo de transposição em Drosophila invoca um mecanismo usando uma transposição intermediária de RNA que é convertida em extremidade de DNA pela transcriptase reversa.

Replicação de DNA é o processo pelo qual células fazem uma cópia completa de sua informação genética antes da divisão celular. Em E. coli, viroses de mamíferos, e S. cerevisiae, a iniciação de replicação de DNA é controlada pelas conduções de proteínas de iniciação que interagem com seqüências replicadoras de DNA agindo em eis. Para S. cerevisiae, replicadores englobam 100-200 bp e incluem os grandes sítios de origem de replicação onde a síntese de DNA inicia. Esses replicadores contêm uma seqüência replicadora autônoma conservada de Ilbp (ARS) que liga o complexo de reconhecimento de origem (ORC) à formação nucleada de complexos de pré-replicação (Gilbert (2001) Science 294:96-100).

Em eucariotos desenvolvidos a replicação de DNA pode ser iniciada simultaneamente em centenas ou milhares de sítios cromossômicos. Seqüências de origem definidas não são requeridas, muitas origens de replicação potenciais existem consistindo de amplas zonas de sítios de iniciação espaçados próximos, alguns dos quais podem ser usados mais freqüentemente.

No entanto, diversas origens de replicação eucarióticas especificas são conhecidas tais como a origem de replicação para 18S-26S rDNA que está localizada em um espaçador não transcrito (Ivessa & Zakian (2002) Genes Dev .16:2459-2464). Esta região é capaz de promover amplificação de construções transgênicos (Hemann et al. (1994) DNA Cell Biol 13:437-445). Outra origem especifica é encontrada na região abaixo do gene dihidrofolato redutase (DHFR) em células de ovário do hamster chinês (CHO) (Altman & Fanning (2001) Mol Cell Biol 21:1098-1110). Sítios preferenciais de iniciação de replicação foram também encontrados no segmento do cromossomo de Drosophila contendo genes córion (Levine & Spradling (1985) Chromosoma 92:136-142).

A maquinaria de replicação de células vegetais e animais é provavelmente capaz de replicar qualquer tipo de DNA introgredido, incluinda construçãos integrados, epissomas, cromossomos inteiros, ou seus fragmentos (Gilbert (2001) Science 294:96-100).

Minicromossomos artificiais são moléculas de DNA lineares ou circulares construídas de elementos de seqüências de DNA agindo em eis responsáveis pela correta replicação e divisão dos cromossomos para as células filha. Os elementos agindo em eis incluem: origens de replicação (ori), os sítios para iniciação de replicação de DNA, também conhecidos como seqüências de replicação autônomas (ARS); centrômeros, os sítios de cinetócoros montados para a correta segregação dos cromossomos replicados na mitose e meiose; e telômeros, estruturas repetidas de DNA especializadas que estabilizam a extremidade cromossomos lineares e facilitam a completa replicação das extremidades do cromossomo.

Diversas estratégias para produzir minicromossomos eucarióticos estão disponíveis, incluindo, mas não estando limitado uma auto-montagem in vivo de um minicromossomo de elementos componentes pela maquinaria de manutenção cromossômica celular endógena em célula eucariótica, montagem de um minicromossomo eucariótico de elementos componentes em uma célula procariótica, e montagem in vitro de um minicromossomo eucariótico de elementos componentes.

Minicromossomos artificiais foram primeiramente construídos em Saccharomyces cerevisiae (Murray et al. (1986) Mol Cell Biol 6:3166-3172; Blackburn & Szostak (1984) Ann Rev Biochem 53:163-194). Um plasmídeo circular compreendendo o centrômero de levedura de 125 bp, uma origem de replicação, um marcador de seleção, e um arranjo palindrômico de dois trechos de DNA telomérico foi montado através de técnicas de DNA recombinante convencionais e introduzido dentro de leveduras por transformação de esferoplasto onde ele resultou em uma molécula linear simples. Construções lineares de 50 kb em comprimento contendo um centrômero, uma origem de replicação, e dois telômeros replicados e segregados na mitose com -99% de exatidão, e retido em culturas em divisão por pelo menos 20 gerações. A geração de YACs indicaram o potencial para montar cromossomos artificiais em outros eucariotos tais como plantas e animais. Experimentos em YACs indicaram que três seqüencias de DNA agindo em eis são necessárias para construir um cromossomo artificial: telômeros; origens (s) de replicação; e um centrômero.

Cromossomos artificiais de animais têm sido gerados por duas abordagens diferentes: geração de cromossomos de novo de segmentos de DNA clonados; ou através de fragmentação e rearranjos de um cromossomo natural (Brown et al. (2000) Trends Biotechnol 18:402-403; Cooke (2001) Cloning Stem Cells 3:243-249; Lipps et al. (20030 Gene .304:23-33). A abordagem de novo, refere-se à montagem ou abordagem bottom-up, que gera cromossomos artificiais através da combinação de componentes clonados essenciais. Co-transfecção de uma mistura de DNA alfóide humano, telômeros, DNA genômico humano, e um marcador de seleção em células HTl080 resultaram na formação de minicromossomos (Harrington et al. (1997) Nat Genet 15:345-355).

Caracterização dos minicromossomos revelaram que eles todos têm estruturas citogenéticas complexas, e foram estavelmente mantidas na ausência de qualquer seleção. Foi concluído que os minicromosomos e seus centrômeros foram formados de novo de entradas de DNA através de rearranjos complexos. Subseqüentemente, outros grupos também usaram células HT1080 para introduzir construções de DNA circulares ou lineares contendo DNA alfóide humano e telômeros clonados em YACs, PACs, ou BACs (Compton et al. (1999) Nucleic Acids Res 27:1762-1765; Grimes et al. (2001) EMBO Rep 2:910-914). Minicromossomos foram observados com diferentes freqüências e mostraram diferentes estabilidades mitóticas. Todos os minicromossomos produzidos foram significantemente maiores do que os construções originais, variando de 5 a 10 Mb. Portanto, um cromossomo de mamífero totalmente funcional poderia ser gerado começando com DNA clonado servindo como uma espinha dorsal para a abordagem de novo.

Fragmentação e rearranjo de cromossomos naturais retendo regiões centroméricas e teloméricas é uma outra estratégia para a produção de minicromossomo. Pequenos fragmentos cromossômicos podem ser isolados através de campo de pulso de gel de eletroforese, readaptado com genes desejáveis, e reintroduzidos dentro de célula hospedeira. Minicromossomos fragmentados foram observados em células cancerígenas, e outros tipos celulares depois da irradiação, no entanto os fragmentos foram muito grandes para isolamento e não existia nenhuma forma de controlar a composição gênica.

Uma abordagem para controlar a redução do tamanho do cromossomo foi baseada em telômero associado à fragmentação cromossômica (TACF) ou truncação direcionado à telômero (TDT) (Heller et ai. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93:7125- .7130; Shen et al. (1997) Hum Mol Genet 6:1375-1382). Ela envolve fragmentação sucessiva dos cromossomos hospedeiros humanos específicos em minicromossomos menores usando um vetor alvo englobando um segmento de telômero terminal, um marcador de seleção, e às vezes uma região de homologia ao cromossomo alvo. Os ^inicromossomos engenheirados' resultantes permanecem autônomos e segregam normalmente. Minicromossomos tão pequenos quanto O.5 Mb têm sido gerados contendo DNA alfóide como a seqüência centromérica funcional em humanos, linhagens híbridas celulares somáticas hamster-humanos, ou células de galinhas.

Recentemente, cromossomos artificiais humanos foram usados para criar bezerros clonados transcromossômicos produzindo imunoglobulina humana. Um vetor de minicromossomo humano (HAC) construído por Cre/loxP translocações cromossômicas mediados e truncações cromossômicas telômero-direcionadas em células DT40 de galinha proficientes em recombinação homóloga foi introduzido para fibroblastos fetais primários bovinos através de transferência cromossômica microcélula mediada (MMCT). Núcleos isolados de fibroblastos fetais com HAC foram transferidos para oócitos maduros enucleados para produzir bezerros clonados (Kuroiwa et al. (2002) Nat Biotechnol 20:889-894). Uma abordagem in vivo para geração de cromossomos artificiais tem sido desenvolvida, baseada na indução de mecanismos de amplificação em larga escala intrínsecos de células de mamíferos. Integração direcionada de DNA satélite centromérico e o espaçador não transcrito do rDNA em um cromossomo específico resultou em uma amplificação em larga escala de regiões centroméricas. Esses cromossomos amplificados se tornaram instáveis e passaram por rearranjos significantes produzindo minicromossomos estáveis preferencialmente compostos de DNA satélite (Kereso et al. (1996) Chromosome Res 4:226-239; Hadlaczky (2001) Curr Opin Mol Ther 3:125-132).

Um cromossomo artificial contendo múltiplos sítios aceptor de recombinação específico de seqüência foi desenvolvido (plataforma ACE). Seqüências de interesse são providas em um vetor alvo, e a enzima lambda integrase usada para catalisar a recombinação entre a plataforma ACE e o vetor alvo.

Processos similares têm sido observados em plantas. Fragmentação espontânea de cromossomos nativos em plantas tem sido observada. Minicromossomos foram descobertos em Arabidopsis (Murata et al. (2006) Chromosoma, publicado online em 11 de abril de 2006), e milho (Brock & Pryor (1996) Chromosoma 104:575-584; Kato et al. (2005) Cytogenet Genome Res 109:156-165). Em alguns casos, minicromossomos foram induzidos por radiação ionizante (Riera-Lizarazu et al. (2000) Genetics 156:327-339).

Um mapa físico do centrômero de arroz 5 tem sido construído, e poderia ser usado para criar um cromossomo de arroz artificial (Nonomura & Kurata (2001) Chromosoma .110:284-291). Uma abordagem similar foi proposta para a construção de um cromossomo artificial para beterraba, Beta procumbens (Gindullis et al. (2001) Genome 44:846-855). Concatemerização de construções transgênicos, ligações, e rearranjos podem ser encontrados em eventos de transformação de planta. Transformação de planta em geral com construções padrões pode produzir rearranjos complexos, concatemerização, e amplificação da construção (Svitashev & Somers (2001) Genome 44:691-697; Svitashev et al. (2002) Plant J 32:443-445). Co-transformação de plantas com plasmideos múltiplos pode produzir Ioci transgênico contendo combinações dos diferentes transgenes (Wu et al. (2002) Transgenic Res 11:533-541). Similar aos estudos em células animais, montagem c/e novo de minicromossomos artificiais via concatemerização espontânea e ligação de componentes pode ocorrer em células vegetais (ver Figuras .1-10, e 14-15).

A presente invenção diz respeito a um minicromossomo artificial de planta compreendendo um centrômero funcional, onde o centrômero se liga especificamente à proteína C centromérica.

Cinetócoros ligam o DNA centromérico ao aparato das fibras do fuso. Autoanticorpos humanos que ligam especificamente próximos facilitaram clonagem de proteínas associadas a centrômeros (CENPs, Rattner (1991) Bioassays .13:51-56). Pelo menos uma dessas proteínas pertence à superfamília cinesina de motores de microtúbulos (Yen (1991) EMBO J 10:1245-1254). Proteínas de leveduras que se ligam a centrômeros têm sido identificadas através de estudos genéticos e bioquímicos (Bloom (1993) Cell 73:621- .624; Lechner et al. (1991) Cell 64:717-725). CENH3 é uma proteína altamente conservada que substitui a histona H3 em centrômeros, é considerada para recrutar outras proteínas requeridas para o movimento dos cromossomos. CENH3 está presente inteiramente no ciclo celular e co-localiza com a proteína C centromérica do cinetócoro (CENPC) em células meióticas.

Anticorpos específicos às proteínas associadas a centrômero podem ser usados para confirmar montagem do centrômero em uma construção de DNA e/ou minicromossomo. Imunolocalização de um CENP, tal como CENH3 e/ou CENPC, para o centrômero de um minicromossomo indica a formação de um centrômero funcional compreendida de elementos de DNA centromérico e as proteínas de ligação associadas. Antisoro para histona centromérica de milho H3 (CENH3, 17kD) foi feito e testado em cromossomos de milho nativos (Zhong et al. (2002) Plant Cell 14:2825-2836). Imunoprecipitação de cromatina demonstrou que a CentC e CRM2 interagem especificamente com CENH3. Aproximadamente 38 e 33% de CentC e CRM2 foram precipitados no ensaio de imunoprecipitação da cromatina, confirmando que muito de CENH3 co-localiza com CentC. Um homólogo de milho de CENPC de mamífero foi isolado por Dawe et al. ((1999) Plant Cell .11:1227-1238) e mostrado para ser um componente do cinetócoro em milho. Um peptídeo conservado de 20 aminoácidos do domínio amino terminal foi usado para produzir antisoro específico para CENPC de milho, que foi marcado diretamente e usado para demonstrar que CENPC é especificamente localizado no centrômero de minicromossomos nativos e artificiais em milho (ver, pex., Figuras 3, 4, 8, e 10)

Os elementos repetidos centroméricos CentA, CentC, CRMl, e CRM2 incluem seqüências que são substancialmente idênticas às seqüências de milho para CentA, CentC, CRM1, e CRM2 das SEQ ID NOs:1-4. Seqüências substancialmente idênticas incluem seqüências que têm uma alta homologia uma com a outra como exemplificado por ter uma significante porcentagem de identidade de seqüência, e/ou através de hibridizar seletivamente sob condições estringentes para um CentA, um CentC, um CRMlf ou um CRM2 (SEQ ID NOs: 1-4), ou um complemento dos mesmos. Seqüências que hibridizam seletivamente sob condições de hibridização estringentes incluem seqüências que hibridizam à seqüência alvo pelo menos 2 vezes sobre o background e a exclusão substancial de ácidos nucléicos não alvo. Seqüências hibridizando seletivamente têm tipicamente cerca de pelo menos 80, 85, .90, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100% de identidade de seqüência à seqüência alvo. Quaisquer condições de hibridização adequadas e tampões conhecidos no estado da técnica podem ser usados, exemplos dos quais têm sido descritos aqui. Identidade de seqüência pode ser usada para comparar a estrutura primária de duas seqüências de polinucleotideos ou polipeptideos. Identidade de seqüência mede os resíduos nas duas seqüências que são as mesmas quando alinhadas para a correspondência máxima. Relações de seqüências podem ser analisadas usando algoritmos implementados por computador. A relação de seqüência entre dois ou mais polinucleotideos, ou dois ou mais polipeptideos pode ser determinada pela determinação do melhor alinhamento das seqüências, e pontuar os compartilhamentos e os gaps no alinhamento, que produz a porcentagem de identidade de seqüência e a porcentagem de similaridade de seqüência. Relações de polinucleotideo podem ser também descritas baseadas em uma comparação dos polipeptideos que cada um codifica. Muitos programas e algoritmos para comparação e análise de seqüências são conhecidos. A menos que indicado de outra forma, valores de identidade/similaridade de seqüência providos aqui referem-se a valores obtidos usando GAP Versão 10 (GCG, Accelrys, San Diego, CA) usando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma seqüência de nucleotideo usando grau de ruptura (GAP Weight) de 50 e Length Weight e 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de similaridade para uma seqüência de aminoácido usando GAP Weight de 8 e Length Weight de 2, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (Henikoff & Henikoff (1992) Proc Natl Acad Sci USA .89:10915-10919). GAP usa o algoritmo de Needleman & Wunsch (1970) J Mol Biol 48:443-453, para encontrar o alinhamento de duas seqüências completas que maximiza o número de compartilhamentos e minimiza o número de gaps. Substancialmente idêntico inclui seqüências tendo pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, .98%, 99% ou mais de identidade de seqüência, onde as seqüências são esperadas reter a função nativa baseada na porcentagem de identidade de seqüência total, a similaridade de seqüência, o alinhamento total da seqüência primária, a presença de blocos conservados de resíduos, a presença de elementos conservados e/ou domínios, a presença de domínios funcionais conservados, a presença de regiões de ligação, a presença de resíduos catalíticos, a(s) estrutura(s) predita secundária(s) e/ou terciária (s) , a viabilidade de estruturas tridimensionais conhecidas, e outros critérios usados por um especialista na área para identificar e predizer um homólogo funcional de qualquer seqüência particular.

Polinucleotideos variantes incluem polinucleotídeos tendo pelo menos uma deleção, adição, e/ou substituição em pelo menos uma das extremidades 5', 3', e/ou sítios internos incluindo íntrons ou éxons, quando comparados com o polinucleotídeo nativo. Polinucleotideos variantes incluem variantes ocorrendo naturalmente bem como polinucleotídeos derivados sinteticamente, por exemplo, aqueles gerados usando mutagênese sítio dirigida. Variantes conservadas incluem seqüências que mantém sua função, codificam o mesmo polipeptídeo, ou codificam um polipeptídeo variante com identidade, função e/ou atividade substancialmente similar com o polinucleotídeo nativo. Variantes podem ser identificadas com técnicas conhecidas, por exemplo, reação de polimerase em cadeia (PCR), e/ou técnicas de hibridização. Geralmente, variantes de um polinucleotídeo particular terá pelo menos cerca de 40%, .45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, .93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de seqüência para aquele polinucleotídeo particular. Polinucleotídeos variantes podem também ser avaliados pela comparação da porcentagem de seqüência entre os polipeptideos codificados usando programas e parâmetros de alinhamento padrões. Quando avaliada pela comparação da porcentagem de identidade de seqüência compartilhada por dois polipeptideos codificados pelos polinucleotideos, a porcentagem de identidade de seqüência entre os dois polipeptideos codificados é tipicamente pelo menos cerca de .40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, .92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência.

Proteínas variantes incluem proteínas tendo pelo menos uma deleção, adição, e/ou substituição em pelo menos uma das extremidades N-terminal, C-terminal, e/ou um sítio inte rno, quando comparadas com o polipeptídeo nativo. Proteínas variantes possuem a atividade biológica desejada da proteína. Variantes incluem polipeptideos ocorrendo naturalmente, bem como aqueles gerados por manipulação humana. Variantes ativas biologicamente de uma proteína tipicamente tem pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, .60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, .96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de seqüência com uma seqüência de aminoácido para a proteína nativa como determinado pelos programas de alinhamento de seqüência. Uma variante biologicamente ativa de uma proteína pode diferir daquela proteína por tão pouco quanto 1-15 resíduos de aminoácidos. Substituições conservadas geralmente referem-se a troca de um aminoácido com outro tendo propriedades similares. Por exemplo, o modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl Biomed Res Found, Washington, D.C.) provê orientação em substituições de aminoácidos que não são esperadas afetar a atividade biológica da proteína.

Polinucleotideos variantes e proteínas englobam seqüências derivadas de procedimentos mutagênicos e/ou recombinogênicos, tais como mutagênese e/ou embaralhamento de DNA. Métodos para mutagênese e alterações na seqüência de nucleotídeo são conhecidos (ver, pex., Kunkel (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154:367-382; U.S. Patent 4.873.192; Walker & Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publ. Co., NY) e as referências citadas aqui). Por exemplo, uma ou mais seqüências diferentes codificando a recombinase podem ser manipuladas para criar e selecionar uma nova proteína recombinase possuindo as propriedades desejadas. Tipicamente, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas de uma população de seqüências relacionadas e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo (ver, pex., Stemmer (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nat Biotechnol 15:436-438; Moore et al. (1997) J Mol Biol 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; e patente americanas US 5.605.793, e US .5.837.458). Geralmente, modificações em um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo não deve alterar a fase de leitura, ou criar e/ou alterar a estrutura secundária do DNA ou mRNA. Ver, publicação de pedido de patente EP No. .75, 444 .

Oligonucleotídeos sobrepostos, denominados overgos, são os primeiros pares que estendem cerca de 40 bp em comprimento e são usualmente constituídos de dois oligonucleotídeos de 24-bp que têm uma região de sobreposição de 8-bp na extremidade 3'. Essa característica permite ao primeiro par de overgo prover um com o outro e sintetizar suas cadeias complementares com nucleotídeos marcados pelo método de preenchimento de Klenow (McPherson (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Vol. 4, pp. .207-213, ed. Birren et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) . Uma variedade de nucleotídeos marcados pode ser usada, incluindo mas não limitada a nucleotídeos marcados com radioatividade ou nucleotídeos marcados com fluorescência. Isso é útil para a geração de sondas por diferentes métodos de hibridização, incluindo mas não limitado a hibridização de colônia, dot blots, Southern blots, e hibridização in situ, tal como FISH. A maior vantagem de sondas overgo sobre as sondas convencionais para hibridização de bibliotecas é que as seqüências para o desenho de overgos podem ser selecionadas, e então seqüências repetidas presentes em um fragmento de DNA de sonda convencional podem ser evitadas; por essa razão, o problema de hibridização cruzada que está freqüentemente associado com rastreamento de biblioteca de DNA de grandes genomas pode ser minimizado. Por causa dessa vantagem, hibridização overgo combinada com a estratégia de agrupamento de sondas (Cai et al. (1998) Genomics 54:387- .397; Chang et al. (2001) Genetics 159:1231-1242; Tao et al. (2001) Genetics 158:1711-1724; Romanov et al. (2003) Cytogenet Genome Res 101:277-281) tem emergido como um método para rastreamento de biblioteca BAC de alta-vazão para identificação de clone e mapeamento genético físico.

Em alguns exemplos genes ou polipeptídeos codificados que possam fortalecer ou estimular o crescimento celular são providos com ou dentro das construções de DNA. Genes que fortalecem ou estimulam o crescimento celular incluem genes envolvidos na regulação da transcrição, regulação de gene homeótico, manutenção e proliferação de célula tronco, divisão celular, e/ou diferenciação celular tais como homólogos WUS (Mayer et al. (1998) Cell 95:805-815; WOOl/002357 5; US2004/0166563) ; aintegumenta (ANT) (Klucher et al. (1996) Plant Cell 8:137-153; Elliott et al. (1996) Plant Cell 8:155-168; números de acesso ao GenBank U40256, U41339, Z47554) ; clavata (pex. , CLV1, CVL2, CLV3) (W003/093450; Clark et al. (1997) Cell 89:575-585; Jeong et al. (1999) Plant Cell 11:1925-1934; Fletcher et al. (1999) Science 283:1911-1914); Clavata e genes da região ao redor do embrião (pex., CLE) (Sharma et al. (2003) Plant Mol Biol .51:415-425; Hobe et al. (2003) Dev Genes Evol 213:371-381; Cock & McCormick (2001) Plant Physiol 126:939-942; Casamitjana-Martinez et al. (2003) Curr Biol 13:1435-1441); baby boom (pex., BNM3, BBM, 0DP1, 0DP2) (W000/75530; Boutileir et al. (2002) Plant Cell 14:1737-174 9); Zwille (Lynn et al. (1999) Dev 12 6:469-481); cotilédone coposo (pex., Lecl, Lec2) (Lotan et al. (1998) Cell 93:1195-1205; WO00/28 058; Stone et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA .98:11806-11811; patente americana 6,492,577); Shoot Meristem-Iess (STM) (Long et al. (1996) Nature 379:66-69); ultrapetala (ULT) (Fletcher (2001) Dev 128:1323-1333); proteína quinase ativadoras mitogênicas (MAPK) (Jonak et al. (2002) Curr Opin Plant Biol 5:415); proteína fosfatase associada à quinase (KAPP) (Williams et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:10467-10472; Trotochaud et al. (1999) Plant Cell 11:393-406); ROP GTPase (Wu et al. (2001) Plant Cell 13:2841-2856; Trotoehaud et al. (1999) Plant Cell .11:393-406); fasciata (pex. FAS1, FAS2) (Kaya et al. (2001) Cell 104:131-142); genes do ciclo celular (patente americana US 6,518,487; W099/61619; W002/074909), Shepherd (SHD) (Ishiguro et al. (2002) EMBO J. 21:898-908); Poltergeist (Yu et al. (2000) Dev 127:1661-1670; Yu et al. (2003) Curr Biol 13:179-188); Pickle (PKL) (Ogas et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:13839-13844); genes knox (pex., KNl, KNAT1) (Jackson et al. (1994) Dev 120:405-413; Lincoln et al. (1994) Plant Cell 6:1859-1876; Venglat et al. (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:4730-4735); fertilização independente de endosperma (FIE) (Ohad et al. (1999) Plant Cell 11:407-415), e semelhantes. As combinações dos polinucleotídeos incluem múltiplas cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse, e as combinações podem ter qualquer combinação de expressão acima-regulada e abaixo-regulada dos polinucleotídeos combinados. As combinações podem ou não podem ser combinadas em uma construção para transformação da célula hospedeira, e portanto pode ser provida seqüencialmente ou simultaneamente. A célula hospedeira pode ser uma célula tipo selvagem ou mutante, em um estado normal ou aneuplóide.

Sistemas recombinase sitio-especificos podem ser usados com qualquer sistema de minicromossomo. Ambas integrases e recombinases capazes de catalisar ambas as reações para frente ("forward") e reversa, são úteis para introduzir modificações após as construções de DNA ou minicromossomos terem sido estabelecidos na célula vegetal. Várias modificações intramoleculares, tais como deleção ou inversão de seqüências definidas podem ser feitas. Além disso, inserções intermoleculares e trocas podem ser feitas, incluindo translocações com cromossomos endógenos compreendendo sítios de recombinação sítio-especificos compatíveis. Os sistemas recombinase podem também ser usados para estabelecer sítios alvo (sítios "docking") dentro do minicromossomo para integração sítio-específica tardia dos polinucleotídeos de interesse providos por qualquer método, incluindo cruzamento ou liberação direta.

Elementos dos sistemas de recombinação, tais como recombinases, e sítios de recombinação podem ser usados, por exemplo em uma construção de DNA, um sítio alvo, e/ou um cassete de transferência. Um sítio alvo compreende um polinucleotídeo integrado dentro do genoma, o polinucleotídeo compreendendo um promotor operacionalmente ligado a pelo menos um sítio de recombinação. Um cassete de transferência compreende pelo menos um primeiro sítio de recombinação operacionalmente ligado a um polinucleotídeo de interesse e/ou um polinucleotídeo codificando um marcador de seleção, onde o primeiro sitio de recombinação é recombinogênico com um sitio de recombinação no sitio alvo. Uma semente ou planta alvo tem incorporado estavelmente dentro do seu genoma uma construção de DNA que tem sido gerado e/ou manipulado através do uso de um sistema de recombinação. Métodos de recombinação sítio- especifico que resultam em vários eventos de integração, alteração, e/ou excisão para gerar a construção de DNA relatado podem ser empregados para gerar uma semente alvo. Ver, pex., W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, W099/258 53, W099/23202, W099/55851, W001/07572, W002/08409, e W003/08045.

Uma recombinase é um polipeptideo que catalisa uma recombinação sitio-especifica entre seus sítios de recombinação compatíveis, e inclui seqüências de recombinase ocorrendo naturalmente, variantes, e/ou fragmentos que retenham a atividade. Um sítio de recombinação é uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente reconhecida por uma enzima recombinase, e engloba seqüências de sítio de recombinação ocorrendo naturalmente, variantes, e/ou fragmentos que retenham a atividade. Para revisão de recombinases sítio-específicas, ver Sauer (1994) Curr Op Biotech 5:521-527; Sadowski (1993) FASEB 7:760-767; Groth & Calos (2004) J Mol Biol 335:667- .678; and Smith & Thorpe (2002) Mol Microbiol 44:299-307. Qualquer sistema de recombinação, ou combinação de sistemas, pode ser usado incluindo mas não limitado a recombinases e sítios de recombinação das famílias integrase e/ou resolvase, variantes e fragmentos biologicamente ativos dos mesmos, e/ou quaisquer outros ocorrendo naturalmente ou recombinantemente enzima produzida ou variante da mesma que catalisa recombinação conservada sítio-específica entre sítios de recombinação especificados, e ocorrendo naturalmente ou sítios de recombinação modificados ou variantes dos mesmos que sejam especificamente reconhecidos por uma recombinase para gerar um evento de recombinação.

Os sít ios de recombinação empregados podem ser sítios correspondentes ou sítios desiguais. Sítios de recombinação correspondentes, ou um grupo de sítios de recombinação correspondentes, são sítios tendo uma seqüência de nucleotídeo idêntica. Um grupo de sítios de recombinação correspondente, na presença da recombinase apropriada, recombinará eficientemente com um outro. Sítios de recombinação desiguais têm uma seqüência diferente, compreendendo pelo menos um nucleotídeo de diferença quando comparados um com o outro. Os sítios de recombinação dentro de um grupo de sítios de recombinação desiguais podem ser recombinogênicos ou não recombinogênicos com relação um ao outro. Cada sítio de recombinação dentro do grupo de sítios desiguais é biologicamente ativo e pode recombinar com um sítio idêntico. Sítios recombinogênicos são capazes de recombinar com um outro na presença da recombinase apropriada. Sítios recombinogênicos incluem aqueles sítios onde a eficiência de excisão relativa de recombinação entre os sítios recombinogênicos está acima do limite detectável sob condições padrão em um ensaio de excisão quando comparado com o controle tipo selvagem, tipicamente, maior do que 2%, 5%, 10%, 20%, 50%, 100%, ou maior. Sítios não recombinogênicos não recombinarão com um outro na presença da recombinase apropriada, ou recombinação entre os sítios não é detectável. Sítios de recombinação não recombinogênicos incluem aqueles sítios que recombinam com um outro em uma freqüência menor do que o limite detectável sob condições padrões em um ensaio de excisão quando comparados com controle selvagem, tipicamente, menores do que 2%, 1.5%, 1%, 0.75%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.075, 0.005%, .0.001%. Quaisquer sítios de recombinação não recombinogênicos adequados podem ser utilizados, incluindo um sítio FRT ou variante ativo do mesmo, um sítio Iox ou variante ativo do mesmo, um sítio att ou variante ativo do mesmo, qualquer combinação dos mesmos, ou qualquer outra combinação de sítios de recombinação não recombinogênicos. Sítios de recombinação repetidos diretamente em um grupo de sítios de recombinação recombinogênicos são arranjados na mesma orientação, recombinação entre esses sítios resultam na excisão da seqüência de DNA interveniente. Sítios de recombinação invertidos em um grupo de sítios de recombinação recombinogênicos são arranjados na orientação oposta, recombinação entre esses sítios resultam na inversão da seqüência de DNA interveniente.

A família Integrase das recombinases tem mais de cem membros e inclui, por exemplo, FLP, Cre, Dre, Int, e R. Para out ros membros da família Integrase, ver por exemplo, Esposito et al. (1997) Nucleic Acids Res 25:3605-3614; Nunes-Duby et al. (1998) Nucleie Aeids Res 26:391-406; Abremski et al. (1992) Protein Eng 5:87-91; Groth & Calos (2004) J Mol Biol 335:667-678; and Smith & Thorpe (2002) Mol Mierobiol 44:299-307. Outros sistemas de reeombinação incluem, por exemplo, baeteriófago estreptomiceto phiC31 (Kuhstoss et al. (1991) J Mol Biol 20:897-908); baeteriófago λ (Landy (1989) Ann Rev Bioehem 58:913-949, e Landy (1993) Curr Op Genet Dev 3:699-707); sistema de reeombinação sitio-espeeifieo SSVl de Sulfolobus shibatae (Maskhelishvili et al. (1993) Mol Gen Genet 237:334-342); e um sistema de integração baseado na integrase retroviral (Tanaka et al. (1998) Gene 17:67-76). Em alguns exemplos, a recombinase é uma que não requer co-fatores ou um substrato super enrolado. Tais reeombinases incluem Cre, FLP, phiC31 Int, mutante λ Int, R, SSV1, Dre, ou variantes ativas ou fragmentos dos mesmos. FLP recombinase catalisa uma reação sítio específica entre dois sítios FRT, e está envolvida em amplificar o número de cópias do plasmídeo 2 mícrons de S. cerevisiae durante a replicação de DNA. A proteína FLP tem sido clonada e expressa. Ver, por exemplo, Cox (1993) Proc Natl Acad Sci USA 80:4223-4227. A recombinase FLP usada pode ser derivada do gênero Saccharomyces. Em alguns exemplos um polinucleotídeo sintetizado usando códons preferidos de planta codificando a recombinase é utilizado. A enzima FLP codificada por uma seqüência de nucleotídeo compreendendo os códons preferidos de milho (FLPm) que catalisa eventos de reeombinação sítio específicos é conhecida (Patente US 5.929.301). Variantes funcionais adicionais e fragmentos de FLP são conhecidas. Ver, por exemplo, Buchholz et al. (1998) Nat Biotechnol 16:617-618, Hartung et al. (1998) J Biol Chem 273:22884-22891, Saxena et al. (1997) Biochim Biophys Acta 1340:187-204, Hartley et al. (1980) Nature 286:860-864, Shaikh & Sadowski (2000) J Mol Biol 302:27-48, Voziyanov et al. (2002) Nucleic Acids Res 30:1656-1663, e Voziyanov et al. (2003) J Mol Biol .326:65-76. A recombinase Cre do bacteriófago Pl catalisa a recombinação sitio especifica entre dois sítios lox. Ver, por exemplo, Guo et al. (1997) Nature 389:40-46; Abremski et al. (1984) J Biol Chem 259:1509-1514; Chen et al. (1996) Somat Cell Mol Genet 22: 477- 488; Shaikh et al. (1977) J Biol Chem 272:5695- 5702; e, Buchholz et al. (1998) Nat Biotechnol 16:617-618. Seqüências do polinucleotideo Cre podem também ser sintetizadas usando códons preferidos de planta, por exemplo, moCre (ver, pex., WO 99/25840), e outras variantes são conhecidas, ver por exemplo Vergunst et al. (2000) Science 290:979-982, Santoro & Schulz (2002) Proc Natl Acad Sci USA 99:4185-4190, Shaikh & Sadowski (2000) J Mol Biol 302:27-48, Rufer & Sauer (2002) Nucleic Acids Res 30:2764-2771, Wierzbicki et al. (1987) Mol Biol .195:785-794, Petyuk et al. (2004) J Biol Chem 279:37040- .37048, Hartung & Kisters-Wolke (1998) J Biol Chem .273:22884-22891, Koresawa et al. (2000) J Biochem (Tokyo) 127:367-372, Patente americana US 6.890.726, e Buchholz & Stewart (2001) Nat Biotechnol 19:1047-1052. Um homólogo Cre tem sido identificado em fagos Pl-relacionados, a recombinase isolada do fago D6 é conhecida como Dre que é uma tirosina recombinase intimamente relacionada ao Cre, mas que reconhece diferentes sítios rox 32 bp (Sauer & McDermott (2004) Nucleic Acids Res 32:1-10). A phiC31 integrase e variantes são conhecidas (Kushtoss et al. (1991) J Mol Biol 222:897-908, W003/066867, W005/017170, US2005/0003540, e Sclimenti et al. (2001) Nucleic Acids Res .29:5044-5051. A λ.integrase e co-fatores (Hoess et al. (1980) Proc Natl Acad Sci USA 77:2482-2486, Blattner et al. (1997) Science 277:1453-1474), e variantes dos mesmos são conhecidos, incluindo variantes Int cofator-independente (Miller et al. (1980) Cell 20:721-729, Lange-Gustafson e Nash (1984) J Biol Chem 259:12724-12732, Christ et al. (1998) J Mol Biol 288:825-836, e Lorbach et al. (2000) J Mol Biol 296:1175-1181), variantes de reconhecimento de sítio att (Dorgai et al. (1995) J Mol Biol 252:178-188, Yagu et al. (1995) J Mol Biol 252:163-167, and Dorgai et al. (1998) J Mol Biol 277:1059-1070), bem como códon de milho otimizado Int, variante, e seqüências co-fatoras (W003/08 04 5) . Outras integrases e variantes são conhecidas, tais como HK022 integrase (Kolot et al. (1999) Mol Biol Rep .26:207-213) e variantes tais como variantes de reconhecimento de sítio att (Dorgai et al. (1995) J Mol Biol 252:178-188, Yagu et al. (1995) J Mol Biol 252:163- .167, and Dorgai et al. (1998) J Mol Biol 277:1059-1070).

Sítios de recombinação tipo selvagem, mutante, ou qualquer combinação do tipo selvagem e/ou sítios mutantes podem ser usados. Tais sítios de recombinação incluem, por exemplo, tipo selvagem lox, FRT, e sítios att, e mutante lox, FRT, e sítios att. Uma análise da atividade de recombinação dos sítios mutantes lox é apresentada em Lee et al. (1998) Gene 216:55-65. Outros sítios de recombinação e variantes são conhecidos, ver por exemplo, Hoess et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 7 9:3398-34 02; Hoess et al. (1986) Nucleic Acids Res 14:2287-2300; Thomson et al. (2003) Genesis 36:162-167; Schlake & Bode (1994) Bioehemistry 33:12746-12751; Siebler & Bode (1997) Biochemistry 36:1740-1747; Huang et al. (1991) Nucleic Acids Res 19:443-448; Sadowski (1995) in Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology Vol. 51, pp. .53-91; Cox (1989) in Mobile DNA, Berg & Howe (eds) American Soeiety of Microbiology, Washington D.C., pp. 116-670; Dixon et al. (1995) Mol Microbiol 18:449-458; Umlauf & Cox (1988) EMBO J 7:1845-1852; Buchholz et al. (1996) Nucleic Acids Res 24:3118-3119; Kilby et al. (1993) Trends Genet .9:413-421; Rossant & Geagy (1995) Nat Med 1:592-594; Bayley et al. (1992) Plant Mol Biol 18:353-361; Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223:369-378; Dale & Ow (1991) Proc Natl Acad Sei USA 88:10558-10562; Qui et al. (1994) Proe Natl Acad Sci USA 91:1706-1710; Stuurman et al. (1996) Plant Mol Biol 32:901-913; Dale et al. (1990) Gene 91:79- .85; Albert et al. (1995) Plant J 7:649-659, Patente americana US 6.465.254, WOOl/23545, W099/55851, e W001/11058. Em alguns exemplos, grupos de sítios de recombinação desiguais e correspondentes podem ser usados, por exemplo sítios de diferentes sistemas de recombinação. Ass im sendo, qualquer sítio de recombinação adequado ou grupo de sítios de recombinação pode ser usado, incluindo um sitio FRT, uma variante biologicamente ativa de um sitio FRT, um sitio lox, uma variante biologicamente ativa de um sitio lox, um sitio att, uma variante biologicamente ativa de um sitio att, qualquer combinação dos mesmos, ou qualquer outra combinação dos sítios de recombinação. Exemplos de sítios FRT incluem, por exemplo, o sítio FRT tipo selvagem mínimo (FRTl) , e vários sítios FRT mutantes, incluindo mas não limitado a FRT 5, FRT 6, e FRT 7 (ver patente americana US 6.187.994). Sítios FRT variantes adicionais são conhecidos, (ver, pex., WOOl/23545, e publicação US 2007/0015195, aqui incorporadas por referência). Outros sítios de recombinação que podem ser usados incluem sítios att, tais como aqueles revelados em Landy (1989) Ann Rev Biochem 58:913-949, Landy (1993) Curr Op Genet Dev 3:699-707, patente americana US 5.888.732, WOOl/07572, e Thygarajan et al. (2001) Mol Cell Biol 21:3926-3934. A recombinase sítio-específica usada depende dos sítios de recombinação no sítio alvo e cassete de transferência. Se sítios FRT são utilizados, recombinase FLP é provida, quando sítios lox são utilizados, recombinase Cre é provida, quando sítios λ att são usados, λ Int é provida, quando sítios phiC31 att são usados, phiC31 Int é provida. Se os sítios de recombinação usados compreendem sítios de diferentes sistemas, por exemplo um sítio FRT e um sítio lox, ambas as atividades recombinase podem ser providas, cada uma como entidades separadas, ou como uma recombinase quimérica, por exemplo FLP/Cre (ver, pex., WO 99/25840). Um marcador provê para a identificação e/ou seleção de uma célula, planta, e/ou semente expressando o marcador. Marcadores incluem, pex. marcador rastreável visual, e/ou de seleção. Um marcador de seleção é qualquer marcador, que quando expresso em um nível suficiente, confere resistência a um agente seletivo. Por exemplo marcadores visuais podem ser usados para identificar células transformadas compreendendo os construções de DNA introduzidos. Em outro exemplo o marcador visual é uma proteína fluorescente. Tais proteínas fluorescentes incluem mas não estão limitadas a proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente ciano (CFP), e proteína fluorescente vermelha (RFP). Em ainda em outros exemplos, o marcador visual é codificado por um polinucleotídeo tendo códons preferidos de milho. Em exemplos adicionais, o marcador visual compreende GFPm, AmCyan, ZsYellow, ou DsRed. Ver, Wenck et al. (2003) Plant Cell Rep. 22:244-251.

Marcadores de seleção e seus agentes seletivos correspondentes incluem, mas não estão limitados a, genes de resistência a herbicida e herbicidas; genes de resistência a antibiótico e antibióticos; e outros genes de resistência química com seus correspondentes agentes químicos. Genes de resistência a drogas bacterianas incluem, mas não estão limitados a, neomicina fosfotransferase II (nptll) que confere resistência a canamicina, paromicina, neomicina, e G418, e higromicina fosfotransferase (hph) que confere resistência a higromicina B. Ver também, Bowen (1993) Markers for Plant Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization; Everett et al. (1987) Bio/Technology 5:1201- 1204; Bidney et al. (1992) Plant Mol Biol 18:301-313; e W097/0582 9.

Resistência pode também ser conferida para herbicidas de diversos grupos, incluindo inibidores da síntese de aminoácidos, inibidores de fotossíntese, inibidores de lipídeos, reguladores de crescimento, desregulador de membrana celular, inibidores de pigmento, inibidores de crescimento de plântulas, incluindo mas não limitado a imidazolinonas, sulfonilureas, triazolopirimidinas, glifosato,setoxidim,fenoxaprop, glufosinato, fosfinotricina, triazinas, bromoxinil, e semelhantes. Ver, por exemplo, Holt (1993) Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 44:203-229; and Miki et al. (2004) J Biotechnol 107:193-232. Marcadores de seleção incluem seqüências que conferem resistência a herbicidas, incluindo mas não limitado a, gene bar, que codifica fosfinotricina acetil transferase (PAT) que confere resistência ao glufosinato (Thompson et al. (1987) EMBO J 6:2519-2523); glifosato oxidoredutase (GOX), glifosato N-acetiltransferase (GAT), e 5-enol piruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS) que confere resistência ao glifosato (Barry et al. (1992) in Biosynthesis and Molecular Regulation of Amino Acids in Plants, B.K. Singh et al. (Eds) pp.139-145; Kishore et al. (1992) Weed Tech 6:626-634; Castle (2004) Science 304:1151- 1154; Zhou et al. (1995) Plant Cell Rep 15:159-163; W097/04103; W002/36782; e W003/092360). Outros marcadores de seleção incluem dihidrofolato redutase (DHFR), que confere resistência ao metotrexato (ver, pex., Dhir et al. (1994) Improvements of Cereal Quality by Genetic Engineering, R.J. Henry (ed), Plenum Press, New York; and Hauptmann et al. (1988) Plant Physiol 86:602- 606). Acetohidroxi ácido sintase (AHAS ou ALS) seqüências mutantes levam à resistência a imidazolinonas e/ou sulfonilureas tais como imazetapir e/ou clorsulfuron (ver, pex., Zu et al. (2000) Nat Biotechnol 18:555-558; Patentes americanas US 6,444,875, e US 6,660,910; Sathasivan et al. (1991) Plant Physiol 97:1044-1050; Ott et al. (1996) J Mol Biol 263:359-368; e Fang et al. (1992) Plant Mol Biol .18:1185-1187).

Em adição, genes de resistência química incluem ainda triptofano decarboxilase que confere resistência ao 4-metil triptofano (4-mT) (Goodijn et al. (1993) Plant Mol Biol .22:907-912); e bromoxinil nitrilase que confere resistência ao bromoxinil. 0 marcador de seleção pode compreender cianamida hidratase (Cah),ver, por exemplo, Greiner et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:4260-4264; e Weeks et al. (2000) Crop Sci 40:174 9-1754. A enzima cianamida hidratase converte cianamida em uréia, por meio disso conferindo resistência à cianamida. Qualquer forma ou derivado de cianamida pode ser usado como a um agente de seleção incluindo, mas não limitado a, cianamida de cálcio (Perlka® (SKW, Trotberg Germany) e cianamida hidrogenada (Dormex® (SKW)). Ver também, Patentes americanas US 6.096.947, e US .6.268.547. Variantes dos polinucleotídeos e/ou polipeptídeos da hidratase cianamida reterá atividade hidratase cianamida. Uma variante ativa biologicamente da hidratase cianamida reterá a habilidade para converter cianamida em uréia. Métodos para ensaios para tais atividades incluem análise para resistência de plantas expressando a hidratase cianamida para cianamida. Ensaios adicionais incluem o ensaio colorimétrico da hidratase cianamida (ver, pex., Weeks et al. (2000) Crop Sci 40:1749- 1754; e Patente americana US 6.268.547).

A presente invenção também engloba um polinucleotideo isolado compreendendo: (a) pelo menos dois arranjos de repetições em tandem de CentC em uma orientação invertida onde o primeiro arranjo compreende pelo menos dez cópias de CentC e o segundo arranjo compreende pelo menos dez cópias de CentC; e, (b) pelo menos uma cópia de um elemento retrotransponivel, onde o elemento retrotransponivel está situado entre o primeiro e o segundo arranjo. Elementos retrotransponiveis adequados são discutidos acima.

Também dentro do escopo da invenção está um polinucleotideo isolado compreendendo: (a) pelo menos um arranjo de repetições em tandem de CentC, o arranjo compreendendo pelo menos dez cópias de CentC; e, (b) pelo menos uma cópia de um elemento retrotransponivel selecionado do grupo consistindo de CentA, CRMl, e CRM2.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção engloba um polinucleotideo isolado compreendendo: (a) pelo menos um arranjo de repetições em tandem de CentC, o arranjo compreendendo pelo menos dez cópias de CentC; e, (b) pelo menos uma cópia cada de CentA, CRMl, e CRM2.

Os polinucleotideos isolados compreendem pelo menos um arranjo de repetições em tandem de CentC. Cada arranjo de repetições CentC pode compreender pelo menos 5, 10, 15, 20, .25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 150, 160, .180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, ou 300 cópias de CentC. Além disso, cada arranjo de repetições em tandem de CentC pode ser interrompida por outro elemento de seqüência, incluindo mas não limitado a um retrotransposon, que é inserido entre cópias de CentC, ou dentro de um elemento CentC, ou dentro de um retrotransposon, ou qualquer outro elemento de seqüência no arranjo. Retrotransposons incluem, mas não estão limitados a, CentA, CRM1, e CRM2.

Um polinucleotideo inclui qualquer molécula de ácido nucléico, e compreende ribonucleotideos deoxiribonucleotideos ocorrendo naturalmente, sintéticos e/ou modificados, e combinações dos ribonucleotideos e deoxiribonucleotideos. Polinucleotideos englobam todas as formas de seqüências incluindo, mas não limitado a, fita simples, fita dupla, linear, circular, ramificada, grampos, estruturas haste-volta, e semelhantes.

Também dentro do escopo da invenção está uma construção recombinante compreendendo qualquer dos polinucleotideos isolados da invenção. Uma construção de DNA recombinante compreende um polinucleotideo que quando presente no genoma de uma planta é heterólogo ou exógeno para aquela localização cromossômica no genoma vegetal. No preparo da construção de DNA, vários fragmentos podem ser manipulados para prover as seqüências em uma orientação própria e/ou na fase de leitura correta. Adaptadores ou ligantes podem ser empregados para unir os fragmentos. Outras manipulações podem ser usadas para prover sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluos, ou remoção de sítios de restrição. Por exemplo, mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, anelamento, resubstituições, transições, transversões, ou sistemas de recombinação podem ser usados. Polinucleotideos de interesse referem-se a qualquer molécula de ácido nucléico incluída nos construções de DNA para qualquer propósito, incluindo mas não limitado a regiões não traduzidas, regiões regulatórias, regiões de iniciação de transcrição, regiões de iniciação da tradução, íntrons, éxons, polinucleotídeos codificando um RNA, marcadores de seleção, marcadores rastreáveis, marcadores fenotípicos, polinucleotídeos codificando uma recombinase, sítios de recombinação, sítios alvo, cassetes de transferência, sítios de restrição, sítios de reconhecimento, isoladores, fortalecedores, seqüências espaçadoras, origens de replicação, seqüência telomérica, operadores, e semelhantes, podem ser providos em uma construção (s) de DNA. A construção pode incluir seqüências regulatórias 5' e .3' operacionalmente ligadas às seqüências apropriadas. As construções de DNA podem incluir na direção 5' a 3' de transcrição pelo menos um dos seguintes, uma região de iniciação transcricional e traducional, o polinucleotideo, e uma região de terminação transcricional e traducional funcional em plantas. Alternativamente, as construções de DNA podem necessitar de pelo menos um elemento regulatório .5' e/ou 3'. Por exemplo, construções de DNA podem ser designados de tal forma que na introdução dentro de uma célula e na presença da recombinase apropriada um evento de recombinação no sitio alvo operacionalmente ligada as regiões regulatórias 5' e/ou 3' com as seqüências apropriadas das construções de DNA.

Elementos regulatórios podem ser usados em uma variedade de maneiras dependendo do elemento polinucleotideo, sitio de recombinação, cassete de transferência e/ou sitio alvo empregado. Em alguns exemplos seqüências intervenientes podem estar presentes entre os elementos operacionalmente ligados e não desorganizam a ligação funcional. Por exemplo, uma ligação operacional entre um promotor e um polinucleotideo de interesse permite ao promotor iniciar e mediar a transcrição do polinucleotideo de interesse. Em alguns exemplos um sitio de iniciação transcricional é operacionalmente ligado a um sitio de recombinação. Em alguns exemplos, um sitio de recombinação está dentro de um intron.

Um cassete pode adicionalmente compreender pelo menos uma a seqüência adicional para ser introduzida dentro da planta. Alternativamente, seqüências adicionais podem ser providas separadamente. Construções de DNA podem ser providos com uma pluraridade de sítios de restrição ou sítios de recombinação para manipulação dos vários componentes e elementos. Construções de DNA podem adicionalmente conter genes marcadores de seleção.

Uma região de iniciação transcricional pode ser nativa, análoga, exógena, ou heteróloga à planta hospedeira ou ao polinucleotídeo de interesse, e pode ser uma seqüência natural, uma seqüência modificada, ou uma seqüência sintética. Um número de promotores pode ser usado para expressar uma seqüência codificadora.

Uma variedade de promotores úteis em plantas é revisto em Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev Biol Plant 40:1- .22. Em alguns exemplos, o promotor expressando o marcador de seleção é ativo na semente. Promotores ativos na semente incluem promotores constitutivos, por exemplo, a parte principal do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos revelados em W099/43838 e a patente americana US 6.072.050; a parte principal do promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); o promotor MVV (mirabilis mosaic virus) (Dey & Maiti (1999) Plant Mol Biol .40:771-782); actina de arroz (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol Biol.12:619-632, and Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor Appl Genet 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J .3:2723-2730); promotor ALS (patente americana US .5.659.026), e semelhantes. Outros promotores constitutivos incluem aqueles revelados em, pex. , patentes americanas US .5.608.14 9; 5.608.14 4; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; .5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611.

O promotor pode ser um promotor tecido-específico, para direcionar a expressão reforçada dentro de um tecido particular vegetal. Em alguns exemplos, um promotor especifico de semente é usado para expressar o marcador de seleção. Promotores específicos de semente incluem ambos os promotores específicos de semente, ativos durante o desenvolvimento da semente, bem como os promotores de germinação da semente, ativos durante a germinação da semente. Ver Thompson et al. (1989) BioEssays 10:108. Promotores específicos da semente incluem, mas não estão limitados a, Ciml (mensagem induzida por citocinina); cZ19Bl (zeína 19 kDa de milho); milps (mio-inositol-1- fosfato sintase) (ver WOOO/11177, e patente americana US .6.225.529), β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, lectina de soja, cruciferina, zeína 15 kDa de milho, zeína .22 kDa, zeína 27 kDa, cera, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, endl, e end2 (WOOO/12733), e semelhantes.

Um promotor químico-regulado pode ser usado para modular a expressão na semente através da aplicação de um regulador químico exógeno. O promotor pode ser um promotor químico-induzível, onde a aplicação de químico induz a expressão gênica, ou um promotor químico-repressivel, onde a aplicação do químico reprime a expressão gênica. Promotores químico induzíveis incluem, mas não estão limitados a, promotor In2-2 de milho, ativado pelo herbicida protetor benzenosulfonamida; o promotor GST de milho, ativado por compostos hidrofóbicos eletrofílicos (pex., alguns herbicidas pré-emergentes); e o promotor PR- Ia de tabaco, ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores químicos regulados de interesse incluem promotores esteróides-responsivos (ver, por exemplo, o promotor glucocorticóide-induzível em Schena et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:10421-10425 and McNellis et al. (1998) Plant J 14:247-257) e promotores tetraciclina- induzível e tetraciclina-represível (ver, pex., Gatz et al. (1991) Mol Gen Genet 227:229-237, patentes americanas US .5.814.618, e US 5.789.156).

As construções de DNA podem compreender unidades de expressão. Unidades de expressão podem ter elementos incluindo, mas não limitado a, íntrons, fortalecedores, isoladores líderes, espaçadores, regiões codificando um RNA, genes marcadores, sítios de recombinação, regiões de terminação, seqüências codificando recombinases,

fortalecedores, ligadores, sítios de reconhecimento, etc. Em adição, as construções de DNA podem compreender cassetes de transferência, sítios alvo, ou quaisquer porções ou combinações das mesmas. Os construções de DNA podem ser modificados em uma variedade de formas incluindo mas não limitado a métodos de integração/recombinação sítio específico ou transposições baseadas em transposon, para prover um número de variações nos construções de DNA. Seqüências de polinucleotídeos podem ser modificadas para expressão na planta. Ver, pex.r Campbell & Gowri (1990) Plant Physiol 92:1-11. Métodos para sintetizar genes preferidos de planta incluem, pex., Patentes americanas US .5.380.831, 5.436.391, e Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:477-498.

Modificações de seqüências adicionais são conhecidas para fortalecer expressão gênica em um hospedeiro celular. Isso inclui a eliminação de seqüências codificando sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítios de união éxon- íntron, repetições como transposons, e outras seqüências bem caracterizadas que possam ser deletérias à expressão gênica. 0 conteúdo G-C da seqüência pode ser ajustado para níveis médios para um dado hospedeiro, como calculado por referência a genes endógenos expressos no hospedeiro. A seqüência pode também ser modificada para evitar estruturas de RNAm secundárias. Cassetes podem adicionalmente conter seqüências líderes 5' no cassete de DNA que podem agir para fortalecer a tradução. Líderes de tradução incluem, pex., líderes pimaizeavirus tais como líder EMCV (Elroy-Stein et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 8 6:612 6-6130); líderes potivirus tais como líder TEV (Gallie et al. (1995) Gene .165:233-238), líder MDMV (Kong et al. (1988) Arch Virol .143:1791-1799), e a proteína de ligação à cadeia pesada da imunoglobulina humana (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature .353:9094); líder não traduzida do RNAm da proteína da capa do vírus do mosaico de alfafa (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líder do vírus do mosaico de tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp. 237-256); e líder do vírus mosqueado clorótico de milho (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81:382-385). Ver também, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol 84:965-968. Outros métodos ou seqüências conhecidas para fortalecer a tradução pode também ser utilizada, tais como íntrons, e semelhantes.

Seqüências de interesse incluem, pex., zinc fingers, quinases, proteínas de choque térmico, fatores de transcrição, reparo de DNA, tratos agronômicos, resistência a insetos, resistência à doença, resistência a herbicida, esterilidade, óleo, proteína, amido, digestibilidade, tamanho do grão de milho, maturidade, composição de nutriente, níveis ou metabolismo, e semelhantes. Genes de resistência a insetos podem codificar resistência a pragas tais como besouros, moscas, European Maize Borer, e semelhante. Tais genes incluem, pex., genes de proteínas tóxicas de B. thuringiensis (patentes americanas US 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; Geiser et al. (1986) Gene 48:109) e semelhantes. Tratos de resistência à doenças incluem genes de detoxificação, tais como contra fumonosina (patente americana US 5.792.931); genes de avirulência (avr) e de resistência a doenças (R) (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); e semelhantes. Tratos de resistência a herbicida incluem genes codificando para resistência a herbicidas incluindo herbicidas tipo sulfoniluréia {pex., mutações S4 e/ou Hra em ALS), herbicidas que agem para inibir ação da glutamina sintase, tais como fosfinotricina ou basta (pex., o gene bar), EPSPS (patentes americanas US 6.,867.293; 5.188.642; e 5.627.061), GOX (Zhou et al. (1995) Plant Cell Rep .15:159-163), e GAT (patente americana US 6.395.485). Genes de resistência a antibióticos podem também ser usados, tais como o gene nptll que codifica resistência aos antibióticos canamicina e geneticina. Genes de esterilidade podem também ser usados, por exemplo como uma alternativa para a retirada da borla, incluindo genes específicos do tecido masculino e genes com fenótipos de esterilidade masculina tais como QM (pex., patente americana US 5.583.210), quinases, e aqueles codificando compostos tóxicos para qualquer desenvolvimento gametofitico feminino ou masculino.

Redução da atividade de genes específicos, silenciamento e/ou supressão pode ser desejada. Muitas técnicas para silenciamento gênico são conhecidas, incluindo mas não limitado a tecnologia antisenso (ver, pex., Sheehy et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:8805- .8809; e patentes americanas US 5.107.065; 5.453.566; e .5.759.829); co-supressão (pex., Taylor (1997) Plant Cell .9:1245; Jorgensen (1990) Trends Biotech 8:340-344; Flavell (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:3490-3496; Finnegan et al. (1994) Bio/Technology 12:883-888; e Neuhuber et al. (1994) Mol Gen Genet 244:230-241); RNA interference (Napoli et al. (1990) Plant Cell 2:279-289; patente americana US 5.034.323; Sharp (1999) Genes Dev 13:139-141; Zamore et al. (2000) Cell 101:25-33; Javier (2003) Nature 425:257-263; e, Montgomery et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:15502- 15507), silenciamento gênico induzido por vírus (Burton et al. (2000) Plant Cell 12:691-705; e Bauleombe (1999) Curr Op Plant Bio 2:109-113); ribozimas especificas de RNA alvo (Haseloff et al. (1988) Nature 334: 585-591); estruturas em grampo (Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; W099/53050; W002/00904; e W098/53083); ribozimas (Steinecke et al. (1992) EMBO J 11:1525; patente americana US 4.987.071; e, Perriman et al. (1993) Antisenso Res Dev 3:253); modificação direcionada mediada por oligonucleotideo (pex, W003/076574: e W099/25853); moléculas direcionadas Zn- finger (pex., W001/52620; W003/048345; e WOOO/42219); e outros métodos, ou combinações dos métodos acima.

A região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação transcricional, pode ser nativa com a seqüência de DNA de interesse operacionalmente ligada, ou pode ser derivada de outra origem. Regiões de terminação convenientes são acessíveis do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, tais como as regiões de terminação da octopina sintase e nopalina sintase. Ver também Guerineau et al. (1991) Mol Gen Genet 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res .15: 9627-9639.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção diz respeito a um método para fazer uma planta transgênica de milho compreendendo um minicromossomo de planta artificial tendo um centrômero funcional, o método compreende:

(a) fazer contato de pelo menos uma célula vegetal de milho com uma mistura compreendendo uma construção recombinante da invenção;

(b) identificar pelo menos uma célula vegetal de milho da etapa (a) compreendendo um minicromossomo de planta artificial tendo um centrômero funcional; e

(c) regenerar uma planta de milho fértil da célula vegetal de milho da etapa (b) onde a dita planta de milho compreende um minicromossomo artificial de planta tendo um centrômero funcional.

A mistura pode ainda compreender um polinucleotideo codificando um polipeptideo que estimula o crescimento celular. Exemplos de polipeptideos que estimulam crescimento celular incluem, mas não estão limitados a, um wuschel, um baby boom, um RepA, ou um Lecl.

Qualquer método para introduzir uma seqüência dentro de uma planta pode ser usado, enquanto o polinucleotideo ou polipeptideo ganha acesso ao interior de pelo menos uma célula. Métodos para introduzir seqüências dentro de plantas são conhecidos e incluem, mas não estão limitados a, transformação estável, transformação transiente, métodos mediados por virus, e reprodução sexual. Incorporado estavelmente indica que o polinucleotideo introduzido está integrado dentro de um genoma e é capaz de ser herdado pela progênie. Transformação transiente indica que uma seqüência introduzida não integra dentro do genoma tal que ela é herdável pela progênie do hospedeiro. As plantas e sementes empregadas podem ter uma construção de DNA estavelmente incorporado dentro do seu genoma. Qualquer protocolo pode ser usado para introduzir a construção de DNA, qualquer componente de sistemas de recombinação sitio especifico, um polipeptideo, ou qualquer outro polinucleotideo de interesse. Prover compreende qualquer método que reunir qualquer polipeptideo e/ou polinucleotideo com quaisquer outros componentes relatados. Qualquer meio pode ser usado para reunir um sitio alvo, cassete de transferência, e recombinase apropriada, incluindo, por exemplo, transformação estável, liberação transiente, e cruzamento sexual (ver, pex., W099/25884). Em alguns exemplos, a recombinase pode ser provida na forma do polipeptideo ou mRNA. Uma série de protocolos pode ser usada com a finalidade de reunir os vários componentes. Por exemplo, uma célula pode ser provida com pelo menos um desses componentes via uma variedade de métodos incluindo métodos de transformação transiente e estável; co-introdução de uma DNA recombinase, mRNA ou proteína diretamente dentro da célula; empregando um organismo (pex., uma cepa ou linhagem) que expressa a recombinase; ou crescer/cultivar a célula ou organismo carregando um sitio alvo, cruzar com um organismo expressando uma proteína recombinase ativa, e selecionar eventos na progênie. Um simples padrão de integração é produzido quando o cassete de transferência integra predominantemente no sítio alvo. Qualquer promotor, incluindo promotor constitutivo, induzível, regulado desenvolvimentalmente, temporal, e/ou espacialmente, etc., que seja capaz de regular expressão no organismo possa ser usado.

Protocolos de transformação bem como protocolos para introdução de seqüências de polipeptídeos ou polinucleotídeos dentro de plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula vegetal direcionada para transformação. Métodos adequados de introduzir polipeptídeos e polinucleotídeos dentro das células vegetais incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334, patente americana US 6.300.543; e pedidos americanos 11/427.947 e 11/427.371 todos os quais são aqui incorporadas por referência) , eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (patentes americanas US 5.563.055; e US 5.981.840), transferência gênica direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717- 2722), e aceleração de partícula balística (patentes americanas US 4.945.050; US 5.879.918; US 5.886.244; e US 5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant Cellf Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg & Phillips (Springer-VerIag, Berlin); McCabe et al. (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação de Lecl (WOOO/28 058) . Também ver Weissinger et al. (1988) Ann Rev Genet 22:421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al. (1988) Plant Physiol 87:671-674 (soja); Finer & McMullen (1991) In Vitro Cell Dev Biol 27P:175-182 (soja); Singh et al. (1998) Theor Appl Genet 96:319-324 (soja); Datta et al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:4305-4309 (milho); Klein et al. (1988) Bioteehnology 6:559-563 (milho); Patentes americanas US 5.240.855; US 5.322.783; e, US 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol 91:440- 444 (milho); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764; Patente americana US 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197- 209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Rep 9:415- 418; e Kaeppler et al. (1992) Theor Appl Genet 84:560-566 (transformação mediada por fibra); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Rep 12:250-255; Christou & Ford (1995) Ann Bot 75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) Nat Biotechnol 14:745-750 (milho via A. tumefaciens) ; and Ch. 8, pp. 189- 253 in Advances ín Cellular and Molecular Biology of Plants, Vol. 5, Ed. Vasil, Kluwer Acad Publ (Dordrecht, The Netherlands) 1999.

Vários compostos podem ser usados na união com quaisquer métodos de liberação direta para introduzir dentro de células vegetais qualquer polinucleotideo, polipeptídeo, ou combinação dos mesmos, opcionalmente contendo outros componentes. Por exemplo, microprojéteis para um método de arma de partículas podem ser preparados através da associação de construções de DNA com microprojéteis na presença de uma solução lipidica catiônica, solução lipossômica, polímero catiônico, proteína de ligação ao DNA, proteína catiônica, peptídeo catiônico, ácido poliamino catiônico, ou combinação dos mesmos. Em alguns exemplos, microprojéteis para um método de arma de partícula são preparados através da associação de construções de DNA com os microprojéteis na presença de Tfx-10, Tfx-20, Tfx-50, Lipofectina, Lipofectamina, Celfectina, Efecteno, Citofectina GSV, Lipídeos Perfect, DOTAP, DMRIE-C, FuGENE-6, Superfect, Polyfect, polietileneimina, quitosana, protamina Cl, proteínas de ligação ao DNA, histona Hl, histona CENH3, pola-L lisina, DMSA, e semelhantes.

0 polinucleotideo pode ser introduzido em plantas através do contato de plantas com um vírus, ou ácidos nucléicos virais. Geralmente, tais métodos envolvem incorporação de um polinucleotideo desejado dentro de uma molécula de DNA viral ou RNA viral. A seqüência pode inicialmente ser sintetizada em uma poliproteína viral e depois processada in vivo ou in vitro para produzir uma proteína desejada. Promotores úteis englobam promotores utilizados para transcrição através de RNA polimerases virais. Métodos para introduzir polinucleotideos dentro de plantas e expressar em plantas uma proteína codificada, envolvendo moléculas de DNA ou RNA viral, são conhecidas, ver, pex., Patentes americanas US 5.889.191; US 5.889.190;

US 5.866.785; US 5.589.367; US 5.316.931; e Porta et al. (1996) Mol Biotech 5:209-221.

Vários componentes, incluindo aqueles de um sistema de recombinação sítio-especifico, podem ser providos para uma planta usando uma variedade de métodos transientes. Tais métodos de transformação transiente incluem, mas não estão limitados a, introdução da recombinase ou fragmento ativo ou variante dos mesmos diretamente, introdução do mRNA da recombinase, ou usando um método não integrativo, ou introduzir baixos níveis de DNA dentro da planta. Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção, bombardeamento de partículas, sistemas de vetores virais, e/ou precipitação do polinucleotídeo onde a transcrição ocorre do DNA ligado à partícula sem substantiva liberação da partícula ou integração dentro do genoma, tais métodos geralmente usam partículas cobertas com polietilimina, (ver, pex., Crossway et al. (1986) Mol Gen Genet 202:179- 185; Nomura et al. (1986) Plant Sci 44:53-58; Hepler et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:2176-2180; e Hush et al. (1994) J Cell Sci 107:775-784).

As células transformadas podem ser regeneradas em plantas usando meios e protocolos padrões, ver pex., McCormick et al. (1986) Plant Cell Rep 5:81-84. Essas plantas podem então ser crescidas e auto-polinizadas, retrocruzadas, e/ou cruzadas, e a progênie resultante tendo a característica desejada identificada. Duas ou mais gerações podem ser crescidas para assegurar que a característica é estavelmente mantida e herdada e então as sementes colhidas. Desta forma sementes transformadas/transgênicas tendo a construção de DNA relatado estavelmente incorporado dentro do seu genoma são providas. Uma planta e/ou uma semente tendo estavelmente incorporado a construção de DNA pode ser ainda caracterizada para expressão, potencial de integração sítio-específica, agronômica, e número de cópias (ver, pex., patente americana US 6.187.994).

Fragmentos e variantes de sítios de recombinação, recombinases, marcadores de seleção, e seqüências de nucleotídeo de interesse podem ser usados, e ao menos que estipulado ao contrário, indicar que a variante ou fragmento retenha pelo menos algumas das atividades/função da composição original. Em exemplos onde o polinucleotídeo codifica uma proteína, um fragmento de um polinucleotídeo pode codificar fragmentos de proteínas que retenham a atividade biológica da proteína de comprimento total. Fragmentos de um polinucleotídeo podem variar de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, e até o polinucleotídeo de comprimento total. Um fragmento de um polinucleotídeo que codifica uma porção ativa biologicamente de uma proteína tipicamente codifica pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 325, 350, 375, 400, 420, ou 450 de aminoácidos contíguos, ou qualquer inteiro nesta faixa até e incluindo o número total de aminoácidos presentes em uma proteína de comprimento total. Um fragmento ativo biologicamente de um polipeptídeo pode ser preparado através de isolamento de uma porção de um dos polinucleotídeos codificando a porção do polipeptídeo de interesse, expressando o fragmento de proteína, e avaliando a atividade.

Alternativamente, um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo pode ser produzido através de clivagem seletivamente química ou proteolítica do polipeptídeo de comprimento total, e a atividade medida. Por exemplo, polinucleotídeos que codificam fragmentos de um polipeptídeo recombinase podem compreender seqüências de nucleotídeo compreendendo pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, ou 1,400 nucleotídeos, ou qualquer inteiro nesta faixa até e incluindo o número total de um polinucleotídeo de comprimento total. Em adição, fragmentos de um sítio de recombinação retêm a atividade biológica do sítio de recombinação, passando por um evento de recombinação na presença da recombinase apropriada. Fragmentos de um sítio de recombinação podem variar de pelo menos cerca de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 nucleotídeos, até o comprimento total de um sítio de recombinação. Por exemplo, sítios de FRT de comprimento total, lox, attB, e attP são conhecidos e variam de cerca de 50 nucleotídeos a cerca de 250 nucleotideos, e totalmente mínimo ativo são conhecidos e variam de cerca de 20, 25, 30, 35, 40, 45, e 50 nucleotideos.

Ensaios para medir a atividade biológica dos sítios de recombinação e recombinases são conhecidos (ver, pex., Senecoll et al. (1988) J Mol Biol 201:406-421; Voziyanov et al. (2002) Nucleic Acids Res 30:7; patente Americana US .6.187.994; W001/00158; Albert et al. (1995) Plant J 7:649- .659; Hartang et al. (1998) J Biol Chem 273:22884-22891; Saxena et al. (1997) Biochim Biophy Acta 1340:187-204; e Hartley et al. (1980) Nature 280-860-864). Ensaios para atividade da recombinase geralmente medem a atividade global da enzima em substratos de DNA contendo sítios de recombinação. Por exemplo, para analisar para atividade FLP, uma inversão de uma seqüência de DNA em um plasmídeo circular contendo dois sítios invertidos de FRT pode ser detectada como uma mudança na posição dos sítios de enzima de restrição (ver, pex., Vetter et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:7284). Alternativamente, excisão de DNA de uma molécula linear ou freqüência de recombinação intermolecular induzida pela enzima pode ser analisada (ver, pex., Babineau et al. (1985) J Biol Chem 260:12313; Meyer-Leon et al. (1987) Nucleic Acids Res 15:6469; and Gronostajski et al. (1985) J Biol Chem 260:12328). Atividade recombinase pode também ser medida por excisão de uma seqüência flanqueada por sítios recombinogênicos FRT para ativar um gene marcador analisável. EXEMPLOS

A presente invenção é ainda definida nos seguintes Exemplos, onde partes e porcentagens são por peso e graus são Celsius, a menos que estipulado de outra forma. Deve ser entendido que esses Exemplos, enquanto indicar concretizações preferidas da invenção, são dados de forma ilustrativa apenas. Da discussão acima e desses Exemplos, um especialista no assunto pode apurar as características essenciais desta invenção, e sem sair do espírito e escopo da mesma, pode fazer várias mudanças e modificações da invenção para adaptá-la a vários usos e condições. Então, várias modificações da invenção em adição aquelas mostradas e descritas aqui serão aparentes para aqueles especialistas no estado da técnica da descrição precedente. Tais modificações são também destinadas a cair dentro do escopo das reivindicações anexadas.

O significado das abreviações é o seguinte: "seg" significa segundo(s), "min" significa minuto(s), "h" significa hora(s), "d" significa dia(s), "μΐ" significa microlitro (s), "mL" significa mililitro(s) , "L" significa litro(s), "μΜ" significa micromolar, "mM" significa milimolar, "M" significa molar, "mmol" significa milimol(s), "pmole" significa micromol(s), "g" significa grama(s), "pg" significa micrograma(s), "ng" significa nanograma(s), "U" significa unidade(s), "bp" significa pares de base (s) e "kB" significa kilobase(s). EXEMPLO 1. Identificação e isolamento de centrômeros de milho

Para avaliar o tamanho, composição, e organização estrutural de centrômeros individuais, sondas especificas marcadas para CentC, CentA, CRMl, e/ou CRM2, foram usadas individualmente e/ou em um coquetel para hibridização fluorescente in situ (FISH) em cromossomos no paquiteno, metáfase e anáfase I da meiose de milho e para moléculas de DNA entendidas (fibra-FISH). Essas quatro sondas foram também usadas para rastrear bibliotecas BAC genômicas de milho.

A. Hibridização In situ

Multi-color FISH para cromossomos na metáfase de milho revelam que essas quatro repetições centroméricas são especificas de centrômeros e estão co-localizadas em regiões centroméricas em todos os cromossomos em células somáticas. Análises FISH mostraram que os retrotransposons CRMl, CRM2, e CentA, ocupam aproximadamente a mesma região em centrômeros de milho. Existe significante variação na composição da repetição e tamanho relativo das regiões de repetição entre centrômeros de diferentes cromossomos de milho.

Resultados FISH mostraram que a sonda CentA teve o sinal de hibridização mais fraco; a sonda CRMl mostrou um padrão de hibridização como gradiente com o sinal mais forte ao redor da constricção primária do cromossomo em metáfase, com o sinal desvanecendo gradualmente na periferia das regiões do centrômero, e a sonda CRM2 mostrou o sinal de hibridização mais claro e compacto. A força do sinal FISH das repetições CentC foi altamente dependente do número de cópias CentC, que é variável entre os centrômeros de diferentes cromossomos de milho. Em alguns centrômeros CentC está firmemente aglomerada, mostrando ligeira sobreposição com outras repetições centroméricas, em outros cromossomos a distribuição da repetição CentC mostra mais sobreposição com todas as outras repetições. FISH de cromossomos meióticos na anáfase I em microsporócitos com todas as quarto repetições centroméricas revelou que a região centromérica neste estágio é altamente estendida e apenas um pequeno segmento da região centromérica inteira está realmente ligado ao cinetócoro. Todas as quatro repetições co-localizadas no segmento ligado ao microtúbulo, sugerem que uma região do centrômero funcional nativo compreende todas as quatro repetições centroméricas. Fibra-FISH em moléculas de DNA estendidas foi usada para caracterizar melhor a distribuição e arranjo das repetições centroméricas em uma resolução mais alta.

Aveia pelo cruzamento de milho gerou embriões Fl que retinham um ou mais cromossomos de milho (ver, pex., Riera- Lizarazu et al. (1996) Theor Appl Genet 93:123-135; Ananiev et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:3524-3529). Essas linhagens fornecem um meio para estudar cromossomos de milho individuais sem as complexidades de fundo dos outros nove cromossomos de milho. Um número de linhagens adicionais de aveia-milho está disponível da Ron Phillips at University of Minnesota (St. Paul, MN, USA), incluindo as linhagens adicionais de aveia-milho Seneca 60, A188, e B73 usadas aqui.

DNA do cromossomo das linhagens adicionais aveia-milho foi usado para análise das regiões centroméricas de cromossomos de milho individuais. Multicolor fibra-FISH em cromossomo de linhagens de aveia-milho adicionais revelou trechos de hibridização ao longo de megabase de repetições centroméricas únicas para cada cromossomo (Figura 11). Nos cromossomos 1, 7, e 8 todas as quarto repetições foram intercaladas ao longo da região centromérica inteira. Em outros cromossomos, CentC estava presente como trechos relativamente curtos (cerca de 300 kb) flanqueados por arranjos "avulsos" de outras três repetições centroméricas. O comprimento total das regiões centroméricas variou grandemente entre diferentes cromossomos de milho como observado através de FISH. CentC revelou significante polimorfismo entre centrômeros de cromossomos individuais na abundância dessa repetição, com uma diferença de 10 vezes o observado dentro de qualquer dado genótipo. O cromossomo 7 teve o maior bloco das repetições em tandem CentC nos cromossomos em metáfase e paquiteno. Similarmente a linhagem adicional aveia-milho com cromossomo 7 teve o trecho mais longo de fibras de DNA que hibridizou com a sonda CentC. Inversamente, o centrômero do cromossomo 4 de milho teve o menor bloco das repetições CentC nos cromossomos na metáfase e a menor extensão de CentC no cromossomo 4 das linhagens adicionais de aveia-milho, especialmente no cromossomo 4 da linhagem de milho B73. Quando analisados por fibra-FISH os retrotransposons centroméricos CentA, CRMl, e CRM2 mostraram um padrão semelhante a pontilhados com grandes lacunas entre os sinais de hibridização positivos. Quando sondas para esses três retrotransposons foram misturadas juntas e usadas como uma sonda coquetel elas revelaram mais fibras de DNA marcadas contiguamente intercaladas com blocos de repetições CentC. Os flanqueios de retrotransposons centroméricos marcados contiguamente mostrando um padrão tipo pontilhado ao longo das moléculas de DNA indicou que retrotransposons centroméricos foram intercalados com outros tipos de seqüências de DNA, incluindo elementos específicos não centroméricos. Os retrotransposons centroméricos podem formar arranjos avulsos de até 1 Mb em centrômeros de cromossomos com pequenos blocos de repetições CentC, tais como cromossomo 4. 0 híbrido de milho Zapalote chico tem um cromossomo-B super numérico. FISH de cromossomos meióticos Zapalote chico indicou que o centrômero funcional do cromossomo B de milho contém todas as quatro repetições centroméricas, similar àquelas observadas em todos os cromossomos-A. No entanto, grupos de repetições CentC podem ser encontrados também em vários sítios não centroméricos no braço longo do cromossomo B. Aqueles sítios são aparentemente livres de outras repetições centroméricas.

Os resultados de FISH nos cromossomos mitóticos e meióticos, e fibra FISH sugeriram que o segmento centromérico nativo funcional responsável pela formação do cinetócoro no cromossomo de milho geralmente compreende arranjos de repetições em tandem CentC intermisturada com três outras repetições centroméricas, CRMl, CRM2 e CentA (Figura 12).

B. Bibliotecas BAC

Vetores BAC permitem a clonagem de grandes fragmentos de DNA genômico, até cerca de 300 kb em tamanho, que pode ser mantido em um hospedeiro bacteriano, tipicamente E. coli. Uma ampla variedade de bibliotecas BAC têm sido geradas de espécies de plantas e animais e estão disponíveis ao público, ver, por exemplo a informação na Cleidson University Genome Institute (CUGI; ver website na genome.clemson.edu) e Children1S Hospital Oakland Research Institiute (CHORI; ver website na chori.org). Bibliotecas BAC genômicas de milho representando mais do que 13X a cobertura usando múltiplas enzimas para construção da biblioteca de dois genótipos de milho diversos, B73 e Mol7, representando os grupos heteróticos Dent e Lancaster respectivamente, foram rastreadas para seqüências centroméricas de milho.

i. Biblioteca BAC genômica de milho Moll

Os vetores de clonagem BAC pIndigoBac536 (Shizuya, unpublished) e pBeloBACll (Kim et al. (1996) Genomics .34:213-218) foram desenvolvidos de pBAC108L (Shizuya et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 8 9:8794-8797). O pBAC108L é um mini fator F baseado em plasmídeo. O fator F codifica para os genes que regulam sua própria replicação e número de cópias na célula. O vetor pBeloBACll foi gerado pela introdução do gene LacZ para facilitar a identificação do clone recombinante pelos fenótipos azul ou ausência de cor (branco). O pBeloBACll tem três sítios de clonagem únicos: BamHI, SphI, e HindIII, que são flanqueados pelos promotores T7 e SP6. Os sítios de restrição de corte raro NotI, EagIr XmaIr SmaIr Bgl I, e SfiI podem ser usados para excitar o inserto de pBeloBACll. No vetor pIndigoBac536, um sítio EcoRI tem sido modificado no gene cloranfenicol (CMr) para que o sítio EcoRI no sítio de clonagem possa ser usado para construção da biclioteca. Os vetores pBeloBACll e pIndigoBac536 têm dois marcadores de seleção, LacZ e CMr para seleção dos transformantes.

Uma biblioteca BAC genômica proprietária de milho da linhagem pura pública de milho Mol7 foi construída em pBeloBACll ou pIndigoBac536 essencialmente como descrita em Kim et al. ((1996) Genomics 34:213-218) sobre contrato com o laboratório Shizuya no Instituto de Tecnologia da Califórnia. Brevemente, DNA genômico Mol7 foi parcialmente digerido com as enzimas de restrição HindIII ou EcoRI. Os fragmentos de DNA foram fracionados por tamanho em gel de agarose e clonados em sítios HindIII no pBeloBACll ou nos sítios EcoRI no pIndigoBac536. 0 tamanho médio do inserto foi cerca de 150 kb. A biblioteca BAC genômica inteira de Mol7 consiste de 433 placas de 384 poços ou 166,272 clones BAC totais. A primeira metade da biblioteca compreende de 214 placas contendo clones BAC com insertos HindIII, enquanto que a segunda metade da biblioteca compreende 219 placas, contém clones BAC com insertos EcoRI. Os clones BAC são mantidos em E. coli DHlOB (BRL Life Technologies).

ii. Bibliotecas BAC genômicas de milho B73

Duas bibliotecas públicas BAC genômicas de milho B73 foram obtidas. A biblioteca ZMMBBb está disponível do Clemson University Genome Institute (CUGI, University of Geórgia, Athens, GA, USA) . A biblioteca BAC ZMMBBb foi criada no CUGI através da clonagem parcialmente digerida com HindIII do DNA genômico de milho B73 no vetor pIndigoBac536 compreendendo um gene de resistência ao cloranfenicol (CMr). A biblioteca BAC ZMMBBb compreende .247,680 de clones BAC totais com uma media do tamanho do inserto de cerca de 137 kb, representando um cobertura genômica de 14X. A segunda biblioteca BAC B73 BAC, CHORI- .201 (ZMMBBc) criada por Pieter de Jong's laboratory no Children's Hospital Oakland Research Institiute (CHORI), está disponível do BACPAC Resource Center at CHORI. Para construir esta biblioteca, DNA genômico foi isolado do núcleo de milho B73. 0 primeiro segmento da biblioteca foi construído usando DNA parcialmente digerido com uma combinação de £coRI e EcoRI metilase, o segundo segmento foi construído usando DNA parcialmente digerido com MboI. DNA selecionado por tamanho foi clonado dentro do vetor pTARBAC2.1 (segmento 1, placas 1-288) entre os sítios EcoRI e dentro do vetor pTARBAC1.3 (segmento 2, placas 289-576) entre os sítios BamRI. Os produtos de ligação foram transformados dentro de células de E. coli DHlOB eletrocompetentes (BRL Life Technologies) . Os clones BAC para cada segmento de biblioteca em cada vetor têm sido arranjados em 288 placas de 384-poços microtitulados. O segmento 1 compreende 106,637 clones BAC individuais com uma media de tamanho de inserto de 163 kb, representando uma cobertura genômica de 6.9X. 0 segmento 2 compreende 105,579 clones BAC individuais com uma média de tamanho de inserto de 167 kb, representando uma cobertura genômica de 7. ΟΧ. A biblioteca total ZMMBBc compreende 212,216 clones BAC individuais com uma média de tamanho de inserto de 165 kb, representando uma cobertura genômica de 13.9X.

C. Rastreamento de biblioteca BAC

Bibliotecas de milho B73 e Mol7 BAC foram rastreadas com quarto sondas separadas para seqüências centroméricas CentA, CentC, CRMl, e CRM2. As sondas foram desenhadas como oligonucleotideos 0VERG0 de 40 bp de comprimento e foram únicas para cada elemento de centrômero. Através do uso de marcações apropriadas, essas sondas podem ser usadas para colônia, e hibridização blot, e FISH e fiber-FISH.

i. Sondas Overgo

Sondas Overgo são tipicamente desenhadas como dois oligonucleotideos curtos que têm uma região de sobreposição de 8 bp de complementariedade. Os oligonucleotideos curtos estão tipicamente na variação de 23-28 bp, com 24 bp sendo mais comumente usado. Após anelamento, os oligonucleotideos formam dimeros com DNA de fita simples de 16 bp em ambos os lados. A sonda parcialmente de fita dupla é marcada pelo preenchimento dc recesso da extremidade 3' usando atividade de polimerização da enzima Klenow na presença de nucleotideos marcados. A sonda overgo final compreende uma sonda marcada de fita dupla de 40 bp. TABELA 1 lista iniciadores e sondas usados para geração, rastreamento, e caracterização dos clones BAC, construções de DNA, e eventos de minicromossomos de milho.

TABLE 1

<table>table see original document page 113</column></row><table> <table>table see original document page 114</column></row><table> <table>table see original document page 115</column></row><table> <table>table see original document page 116</column></row><table> <table>table see original document page 117</column></row><table>

ii. Resultados do rastreamento da biblioteca BAC

O rastreamento da hibridização da colônia identificou um grupo de aproximadamente 8000 clones BAC que hibridizaram com pelo menos uma das quatro sondas específicas de centrômero. Os 8000 clones BAC foram classificados em 4 grupos baseados em seu perfil de hibridização (Tabela 2).

TABELA 2

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Baseados na composição da repetição centromérica os clones BAC foram ainda classificados em 5 grupos baseados na composição das sondas que hibridizaram com cada clone BAC particular (Tabela 3).

TABELA 3

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Os clones BAC foram ainda classificados baseados no somatório dos clones BAC que hibridizaram para cada sonda particular (Tabela 4).

TABELA 4

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Um grupo de 247 clones BAC contém todas as quatro repetições centroméricas. Eles compreendem 0.15% do genoma do milho ou podem estar presentes em um segmento de DNA de cerca de 300 kb por centrômero em média. Este grupo de clones BAC foi identificado como o grupo principal a ser usado primeiro em experimentos para construir um minicromossomo de milho. 0 DNA foi purificado de todos os 247 BACs no grupo principal, digeridos com XmnI ou RsaI, transferencia de DNA (blotted) e hibridizado com cada uma das quatro repetições centroméricas. Hibridização southern blot, confirmou que clones neste grupo principal continham todas as quatro repetições centroméricas. Os BACs mostraram diferenças gerais na composição do fragmento de restrição e padrões de hibridização, e foram ainda classificados dentro de 87 grupos com base na similaridade dos fragmentosde restrição. Um representante de cada um dos 87 grupos (Tabela 5) foi tomado para gerar um grupo principalde construções de DNA e/ou grupos de grupos principaisde construções BAC para transformação e montagem de minicromossomo.

TABELA 5

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D. Identificação de arranjos invertidos de repetições CentC

Bibliotecas BAC de linhagens de milho Mol7 e B73 foram buscadas para arranjos em tandem invertidos de CentC. Uma busca no BLAST de um banco de dados de seqüências da extremidade BAC Mol7 revelaram 591 extremidades BAC contendo repetições. Dessas, apenas 45 clones BAC continham repetições CentC em ambas as extremidades, e 44 BACs tinham repetições CentC na mesma orientação, com apenas um BAC tendo repetições CentC em uma orientação invertida (bacm.pkl28.j21). Um segundo clone BAC, bacm.pk008.d20 tendo repetições CentC em uma orientação invertida foi encontrado por análises de hibridização em Southern. As análises de Southern deste clone mostraram um padrão de hibridização muito similar ao padrão observado para bacm.pkl28.j21. Uma busca no BLAST do banco de dados de seqüências públicas de extremidades BAC B73 revelou 136 extremidades BAC contendo repetições CentC. Dessas, apenas .5 clones BAC continham repetições CentC e ambas as extremidades, e 4 BACs tinham repetições CentC na mesma orientação, com apenas um BAC tendo repetições CentC na orientação invertida (ZMMBBb0243L15). O DNA de bacm.pkl28.j21 e bacm.pk008.d20 foram digeridos com a enzima de restrição XmnI, que cliva repetições CentC em curtos fragmentos monoméricos ou diméricos. Um fragmento Xmn I de 10 kb foi isolado, subclonado e seqüenciado. A análise da seqüência mostrou que o elemento CRMl (SEQ ID NO: 191) está localizado entre duas repetições invertidas CentC.

E. Isolamento de clones BAC centroméricos do cromossomo 4 de milho

O cromossomo 4 de milho contém o arranjo de repetição mais curto de repetições CentC. Esses arranjos estão presentes em um simples trecho de DNA de aproximadamente 300 kb como estimado por fibra-FISH. Este segmento pode conter as seqüências de DNA centromérico funcional principais, e poderia potencialmente ser representado por 2-4 clones BAC sobrepostos. Os clones BAC centroméricos específicos do cromossomo 4 podem ser identificados através seqüências de DNA únicas encontradas localizadas na região centromérica do cromossomo 4.

A biblioteca BAC genômica do milho Mol7, compreendendo 10,965 extremidades de seqüências BAC foi analisada para identificar extremidades únicas de seqüências BAC representadas apenas uma vez na biblioteca. Oitenta e uma extremidades de seqüências BAC únicas foram identificadas e selecionadas para caracterizações posteriores. Um par de iniciadores de PCR foi desenhado para cada uma das 81 extremidades de seqüências BAC únicas para mapeamento no painel de linhagens adicionais de cromossomos aveia-milho e cada seqüência única designada para um cromossomo de milho individual.

A extremidade de seqüência BAC de bacm.pkl08.hl5 (170 kb) de Mol7 foi mapeada para o cromossomo 4. Este BAC foi sequenciado e 6 seqüências únicas, bem como todas as quatro repetições centroméricas CentA, CentC, CRMl e CRM2 foram encontradas. Usando PCR, este BAC foi designada para um contig contendo diversos BACs que também hibridizam com CentC. Seqüenciamento confirmou que dois ou mais clones BAC deste contig, bacm.pkOlO.m7 (170 kb), e bacm.pkl84.c21 (150 kb) sobrepunham parcialmente com bacm.pkl08.hl5 e compartilham alguns marcadores únicos. Três seqüências de DNA únicas foram identificadas dentro desses três clones BAC e sua localização no cromossomo 4 foi confirmada por PCR em DNA da linhagem adicional de aveia-milho. Sondas overgo correspondentes (SEQ ID NOs: 102-104 na Tabela 1) foram desenvolvidas e usadas para rastreamento de uma biblioteca BAC pública B73.

Sete cloneas BAC da biblioteca BAC B73 foram selecionados baseados na hibridização para todas as três sondas especificas do cromossomo 4. O DNA desses clones BAC foi digerido com XmnI, transferido para uma membrana e hibridizado com todas as quatro sondas da repetição centromérica. Quatro dos clones BAC B73 selecionados contém os elementos repetidos centroméricos CentC, CRM1, e CRM2: bacb.0424.d20 (150 kb) ; bacb.0155.hl5 (175 kb) ; bacc.0048.g5 (170 kb); e bacc.0237.m8 (125 kb) . Outros três clones BAC B73 contém apenas os elementos repetidos centroméricos CRMl e CRM2: bacc.0143.i9 (205 kb) ; bacc.0237.j16 (175 kb) ; e bacc.0270.cl (180 kb) .

Seqüenciamento do clone BAC bacb.0155.hl5 confirmou que ele contem regiões significantes de homologia para os clones BAC Mol7 específicos do cromossomo 4 bacm.pkOlO.m7, e bacm.pkl08.hl5.

Dois grupos de clones BAC representando a região centromérica do cromossomo 4 das linhagens puras Mol7 e B73 foram usados para a produção de construções de DNA para montagem de minicromossomo.

F. Isolamento e purificação dos fragmentos de DNA centroméricos cromossômicos

Essencialmente todo DNA genômico de milho é fortemente metilado, e este padrão de metilação pode desempenhar um papel na montagem, função, e/ou manutenção dos centrômeros de milho. DNA genômico de milho isolado mantendo a metilação e/ou outras características genômicas nativas, tais como tamanho, organização dos elementos, e outras modificações de nucleotídeo nativas, pode ser usado para gerar construções de DNA para montagem do minicromossomo de milho.

Seleção das enzimas de restrição

Análises de seqüência de repetições centroméricas de milho identificaram um grande número de enzimas de restrição (seis enzimas) com nenhum sitio de reconhecimento dentro de qualquer das repetições centroméricas CentAf CentC, CRMl, ou CRM2 (Tabela 6). Essas enzimas de restrição deveriam digerir o volume do DNA genômico em pequenos fragmentos de DNA, a maioria das quais sendo cerca de 1-20 kb em tamanho, enquanto o DNA centromérico é esperado ser significantemente mais longo. Regiões centroméricas cromossômicas de milho podem ser isoladas por digestão parcial ou completa do DNA genômico de milho de alto peso molecular (HMW) com pelo menos uma dessas enzimas de restrição. A fração do DNA genômico HMW digerido compreendendo grandes fragmentos de aproximadamente 50 kb - cerca de 1000 kb podem ser purificados após o campo de gel de eletroforese pulsado (PFGE) de núcleos de milho embebidos em blocos de agarose.

ii. Preparação e caracterização de DNA HMW genômico de milho DNA HMW genômico de milho de Mol7 foi preparado essencialmente como descrito por Liu & Whittier ( (1994) Nucleic Acids Res 22:2168-2169) do DNA embebido em blocos de agarose através da digestão com várias enzimas de restrição da TABELA 6 e fracionização por PFGE. Cinco enzimas de restrição, BspTIf AatIIf Cfr91, MbiI, MluI, foram selecionadas para análises iniciais. Dessas, BspTI foi selecionada para todas as outras preparações. Hibridação Blot com sonda centromérica CentC marcada revelaram que a enzima de restrição BspTI produziu um grupo de fragmentos de DNA centroméricos genômicos variando de cerca de 50 kb a cerca de 600 kb que foram bem separados do resto do DNA genômico. Hibridização dos mesmos fragmentos de DNA com três outras sondas centroméricas (CentA, CRMl, e CRM2) confirmaram que esses longos fragmentos de DNA compreendendo todas as quatro repetições centroméricas não tiveram essencialmente nenhum sitio de restrição BspTI. As bandas de hibridização podem representar fragmentos de DNA centroméricos individuais que podem ser isolados e usados para gerar construções de DNA para montagem de minicromossomo.

TABELA 6

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EXEMPLO 2. Identificação e isolamento de seqüências teloméricas

Qualquer região telomérica funcional, nativa, clonada, ou sintética, compreendendo uma repetição telomérica pode ser usada para fazer construções de DNA. Diversas repetições teloméricas são conhecidas, incluindo aquelas de Tetrahymena, Paramecium, Oxytricha, Euplotes, Dictyostelium, Saccharomycesf Caenorhabditis, Trypanosoma, Leishmania, Physarum, Arabidopsis, humanos, e ratos.

Repetição telomérica_Organismos exemplares

CCCCAA (C4A2) Tetrahymena, Paramecium

CCCCAAAA (C4A4) Oxytrichaf Euplotes

CCCTA (C3TA) Trypanosoma, Leishmania, Physarum

C^_3A Saccharomyces

Ci_gT Dictyostelium

CCCTAAA (C3TA3) Arabidopsis, humanos,

ratos,Caenrhabditis

A. Seqüências teloméricas sintéticas

A natureza altamente conservada, repetitiva das seqüências teloméricas permite a síntese química e/ou amplificação de PCR de longas regiões teloméricas disponíveis para construção do vetor. Longos tratos de repetições teloméricas, pex., (CCCTAAA)n para flanquear extremidades de minicromossomos podem ser geradas.

Longos trecho de repetições teloméricas em tandem podem ser produzidos por diversos ciclos de amplificação PCR usando pares iniciadores das SEQ ID NOs: 5 e 6 por mútuo preparamento de dois oligonucleotídeos teloméricos complementares e seus produtos. Uma reação PCR usando uma baixa concentração de iniciadores (< Ο.ΙμΜ) pode produzir segmentos de DNA de cerca de 100-10000 bp. Preferencialmente, repetições teloméricas sintéticas podem ser produzidas por ligação dos oligos fosforilados.

Segmentos de DNA teloméricos foram clonados e usados para produzir construções de DNA.

B. Identificação e isolamento de seqüências subteloméricas i. Clones BAC contendo repetições teloméricas Clones BAC contendo regiões subteloméricas compreendendo repetições teloméricas podem ser usados para estabilizar extremidades cromossômicas de uma construção de minicromossomo. Um número de seqüências foram previamente identificadas como repetições subteloméricas (Burr et al. (1992) J Plant Cell 4:953-60). O banco de dados Genbank sequence pesquisado por palavra chave para seqüências teloméricas e subteloméricas. Seqüências selecionadas foram alinhadas e um elemento repetitivo comum identificado (Telo266, SEQ ID NO:189). Usando SEQ ID NO:189, diversos oligonucleotídeos foram desenhados e usados como sonda para rastrear a biblioteca Mol7 BAC. Um número de BACs foi recuperado, um foi selecionado (bacm.pkl07.gl) , marcado, e hibridizado para cromossomos paquitenos. Seqüências do clone BAC foram encontradas em grupos de 6 dos 20 subtelômeros em cromossomos de milho. 0 inserto do BAC bacm.pkl07.gl foi subclonado e sequenciado. Análises de seqüência revelaram um elemento repetitivo comum (TR430, SEQ ID NO:190) que foi usado para desenhar sondas overgo (Tabela 1) . Localização subtelomérica daquelas repetições foi confirmada por FISH para cromossomos paquitenos de milho Mol7 e B73. Usando as mesmas sondas, bibliotecas BAC genômicas de milho Mol7 foram rastreadas por hibridização de colônia.

Aproximadamente 71 clones BAC contendo blocos de repetições subteloméricas de milho foram confirmados como tendo a repetição subtelomérica TR430 (Tabela 7).

TABELA 7

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Impressão digital de restrição com DpnI e hibridização blot com sondas TR430, sonda (CCCTAAA)n, e sondas para repetições knob 180 bp apresentaram pelo menos 3 tipos de clones BAC subteloméricos. O primeiro tipo tem longos tratos de repetições relacionadas de TR430 mais longas do que 10-20 kb. 0 segundo dos clones BAC tem repetições TR430 relacionadas que têm um sitio de restrição dentro da unidade, onde a unidade pode ser 800 bp ou 900 bp. Alguns clones BAC continham ambas dessas duas repetições. O terceiro tipo de clones BAC tem unidade relatada TR430 bp ao redor de 500 bp. Alguns desses clones BAC também têm repetições teloméricas relacionadas (CCCTAAA)n. Repetições knob de 180 bp estão também presentes em 37 clones BAC subteloméricos sugerindo que as repetições de 180 bp podem ser uma parte de algumas regiões subteloméricas. Clones BAC representativos de cada tipo foram pegos para análises posteriores, experimentos readaptados, e experimentos transgênicos: bacm.pk038.g6; bacm2.pk063.g24; bacm.pk071.cl2; bacm.pkll2.bl8; bacm.pkl42.bl5; bacm.pkl73.e9. Insertos BAC com fragmentos subteloméricos podem ser usados em construções de DNA para montagem de minicromossomos ín vitro, ou montagem de uma célula vegetal. ii. Isolamento dos fragmentos de DNA teloméricos cromossômicos nativos

Fragmentos teloméricos cromossômicos que retenham pelo menos uma característica genômica nativa, tais como padrão de metilação, foram purificados de DNA genômico de milho através de fracionamento de tamanho do DNA genômico de milho digerido com enzimas de restrição que tenham um curto sítio de reconhecimento de 4 bp ou menor. Seqüência telomérica de milho nativo compreende centenas ou milhares de repetições em tandem de CCCTAAA em cada telômero, essas curtas repetições em tandem no telômero não têm nenhum sítio de reconhecimento para qualquer enzima de restrição conhecida. Quaisquer enzimas de restrição de pequeno corte que reconhece uma seqüência de 2-4 bp pode ser usada, enquanto elas não tiverem especificidade para repetição em tandem telomérica canônica (CCCTAAA)n. Pequenos cortadores digerem a maioria do DNA genômico em pequenos fragmentos que podem ser separados do grande DNA telomérico. O uso de uma combinação de duas ou mais enzimas de restrição de corte pequeno pode eliminar outros fragmentos de DNA não teloméricos não fragmentados pela primeira enzima de restrição. Não existem enzimas de restrição conhecidas tendo um sítio de reconhecimento dentro da repetição telomérica em tandem canônica.

DNA genômico de milho de Mol7 foi digerido com a enzima de restrição Sau3R, a maioria do DNA genômico é reduzido a pequenos fragmentos bem abaixo de 1 kb, enquanto a maioria dos fragmentos de DNA telomérico são maiores do que cerca de 15 kb como determinado pela hibridização blot. 0 comprimento total dos segmentos de DNA telomérico Sau3A por genoma haplóide é cerca de 400 kb, ou 0.02% do genoma haplóide de milho total. Aproximadamente 1 mg do DNA genômico de milho total produz aproximadamente 200 ng de fragmentos de DNA telomérico na fração restante não digerida. A fração de DNA telomérica genômica pode ser purificada do gel e usada para gerar construções de DNA para montagem de minicromossomos.

EXEMPLO 3. Origem de replicação

As construções de DNA são readaptadas com segmentos de DNA carregando origens de replicação para permitir replicação própria da construção e/ou minicromossomo no núcleo de células vegetais transgênicas. Qualquer origem de replicação que funciona em uma célula vegetal pode ser usada. Origens de replicação disponíveis são conhecidas e incluem origens de replicação vegetais, e origens de replicação virais. Opcionalmente, se uma construção for mantido em uma célula hospedeira não vegetal pelo menos uma origem de replicação apropriada pode ser incluída na construção, por exemplo origens de replicação bacteriana e/ou de levedura.

A. Espaçador não transcrito do rDNA 18-26S

Uma origem de replicação eucariótica bem estabelecida é um espaçador não transcrito do rDNA 18-26S (Ivessa & Zakian (2002) Genes Dev 16:2459-2464) que é provavelmente funcional em plantas (Hernandez et ai. v±993) EMBO J .12:1475-85). As seqüências de DNA 18-26S rDNA NTS podem ser isoladas de uma variedade de diferentes espécies de plantas, tais como Zea mays, Triticum aestivum, Avena sativa, Hordeum vulgare, Arabidopsis thaliana, e/ou Glycine max. Essas seqüências são clonadas em construções como cópias dispersas únicas ou múltiplas. Cromossomos eucarióticos tipicamente têm múltiplas origens de replicação, por essa razão a inclusão de múltiplas origens de replicação nos construções de DNA pode ser útil. A menos que disposto de outra forma, a seqüência 18-26S rDNA NTS de milho é usada nos construções de DNA (Toloczyki & Feix (1986) Nucleic Acids Res 14:4969-86).

B. Iniciador de proteína (Rep) do "Wheat dwarf virus" (WDV) Iniciador de proteína (Rep) do "Wheat dwarf virus" (WDV) e sua origem de replicação cognata podem ser usados para gerar construções de DNA para montagem de minicromossomos. 0 iniciador de proteína (Rep) do "Wheat dwarf virus" (WDV) e sua origem de replicação cognata podem ser usados para suportar replicação de construções de minicromossomos em células de milho. A origem de replicação WDV pode ser provida na construção de DNA (em eis), enquanto genes necessários para o iniciador da proteína Rep e proteína RepA estimuladora do ciclo celular podem ser providos através da co-transformação em construções de plasmídeo independentes (in trans) (Sanz-Burgos & Gutierrez (1998) Virology 243:119-129.). EXEMPLO 4. Polinucleotideos e polipeptideos que estimulam crescimento

Polinucleotideos e/ou polipeptideos que realçam o crescimento celular através da promoção da divisão celular, entrada na fase S, estimulação da divisão celular e/ou crescimento em cultura, ou melhora da transformação podem ser providos antes, durante, ou depois da introdução de construções de DNA compreendendo seqüência centromérica de milho e/ou fragmento subtelomérico. Qualquer tal composição, ou combinação dos mesmos pode ser usada incluindo polinucleotideos, polipeptideos, e/ou outros fatores usando qualquer método de liberação adequado.

A. Proteína A associada à replicação.

Proteína A de replicação do "wheat dwarf vírus" (WDV) pode ser provida para fortalecer crescimento celular e/ou recuperação de eventos transgênicos. Ambas as RepA que retém atividade de replicação e uma RepA modificada que não auxilia na replicação viral podem ser usadas. Por exemplo, um plasmídeo carregando promotor nos::RepA pode ser co- liberado em células vegetais com construções de DNA. Expressão transiente de RepA durante os primeiros três dias é esperada ser suficiente para estimular divisão celular e aumentar evento de recuperação (ver, por exemplo, WO00/50614, aqui incorporada por referência).

B. Ciclinas

Proteínas ciclinas, envolvidas na modulação do ciclo celular podem fortalecer crescimento celular e recuperação de eventos transgênicos. Por exemplo, ciclina D de milho pode estimular divisão celular e crescimento de calo na cultura e melhorar a transformação de milho. Expressão ectópica de E2F induziu proliferação celular em Arabidopsis, este efeito foi aumentado pela co-expressão de DPa (de Veylder et al. (2002) EMBO J 21:1360-1368). Muitos homólogos de ciclo celular, incluindo ciclina D, ciclina E, weel, Rb, Rbr3, E2F/DP, e semelhantes têm sido isolados de plantas (Patente americana US 6.518.487; W099/61619; WOOO/37645; W002/074909; Xie et al. (1996) EMBO J 15:4900- 4908; todas as quais são aqui incorporadas por referência), e podem ser introduzidos dentro de vetores para liberação em células vegetais.

C. Wuschel

Genes que causam vias de desenvolvimento especifico são úteis no fortalecimento do crescimento celular. Por exemplo, membros da família WOX, tais como wuschel (WUS) parecem estimular divisão celular em ambas as células expressando WUS e células adjacentes. Uma construção compreendendo um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo WUS pode ser usado para estimular divisão celular através de co-transformação com os construções de DNA. Diversos homólogos WUS são conhecidos em plantas, tais como Arabidopsis e milho (pex., Mayer et al. (1998) Cell 95:805-815; W001/0023575; e US2004/0166563, todas as quais são aqui incorporadas por referência) , e podem ser usadas para melhorar o crescimento de células transformadas. Por exemplo, uma construção compreendendo um gene WUS de milho foi construída:

PHP21139 ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::WUS::pinlI

D. Protéína 2 do desenvolvimento de óvulo

Outros genes de interesse incluem aqueles revelados à família AP2/ERF dos fatores de transcrição que são preferencialmente expressos em embriões em desenvolvimento e sementes, incluindo Proteína 2 do desenvolvimento de óvulo (ZmODP2) que é expresso precocemente em embriogênese de milho. Quando ectopicamente expresso, ODP2 pode estimular crescimento celular em uma variedade de tecidos, incluindo tecidos não embriônicos, que podem facilitar a recuperação de eventos transgênicos. Essa família de genes inclui baby boom (BBM, BNM3, ODP2) que tem sido mostrado induzir embriões somáticos ectópicos em plantas (Boutilier et al. (2002) Plant Cell 14:1737-1749). Homólogos BBM/0DP2 são conhecidos, incluindo homólogos de milho (W000/75530, aqui incorporada por referência) e podem ser liberadas para células vegetais para melhorar crescimento celular. Por exemplo, uma construção compreendendo um gene de milho 0DP2 foi construída:

PHP21875 ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::ODP2::pinll

E. Knotted-I

Genes Homeobox, incluindo membros da família gênica knox, tais como KNl, KNAT1, e STM atuam na iniciação do meristema e/ou manutenção em plantas (Jackson et al. (1994) Dev 120:405-413/ Lincoln et al. (1994) Plant Cell 6:1859- 1876; Venglat et al. (2002) Proc Natl Acad Sei USA 99:4730- 4735) . Muitos membros da família knox são conhecidos em plantas, incluindo homólogos de milho (Vollbrecht & Hake (1991) Nature 350:241-243; Kerstetter et al. (1994) Plant Cell 6:1877-1887; Serikawa et al. (1996) Plant Mol Biol 32:673-683) e podem ser usados para construir vetores para liberação em células vegetais.

F. Lecl

Genes de cotilédones frondoso, tais como Lecl e Lec2, estão envolvidos na regulação da embriogênese e atividade transcricional em plantas (Meinke et al. (1994) Plant Cell 6:1049-1064; Lotan et al. (1998) Cell 93:1195-1205; WOO 0/2 8 058; Stone et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:11806-11811; Patente americana US 6.492.577, aqui incorporadas por referência). Muitos homólogos são conhecidos que podem ser usados para construir vetores para serem liberados dentro das células vegetais.

G. Combinação dos polinucleotideos estimulando crescimento

Uma combinação de polinucleotideos e/ou polipeptídeos que aumentam crescimento celular através da promoção da divisão celular, entrada na fase S, estímulo da divisão celular e/ou crescimento na cultura, ou melhora na transformação podem ser providos antes, durante, ou depois da introdução de construções de DNA compreendendo seqüências centroméricas de milho e/ou fragmentos subteloméricos. Por exemplo, polinucleotídeos codificando um 0DP2 (PHP21875) de milho e um WUS (PHI21139) de milho podem ser usados em experimentos de transformação com construções de DNA compreendendo regiões centroméricas e/ou subteloméricas de milho. Em geral 0DP2 e/ou WUS em co- transformação de bombardeamento de partículas de embriões de milho imaturos, como descrito no Exemplo 6D, mostrou um aumento significativo na freqüência de eventos transgênicos como determinado pelo fenótipo BARr e expressão da proteína marcadora fluorescente (DsRed). Em média 1008 eventos/4800 embriões primários (21%) foram observados quando foram providos na mistura de transformação. Sem PHP21139 ou PHP21875, 8 eventos/706 embriões primários 1%) foram observados. Análises posteriores de eventos transgênicos indicaram que as construções ODP2 e/ou WUS co-bombardeados não foram integradas dentro do genoma ou minicromossomos montados.

EXEMPLO 5. Construção de vetor

Vetores, circulares ou lineares, para liberação dentro de células vegetais usando qualquer protocolo de transformação padrão são construídos usando protocolos de biologia molecular padrões, ver e.g. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Vols. 1-3. Vetores para transformação de células vegetais são construídos através da combinação de elementos cromossômicos isolados, opcionalmente com outros polinucleotídeos de interesse, usando técnicas padrões. Os vetores incluem aqueles desenhados para serem mantidos em um sistema hospedeiro conveniente tal como E. coli, Agrobacterium, ou levedura, bem como em células vegetais. Tipicamente, a construção compreende ainda um marcador de seleção e/ou rastreável que funciona em células vegetais para auxiliar na manutenção, identificação, e/ou seleção de células vegetais compreendendo a construção de minicromossomo. Além disso, a construção tipicamente compreende diversos sítios de restrição únicos onde os polinucleotideos adicionais de interesse podem ser clonados. A construção pode também compreender sítios de recombinação sítio-específicos úteis para clonagem recombicional, e/ou para direcionamento tardio e/ou modificação do minicromossomo. Construções de DNA derivados dos clones BAC de milho compreendendo seqüências centroméricas para liberação direta ou transformação de planta mediada por Agrobacterium são descritos abaixo. Vários componentes podem ser fornecidos na construção do clone BAC, e/ou em construções de DNA separados em trans.

A. Marcadores

Uma variedade de marcadores podem ser usados para identificar células transformadas compreendendo as construções de DNA introduzidas. Marcadores visuais incluem proteínas fluorescentes, tais como AmCyan, ZsYellow, ou DsRed (ClonTech Laboratories, Inc., Mountain View, CA, USA) . Marcadores selecionáveis incluem PAT, BAR, GAT, e semelhantes. Um cassete de expressão, PHP 23715, para liberação em células vegetais compreendendo uma proteína fluorescente vermelha (DsRed2) e uma marcador de seleção PAT foi construído compreendendo os seguintes componentes operacionalmente ligados:

ubi pro::ubi 5'UTR::ubi intron::DsRed2::moPAT::pinlI

Uma construção de DNA, PHP 23714, compreendendo uma proteína fluorescente ciano (AmCyan) para liberar em células vegetais é construído compreendendo os seguintes componentes operacionalmente ligados:

ubi pro::ubi 5'UTR::ubi intron::AmCyanl::moPAT::pinlI

B. Vetores Agrobacterium

Plasmideos binários de Agrobacterium são feitos usando o sistema híbrido descrito por Komari et al. ( (1996) Plant J 10:165-174). Derivados de pSBll são construídos coma construçãos de T-DNA intermediários contendo a configuração desejada entre as seqüências de borda de T-DNA. 0 plasmídeo pSBll é obtido da Japan Tobacco Inc. (Tokyo, Japan) . Construção de pSBll de pSB21, e construção de pSB21 dos vetores iniciadores, é descrita por Komari et al. ((1996) Plant J 10:165-174). Descrição da integração do plasmídeo T-DNA dentro do plasmídeo superbinário pSBl por recombinação homóloga pode ser encontrada em EP672752 Al. O plasmídeo pSBl é também obtido da Japan Tobacco Inc. Esses plasmídeos são usados para transformação mediada por Agrobacterium depois de fazer a co-integração em LBA4404. Células eletro-competentes da cepa LBA4404 de Agrobacterium abrigando o pSBl são criadas usando o protocolo como descrito por Lin (1995) em Methods in Molecular Biology, ed. Nickoloff, J.A. (Humana Press, Totowa, NJ). Células e DNA são preparados por eletroporação através da mistura de 1 μl de DNA plasmidial (~100ng) com 20 ml de células competentes em uma cubeta de eletrodo de 0.15cm da Life Technologies (agora Whatman Biometra) (Whatman Biometra #11608-031). Eletroporação é realizada em um aparelho de eletroporação porador de células usando a unidade de controle de pulso (Whatman Biometra #11604-014) no ambiente de 330 pF com um impulsionador de voltagem (Whatman Biometra #11612-017) fixado em 4kW. 0 sistema libera aproximadamente 1.8 kV para as células de Agrobacter ium. Recombinação com sucesso é verificada através de análise de restrição do plasmideo co-integrante seguindo isolamento e transformação de volta em células E. coli DH5oí para amplificação.

C. Montagem In vitro de construções de DNA através de ligação

Vetores de minicromossomo da construção de DNA linear são produzidos através de preparação dos componentes de fragmentos de DNA tais como seqüências centroméricas de milho, marcadores de seleção (DsRed2 e AmCyan), origens de replicação eucarióticas (ori), seqüências teloméricas (TEL), e gene conferindo resistência a bialophos (PAT) sob controle do promotor de ubiquitina (ubi). Em um exemplo, vetores de minicromossomo linear foram feitos do clone BAC centromérico bacm.pkl28.j21 que compreende repetições invertidas de arranjos em tandem de CentC flanqueando um elemento de repetição centromérica CRMl. Fragmentos de DNA foram gerados de bacm.pkl28.j21 através de digestão com NotI e purificação em gel de agarose. 0 fragmento purificado compreendendo a região centromérica foi combinado com fragmentos digeridos com restrição especifica compreendendo marcadores de seleção e origem de replicação: ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::DsRed::moPAT-18S-26S rDNA NTS (NotI/Spel), e um segundo cassete de marcador de seleção: ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::AmCyan::moPAT (Notl/SmaI), e seqüências teloméricas (Spel/Xhol ou SSmal/KpnI) de seus construções. Fragmentos de DNA foram preparados de tal modo que cada fragmento compreendeu sitios de reconhecimento únicos para montagem in vitro de uma estrutura linear única durante a ligação. O vetor linearizado montado compreende: TEL-(Spel)-ubi pro::ubi 5' UTR:ubi intron::AmCyan::moPAT- (Notl) -bacm.pkl28 . j21- (AZotI) -ori-ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::DsRed::moPAT-(Smal)-TEL

D. Construções de DNA - Vetores de clone BAC readaptado circular

Qualquer clone BAC centromérico e/ou subtelomérico ou clone de fragmento cromossômico pode ser readaptado com componentes adicionais para transformação de planta.

0 sistema de construção de vetor transposon EPICENTRE EZ::TN™ pM0D™-2 MCS (EpiCentre Madison, WI, USA) é usado para reconverter polinucleotideos de interesse em clones BAC existentes. 0 pMOD-2 é um plasmideo baseado em pUC com uma origem de replicação colEl e um sitio múltiplo de clonagem (MCS) entre a extremidade em mosaico hiperativa de 19 bp (ME) reconhecida pela transposase EZ-Tn5. 0 transposon Tn5-2 integra randomicamente em cada DNA alvo, portanto cada reação de transposição gera uma pequena biblioteca de construções representando diferentes sítios de integração. Preparações de DNA de clones readaptados individuais ou um grupo de clones podem ser usados para transformação de células vegetais.

i. BACs Centroméricos

Dois BACs representativos de apenas CentC, bacm.pk018.113 e bacm2.pkl74.o21, foram selecionados baseados em sua digestão com enzimas de restrição e padrões de hibridização de Southern. Esses clones BAC foram readaptados usando o sistema de construção EPICENTRE EZ::TN™ pM0D™-2 MCS para gerar construções de DNA circular para transformação de plantas e montagem de minicromossomo.

0 MCS foi usado para inserir um fragmento de DNA compreendendo marcadores de seleção: ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::DsRed::moPAT com ou sem um 18-26S rDNA NTS ori de milho para produzir uma primeira versão de uma construção de transposon prático, Tn5-ls. Depois de clonar as seqüências de DNA de interesse, o transposon é gerado através da digestão com a enzima de restrição PshAl. Após a integração os construções BAC são transformados em E. coli, clones positivos selecionados através da hibridização da colônia com as sondas de transposon, e o DNA isolado de clones positivos selecionados.

ii. BACs subteloméricos

Seis clones BAC representativos foram selecionados do BAC do grupo BAC subtelomérico: bacm.pk038.g06, bacm2.pk063.g24, bacm.pk071.cl2, bacmpkl12.bl8, bacm.pkl42.bl5, e bacm.pkl73.e09. Novos construções de transposon personalizados Tn5-2 compreendendo 18-26S rDNA NTS ori-ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::DsRed::moPAT, um gene Kanr, e sítios para três diferentes enzimas de restrição da origem: I-PpoI, I-CeuI, and PI-SceI, foram construídos e usados para reconverter os clones BAC subteloméricos. As construções BAC readaptadas são transformadas em E. coli e selecionados em canamicina e cloranfenicol, DNA é isolado dos clones positivos selecionados.

E. Construções de DNA - Clones BAC readaptados linearizados

Adicionais construções de transposon customizados Tn5- .3 foram gerados. Esses vetores Tn5-3 compreendem 18-26S rDNA NTS ori-ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::DsRed::moPAT. As construções também compreendem um gene Kanr flanqueados por dois segmentos de DNA em orientação invertida cada uma composta de dois sítios de reconhecimento para as enzimas de restrição de origem I-CeuI e PI-SceI, e seqüência telomérica compreendendo arranjos de repetições teloméricas. Depois da clonagem das seqüências de DNA de interesse, o transposon é gerado pela digestão com a enzima de restrição PshAI. Após a integração as construções BAC são transformadas em E. coli e selecionados canamicina e cloranfenicol, DNA é isolado dos clones positivos selecionados. DNA BAC readaptado recombinante é digerido in vitro com enzimas de restrição de origem (I-CeuI ou PI- SceI) convertendo o DNA circular em uma construção de DNA linear flanqueado com seqüências teloméricas na orientação correta, e removendo o fragmento compreendendo Kanr (Figura .13) .

Três tipos de clones BAC centroméricos foram readaptados com este vetor Tn5-3:

1. Clone BAC centromérico com blocos invertidos de repetições centroméricas CentC flanqueando um elemento centromérico CRMl bacm.pkl28.j21, não seqüências CentA ou CRM2 ;

2. Clones BAC centroméricos pertencendo ao grupo principal dos clones BAC centroméricos contendo todas as quarto repetições especificas de centrômero CentA, CentC, CRMlf e CRM2 (Tabela 8); e,

3. Clones BAC centroméricos do cromossomo 4 de milho (Tabela 9) .

Amostras de DNA de cada clone BAC são fracionadas em um gel de agarose e a banda contendo a construção BAC readaptado linear foi excisada. DNA é eletroeluido da agarose e usado para transformação biolística de embriões Hi-II imaturos 8-11 DAP (dias depois da polinização). Opcionalmente, essas construções podem ser usadas para microinjeção do DNA, ou convertido em vetores para transformação mediada por Agrobacterium.

TABELA 8

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TABELA 9

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F. Construções de DNA - Vetores de combinação BAC múltiplo recombinados Clones BAC centroméricos pertencendo ao grupo principal dos clones BAC centroméricos contendo todas as quatro repetições especificas de centrômero CentA, CentC, CRMl, e CRM2 (Tabela 8) foram também recombinadas com o vetor Tn5-2. Construções Tn5-2 compreendem ori-ubi pro::ubi .5' UTR::ubi intron::DsRed2::moPAT, um gene Kanr, e sítios para três enzimas de restrição de origem: I-PpoI, I-CeuI, and PI-SceI. Os BACs readaptados foram cortados com enzimas de restrição de origem I-CeuI e PI-SceI, separados por gel de eletroforese de campo pulsado (PFGE) sob condições padrões: 1% agarose, IX TAE, pulso inicial de 5 seg, pulso final de 10 seg, tempo total de corrida 12 hs à 12 °C. Grandes fragmentos foram purificados, e sujeitos a ligação para formar construções de DNA multiméricos de até 1 Mb longos.

EXEMPLO 6: Transformação de planta

Qualquer método de transformação de planta disponível pode ser usado. Similarmente qualquer célula vegetal e/ou tecido que possa ser transformado, cultivado, e/ou regenerado em uma planta pode ser usado. Essas células e tecidos vegetais, bem como meio de cultura e condições, métodos de transformação disponíveis, e meio de regeneração e condições são bem conhecidos.

A. Tipos celulares

Uma variedade de tipos celulares foram avaliados para o seu potencial como alvo para geração de minicromosomo e liberação da construção, incluindo células em suspensão Black Mexican Sweet (BMS), células meristemáticas, o zigoto, células escutelares no embrião imaturo, células nos embriões somáticos cultivados, célula central e células do endosperma precoce. Métodos estão disponíveis para produzir embriões haplóides através do cruzamento de um dado genótipo com a linhagem RWS, ou outra linhagem indutora. Embriões imaturos haplóides podem ser um bom alvo para a liberação do minicromossomo, tanto em células escutelares de 10-12 dias depois da polinização (DAP) ou dentro de meristemas apicais expostos dos embriões de estágio coleóptilo (7-8 DAP). Comparações importantes no comportamento de minicromossomos introduzidos em um ambiente diplóide ou haplóide podem ser executadas, além disso, se a introdução do minicromossomo é seguida por duplicação cromossômica quimicamente induzida (pex. colchicina, ou óxido nitroso) , esses embriões duplo- haplóides podem ser rapidamente regenerados para produzir uma linhagem pura contendo minicromossomo. Todos os tipos celulares haplóides e diplóides acima mencionados podem ser convertidos em cultura de suspensão e/ou protoplastos, ou culturas em suspensão estabelecidas, tais como BMS são adequados e podem ser usados para transformação. Células em suspensão e/ou protoplastos podem prover fácil acessibilidade e claridade ótica para monitoramento microscópico após a liberação da construção de DNA. Qualquer método adequado para liberação da construção para a cultura de protoplasto de planta pode ser usado, incluindo métodos padrões de liberação direta de eletroporação e mediado por PEG, ver pex., C. 8, pp. 189- .253 in Advances in Cellular and Molecular Biology of Plants, Vol. 5, Ed. Vasil, Kluwer Acad Publ (Dordrecht, The Netherlands) 1999.

B. Microinjeção de milho

Qualquer método adequado para microinjeção de células vegetais, tecidos, e/ou embriões pode ser usado. Além disso, qualquer composição ou combinação/mistura de composições pode ser injetada, incluindo polinucleotideos, polipeptideos, cofatores, químicos, adjuvantes, e semelhantes. Liberação direta em um zigoto provê uma oportunidade para produzir uma planta transgênica sem os passos intermediários da cultura de tecido e regeneração. Por exemplo, microinjeção de milho pode ser feita essencialmente como descrita na patente americana US .6.300.543. Brevemente, óvulos de milho imaturos são seccionados para produzir placas nucelares compreendendo o saco embrionário, que é direcionado para liberação de microinjeção da composição de transformação. Seguindo a microinjeção, os sacos embrionários são cultivados em meio apropriado para propagação e regeneração da planta.

C. Transformação mediada por Agrobacterium

Transformação de milho mediada por Agrobacterium é realizada essencialmente como descrita por Zhao (W098/32326). Brevemente, embriões imaturos são isolados de óvulos de milho e os embriões contactados com uma suspensão de Agrobacterium contendo um T-DNA, onde as bactérias são capazes de transferir a construção de DNA para pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos. Opcionalmente, o tecido alvo pode ser co-transformado com múltiplas linhagens de Agrobacterium compreendendo T-DNAs com diferentes construções de DNA e/ou polinucleotideos de interesse.

Passo 1: Passo de infecção. Embriões imaturos são imersos em uma suspensão de Agrobacterium para iniciação da inoculação.

Passo 2: Passo de co-cultivo. Os embriões são co-cultivados por um tempo com o Agrobacterium.

Passo 3: Passo de descanso. Opcionalmente, seguindo o co- cultivo, um passo de descanso pode ser executado. Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para eliminação do Agrobacterium e para uma fase de descanso para as células infectadas.

Passo 4: Passo de seleção. Embriões inoculados são cultivados em meio contendo um agente de seleção e calos transformados desenvolvidos são recuperados. Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com um agente de seleção resultando no crescimento seletivo das células transformadas.

Passo 5: Passo de regeneração. Calos crescidos em meio seletivo são cultivados em meio sólido para regenerar plantas.

D. Bombardeamento de partículas de milho

Embriões imaturos de milho são bombardeados com uma construção de DNA circular ou linear compreendendo uma seqüência centromérica de milho isolada, e opcionalmente regiões subteloméricas, origens de replicação, sítios de recombinação docking, polipeptídeos, e/ou marcadores, por exemplo um gene marcador de seleção tal como PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70:25-37) que confere resistência ao herbicida Bialaphos, ou outro marcador de seleção adequado ou marcadores rastreáveis, tais como RFP e/ou CFP. A construção pode também compreender outros genes marcadores, ou ser co-transformados com construções de polinucleotídeos adicionais compreendendo marcadores. Transformação é executada essencialmente como segue.

Espigas de milho imaturas de 8-11 DAP são esterilizadas na superfície em uma solução de alvejante 30% mais 0.5% de micro detergente por 20 minutos, e lavadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são excisados, colocados com o lado do eixo embrionário para baixo (lado do escutelo para cima), 50 embriões por placa, em 560L de meio por 1-3 dias a 26°C no escuro. Antes da transformação os embriões imaturos são transferidos para um meio 560Y por 4 horas, e então alinhados dentro de uma zona alvo de 2.5-cm na preparação para o bombardeamento.

O DNA é precipitado em péletes de ouro de 0.6 pm (diâmetro médio) usando um lipídeo catiônico solúvel em água Tfχ™-5O (Cat# E1811, Promega, Madison, WI, USA) como segue: preparar uma solução de DNA em gelo usando 1 ug da construção de DNA centromérico de milho (10 μΐ); opcionalmente outros construções para co-bombardeamento tais como 50 ng (0.5 μΐ) de PHP21875 (BBM), e 50 ng de (0.5 μΐ) PHP21139 (WUS); solução de DNA misturado. Para o DNA pré-misturado adicionar 20 μΐ de partículas de ouro preparadas (15 mg/ml) em água; 10 μΐ de Tfx-50 em água; misturar cuidadosamente. Isso pode ser estocado em gelo durante a preparação de macrocarregadores, tipicamente por cerca de 10 min. Partículas de ouro são peletizadas em uma microcentrífuga à 10,OOOrpm por 1 min, remover o sobrenadante. Cuidadosamente lavar o pélete com 100 ml de EtOH 100% sem ressuspender o pélete, cuidadosamente remover o EtOH por lavagem. Adicionar 20 μΐ de EtOH 100% e cuidadosamente ressuspender as partículas por sonicação breve, 10 μΐ gotejados no centro de cada macrocarregador e permitido secar por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento.

As placas de amostras de embriões alvos de milho são bombardeadas duas vezes por placa usando aproximadamente .0.5 μg de DNA por tiro usando o aparelho Bio-Rad PDS- .1000/He (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) com uma pressão de ruptura de 450 PSI, uma pressão de vácuo de 27- .28 polegadas de Hg, e uma distância de vôo (flight) da partícula de 8.5 cm.

Após o bombardeamento, os embriões são transferidos para o meio sólido 560P mantido no escuro à 26°C por 4-6 dias, então transferidos para o meio de seleção 560R contendo 3 mg/L de Bialaphos, e subcultivado a cada 2 semanas. Depois de aproximadamente 10 semanas de seleção, clones de calos resistentes à seleção são transferidos para o meio 288J para iniciar a regeneração da planta. Após a maturação do embrião somático (2-4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para o meio .272V para germinação e transferidos para um quarto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 dias mais tarde, plântulas em desenvolvimento são transferidas para um meio .272V livre de hormônio em tubos por 7-10 dias até as plântulas estarem bem estabelecidas. Plantas são então transferidas para inserções em frascos (equivalentes a potes de 2.5") contendo solo envasado e dexiadas crescer por 1 semana em uma câmara de crescimento, subseqüentemente crescidas em um adicional de 1-2 semanas na casa de vegetação, então transferidas para 600 potes clássicos (1.6 galão) e crescidas até a maturidade.

E. Bombardeamento de partícula de soja

Um polinucleotídeo, uma mistura de polinucleotídeos, e opcionalmente, polipeptídeos, podem ser introduzidos em culturas de suspensão embriogênica de soja através de bombardeamento de partícula usando essencialmente os métodos descritos em Parrot et al. (1989) Plant Cell Rep .7:615-617. Este método, com modificações, é descrito abaixo. Semente é removida de vagens imaturas e cotilédones menores do que 4mm em comprimento são selecionados. As sementes são esterilizadas por 15 minutos em uma solução alvejante 0.5% v/v e então lavadas com água destilada estéril. Os cotilédones imaturos são excisados através de primeiro suprimir a porção da semente que contenha o eixo do embrião. Os cotilédones são então removidos do tegumento empurrando gentilmente a extremidade distai da semente com a extremidade brusca da lâmina de bisturi. Os cotilédones são então colocados em placas de petri (lado para cima) com meio de iniciação SBl. As placas de petri são incubadas na luz (16 hr dia; 75-80 μΕ) à 26°C. Depois de 4 semanas de incubação os cotilédones são transferidos para meio SBl fresco. Depois de um adicional de duas semanas, embriões somáticos no estágio globular que exibem áreas proliferativas são excisados e transferidos para meio liquido FN Lite (Samoylov et al. (1998) In Vitro Cell Dev Biol Plant 34:8-13). Cerca de 10 a 12 pequenos grupos de embriões somáticos são colocados em frascos de 250 ml contendo 35 ml de meio SB172. As culturas em suspensão embriogênicas de soja são mantidas em meio liquido de 35 mL em um agitador rotativo, 150 rpm, à 26°C com luz fluorescente (20 μΕ) em um cronograma de 16:8 hora dia/noite. Culturas são sub-cultivadas a cada duas semanas através da inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em .35 mL de meio liquido.

Culturas em suspensão embriogênicas de soja são então transformadas usando bombardeamento de partícula (Klein et al. (1987) Nature 327:70; patente americana US 4.945.050). Um instrumento de biolistica da BioRad PDS1000/HE pode ser usado para essas transformações. Um gene marcador de seleção pode ser usado para facilitar a transformação de soja, por exemplo, um cassete de expressão pode ser usado compreendendo o promotor 35S do vírus mosaico da couve-flor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812), o gene higromicina fosfotransferase do plasmideo pJR225 (de E. coli; Gritz et al. (1983) Gene 25:179-188) e a região 3' do gene da nopalina sintetase do T-DNA do plasmideo Ti de Agrobacterium tumefaciens.

Para 50 pL de uma suspensão de particular de ouro de .60 mg/mL 1 μπι é adicionado (em ordem): 5 pL de DNA (1 mg/mL), 20 μΐ de espermidina (0.1 Μ), e 50pmL de CaCl2 (2.5 Μ) . A preparação de partícula é agitada por três minutos, centrifugada em uma microcentrífuga por 10 segundos e o sobrenadante removido. As partículas cobertas com DNA são lavadas uma vez em 400 pL de etanol 70% e então ressuspendidas em 40 pL de etanol anidro. A suspensão DNA/partícula é sonicada três vezes por um segundo cada. Cinco pL das partículas de ouro cobertas com DNA são então carregadas em cada disco macrocarregador.

Aproximadamente 300-400 mg de uma cultura em suspensão de duas semanas de idade são colocados em uma placa de petri vazia de 60x15 mm e o líquido residual removido do tecido com uma pipeta. Pressão de ruptura de membrana é fixada em 1100 psi e a câmara é evacuada para um vácuo de .28 polegadas de mercúrio. 0 tecido é colocado aproximadamente 8 cm distante da tela de retenção, e é bombardeado três vezes. Após o bombardeamento, o tecido é dividido na metade e colocado em dois frascos separados com .35 ml de meio FN Lite por frasco.

Cinco a sete dias depois do bombardeamento, o meio liquido é trocado com meio fresco. Onze dias após o bombardeamento o meio é trocado com meio fresco contendo higromicina 50 mg/mL. Esse meio seletivo é substituido semanalmente. Sete a oito semanas após o bombardeamento, tecido verde transformado será observado crescendo dos grupos embriogênicos necróticos não transformados. Tecido verde isolado é removido e inoculado em frascos individuais para gerar novas, clonalmente propagadas, transformadas culturas de suspensão embriogênicas. Cada nova linhagem é tratada como um evento de transformação independente. Essas suspensões são então subcultivadas e mantidas como grupos de embriões imaturos, ou tecido é regenerado em plantas inteiras através de maturação e germinação dos embriões individuais.

Para regeneração, eventos são removidos da cultura liquida e o processo de maturação é iniciado em meio sólido. Grupos embriogênicos são removidos do liquido SB196, colocados em papel de filtro estéril, e colocado em meio Agar sólido SB166 por 1-2 semanas. Grupos de tecidos são quebrados ou gentilmente esmagados com colher. Cerca de .10-20 grupos de tecido de cerca de 4-5 mm de diâmetro são subcultivados por três semanas em meio SB103 ou SB148, para gerar embriões. Embriões são cultivados por 4-6 semanas a .26°C sob luz fluorescente branca fria e bulbos Agro (40 watt) em um fotoperiodo de 16:8 hr com intensidade luminosa de 90-120 pE/m2s. Após 4-6 semanas de maturação, embriões individuais são desidratados através da colocação em uma grande placa de petri estéril (60 χ 25 mm) selada com fita de fibra, ou colocados em uma caixa plástica (com nenhuma fita de fibra) por 4-7 dias. Embriões desidratados são plantados em meio sólido SB71-4 em cada vaso de cultura circular ventilado (RCV) ou em placa de petri de 100x25 mm, e germinados e 26°C sob luz fluorescente branca fria e bulbo Agro (40 watt) em um fotoperiodo de 16:8 hr com intensidade luminosa de 90-120 uE/m2s para produzir plântulas. Plântulas são colocadas em bandejas celulares e colocadas em um incubador em condições de 16 hr de fotoperiodo, 26°C/24°C de temperatura dia/noite por cerca de 2 semanas antes do transplante para solo para produção de semente.

F. Meio de cultura de célula vegetal

Meio 560L compreende 4.0 g/L de sais basais N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/L de mistura de vitaminas Eriksson's (1000X Sigma 1511), 0.5 mg/L de tiamina HCl, 20 g/L de sacarose, .1.0 mg/L de 2,4-D, e 2.88 g/L de L-prolina (trazida para o volume com D-I H2O seguindo ajuste para pH 5.8 com KOH) ; .2.0 g/L Gelrite® (adicionado após trazer para o volume com D-I H2O) ; e 8.5 mg/L de nitrato de prata (adicionado após esterilização do meio e esfriamento para temperatura ambiente).

Meio 560P compreende 4.0 g/L de sais basais N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/L de mistura de vitaminas Eriksson's (1000X Sigma 1511), 0.5 mg/L de tiamina HCl, 30 g/L de sacarose, .2.0 mg/L de 2,4-D, e 0.69 g/L de L-prolina (trazida para o volume com D-I H2O seguindo ajuste para pH 5.8 com KOH) ; .3.0 g/L Gelrite® (adicionado após trazer para o volume com D-I H2O); e 0.85 mg/L de nitrato de prata (adicionado após esterilização do meio e esfriamento para temperatura ambiente).

Meio 560Y compreende 4.0 g/L de sais basais N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/L de mistura de vitaminas Eriksson's (1000X Sigma 1511), 0.5 mg/L de tiamina HCl, 120 g/L de sacarose, .1.0 mg/L de 2,4-D, e 2.88 g/L de L-prolina (trazida para o volume com D-I H2O seguindo ajuste para pH 5.8 com KOH) ; .2.0 g/L Gelrite® (adicionado após trazer para o volume com D-I H2O) ; e 8.5 mg/L de nitrato de prata (adicionado após esterilização do meio e esfriamento para temperatura ambiente).

Meio 560R compreende 4.0 g/L de sais basais N6 (Sigma C-1416), 1.0 ml/L de mistura de vitaminas Eriksson's (1000X Sigma 1511), 0.5 mg/L de tiamina HCl, 30.0 g/L de sacarose, e 2.0 mg/L de 2,4-D (trazido para o volume com D-I H2O seguindo ajuste para pH 5.8 com KOH) ; 3.0 g/L Gelrite (adicionado após trazer para o volume com D-I H2O); e 0.85 mg/L de nitrato de prata e 3.0 mg/L de bialaphos (ambos adicionados após esterilização do meio e esfriamento para temperatura ambiente).

Meio 288J compreende: 4.3 g/L de sais MS (Gibco 11117- .074), 5.0 ml/L de solução estoque de vitaminas MS (0.100 g/L de ácido nicotinico, 0.02 g/L de tiamina HCl, 0.10 g/L de piridoxina HCl, e 0.40 g/L de glicina trazida para o volume com D-I H2O) (Murashige & Skoog (1962) Physiol Plant .15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0.5 mg/L de zeatina, 60 g/L de sacarose, e 1.0 ml/L de ácido abscisico 0.1 mM (trazido para o volume com D-I H2O após ajustar para pH .5.6); 3.0 g/L Gelrite (adicionado após trazer para o volume com D-I H2O); e 1.0 mg/L de ácido indol acético e 3.0 mg/L de bialaphos (adicionado após esterilizar o meio e esfriar para 60°C).

Meio 272V compreende: 4.3 g/L de sais MS (Gibco 11117- .074), 5.0 ml/L de solução estoque de vitaminas MS (0.100 g/L de ácido nicotinico, 0.02 g/L de tiamina HCl, 0.10 g/L de piridoxina HCl, e 0.40 g/L de glicina trazida para o volume com D-I H2O), 0.1 g/L de mio-inositol, e 40,0 g/L de sacarose (trazida para o volume com D-I H2O após ajustar pH para 5.6); e 6 g/L de bacto-agar (adicionado após ajustar volume com D-I H2O), esterilizar e esfriar para 60°C.

Meio SBl compreende sais MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117- .066, 1 pk/L) , estoque de vitaminas B5 lml/L, 20 mg/L de .2,4-D, 31.5 g/L de sacarose, 8 g/L de TC Agar, pH 5.8

Estoque de vitaminas B5 1000X compreende 10 g de mio- inositol, 100 mg de ácido nicotinico, 100 mg de piridoxina HCl, 1 g de tiamina, D-I H2O para 100 ml, alicotar e estocar a -20°C.

G. Isolamento de DNA de calos e tecido foliar

Putativos eventos de transformação podem ser rastreados para a presença do transgene. DNA genômico pode ser extraído de caules, folhas, ou outro tecido usando separação de núcleo vegetal, lise, e purificação HMW, ou alternativamente usando uma modificação do CTAB (brometo de cetiltrietilamônio, Sigma H5882) método descrito por Stacey &Isaac (1994 In Methods in Molecular Biology Vol. 28, pp. .9-15, Ed. P. G. Isaac, Humana Press, Totowa, NJ). Aproximadamente 100-200 mg de tecido congelado é macerado em pó em nitrogênio líquido e homogeneizado em 1 ml de tampão de extração CTAB (2% CTAB, 0.02 M EDTA, 0.1 M TrisHCl pH 8, 1.4 M NaCl, 25 mM DTT) por 30 min a 65°C. Amostras homogeneizadas são permitidas esfriar em temperatura ambiente por 15 min antes de uma simples extração de proteína com aproximadamente 1 ml 24:1 v/v clorofórmio:octanol é feita. Amostras são centrifugadas por .7min a 13, 000 rpm e a camada superior do sobrenadante coletada usando ponteiras de pipeta de grande largura. DNA é precipitado do sobrenadante através de incubação em etanol 95% em gelo por 1 h. Fibras de DNA são enroladas em um gancho de vidro, lavadas em etanol 75% contendo acetato de sódio 0.2 M por 10 min, secas ao ar por 5 min e ressuspensas em tampão TE. Cinco μΐ de RNAse A é adicionada para as amostras e incubadas a 37°C por 1 h. Para quantificação do DNA genômico, gel de eletroforese é realizado usando um gel de agarose 0.8% em tampão Ix TBE. Um microlitro de cada uma das amostras é fracionado ao lado de 200, 400, 600 e 800 ng μΐ-l λ marcadores de DNA intactos.

EXEMPLO 7. Resultados da Transformação

Embriões de milho imaturos Hi-II em 8-11 DAP foram transformados por bombardeamento de partículas essencialmente como descrito no Exemplo 6D. Junto com construções de DNA BAC readaptados, embriões foram co- transformados com ODP2, WUS, e/ou vetores ODP2+WUS. Nas duas semanas pós-bombardeamento, células transformadas tinham proliferado para formar um calo embriogênico com múltiplos embriões somáticos. Alguns desses embriões somáticos expressaram o gene marcador fluorescente DsRed2 indicativo de herança estável. Embriões somáticos individuais foram excisados e propagados como eventos independentes no meio de seleção Bialophos. Cultura de calos clonalmente propagados foi estabelecida de cada evento.

Um primeiro rastreamento de cada evento de transformação foi feito usando FISH. Embriões somáticos foram usados para fazer distribuição cromossômica para FISH como descrito no Exemplo 8. Cada evento foi caracterizado usando sondas FISH separadas para o marcador mo-PAT/DsRed2 (PHP23715), e as repetições centroméricas CentC em tandem para detectar do marcador transgênico e herança de seqüências de DNA centroméricas, respectivamente. Seguindo o primeiro rastreamento, eventos de transformação selecionados de interesse foram transferidos para um meio de regeneração para produzir plântulas, que fo ram eventualmente transferidas em solos para recuperar plantas. Após um período de crescimento, as plantas selecionadas foram rastreadas uma segunda vez através de análises FISH da ponta da raiz comprimida para reafirmar a herança.

A. Experimentos de co-transformação de grupos de BACs

Os embriões foram co-transformados com grupos de construções de DNA. Esses grupos podem compreender combinações de construções de DNA derivados de clones BAC compreendendo repetições centroméricas de milho, construções de DNA derivados de clones BAC compreendendo segmentos teloméricos e/ou subteloméricos, plasmídeo marcador visual PHP23715, e polinucleotideos codificando proteínas fortalecedoras do crescimento Ovule Development Protein-2, plasmídeos ODP-2 (PHP21875) e Wushel (PHP21139) . Construções de DNA derivados dos clones BAC centroméricos incluem clones BAC tendo CentC apenas, CRM2 apenas, CentC e CRM2 apenas, e BACs principais tendo todas as quatro repetições centroméricas CentA, CentC, CRMl, e CRM2.

Análises FISH dos 80 calos transformados com grupos de BACs compreendendo DNA centromérico revelaram 42 eventos citogeneticamente detectáveis de novos grupos de CentC em adição aos sítios de centrômeros normais. Em alguns exemplos, os elementos centroméricos de milho usados para transformação inseridos dentro dos cromossomos nativos, resultaram nas estruturas dicêntricas. Essas inserções de seqüências de DNA centroméricas variam em tamanho (número de repetições), número de inserções por cromossomo (até 3 detectáveis em um único cromossomo), e número de cromossomos com inserções (até 4 cromossomos com pelo menos uma inserção) e todas as inserções co-localizadas com a sonda plasmidial marcadora RFP. Isso indica que fragmentos de DNA exógeno podem ser montados em grandes blocos e integrados dentro de um cromossomo de milho.

B. Transformação com construções de DNA protótipo de minicromossomo linear montados através de ligação in vitro de um clone BAC centromérico, seqüências teloméricas e seqüências marcadoras.

O clone Mol7 BAC, bacm.pkl28.j21, com orientação invertida das repetições em tandem CentC foi identificado como descrito no Exemplo 1D. Seqüências teloméricas foram geradas através de amplificação de PCR de oligonucleotideos teloméricos e clonadas em um vetor plasmidial. Uma construção de DNA linear foi gerado deste clone BAC através de montagem in vitro com marcadores de seleção (moPAT, AmCyanl, DsRed2), uma origem de replicação (ori) 18-26S rRNA NTS, e seqüências teloméricas (TEL). Cada fragmento de DNA tinha sítios de reconhecimento que permitiam a montagem de uma estrutura única mediante ligação. A construção linearizada montada compreende: TEL-(SpeI)-ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::AmCyan::moPAT- (WotI)-bacm.pk.128J21-(NotI)-ori-ubi pro::ubi 5' UTR::ubi intron::DsRed::moPAT-(SmaI)-TEL

A mistura de ligação inteira, contenda construção montado bem como os sub-produtos da ligação, foram liberados dentro de embriões imaturos Hi-II através da transformação biolistica. Mais do que duzentos de eventos foram propagados como clones de calos individuais baseados no marcador de seleção selecionável e fluorescente (PAT). Três grupos de clones foram recuperados: aqueles que mostraram apenas marcadores fluorescentes vermelhos (72), apenas marcadores fluorescentes azuis (83), ou ambos apenas marcadores fluorescentes (137). Eventos expressando ambos os marcadores foram selecionados de análises posteriores através de FISH.

Em adição aos eventos de integração simples, um número de eventos de integração múltiplos foram observados cada um no mesmo cromossomo, ou em cromossomos diferentes. Em dois eventos nós observamos rearranjos cromossômicos. Os sítios de inserção adicionais da repetição centromérica CentC co- localizada com a sonda marcadora PHP23715 sugere possível formação cromossômica dicêntrica. Análises de células dividindo na anáfase mostraram pontes cromossômicas consistentes com a presença de cromossomos dicêntricos com dois centrômeros funcionais devido à integração das seqüências de DNA centroméricas exógenas CentC. A função centromérica é indicada pela formação dos cromossomos dicêntricos, aparecimento das pontes cromossômicas na anáfase, e a indução de quebras cromossômicas. Esses resultados indicam que os elementos cromossômicos podem se auto-arranjar dentro da célula vegetal em blocos de multicópias, associados com proteínas cromatina, e em alguns casos podem adquirir função centromérica.

Um evento mostrou um cromossomo 6 rearranjado tendo dois sítios de inserção da construção de DNA centromérico perto da região de organização nucleolar (NOR), bem como uma estrutura adicional semelhante à estrutura do minicromossomo com uma grande região centromérica e um pequeno sítio de inserção adicional da construção de DNA centromérico. A citologia deste evento pode ser uma indicação de ruptura cromossômica devido à formação de um cromossomo dicêntrico.

C. Transformação com grupos de clones BAC readaptados linearizados

Diversos clones BAC foram readaptados com Tn5-3 transposons feitos usando o sistema transposase (EPICENTRE EZ::TN™ pM0D™-2 MCS Transposon Construction Vector system (EpiCentre, Madison, WI, USA)) essencialmente como descrito no Exemplo 5E. Eles foram linearizados e usados por transformação biolística de embriões imaturos de milho Hi- II:

1. Sete diferentes variantes do clone readaptado bacm.pkl28.j21 com blocos invertidos de repetições centroméricas CentC representando diferentes inserções geradas por transposase dentro do mesmo clone BAC foram unidas em um grupo;

2· 84 clones BAC grupos principais centroméricos readaptados foram combinadas para gerar 4 grupos com 21 variantes individuais cada (Tabela 8). Cada um dos 4 grupos foi usado individualmente por transformação biolística;

3. Clones BAC centroméricos readaptados do cromossomo 4 foram divididos em 2 grupos contendo três clones BAC de B73 e três clones BAC de Mol7 (Tabela 9); e,

4. Grupo 1 da Tabela 8, foi dividido em 4 subgrupos de 5 ou .6 clones BAC grupos principais centroméricos readaptados (Tabela 10). Cada um dos subgrupos foi usado ind ividualmente para transformação biolística.

TABELA 10

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Para cada exemplo acima, os embriões imaturos Hi-II foram co-transformados com 0DP2, WUS, e/ou vetores de expressão ODP2+WUS e grupos BAC readaptados. Diversas diferentes classes de eventos de integração foram encontradas quanda construçãos readaptados linearizados dos clones BAC foram usados para transformação. Por exemplo, quando os construções BAC contendo blocos invertidos das repetições centroméricas CentC (bacm.pkl28.j21) , ou grupos ou subgrupos readaptados do grupo principal dos clones BAC foram usados para transformação:

1. Integrações únicas dentro de regiões eucromáticas dos cromossomos hospedeiros;

2. Integrações múltiplas dentro de regiões eucromáticas de cromossomos hospedeiros;

3. Integrações únicas dentro da região centromérica de cromossomos hospedeiros;

4. Integrações múltiplas dentro de regiões centroméricas de cromossomos hospedeiros;

5. Integrações que resultaram em quebras cromossômicas, tais como novas variantes não usuais de cromossomos de milho com braços cromossômicos reduzidos, ou duplicação de certas regiões cromossômicas, por exemplo um cromossomo 6 com dois NORs, ou formação cromossômica dicêntrica;

6. Amplificação local de marcadores e construções centroméricos na integração;

7. Amplificação de marcador e construções centroméricas dentro de segmentos de cromatina extra-cromossômica em algumas células;

8. Criação de novos minicromossomos tendo um centrômero funcional similar aos cromossomos nativos, por exemplo segregação autônoma na mitose.

Essas observações indicam que clone BAC centromérico readaptado bacm.pkl28.j21 e o grupo central dos clones BAC reunidos são capazes de induzir uma variedade de efeitos citogenéticos tais como formação de cromossomos dicêntricos, quebras cromossômicas, amplificação local de construções transgênicos e formação de elementos extra cromossômicos, i.e. minicromossomos.

Eventos de minicromossomos de sucesso que resultaram da reconversão (montagem) de um único BAC ou grupo de BACs específicos de centrômero com a construção Tn5-3 e sua subseqüente linearização dentro de uma construção de transformação linear são descritos abaixo:

1) Grupo 1 região principal dos BACs específicos de centrômero (Tabela 8), ou subgrupos do grupo 1(Tabela 10);

2) Grupo 3 região principal dos BACs específicos de centrômero (Tabela 8);

3) um único clone BAC, bacm.pkl28.j21, com repetições CentC invertidas; e,

4) três clones BAC específicos de centrômero do cromossomo 4 B73 (Tabela 9) .

0 primeiro evento de minicromossomo de milho (CMC3 grupo 1 evento #14) foi encontrado entre eventos gerados por transformação biolística com grupo 1 da região principal reconvertida do BAC Tn5-3 linearizado (Tabela 8). No meio seletivo calos embriogênicos crescendo ativamente expressaram o marcador visual DsRed2. Análises FISH no estágio de metáfase mostraram O, 1, 2, ou 3 minicromossomos adicionais tendo várias formas e tamanhos (Figuras 1-4) . Neste evento, 60 dos 80 núcleos pesquisados tiveram 1, 2, ou 3 minicromossomos juntamente com o complemento normal de .20 cromossomos nativos. Esses cromossomos artificiais variaram em tamanho de cerca de 20% a cerca de 50% da média do cromossomo nativo de milho como medido na metáfase. Preliminarmente medidas na prometáfase mostrou os minicromossomos relativamente inalterados no tamanho, enquanto os cromossomos nativos são cerca de 4-5 vezes maiores, portanto os minicromossomos medidos neste estágio são cerca de 5% para cerca de 15% do comprimento de um cromossomo médio nativo na prometáfase de milho. Como determinado por FISH os minicromossomos são predominantemente compostos de repetições centroméricas e componentes Tn5-3. Diversos exemplos de formação de anel cromossômico que tem uma organização mais complexa foram também observados. Esses minicromossomos recentemente formados são aparentemente capazes de replicação e segregação durante a mitose (Figura 4), no entanto a segregação não é perfeita e algumas não disjunções foram observadas, resultando em células com uma mudança no número de cromossomos. Calos do grupo 1 CMC 3 evento #14 foram mantidos crescendo ativamente sob seleção por pelo menos 10 meses, amostrados em vários momentos, e analisados por FISH para demonstrar manutenção estável do minicromossomo através de muitas rodadas de divisão c-lular m : Lotica. Este evento, grupo 1 CMC3 evento #14, foi também analisado por FISH para a presença de telômeros usando as sondas overgo Telo-31 (SEQ ID NOS: 192 e 193) usando núcleos de calos na metáfase. Dois dos quatro Ioci positivos telo-31 foram observados em cada minicromossomo, onde os dois Ioci observados podem representar 4 Ioci separados que não podem ser distinguidos nesta resolução. A intensidade do sinal telo-31 foi geralmente mais fraca no minicromossomo quando comparada com o sinal observado para os cromossomos nativos em cada amostra. Plantas foram regeneradas deste evento e suas pontas das raízes foram analisadas com FISH para determinar se os minicromossomos foram herdáveis através de sucessivas divisões mitóticas em um ambiente de casa de vegetação. Cinco das 19 plantas que regeneraram deste evento de transformação mostraram a presença de um minicromossomo. Quatro plantas tiveram uma alta incidência de núcleos com um único minicromossomo mais o complemento normal de 20 cromossomos nativos. A quinta planta teve uma maioria deste núcleo com 1, 2, ou 3 minicromossomos mais o complemento normal de 20 cromossomos nativos. Todos os minicromossomos descritos acima foram compreendidos predominantemente de repetições centroméricas e componentes Tn5-3.

Subseqüentemente, grupo 1 da região principal do BAC readaptado foi ainda dividido em quatro subgrupos tendo 5-6 dos clones BAC da região principal reconvertida (Tabela .10) . Análises FISH demonstraram a presença de minicromossomos nos calos embriônicos gerados por subgrupos .1.1 e 1.3. Dois eventos de minicromossomos foram produzidos do subgrupo 1.1: o primeiro evento teve o complemento normal dos 20 cromossomos, mais 1 minicromossomo que não hibridiza com o marcador PHP23715 ou CentC em um nivel detectável; o segundo evento mostrou 24-28 cromossomos, 3 cópias do cromossomo 6, e 1 minicromossomo. Baseado em observações FISH, este minicromossomo foi positivo para CentC, mas não foi consistentemente positivo para a sonda PHP23715. Este evento pode ter sido produzido por integração e ruptura de um cromossomo nativo, e/ou condições produzidas por ou resultante de aneuploidia. Subgrupo 1.3 produziu 5 eventos. Três dos cinco eventos parecem ser de novo formação de minicromossomo e tinham complemento normal de 20 cromossomos mais 1 minicromossomo, e os minicromossomos foram positivos para o marcador PHP23715 e CentC por análises FISH dos eventos de calos primários na metáfase. Um desses eventos, CMC3 subgrupo 1.3 evento #27, foi ainda analisado por FISH para a presença de telômeros usando as sondas overgo Telo-31 (SEQ ID NOS: 192 e 193) usando núcleos de calos na metáfase. Este evento tem um minicromossomo muito pequeno com dois fortes Ioci CentC e dois Ioci telo-31 em cada minicromossomo. Os dois Ioci telo-31 observados podem representar 4 Ioci separados que não podem ser distinguidos nesta resolução. Este evento tem um minicromossomo menor do que o observado em eventos prévios. Quando medido na metáfase, o minicromossomo é aproximadamente 0.5 a 1 micron em comprimento, que é cerca de um terço para cerca de um meio do tamanho dos minicromossomos em outros eventos independentes. 0 sinal FISH para telo-31 foi geralmente mais fraco no minicromossomo do que em cromossomos nativos. Calos do subgrupo 1.3 CMC3 evento #27 têm sido crescidos ativamente sob seleção por aproximadamente 10 meses, amostrados em vários momentos, e analisados por FISH para demonstrar manutenção estável do minicromossomo através de muitas rodadas de divisão celular mitótica. Os dois outros eventos do subgrupo 1.3 tiveram 19 cromossomos normais mais um minicromossomo, possivelmente como um resultado da integração e quebra cromossômica. Usando análises FISH um dos dois minicromossomos foi positivo para CentC apenas, e o segundo foi positivo para ambos os marcadores PHP23715 e CentC. Usando FISH no núcleo na metáfase dos calos, todos dos eventos do subgrupo parecem essencialmente similares quando comparados com mostras de outros eventos de minicromossomos gerados, como mostrado nas Figuras 1, 2, 5, .6, e 9.

Outro evento de minicromossomo foi observado (Figuras .5-8) de um evento de transformação biolistica de um embrião imaturo Hi-II com região principal reconvertida linearizada dos clones BAC grupo 3 (Tabela 8) . 0 evento de calos embriogênicos resultante foi positivo no meio de seleção Bialophos e expressou a proteína marcadora fluorescente DsRed. Análises FISH mostraram que este evento foi tetra- aneuplóide, com apenas 39 cromossomos observados porque um cromossomo 6 estava ausente. Cada núcleo teve 0, 1, ou 2 minicromossomos neste evento. Como descrito com o primeiro evento de minicromossomo do grupo 1, os minicromossomos neste evento foram compreendidos predominantemente de repetições centroméricas e componentes Tn5-3. Na anáfase, as cromátides irmãs dos minicromossomos foram capazes de segregar (Figura 7) indicando a presença de centrômeros funcionais. 0 quadro acima indica que os minicromossomos estão replicando autonomamente e mostram estabilidade através de sucessivas divisões mitóticas.

Outro evento de minicromossomo foi observado (Figuras .9-10) de um evento de transformação biolistica de um embrião imaturo Hi-II com clone BAC Tn5-3 readaptado linearizado bacm.pkl28.j21. Novamente, os calos embriogênicos deste terceiro evento foram positivos no meio de seleção Bialophos e expressaram a proteína fluorescente DsRed. Uma planta foi regenerada deste evento e as pontas das raízes rastreadas via FISH. Cada núcleo teve 0 ou 1 minicromossomo. Naqueles núcleos com um minicromossomo, apenas 19 dos 20 cromossomos nativos foram observados. Análises FISH na distribuição metafásica mostraram que o minicromossomo único foi composto principalmente de repetições centroméricas e componentes Tn5-3.

Outro evento de minicromossomo, bCMC4 evento #73, foi observado de um evento de transformação biolistica de um embrião imaturo Hi-II com linearizados, Tn5-3 readaptado três clones BAC específicos de centrômero do cromossomo 4 (Tabela 9). 0 evento de calos embriogênicos resultantes foi positivo no meio de seleção Bialophos e expressou a proteína marcadora fluorescente DsRed. Análises FISH mostraram que este evento foi aneuplóide, com apenas 19 cromossomos e 1 ou 2 minicromossomos. Similar aos minicromossomos descritos acima, os minicromossomos neste evento foram compreendidos predominantemente de repetições centroméricas e componentes Tn5-3.

Observações em todos os eventos de minicromossomos indicaram que minicromossomos recém formados predominantemente resultaram de concatenação e/ou amplificação das construções de DNA linear liberados para células vegetais para produzir um minicromossomo de novo.

Três dos eventos de minicromossomos foram posteriormente analisados utilizando imunofluorescência com um anticorpo marcado fluorescentemente levantada contra a proteína específica para centrômero/cinetócoro, proteína C centromérica (CENPC). Imunocoloração de distribuição nuclear revelou que CENPC liga especificamente à região centromérica dos cromossomos nativos. Em adição, a CENPC localizada em distintas posições em todos os minicromossomos em todos os três eventos de minicromossomos estudados (Figuras 3, 4, 8, e 10). Ligação FISH com imunolocalização mostrou que a repetição CentC e a localização da sonda marcadora DsRed2 sobrepôs com CENPC nos minicromossomos. Como visto para os cromossomos nativos, na metáfase os minicromossomos têm dois diferentes Ioci de CENPC (Figuras 3, 8, e 10) , e na anáfase as cromátides irmãs dos minicromossomos separadas e cada cromátide irmã tem um único Ioci de CENPC (Figura 4). Os resultados acima indicam que os minicromossomos podem recrutar as proteínas necessárias, tais como CENPC, para formação de cinetócoro, e, portanto agem autonomamente dos cromossomos nativos durante a replicação e segregação dentro das células filha durante a mitose e meiose.

Vários milhares bialophos-resistente, eventos transgênicos de milho DsRed positivo tem sido gerados e pelo menos diversas centenas foram citologicamente caracterizados. Os eventos mostram uma alta incidência de integração dentro dos cromossomos hospedeiros, com cerca de .60% dos eventos mostrando integração detectável por FISH. Ambos os marcadores visual e de seleção estão presentes em quase 39% dos eventos, mas não detectáveis por análises FISH. Até o momento a maioria das combinações das construções recombinantes produziram minicromossomos contendo ambos marcadores e repetições CentC detectáveis por FISH em apenas cerca de 1% dos eventos (4 eventos, Figuras 1-10). A exceção é o subgrupo 1.3 que gerou minicromossomos contendo ambos marcadores e repetições CentC em cerca de 12% dos eventos analisados (4 dos 34).

D. Medidas do tamanho dos minicromossomos artificiais Três dos eventos com minicromossomos de milho

autônomos foram posteriormente caracterizados pela medida do tamanho dos minicromossomos montados e o cromossomo 6, que é facilmente identificado pela sonda 18-26S rDNA FISH. Todas as medidas foram tomadas no núcleo metafásico, que deram medidas mais consistentes. Outros estágios são menos definidos e altamente variáveis no tamanho do cromossomo, por exemplo, medidas preliminarmente na prometáfase mostram os minicromossomos relativamente inalterados no tamanho em relação às medidas na metáfase, enquanto os cromossomos nativos são cerca de 4-5 vezes maiores, portanto os minicromossomos medidos neste estágio são cerca de 5% a cerca de 15% do comprimento de um cromossomo na prometáfase de milho nativo médio. Portanto, minicromossomos medidos na metáfase provavelmente parecem maior com relação aos cromossomos nativos do que se medidos em um estágio diferente. Cromossomos foram medidos usando um microscópio fluorescente Leica DMRXA, imagens capturadas com uma câmara Photometrics CoolSnap CCD e medidas capturadas com software de análise de imagem Metamorph® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Todas as medidas estão em microns.

Cromossomo 6 nativo (n=29):

Média = 4.62 (1) e 2.38 (w)

Faixa = 3.16 - 5.78 (1) e 2.06 - 2.70 (w)

Minicromossomo (n=37):

Média = 1.29 (1) e 1.67 (w)

Faixa = 0.75 - 3.07 (1) e 1.12 - 3.17 (w)

Os minicromossomos de milho estão em média cerca de .28% do cromossomo 6 em comprimento, mas pode variar de cerca de 13-97% do comprimento total do cromossomo 6 na metáfase. O tamanho dos minicromossomos de milho observados podem também ser estimados em Mb. Por exemplo, o genoma de milho compreende cerca de 2500 Mb do DNA total, com cromossomos variando em tamanho de cerca de 150-350 Mb, cromossomo 6 é aproximadamente 200 Mb (Seneca 60).

EXEMPLO 8: Métodos

Isolamento de DNA de espigas imaturas ou folhas verdes das plantas de milho foi realizado essencialmente como descrito em Ananiev et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:3524-3529. DNA de clone BAC foi isolado usando o kit de plasmideo Nucleobond (BD Biosciences Clontech, Califórnia) de acordo com as recomendações do fabricante. Preparação de DNA de alto peso molecular em blocos de agarose foi realizada essencialmente como descrito em Liu & Whittier Nucleic Acids Res (1994) 22:2168-2169. Digestão de restrição de DNA, gel de eletroforese, Southern blotting, e filtro de hibridização foram realizados usando técnicas padrões como descrito em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Vols. 1-3. As referências acima são todas aqui incorporadas por referência.

A. Marcação de sondas overgo para colônia e hibridização southern

Overgos agrupadas para cada sonda (5 pmol de cada oligo) foram combinadas com 2 μΐ de tampão Klenow IOx, 1 μΐ da enzima Klenow (5 U/μΙ) , 1 μΐ de ImM dGTP, 1 μΐ de ImM dTTP, [Oi32PjdCTP and [a32P]dATP - 5 μΐ cada, e água estéril para um volume final de 20 μΐ. A mistura de reação foi incubada à 14 0C por 2 horas. Porcentagem de incorporação foi calculada e foi considerada aceitável a 50% ou mais.

B. Preparação de membrana e hibridização

Membranas foram preparadas usando 432 placas de 384 poços uniformemente distribuídos entre as bibliotecas BAC Mo17 EcoRI e HindIII. Um padrão de grade 4x4 que permitiu .96 placas com 384 poços serem espotadas em uma única membrana de nylon Millipore Imobilon N+ (Bedford, MA) foi usado. As 96 placas gradeadas compreendiam 90 placas de clone BAC e 6 placas de clone plasmidial usadas como marcadores de grade. Depois de gradear, membranas foram cuidadosamente colocadas com as bactérias viradas para cima em placas ágar Luria-Bertani com 17 pg/mL de cloranfenicol, as placas foram cobertas, invertidas, e crescidas à 370C durante à noite. Depois do crescimento da colônia as membranas foram removidas das placas e denaturadas em 1.5 M NaCl e 0.5 M NaOH por 5 min cada, seguida por neutralização em 1.5 M NaCl, 1 M Tris-HCl duas vezes por 5 min cada. Membranas foram secas e tratadas com proteinase K (100 mis em 1 mg/mL; Sigma, St. Louis, MO) por 50 min à 37°C.

Cada membrana foi embebida em 6x SSC, 0.5% de solução SDS em caixas plástica. Filtros foram pré-hibridizados à .56°C em 6x SSC, 0.5% SDS com constante agitação por pelo menos 20 minutos. Sondas overgo agrupadas foram desnaturadas à IOO0C por 5 min e adicionadas à solução de hibridização que tinha sido usada para pré-hibridização. Hibridização foi por 12-16 h à 56°C. Membranas foram lavadas progressivamente por 1 h cada à 56°C em 2x SSC e .0.1% SDS (lavagem 1), 1. 5x SSC e 0.1% SDS (lavagem 2), e .O.lx SSC e 0.1% SDS (lavagem 3). Membranas foram seladas em plástico moldado e expostas ao filme raio X por 3 h durante à noite. Após a hibridização, os filtros foram despojados em 100 ml de O.lx SSC e 0.1% SDS à 90°C por 10 min e estocados à -20°C. Membranas foram usadas múltiplas vezes.

C. Métodos citológicos

Quaisquer métodos adequados, e composições, incluindo muitos métodos citológicos padrões, preparações, e semelhantes são conhecidos no estado da técnica e podem ser usados para analisar tecidos vegetais.

i. Preparação do núcleo de tecido de calos de milho

1. Calos usados para fazer preparações nucleares foram primeiro intoxicados com óxido nitroso à 150psi por 3 horas e ent ão imediatamente fixados. Óxido nitroso detém o núcleo na metáfase que permite uma distribuição cromossômica melhorada para análises FISH.

2. Fixar as amostras de tecidos dos calos em ácido acético 50% por pelo menos 1 hora. Tecidos podem ser estocados indefinidamente em ácido acético 50% à -20°C.

3. Separar embriões somáticos dos calos e colocar em 50 μΐ de gota de tampão PIM (50mM CaCl2, IOmM de acetato de sódio, pH 5.8) em uma placa de petri pequena.

4. Dissecar embriões somáticos em pedaços menores do que .0.5 mm.

5. Lavar o tecido em tampão PIM 3-5 vezes sobre 1 hora para remover o fixador. Pipetar lentamente diversas vezes para lavar e substituir com tampão PIM fresco.

6. Remover cuidadosamente tampão PIM. Adicionar 50 μΐ de solução de enzima de digestão (2% p/v celulase (Cat# CEL, Worthington Biochemical Corp. (Lakewood, NJ, USA)), 0.2% p/v pectinase (Cat# PASE, Worthington Biochemical Corp. (Lakewood, NJ, USA)); 0.5% p/v albumina sérica bovina).

7. Digerir o tecido à temperatura ambiente, no escuro, em uma câmara úmida por 1-2 horas. Como o tecido começa a ficar mole, pipetar muito gentilmente e/ou esmagar com sonda para desmembrar grandes pedaços e liberar as células.

8. Remover cuidadosamente a solução de digestão da enzima e substituir com cerca de 50 μΐ de tampão PIM.

9. Transferir células/núcleos livres para um tubo de microcentrifuga. Adicionar mais tampão PIM para o tecido digerido remanescente e gentilmente pipetar para liberar células, transferir essas células para um tubo de microcentrifuga, repetir quando necessário.

10.Peletizar células em uma microcentrifuga à 500 rpm por minutos, remover sobrenadante. Adicionar tampão PIM fresco e gentilmente ressuspender as células. Repetir esse passo de lavagem mais 3 vezes.

11. Remover tampão PIM e substituir com ácido acético 50%. Ressuspender gentilmente as células, peletizar à 500 rpm por 10 min., remover o sobrenadante e adicionar ácido acético 50%. Repetir.

12. Estocar núcleo isolado em ácido acético 50% à -20°C. O volume final de ácido acético 50% deve ser 2X o volume do pélete nuclear.

13. Transferir 5 μΐ do núcleo ressuspendido para uma lâmina de vidro, adicionar uma lamela de 18 mm^.

14. Aquecer lâmina em uma placa quente à 70 0C por 15 segundos.

15. Remover lâmina do calor e gentilmente pressionar para baixo na lamela laminula para esmagar o núcleo.

16. Permitir a lâmina esfriar brevemente, então imergir lâmina no nitrogênio liquido por 10-15 segundos.

17. Remover lâmina do nitrogênio liquido e aquecer laminula com seu hálito.

18. Remover rapidamente laminula com a ponta de uma lâmina de navalha.

19. Colocar a lâmina em 2 mudanças de etanol 100% por 2 minutos cada.

20. Permitir a secagem das lâminas ao ar. Estocar lâminas à -20°C até o necessário.

ii. FISH seguido por imunolocalização direta do núcleo a. Preparação de sonda overgo para FISH

Sondas overgo são descritas na Tabela 1.

1. Adicionar 10 μΐ da mistura overgo 100 μΜ, compreendendo concentrações iguais de cada overgo, para 5 μΐ de água deionizada.

2. Aquecer à 95°C por 1 min, então transferir para o gelo.

3. Adicionar a mistura acima:

- 2 μΐ de tampão DNA polimerase 10X (IOOmM Tris-HCl, pH 7.5, 10 0 mM MgCl2, 7.5 mM DTT)

- 0.5 μΐ de fluoróforo dUTP

a) dUTP-Cy3 (Amersham)

b) dUTP-FITC (Roche)

c) dUTP-Texas Red (Molecular Probes)

- 2 μΐ dNTPs (200 μΜ A-, G-, CTP; 40 μΜ TTP)

- 0.5 μΐ Klenow

4. Incubar à 37°C por 20 min.

5. Lavar sonda usando o kit de extração de nucleotideo da Quigen. Eluir em 50 ml de formamida 50% em um tampão de eluição do kit.

b. Hibridização fluorescente in situ (FISH)

FISH dos núcleos de milho em lâminas foi feita essencialmente como segue:

1. Fixar lâmina 10 min. em paraformaldeido 1% v/v m solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7.2

2. Lavar 2X 5 min. em PBS

4. Lavar 2 min. em água destilada/deionizada

5. Secar lâmina

6. Hibridizar 2 min à 80°C em sonda fluorescente titulada em formamida 50% em uma concentração final de 50 mM MgCl2

7. Hibridizar 30 min - durante à noite na câmara úmida à .37 ºC

8. Lavar 5 min. em 2X SSC .

9. Lavar 5 min. em 0.2X SSC

10. Secar lâmina ao ar

11. Adicionar Vectashield© com DAPI (Cat# H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) e laminula (5 ml meio montagem/22mm laminula)

12. Examinar sobre microscópio usando conjunto de filtros apropriados e/ou óleo de imersão quando necessário.

c. Imunolocalização

Após exame e caracterização da localização da sonda FISH, essas mesmas amostras podem ser processadas e usadas para imunolocalização usando uma sonda anticorpo identificada diretamente. Imunolocalização do anticorpo anti-CENPC de Coelho policlonal fluorescente-marcada foi feita essencialmente como segue:

1. Remover laminula

2. Lavar 5 min. em etanol 70% v/v EtOH para remover meio montagem e óleo de imersão

3. Lavar 3X 5 min. em PBS

4. Bloquear 1 hora à 37 ºC me uma câmara úmida em soro de Coelho normal 5% v/v (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA) em PBS-BT (PBS com BSA 3% p/v, 0.02% p/v Na azida, .0.5% v/v Triton X-100)

5. Enxaguar em PBS

6. Incubar durante à noite à 37 0C em uma câmara úmida com 1º anticorpo em soro de coelho normal 5% v/v em PBS-BT. Anti-CENPC-Cy3 (ou -FITC) de Coelho foi usado em uma diluição 1:200, concentração final 2.5 μς/ιηΐ, de anticorpo marcado

7. Lavar 3X em PBS sobre um período de 1 hora

8. Secar lâmina

9. Adicionar Vectashield® com DAPI (Cat# H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) e lamínula (5 ml de meio montagem/22mm lamínula)

10. Selar lamínula com unha polida

11. Examinar sobre microscópio usando filtros apropriados e/ou óleo de imersão quando necessário.

d. Produção de anticorpo CENPC e marcação Um CENPC de milho homólogo de mamífero foi isolado por Dawe et al. (1999 Plant Cell 11:1227-1238) e mostrou ser um componente do cinetócoro em milho. Um peptídeo conservado de 20 aminoácidos do domínio amino terminal foi sintetizado e usado para produção de anticorpo policlonal em coelhos (Openbiosystems, Huntsville, AL, USA) . Os anticorpos resultantes foram diretamente marcados com fluoróforos processando o kit de marcação Fluorolink-AbCy3 (GE Healthcare, UK) ou kit de marcação de proteína fluorescente (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN, USA).

iii. Fibra-FISH

Fibras de DNA estendidas nas lâminas citológicos foram preparadas como descrito em Jackson et al. (1998) Genome .41:566-572. Sondas para fibra-FISH foram marcadas com biotina-ll-dUTP (Roche, Germany) ou DIG-dUTP (Roche, Germany) usando o kit Nik Translation Labeling (Roche, Germany) de acordo com recomendações do fabricante. Após a precipitação, as sondas foram re-dissolvidas em tampão TE e estocadas à -20°C. Para fibra-FISH, as sondas foram hibridizadas para fibras de DNA em uma mistura de formamida .50% (v/v), SDS 10% (v/v), e SSC 2x em um volume final de 10 pL. As lâminas foram cobertas com lamínulas, selados com cimento de borracha e incubadas à 80°C por 2 min para desnaturar ambas as sondas e o DNA alvo, seguido pela incubação à 37°C. As lavagens pós-hibridização e detecção do sinal foram executados como descrito por Zhong et al. (1996) Plant Mol Biol Rep 14: 232-242. As sondas marcadas com biotina foram detectadas com fluoresceina-avidina DN (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), biotinilada anti-avidina D (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) e novamente com fluoresceina-avidina DN (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) . As sondas DIG-marcadas foram detectadas através de anticorpos monoclonais anti-DIG de rato (Jackson Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) e anticorpos anti-rato Cy3-conjugada em ovelha (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA) . As lâminas foram então montadas em um meio de montagem Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) . Preparações foram examinadas usando um microscópio fluorescente Leica DMRXA, imagens capturadas com uma câmara Photometrics CoolSnap CCD. Imagens foram capturadas usando software de análise de imagem Metamorph® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) . Fibra-FISH foi realizada em 3 para 5 preparações de cada linhagem. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS <110> Depositante: PIONEER HI-BRED INTERNATIONAL, INC.

<120> Título da Invenção: Microssomo Artificial de Planta

<130> Referência do documento: 2083-PCT

<150> Número do Documento de Prioridade: 60/801,004

<151> Data de Depósito do Documento de Prioridade: 2006-05-17

<160> Quantidade de SEQ ID NOs.: 193

<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> SEQ ID NO: 1 <211> Comprimento: 4635 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Zea mays

<220>

<221> Nome: Origem

<222> Localização: (1) . . . (4635)

<223> Outras Informações: CentA

<400> SEQ ID No. 1

tgatgagaac ataacccgca cagatatgac catgttaatg gctcctgcta caaagacatt 60 gaggaacaaa gaagttgatt ggggaccaag taatgatatt tccaacattt ccaacaaagc 120 aagcacatca tcaaatttaa agatatactt gggtgaggag catacactag agtcgaggac 180 gactctatta caagaagggg aggatgatga ggacatcact gccatcaata caccacacca 240 gcgacctcct tcaccattta ataatggacc agtaaacgag tccgtgcacg taaattttat 300 tatcaggtga actcgttcct tattgttgaa gctaatcatt ccttaaatga ggtactaata 360 ccttgtgatt actttattaa tctaaggtgt ttgggaggtg aaccatctag aatttgagaa 420 ggcaacaagg caataaaagc tgctccactt gaggggattt cgaaactaca acaagtgcaa 480 gtttaagagg gcatatcttt cagctcctaa ggttgtttaa tgcaaataag cacttgttgg 540 aaaggtctct ttgtctactt tctagtggat caagaatcaa cgagagatca gacactaagt 600 gtccagaaac tgccgagtga actcctgctc tacccaagtc aatttcgtaa ctgcagcatg 660 caccaaatta aatggagcat aactttccac tcccaaggtt gtttagtgca aataactact 720 tgttggaaag ctctcttcgt ctactttcat gtgcatcaat aatcaatgac agaaaccaaa 780 cgaggcgtcc agaaactgcc gagagagttt cgttctccat tagaactcct ttctattcct 840 ctatttaagc aactagcagc caccaaagaa cttgggtttt tgtttgatgt aagtttagcc 900 tttgctactt ccttgtaaac gcatgtgtcg gctagaccac ccggatactt gaaacagaac 960 cccaactcta tcagatccgt gagtgtctgc tttttatctt gttcttgctt gttctcgatt 1020 gcttgcaggt tcaaggctgt tcttggcacg gcaagggcag caacaacagg agccgatgta 1080 actatcgcta aggcgcagca cccttgtggt tgttgtagtc ggatagcaca acgtcgacct 1140 ccaccccaaa tcgtagttat caggagacgg tgtacctgtc gctcaaggcg ccacaccatc 1200 ttggttgtgg tagtcgggca gccaacgtcg ttctccaaca agtttccacc tccatcatct 1260 ctcatcgaaa gatcgggcac ccttctaccc gttgggttta tcaagtggta tcaaatttca 1320 ggttgctcgg tgagagatct caatcttcct tgttttgttt acctacagtc cacttttgcc 1380 caaagatata tttagagcag aaattcacct aaaaacagtt tgagcctttg ctttactact 1440 tagttttcga cttgttgaat tccggtagct gcatttgggt cgagttgctg gtctaaagtt 1500 ttcttaccgc tagagtttcg agttcgcgcc accttgtttc aatcaccagt ttagacctct 1560 tgctgcaatt caaccaaaaa gaagagaaag caaaaggcga gtgcacaaaa aaagccgcac 1620 taatcagcaa aacaaaaaaa gacacgtgca aaacaaaaga gagagaaaaa aaccagttct 1680 gaattttggt agataaaatt tgtaagtgca acaaaacaaa aggcagtttg tgtgccttct 1740 ttttatagtt tcagaaatca gattgttgtt ctgagctttt ggtgatacta tttgtgtaac 1800 ggctcgcgtc tctattacgg tttggactag gaccagcaca acaccttgtg gaacgtttat 1860 tcaacttgtt gtggctaacg tggtactagc tattccttgg aactattgtt taaacagcca 1920 cctataaatc cacaaaattt tctacaacac gttgttcgtg ctgtttgcca gcgcctcctg tttaaccagt ttgagagtga gagattacaa gatatttttt attgtttctt gtctttacta ccaaccgaac gttatattgg aggcatcatt gatcctcatg catacattga ttgggagcta ctatctcaaa aacaaaagat ttatattgcc gaatggaaat acatttgtag gcacaacaaa cattttagag atgcattcat tcctgcatac accttaaagc agggtgctag gactgtgaaa atgtttgctc gtttagatga atgcatggaa aattctgaaa ttcagactat agtcatgcat ttgcttgcat gtaaagctga aaatgagatt gtgagccata attcctcttt tgcatcttct aaaccagctg ttgtttttcc atcatcacaa gaagatttgt gggataatga ttcacatgta acatctatta ttgaaccaaa cattttggct gaaactgaag aaataaattt gctctcttct gatctttttg agctcggtaa tttggaaaat tccttctcat gatatatttt atattgctgg gcatagaatt tctatttcat ctagatatgt ggtatgttct caagaagaaa agaatctctt tttatatttg aaagacatta ataaaagctt gaggacggtt tgctatcaag aaggggagaa catgttaatg gctcctgcta caaagacatt taatgatatt ttcaacattt ccaacaaagc gggtgaggag catacactag agtcgaggac ggacatcact gccatcaata caccacacca agtaaacgag tccgtgcacg taaatttaat gctaatcatt ccttaaatga ggtactaata ttgggaggtg aaccatctag aatttgagaa gaggggattt cgaaactaca acaagtgcaa ggttgtttaa tgcaaataag cacttgttgg caagaatcaa cgagagatca gacactaagt tacccaagtc aatttcgtaa ctgcagcatg tcccaaggtt gtttagtgca aataactact gtgcatcaat aatcaatgac agaaaccaaa cgttctccat tagaactcct ttctattcct cttgggtttt tgtttgatgt aagtttagcc gctagaccac ccggatactt gaaacaaaac tttttatctt gttcttgctt gttctcgatt gcaagagcag caacaacagg agccggtgta tgttgtagtc ggatagcaca acgtcgacct tgtacctgtc gctcaaggca ccacaccatc ttctccaaca agttttccac ctccatcatc cgttgcgttt atcaa 4635

caccaggttg tgctagcagc cactgttgtt 1980 ctttgcgtgg tgagaacttg taagaacttg 2040 caatgattcc tagtagttta tagaatcaaa 2100 aacatggcag gtgatatgga catttttgac 2160 caacacttgc ctttatatgc cggtaaattc 2220 aagctagata aggaatttga taagcatgat 2280 tctaatttgt taactgagca cgcattgatg 2340 gttccacaat cttgggaaga cttcaaactt 2400 tatgctgatc atttgctttc taaattagac 2460 gattattatt atgattttaa aatttttacc 2520 gatgtcatga ctaggttcat gaaaggactc 2580 gaagcataca aacacatttc tcacttgttt 2640 ctattataca attatacaag cactgaacat 2700 ctacatgctg atcaagaaca caaaataatg 2760 gaagaattga ttgctgacac ttgtgatagt 2820 ctaagacaac aactagtaaa tgaacatgtt 2880 aaaaaggaac atgtaatttg tattgcaaac 2940 ttaaatactt ggggctatat tgaatttgat 3000 attttatttg ctagattcaa ctataccatg 3060 caagtacaac aacataggac aatttcttgt 3120 tgtttcttca ctttgtgcaa ataagatatt 3180 gtttccatgt actttagttg aagtttcagg 3240 agtcatcaac atcaatcatg atgcaaaacc 3300 tgatgagaac ataacccgca cagatatgac 3360 aaggaacaaa gaagttgatt ggggaccaag 3420 aagcacatca tcaaatttaa agatatactt 3480 gactctatta caagaagggg aggacgatga 3540 gcgacctcct tcaccattta ataatggacc 3600 tatcaggtga actcgttcct tgttgttgaa 3660 ccttgtgatt actttattat tctaaggtgt 3720 ggcaacaagg caataaaagt tgctccactt 3780 gtttaagagg gcatatcttt cagctcctaa 3840 aaaggtctct ttgtctactt tctagtggat 3900 gtccagaaac tgccgagtga actcctgctc 3960 caccaaatta aatggagcat aactttccac 4020 tgttggaaag ctctcttcgt ctactttcat 4080 cgaggcgtcc agaaactgcc gagagagttt 4140 ctatttaagc aactagcagc caccaaagaa 4200 tttgctactt ccttgtaaac tcatgtgtcg 4260 cccaactcta tcagatccgt gagtgtctgc 4320 gcttgcaggt tcaaggctgt tcttggcacg 4380 actatcgcta aggcgcagca cccttgtggt 4440 ccaccccaaa tcgtagttat caggagacgg 4500 ttggttgtgg tagtcgggca gccaacgtcg 4560 tctcatcgaa agatcgggca cccttctacc 4620

<210> SEQ ID NO: 2 <211> Comprimento: 156 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Zea mays

<220>

<221> Nome: Origem

<222> Localização: (1)...(156)

<223> Outras Informações: CentC

<400> SEQ ID NO. 2

ggttccggtg gcaaaaactc gtgctttgta tgcaccccga cacccgtttt cggaatgggt 60 gacgtgcgac aacgaaattg cgcgaaacca ccccaaacat gagttttgga cctaaagtag 120 tggattgggc atgttcgttg cgaaaaacga agaaat 156

<210> SEQ ID NO: 3 <211> Comprimento: 6915 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Zea mays

<220> <221> Nome: Origem <222> Localização: (1)...(6915) <223> Outras Informações: CRMl

<400> SEQ ID No. 3 cttggtcttg gacagtacct cactgatgaa tttcggcgag tagagataat tccgatttgg cgagcaagcc cgaggcgcca atgcaatcgc ctgatgcgag atcggcctga tcacgaagat agaataagat gcgagcaatc taatctatta cagcgcagat tagcgcgtgt tcgagagtag ataaaggagg cgcagctcct gaataaatag ccctaggtcg tccattatgg gccgcaattg tctttaacaa catgatgtag ttcaattctc gaaggggtgg cgcctgggct ggagaaggtg tgatgtccgc atcatcctcc ccttcttgaa cttctcccgc atacggtttc aaatctgcaa caggtaggtc gagggtataa gcattatcat cagcacgagg catcaattta gaacggcgca accaaaccat atcaccaggt tcaaaagtaa gattttttgt attagtagca gcaatgttct gttcaacatg tgcagaagca tctacatgtg caataggtgc cctaggaatg taaccataaa aatgcgtggc atgattgtaa gcaaattcaa aattcttgtc taaaacagcc ctaagcatgg gtccatcagt ttgagggtga caagtagtgc aaagagatct ccaaaaatgg cttagaaact gaataccatg taaacgaata atttctctaa cagttttatg acaaggtata aagtgagcca tactatccct ccccttctta gttctaggca gccaaggaga agaagggaca ggcaaaggca tagctttctg acaagtagtg cagcgtgcaa gccaaaagaa gtgggcagcc aacacctcat gaccgcctcc atgcgcttcc tgtaacaaca gcttgttagc gcgaaacagg aacccatcct taatacaatg gccgaaagca tctttaaaat tgtccaaacc aaagatttta aaatctaact catcagcaat aacattgtcc ttcccgttct tgaattctac ccatttagca tgacgacggt aagcctcatg atcagaatgg attatgaact gcaaagtgcg cactaaagcg taaagctcct cgcttaattt ttcactaaaa taagcaactg gcccaatacc actagcatcg cattcaagct agaggggagc ttgggttaac ttatctttca tccaggcaaa cggcacatct ttctttgtaa aatcacgaac aaatctgcgg tagaaaccgg ccgtcgtcgg tgtaggccac tcccgaatgg cctgcggagt aaccacataa ccaagaaacg ccatgttacc aaacaagcga gcagcacgca aatgctcctc tatagacttg ctgtaaataa aacctatgaa ggcccgtaga acttcgttca tcaatccaaa tggcataacc aaccattcat

gtagacctga tgaagctgag gtgcccgatc 60 cggaagatga cccttgcgat ccgactacga 120 tgaaccaact ccctgtggtt accgaccttg 180 cgtttcctgt gcgcaatcga agaacgaaca 240 ctcgagggtg gagttctgaa tacacgaaga 300 ctaaggctaa cgtaaaacaa aactcaggaa 360 agagggggcg cagcccctag gggcggccaa 420 ggctggtcgt ctattcttcc gggccttcgt 480 ttgcacgggc ccgagtcact ggcccaggtg 540 ctgctggtgt agatgtgctc gtgttggtgt 600 ctgaagtcgt cctcgacggc aactcctcat 660 cattaaaact agtggaaaca ccaaactccg 720 taatcttggt tagtatctta aaaggaccag 780 aagtaggaaa acgatccttt ctcaaatgca 840 catgttttct tcctttacta ccagcaacct 900 gtttcgtttg ttcatgtatg gtaatcattt 960 gggcgttcgc agcattaagt gaaatcaaat 1020 caatctggaa agggcacatc tttgtagaag 1080 catgaggcaa gcaatcctcc caacgtcgca 1140 tagataaagt tctatttact acctcagttt 1200 taaacaacaa tttagttccc aatttattcc 1260 tagcatcgcg atcagagact attgtttttg 1320 agaacaattc agcaacaatg ctagcatcat 1380 ttttagagaa tctatcaaca accacaaaaa 1440 agcccaaaac aaagtccata gagatatcaa 1500 tatacaaacc atggttgttc aaccgtgact 1560 caaggcgctc cacatcagcg cgcatccgag 1620 gtgtcttgta gacgccaaaa tgccccatga 1680 aaagacgaac cgagctagct ggaacacaca 1740 gtatgtgaaa tttgccccat ggttttccat 1800 cagcatcgtc aacatattga tccttcacag 1860 gtgacagcat ggtatagcga cgagacaaag 1920 tgtgtttaat aatgtaagga aaggactcaa 1980 tcagatttgt ttgggtacga atatgtttta 2040 cacgatgcca aagatagtgc tgccatgtat 2100 tatcataagt agaatatttc agactagcac 2160 gttttccttc ttgtaacaaa acagcaccca 2220 cgaaaacttt attaaaatca ggcaattgca 2280 aagtgctgaa cgctacctcc tgcgaatcac 2340 gctcatgtag aggcgctgca atggagctaa 2400 caagtccaag aaagctccga atttgtgtga 2460 cagcaatctt gctgctatcc acctcaatgc 252 0 agacacgttg cgtgcaaaat gtgcactttt 2580 aagcgtcaaa aacagcacgc aaatgttcta 2640 ggatatcatc gaaataaaca acaacaaaca 2700 ttaaacgcat aaaggtgctg ggagcattag 2760 ataaaccaaa tttcgtttta aaagccgttt 2820 tccattcatc accgagtttc attctaatct agaaaataac ggcaccacta agctcatcta gataacgaac tgtgatgtta ttaatagcac ctttctttgg aacgagtaaa acgggaaccg ccttatcaag cagcgtctgc acctggcgct ggtacggagc gcggttcgga agagaagtgc cacggagggg aggaagaccc ggtggtaagt aaaggttaac aacagcaggg ggtatatcca ttcgcgagca tacaagtgca taacagggca cacgtgtagc aagtaaaaca ggagagtgca atgtcgattt gacttgttgt gcagttttag ggtcaggggt cattggatgt ataattattt ttgaacgacc atgatgtaaa ctatcagtat agcatgcttc cataggaata acatcgcaat aggggacacg taccgaacgt gttaccttta gatacggatg tggatgtgtg cgagtgggca ccaaattgtt gcagctgcca ctatcgatga ccttggtatg gaatagagtg tgtcgctgat gaacacgctg cacaacaaga ctctcatacc cctcattttc tgcatggtta gtggcaatca ctgaagagta ctcaccattg tcacgtataa tcatgtgccc aaaccctctg caacgatggc aagcggcgcc tttggcaggg ggcgccactg taggcgtagg aggtgcaggg ctggaaggag aagagttagt atatgtcttt gatcgtcgtc attcaaacaa tgtggttata tcaaaataat tgttcaaacc accacgaaaa cgcgccatag gaagcatacc cttttgcaac tcctggtaat aacgctgcat tttgttaagc aaatcacgag tggcagtttt taattgggtc caagtaatga cacgccacca aattaaagca aaatcagtaa tagcaggaat atcatggcat gaaaatttct cagcaggatc atatttacca ttaaaagatg cattaggggg atgacgaacc acacgacgtg cagtgtcacc gccgtattcc tgctccatct tggtgtcgag tgtggtgcga gtcgccgttt tcgtcgaagt gatcgttgaa tcaagccgtt catcaacttg gccccttact tcctgcaact tagttagcgc aaacaccaaa aggagaaaaa caaggcgctc acactagtgc tgttatcaag tgaactgcaa ccaacaggtg gaaccggtga agaaacctgc tcgtcgtaga aatatgtgga ttagcacgat caaacaataa tgcaaagttg ctggccacag gtgcaaagga tggatggatg tgtactagtg atgccaaaaa ggcactagta tgtatgattt ttttgatatt tttctcagca gtttcaccta aaacagatat cagatgtggt cgtgcgagaa ctttgacgga tttttttctt cgaaccccaa acagaccgta ggtgagtttg tgtaaaaatt tcagattttt tggacacccg tacctcaaat tatgttttca aacgaccgga gttttttgtt tctgtttttt tttttacgta gactcggttt gttttttttt ctgttttttt atcaaggaaa acagccgttg actcggtttg ggagaaaaac aaggaaacaa tgttgactcg gcggcgctag ggtttgaatg gtggaagaac gcacacaaat tcaacaatgc agattattga gataagatct aacctgaatt tttatgtggt ataaactcac cgatcaacct agaaatctga tttcggcgag tagagataat tccgatttgg cgagcaagcc cgaggcgcca atgcaatcgc

gatggtaacc gctacgcaaa tcaaccttag 2880 gcatatcatc aaggcgtgga ataggatatc 2940 gacaatctac gcacatacgc catgacccat 3000 agcaagggct aagagactca cgaatgtaac 3060 ggatctcctt cgtctcatct ggatttgtac 3120 cggggatgag atcgatctga tgctcaatgc 3180 ccgtaggata aacatcagca tactcctgca 3240 aagacggtgc atcatcaagc ggaacaagca 3300 tatgagcttc atggagatca tcaaaatcag 3360 acttgatttc agatttaata ggtgcggctg 3420 cagccctagt aagatcatct ttcaaaattt 3480 tctggccttt aaacatgaaa gaataatgat 3540 catattgcca aggtcgaccc aataacaaag 3600 caacataatc agaataagaa cccagcgaaa 3660 ttttaccacc atcattaagc cattgaatgt 3720 aggataattt ctctaccaac gctgtacttg 3780 tgatgcgaat cgaccgttcg tgcacgacgc 3840 ttttttcggc ctgggcaacc tgtgtgctga 3900 tatcagcgtc gatgggatca acgtggactt 3960 tagcatgact agtttcctca gaatcactgg 4020 gcaaggtacg cttgtttggg cagtcccgaa 4080 actgaatatc ccgtgtacgt cctgtggaag 4140 gcttggccgg ccctgtgcgc gatgtagtgc 4200 ttgagctgtg tgttggaccc cggcctgcaa 4260 cctgcacttc acgttcagct ttgcaagcat 4320 ccttataatc aagtatatcc tgaatttccc 4380 cagcgtcatc tgactcaacc aaaccacaac 4440 attcctcaac agattgtgaa ccttgttgaa 4500 cataatagga aggaacaaat ctgtggcgca 4560 cactgttaat gggaagtttt tgtttatact 4620 attcactaat ggcagccttc acttggctat 4680 gttctacctc taattcccaa tcaagatatg 4740 gaattttaaa tttaatctta gaaaataagt 4800 cacgaccacg gcgatctcca tcgtcctgct 4860 ttgtggtcaa tgcatcaagg cgtgccagga 4920 gagcaaggtc aagttggttg aaacgctcgg 4980 catgcatcgt cctaatgtca gcagcaagtc 5040 gggcatccac catgtcgtgt gctcctgcca 5100 ccaacgacaa aaacaggggt gtactgctca 5160 ttcttatccg ttcttaccaa gccacagtgg 5220 aagattggat gagcgattgc ttggagaaac 5280 gttgtgggta ggctgcactc aagtcaagga 5340 aattatagtg caaaacacga aactatattg 5400 gaaatagcag aatggcagta acgtaaatat 5460 caaatcacag gtgattttgt ttttcttttt 5520 caagaagcaa caagatagga gctacacgaa 5580 ctacagaaaa tcaggaagtt ctctgaaaag 5640 tattttcctg aatttttttg acaattttgt 5700 gccgggctca gaatggtgtc aactagctcc 5760 agcgaaaagt tatgcccggt ttaaggaagg 5820 atgaaacaac cgtatccttt ctccttcgtt 5880 accgaaggag aaaaacaagg aaacgatgtt 5940 ttctgttttt tttcgtaacc gaaggagaaa 6000 ttttttctgt ttttttttga cgtaaccgaa 6060 gtttgtggtg tgatcaaacg agagatggtg 6120 acaatgcaac cagcaacaaa tgacgcgaaa 6180 aagaaagtgc gaggctcaaa agggtgctgg 6240 tttgtggact gtaggaaaaá aaaacgctcg 6300 taccaattga tgaagctgag gtgcccgatc 6360 cggaagatga cccttgcgat ccgactacga 6420 tgaaccaact ccctgtggtt accgaccttg 6480 ctgatgcgag atcggcctga tcacgaagat agaataagat gcgagcaatc taatctatta cagcgcagat tagcgcgtgt tcgagagtag ataaaggagg cgcagctcct gaataaatag ccctaggtcg tccattatgg gccgcaattg tctttaacaa catgatgtag ttcaattctc gaaggggtgg cgcctgggct ggagaaggtg tgatgtccgc atcaa 6915

cgtttcctgt gcgcaatcga agaacgaaca 6540 ctcgagggtg gagttctgaa tacacgaaga 6600 ctaaggctaa cgtaaaacaa aactcaggaa 6660 agagggggcg cagcccctag gggcggccaa 6720 ggctggtcgt ctattcttcc gggccttcgt 6780 ttgcacgggc ccgagtcact ggcccaggtg 6840 ctgctggtgt agatgtgctc gtgttggtgt 6900

<210> SEQ ID NO: 4 <211> Comprimento: 7572 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Zea mays

<220>

<221> Nome: Origem

<222> Localização: (1) . ..(7572)

<223> Outras Informações: CRM2

<400> SEQ ID NO. 4 tgatgaagac atccacacta ctgatgcatc cattactcgc gctcgtgctc gtcaactcaa tccatcatat ttagaccatg gagacccgtg agaccgaaag ggaaaaggat ttgaacatgc gtgacggtca ccacggtcag atgcgggctc gcttatcaag tctactttca tatggatccg cgtaatcatt gttttcttac cgagacattt ccctattttg gcccaatggg tcgtgtatca ttgcagcacg accccaatac ccttgtggtc ccaccaagaa cagcgggttt tgtttagatc gcgcgtgcta gttcagccgc ccgtcttctt atctttaaac ctacatttag atctggtaat tcttcgattg cttgcaggac gagtgcccta tgacagccat aggaggtggt gtatcggttg tcgggccgtg aacgtcgtct cctcccccaa atcgggcaat cacccaacgg gtgcacatca gagatttact tttcttcgct gttttcttat agtagattag ttttaccgca atcctataaa agggcttgtt gagtttttgg ttgcatcggt tttagagttt tgagttctac cacgttttgg tctctggttc gtttttgcca ccacggatac aatctggaaa gcttatctta tcttctttcc ctgagcgctc cgcaatcatc gtagagattt aatctgattt aaaggggttg ttagcaatat aagggtttag gcccctgcaa aaaaaaacag aaaaaaagga aaagaagaag aagggggctg tgtgctagtt gttctttttc agtgactacc tttagcctag gaccagcaca gtaccaccgt aacgtggtac tagtgtattc cttgcttcag agtttgacag gtcgtgttgc tgcggcaccg ggttgctgac ccctcctgtt gtgcaaggta agagtgagcg ccttgcagta gctacatcct ttttttttct tgttgcctct gttcgtctaa ctcgtaatat gccacactct cctcgcacca tgaaaacgca cacggaaggt cttgataatg aattggaggc cacacagatc gacacaaaca ctcatattga caagagcctt gtcgcactct ccaatggtgg gcgtgatgag ggcgccgaag aacaagatga ccaagaagca cctaatcgcc gtggttttca ccgacgtgag gtacatggta

tataccaata caagtaccaa tttctggtcc 60 ccatcaggtg attacactct tgagttcatg 120 cactcttgtt ttgcttagga atcagggaga 180 tggattcgga ctgcagaaga acaccaactt 240 ggattggaat gttcaagcac aacatggaaa 300 gaattatagt catatctgtt ctgaggccgc 360 cctgcctttt ctgcccatgg tgctgcgtca 420 agttaggtcc attagggacg catcctaggg 480 gtcctcccat gtttataaac cccctagccg 540 aagtttagct ctcgctactt gcttgcaagc 600 gtcttcggaa ccccaccata ttggagtttg 660 tcagtacttg ttctacttgt tcttgctagt 720 gtggccaggg tgtcacgctc cacaagatcg 780 ctaaggcgca gcgtctttgg aaggctgtag 840 tcgagttatt ccacaccctc tcatcgaaag 900 gttggtaatc agagcaaggt ttatcggtga 960 ctcctatagt ccagaaaaag ccaaaaaaat 1020 ccattgagca tttactagta ctacttagtt 1080 tgtgtcgagt tgctggtctt agtttattcc 1140 tcaccacgag atccaccatc accaaaaaca 1200 atatcatatc cgatttggaa gtttaaatac 1260 aacggatctg accttatctc aaaattcgtt 1320 ctggactttc tatattaaca agatttgtta 1380 ctttattgtt tgggttgtca tagtgaaaaa 1440 aagaagaaga aaaaaaaaga atagaaaaga 1500 aatctctaaa tctgttgttt ctctttgtgc 1560 tttgtgccta ggctcacgtc tctagcctgg 1620 tgaacgatta ttcagcttgc ttttgtaact 1680 cccacctaca actctacata tttcgactac 1740 atacacttat tccacggttg cagacttgtt 1800 agaattggta agagcttgtg tggcaggttg 1860 aatagttgta gagtttttat tccttcacat 1920 ccatggcagg attggaggtt gatgatgctt 1980 agggtatcat acaacacttt gtaaggctgg 2040 acatgcaggt gacgaatgaa aagatggggc 2100 ccaaacttgc aaatgtggaa atgacagttg 2160 tgaggcgatt tgatgagatg catgctaata 2220 gtaactggga tgactatgtt gctgatactg 2280 ggcgactacg tactaaccgt agaggtatgg 2340 atgatgatgc ttttagtaag gttaaattta 2400 aaatacctcc ttttgatggt aaatatgacc ttgatcaaaa gtttgcatgc catgaatttc gtgagtttac tgaatttgct tctgtttggt acatgccaca aacttgggat gcgttgaaac attatgcacg tgatatgtta aacaagttgc aagaatatta tcaggaatta caaatgggta aatctgctat ggctagattt ttgggcgggt ataaagatta tgctaatgta acccgattgt tgcagggacg acgtgctagt gcaaggtcta aacagcgcac gactacgtcc atgaccggcc gaccagcacc cccgccttcc tccagcgaca ccaaatctgc ccagaaacca gcaggtagtg gagatgttct gtgttatcga tgcaagggct agcgtgtttt ggtggtaaaa gacgatggtg ctacacttgc tttgcttgcg gctgatgatg ttggtgcaga tgatgcagag cattatgaga aaatggagaa ggcagagcag aatcagcgac aggagcgttc atgtcgtttg atcattgatg acatggtgga gaagcttgca cttacgacca ggctcaacaa tagtggtaag gtcaaggtaa gttcatatcg tgatgttgtt gactgtgatg taggtagacc atggcaattt gattcagatt ctctcataca ccatgataag aaaattattt gtgatgatgt tgctaaagct accaaagcta ttggtaataa caaagatggg ataaaattga atgttaatga attatttgct tccactactg tgatttcaat tcaagatatg cagcattctt agtattctga tgtatttcca agtgagatac agcaccaaat tgatcttatt cctggtgcat atccagagga aacaaaagaa attcagcgac tgcgtgagtc tcttagtccg tgtgctgttc catggcgtat gtgtgttgat tgtagggcta ctattccacg tttagatgat atgcttgatg ttgatttgcg tagtgggtac caccagattc ctttcaaaac taagttcgga ttgtatgagt cacctagcac tttcatgaga ttaatgaacg tggtagtata ctttgatgac atattaatct acatgcgtgc tgtttttaat gctttacgag gcacattttg caccgatcga gtttcgtttc aggttgatca agccaaggta gaagcgatac aggtgcggag tttcctagga cttgctggct ccattgctgc acctttgaat gagcttacga tacaagagca cgctttcaac gtgctgaaag ttcctgattt taataagact tttgagcttg gtgttttgtt acaagaaggc aaacctgttg ttctaaatta ttctacttat gataaggaat ggcagcatta tttgtggccc aaagagtttg atattcgtag tcaaggaaaa ctgaaccgta cgtttcctta tgttattaag cacaagaaag ctaggagata tactttgctg aatcaacttg aagaccaata tgttcatgat gctgatttta aaggatggaa caaatatatc gttagtgatg ttccagctag ctccgttcgt ttgttgttgt gacattttgg agcaaagaaa acggaggaca tgagaagaga tgtggtgaga ttggttgctc ggttaaatcc acacggtttg tatttgcctc tttctatgga ttttgtgctg ggattgccta tggttgttga tagattttct aagatggcac ctactcatat tgctgatttg ttctttcgtg caatcgtttc tgatcgtgat gctaaatttc aattggggac taagctttta ttttctacta

ctgatgctta cattacttgg gagattgcgg 2460 ctgagaatgc gcgggttaga gctgctacta 2 52 0 ggatagaaca tggtaagaag aatcctaata 2 580 gggtcatgcg ggctagattt gttccttctt 2640 aacaattgag acagggtact aaaagtgtag 2700 tgctgcgttg taacatagag gagggtgagg 2760 taaataggga aattcaggac atccttgctt 2820 ttcatcttgc ttgcaaagct gaaagggaag 2880 atgtttctgc aggaaaatct acaccatggc 2940 gtacactagc accaactccc tcgccaagtc 3 000 aaccacgtgc atcttccaca aattcagcaa 3060 cctcttcagt agcctccacg ggtagaacaa 3120 atggacacgt gcagcgtgat tgtcctaatc 3180 ggtattcctc tgctagtgat ttggatgaag 3240 caggcactaa ggaaccaccc gaagaacaga 3300 gcctcattgt acagcgtgtg cttagtgcac 3360 atacgttgtt tcaaacaaag tgtgtcatta 3420 gaggtagctg caacaacttg gctagcagcg 3480 aaccgcaccc gcatccatat cacattcaat 3 540 ccaagctggt acgaattaat tttgctattg 3600 ttgtgcctat ggatgcttgt aatattctgc 3660 gtatgcatca tggtagatca aatcaatatt 3720 tgcttcccat gtcccctgag gctattgtgc 3780 aaactgagaa caacaagaat attaaagttg 3840 aaggacattg cttgcttgca acaaaaactg 3900 ttgcctacgc cttggtatgc aaggatgctt 3960 tgcctcctgt tattactaac attttgcagg 4020 cagaggggct gccacctata cgagggattg 4080 ctttgccgaa tcgtgcgcca tataggacaa 4140 aagtgcaaga actactcgac aaaggttacg 4200 cggttatttt agtgcctaaa aaagatggaa 4260 ttaataatat cacgatacgt tatcgacacc 4320 aattgagtgg tgccattgtc ttttctaaag 43 80 gtatgaaatt gggagatgaa tggaaaactg 4440 ggttagtcat gccttttggg ttaactaatg 4500 aggttttgcg tgccttcatt ggaaaatttg 4560 acagcaaatc tatggatgaa catgttgatc 4620 atgcacgttt atttggtaac cttgagaagt 4680 ttggttatgt tgtgactcca cagggaattg 4740 atggatggcc tatgccaaag actatcacac 4800 tctatcgccg ttttgtgaag gactttagca 4860 agaagggagt gcattttagt tggggcaaag 4920 ataagttgac acatgcacct ctcctccaac 4980 aatgtgatgc tagtggaatt ggattgggtg 5040 catattttag tgaaaaattg agtgggtctg 5100 tatatgctct tgtgcgaaca ttagaaacat 5160 ttattcattc tgatcatgaa tctttgaaac 5220 gacatgctaa gtgggttgaa tttatcgaat 5280 gaaaagagaa tatcattgct gacgctttgt 5340 actacaaaat ctttggatta gagacgatta 5400 aagatgtgtt gctgcattgt aaagatggga 5460 ggtttgtgtt tagagctaac aagctatgca 5520 tacaggaagc acatggaggt ggcttaatgg 5580 tacttgctgg tcatttcttt tggcccaaga 5640 gttgcacgac atgccaaaag gcgaagtcac 5700 tacccgttcc tagtgctcct tgggaagata 5760 ggactaggaa gggacgtgat agtgtgtttg 5820 atttcatacc atgtcataaa actgacgatg 5880 aaattgttcg cttgcatggt gtgcccaaca 5940 ttagtcattt ttggaggact ttgtgggcaa 6000 catgtcatcc tcaaactgat ggtcaaactg 6060 aagttgtgaa tagaactttg tctactatgt tgtgggagga ctgtttgcct catattgaat caaagatgtg cccatttcag attgtatatg tgcctttgcc atcttctgaa aaactaaatt taaaactgca cgaaactact aaagaaaaca ctagtgataa aggtagaaag gaaataaatt tgagaaagga aaggtttcct gaattacgaa cgtttaaagt gctagagaaa attaacgaca ttggggttag ccccacattt aacattgcag agcttgagtc gaggacgact caaatgcaag ctgatgcatc tataccaata caagtaccaa gtcaactcaa ccatcaggtg attacactct ggagacccgt gcactcttgt tttgcttagg tttgaacatg ctggattcgg actgcagaag gatgcgggct cggattggaa tgttcaagca atatggatcc ggaattatag tcatatctgt ccgagacatt tcctgccttt tctgcccatg gtcgtgtatc aagttaggtc cattagggac cccttgtggt cgtcctccca tgtttataaa ttgtttagat caagtttagc tctcgctact cccgtcttct tgtcttcgga accccaccat gatctggtaa ttcagtactt gttctacttg cgagtgccct agtggccagg gtgtcacgct tgtatcggtt gctaaggcgc agcgtctttg tcctccccca atcgagttat tccacaccct ggtgcacatc ag 7572

taagggcagt tctaaagaag aatattaaga 6120 ttgcttataa tcgatcattg cattctacta 6180 gtttgttacc tcgtgctcct attgatttaa 6240 ttgatgctac taggcgtgct gaattgatgt 6300 tagagcgtat gaatgctaga tataagtttg 6360 ttgaacctgg agatttagtt tggttgcatt 6420 aatctaaatt gttgcctcga gccgatggac 6480 atgcatatag gctagatctg cctgcagact 6540 atttaaagcc ctacttggga gaggaagttg 6600 aaggggagaa tgatgaagac atccacacta 6660 tttctggtcc cattactcgc gctcgtgctc 6720 tgagttcatg tccatcatat ttagagccat 6780 aatcagggag aagaccgaaa gggaaaagga 6840 aacaccaact tgtgacggtc accacggtca 6900 caacatggaa agcttatcaa gtctactttc 6960 tctgaggccg ccgtaatcat tgttttctta 7020 gtgctgcgtc accctatttt ggcccaatgg 7080 gcatcctagg gttgcagcac gaccccaata 7140 ccccctagcc gccaccaaga acagcgggtt 7200 tgcttgtaag cgcgcgtgct agttcagccg 7260 attggagttt gattttgaaa cctacattta 7320 ttcttgctag ttcttcgatt gcttgcagga 7380 ccacaagatc gtgacagcca taggaggtgg 7440 gaaggctgta gtcgggccgt gaacgtcgtc 7500 ctcatcgaaa gatcgggcaa tcacccaacg 7560

<210> SEQ ID NO: 5 <211> Comprimento: 32 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo telomere primerl <400> SEQ ID NO. 5

agggtttagg gtttagggtt tagggtttag gg 32

<210> SEQ ID NO: 6 <211> Comprimento: 30 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo telomere primer2 <400> SEQ ID NO. 6

ccctaaaccc taaaccctaa accctaaacc 30

<210> SEQ ID NO: 7 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CentC-OVG-l-40-F Biocode 65644 <400> SEQ ID NO. 7

ggttccggtg gcaaaaactc gtgc 24

<210> SEQ ID NO: 8 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CentC-QVG-l-40-R Biocode 65645

<400> SEQ ID NO. 8

tgtcggtgca tacaaagcac gagt 24

<210> SEQ ID NO: 9 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CentC-OVG-51-90-F Biocode 65646

<400> SEQ ID NO. 9

gaatgggtga cgtgcgacaa cgaa 24

<210> SEQ ID NO: 10 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CentC-OVG-51-90-R Biocode 65647

<400> SEQ ID NO. 10

ggtggtttct cgcaatttcg ttgt 24

<210> SEQ ID NO: 11 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CentC-OVG-101-140-F Biocode 65648

<400> SEQ ID NO. 11

gttttggacc taaagtagtg gatt 24

<210> SEQ ID NO: 12

<211> Comprimento: 24

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CentC-OVG-101-140-R Biocode 104790

<400> SEQ ID NO. 12

cacaacgaac atgcccaatc cact 24

<210> SEQ ID NO: 13 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRMl-LTR-OVGl-F Biocode 69509

<400> SEQ ID NO. 13

cttggtcttg gacagtacct cact 24

<210> SEQ ID NO: 14 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM1-LTR-0VG2-F Biocode 69510

<400> SEQ ID NO. 14

cccttgcgat ccgactacga cgag 24

<210> SEQ ID NO: 15 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM1-LTR-0VG3-F Biocode 69511 <400> SEQ ID NO. 15

tcacgaagat cgtttcctgt gcgc 24

<210> SEQ ID NO: 16 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM1-LTR-0VG4-F Biocode 69512 <400> SEQ ID NO. 16

cagcgcagat tagcgcgtgt tcga 24

<210> SEQ ID NO: 17 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRMl-LTR-OVG5-F Biocode 69513 <400> SEQ ID NO. 17

ccaaccctag gtcgtccatt atgg 24

<210> SEQ ID NO: 18 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM1-LTR-0VG6-F Biocode 69514 <400> SEQ ID NO. 18

ttcaattctc ttgcacgggc ccga 24

<210> SEQ ID NO: 19 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRMl-LTR-OVGl-R Biocode 69515 <400> SEQ ID NO. 19

tcaggtctac ttcatcagtg aggt 24

<210> SEQ ID NO: 20 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM1-LTR-0VG2-R Biocode 69516 <400> SEQ ID NO. 20

tggcgcctcg ggcttgctcg tcgt 24

<210> SEQ ID NO: 21 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRMl-LTR-0VG3-R Biocode 69517 <400> SEQ ID NO. 21

tgttcgttct tcgattgcgc acag 24

<210> SEQ ID NO: 22 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer

<400> SEQ ID NO. 22 ttagccttag ctactctcga acac 24

CRM1-LTR-0VG4-R Biocode 69518

<210> SEQ ID NO: 23 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRMl-LTR-0VG5-R Biocode 69519 <400> SEQ ID NO. 23

ccagcccaat tgcggcccat aatg 24

<210> SEQ ID NO: 24 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM1-LTR-0VG6-R Biocode 69520 <400> SEQ ID NO. 24

cacctgggcc agtgactcgg gccc 24

<210> SEQ ID NO: 25 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVGl-F Biocode 69521 <400> SEQ ID NO. 25

tgatgaagac atccacacta ctga 24

<210> SEQ ID NO: 26 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVG2-F Biocode 69522 <400> SEQ ID NO. 26

ttgaacatgc tggattcgga ctgc 24

<210> SEQ ID NO: 27 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características: <223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVG3-F Biocode 69523

<400> SEQ ID NO. 27 ctgcccatgg tgctgcgtca ccct 24

<210> SEQ ID NO: 28 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVG4-F Biocode 69524

<400> SEQ ID NO. 28 gcgcgtgcta gttcagccgc ccgt 24

<210> SEQ ID NO: 29 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVG5-F Biocode 69525

<400> SEQ ID NO. 29 gtatcggttg ctaaggcgca gcgt 24

<210> SEQ ID NO: 30 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVGl-R Biocode 69526

<400> SEQ ID NO. 30 tattggtata gatgcatcag tagt 24

<210> SEQ ID NO: 31 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVG2-R Biocode 69527 <400> SEQ ID NO. 31

aagttggtgt tcttctgcag tccg 24

<210> SEQ ID NO: 32 <211> Comprimento: 25 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVG3-R Biocode 69528 <400> SEQ ID NO. 32

cccattgggc caaaataggg tgacg 25

<210> SEQ ID NO: 33 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVG4-R Biocode 69529

<400> SEQ ID NO. 33 ttccgaagac aagaagacgg gcgg 24

<210> SEQ ID NO: 34 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CRM2-LTR-OVG5-R Biocode 69530

<400> SEQ ID NO. 34 ctacagcctt ccaaagacgc tgcg 24

<210> SEQ ID NO: 35 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-OVGl-F Biocode 69531

<400> SEQ ID NO. 35 tgatgagaac ataacccgca caga 24

<210> SEQ ID NO: 36 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG2-F Biocode 69532

<400> SEQ ID NO. 36 aggatgatga ggacatcact gcca 24

<210> SEQ ID NO: 37 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG3-F Biocode 69533 <400> SEQ ID NO. 37 aaccatctag aatttgagaa ggca 24

<210> SEQ ID NO: 38 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG4-F Biocode 69534

<400> SEQ ID NO. 38 gtccagaaac tgccgagtga actc 24

<210> SEQ ID NO: 39 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG5-F Biocode 69535

<400> SEQ ID NO. 39 gagagagttt cgttctccat taga 24

<210> SEQ ID NO: 40 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG6-F Biocode 6953 6

<400> SEQ ID NO. 40 gttcttgctt gttctcgatt gctt 24

<210> SEQ ID NO: 41 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG7-F Biocode 69537

<400> SEQ ID NO. 41 ttggttgtgg tagtcgggca gcca 24

<210> SEQ ID NO: 42 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-OVGl-R Biocode 6953 8 <400> SEQ ID NO. 42 cattaacatg gtcatatctg tgcg 24

<210> SEQ ID NO: 43 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-OVG2-R Biocode 69539

<400> SEQ ID NO. 43 tggtgtggtg tattgatggc agtg 24

<210> SEQ ID NO: 44 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG3-F Biocode 69540

<400> SEQ ID NO. 44 cttttattgc cttgttgcct tct 23

<210> SEQ ID NO: 45 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG4-R Biocode 69541

<400> SEQ ID NO. 45 gacttgggta gagcaggagt tcac 24

<210> SEQ ID NO: 46 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG5-R Biocode 69542

<400> SEQ ID NO. 46 aggaatagaa aggagttcta atgg 24

<210> SEQ ID NO: 47 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG6-R Biocode 69543 <400> SEQ ID NO. 47

acagccttga acctgcaagc aatc 24

<210> SEQ ID NO: 48 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer CentA-LTR-0VG7-R Biocode 69544 <400> SEQ ID NO. 48

tgttggagaa cgacgttggc tgcc 24

<210> SEQ ID NO: 49 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Cent4-250-OVG1-F Biocode 69555 <400> SEQ ID NO. 49

taagtgcaaa ccattgttaa attt 24

<210> SEQ ID NO: 50 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Cent4-250-OVG2-F Biocode 69556 <400> SEQ ID NO. 50

cacaaaccct taactcgaaa ctat 24

<210> SEQ ID NO: 51 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Cent4-250-OVG3-F Biocode 69557 <400> SEQ ID NO. 51

atcgaaagat aactcatatg gctt 24

<210> SEQ ID NO: 52 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Cent4-25Q-OVG4-F Biocode 69558 <400> SEQ ID NO. 52 tccactaaag aaccaagatt gtga 24

<210> SEQ ID NO: 53 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer Cent4-25C)-0VG1-F Biocode 69559

<400> SEQ ID NO. 53 aattgtacta tctctaaaat ttaa 24

<210> SEQ ID NO: 54 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer Cent4-25C)-OVG2-R Biocode 69560

<400> SEQ ID NO. 54 tttagggttt ggggttatag tttc 24

<210> SEQ ID NO: 55 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer Cent4-250-OVG3-R Biocode 69561

<400> SEQ ID NO. 55 gaccataatg gtcaaaaagc cata 24

<210> SEQ ID NO: 56 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer Cent4-25C)-OVG4-R Biocode 69562

<400> SEQ ID NO. 56 atatgttgga cacaaatcac aatc 24

<210> SEQ ID NO: 57 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 18-26SrDNANTS-OVGl-F Biocode 69634 <400> SEQ ID NO. 57 ccggaaataa gcaaagtcca agcg 24

<210> SEQ ID NO: 58 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 18-26SrDNANTS-OVG2-F Biocode 69635

<400> SEQ ID NO. 58 tatgtcttgg gtgaagggca tggc 24

<210> SEQ ID NO: 59 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 18-2 6SrDNANTS-OVG3-F Biocode 69636

<400> SEQ ID NO. 59

cgcaaggcga cgggcggcat ggct 24

<210> SEQ ID NO: 60 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 18-26SrDNANTS-OVG4-F Biocode 69637

<400> SEQ ID NO. 60

cgaggggttc cccatggcgc acgg 24

<210> SEQ ID NO: 61 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 18-26SrDNANTS-OVGl-R Biocode 69638 <400> SEQ ID NO. 61

tcggtgtctt tccacacgct tgga 24

<210> SEQ ID NO: 62 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 18-26SrDNANTS-OVG2-R Biocode 69639 <400> SEQ ID NO. 62 gttttccctc cgttccgcca tgcc 24

<210> SEQ ID NO: 63 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 18-26SrDNANTS-OVG3-R Biocode 69640

<400> SEQ ID NO. 63 agacgcaagg ccgaacagcc atgc 24

<210> SEQ ID NO: 64 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 18-26SrDNANTS-OVG4-R Biocode 69641

<400> SEQ ID NO. 64 ggcctcagtt ttcggcccgt gcgc 24

<210> SEQ ID NO: 65 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74794

<400> SEQ ID NO. 65 gacacatgtt tttgtcgtcg aaca 24

<210> SEQ ID NO: 66 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74795

<400> SEQ ID NO. 66 ggaggcacga aatcgctgtt cgac 24

<210> SEQ ID NO: 67 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74796 <400> SEQ ID NO. 67

cgaccgccac ccatgatttg acca 24

<210> SEQ ID NO: 68 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74797 <400> SEQ ID NO. 68

accttaccag tctctatggt caaa 24

<210> SEQ ID NO: 69 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74799 <400> SEQ ID NO. 69

tcccgtgagc tatagcacac gttt 24

<210> SEQ ID NO: 70 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74800 <400> SEQ ID NO. 70

acacgttttc atggccgagc gacc 24

<210> SEQ ID NO: 71 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-2 66 Biocode 74801 <400> SEQ ID NO. 71

ccgtgttcct ccacacgtgt tttt 24

<210> SEQ ID NO: 72 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74802 <400> SEQ ID NO. 72

aaggtgctcc ggggacaaaa acac 24

<210> SEQ ID NO: 73 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74803 <400> SEQ ID NO. 73

ttggcctccc gcgagctata tcac 24

<210> SEQ ID NO: 74 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74803 <400> SEQ ID NO. 74

ttggccacgg aaatgtgtga tata 24

<210> SEQ ID NO: 75 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74805 <400> SEQ ID NO. 75

ttatgtatcc gacctgccac cttc 24

<210> SEQ ID NO: 76 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-2 66 Biocode 74806 <400> SEQ ID NO. 76

ctccccggtc taaaacgaag gtgg 24

<210> SEQ ID NO: 77 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74807 <400> SEQ ID NO. 77

gccacccgtg agctatagca cacg 24

<210> SEQ ID NO: 78 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer Subtelomere-266 Biocode 74808 <400> SEQ ID NO. 78

taggtttcca taaaatcgtg tgct 24

<210> SEQ ID NO: 79 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 180-knob-0VG-21-60-F Biocode 65650 <400> SEQ ID NO. 79

tgtcgaaaat agccatgaac gacc 24

<210> SEQ ID NO: 80 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 180-knob-OVG-21-60-r Biocode 65651 <400> SEQ ID NO. 80

cggtattatt ggaaatggtc gttc 24

<210> SEQ ID NO: 81 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 180-knob-OVG-71-HO-F Biocode 65652 <400> SEQ ID NO. 81

cctacggatt tttgaccaag aaat 24

<210> SEQ ID NO: 82 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 180-knob-0VG-71-110-r Biocode 65653 <400> SEQ ID NO. 82

atttctagtg gagaccattt cttg 24

<210> SEQ ID NO: 83 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 180-knob-OVG-141-18C)-F Biocode 65654 <400> SEQ ID NO. 83

atgtggggtg aggtgtatga gcct 24

<210> SEQ ID NO: 84 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 180-knob-OVG-141-18C>-r Biocode 65655 <400> SEQ ID NO. 84

atgagcctct ggtcgatgat caat 24

<210> SEQ ID NO: 85 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 5S-rDNA-OVG-l-40-F Biocode 65656 <400> SEQ ID NO. 85

ggatgcgatc ataccagcac taaa 24

<210> SEQ ID NO: 86 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 5S-rDNA-OVG-l-4C)-r Biocode 65657 <400> SEQ ID NO. 86

tgatgggatc cggtgcttta gtgc 24

<210> SEQ ID NO: 87 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 5S-rDNA-OVG-61-100-F Biocode 65658 <400> SEQ ID NO. 87

cttgggcgag agtagtacta ggat 24

<210> SEQ ID NO: 88 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 5S-rDNA-OVG-61-100-R Biocode 65659 <400> SEQ ID NO. 88

tcccaggagg tcacccatcc tagt 24

<210> SEQ ID NO: 89 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 5S-rDNA-OVG-161-200-F Biocode 65660 <400> SEQ ID NO. 89

accatagtaa aaatgggtga ccgt 24

<210> SEQ ID NO: 90 <211> Comprimento: 23 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 5S-rDNA-OVG-161-200-R Biocode 65661 <400> SEQ ID NO. 90

taatttaaca cgagaacggt cac 23

<210> SEQ ID NO: 91 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 5S-rDNA-OVG-261-230-F Biocode 65662 <400> SEQ ID NO. 91

cegtgggcga gccgagcacg gagg 24

<210> SEQ ID NO: 92 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer 5S-rDNA-OVG-261-23Q-F Biocode 65662 <400> SEQ ID NO. 92 tcctcttatg cccacacctc cgtg 24

<210> SEQ ID NO: 93 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 350-knob-0VG-31-70-F Biocode 65664

<400> SEQ ID NO. 93 ctcaaatgac gtttctatga tatt 24

<210> SEQ ID NO: 94 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 350-knob-0VG-31-70-R Biocode 65665

<400> SEQ ID NO. 94 tgaatacaat gccctcaata tcat 24

<210> SEQ ID NO: 95 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 350-knob-OVG-121-160-F Biocode 65666

<400> SEQ ID NO. 95 ctaggtttcc tataatcccc teta 24

<210> SEQ ID NO: 96 <211> Comprimento: 23 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 350-knob-OVG-121-160-R Biocode 65667

<400> SEQ ID NO. 96 etaggtatgc cttgaataga ggg 23

<210> SEQ ID NO: 97 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 350-knob-0VG-161-200-F Biocode 65668 <400> SEQ ID NO. 97 atgttgttta tgtccactca agta 24

<210> SEQ ID NO: 98 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 35C)-knob-OVG-161-200-R Biocode 65669

<400> SEQ ID NO. 98 atggtgtacg gtgttttact tgag 24

<210> SEQ ID NO: 99 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 350-knob-OVG-261-3000-F Biocode 65670

<400> SEQ ID NO. 99 gtgagatctg tccaaacata ggtt 24

<210> SEQ ID NO: 100 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer 350-knob-OVG-261-300-R Biocode 65671

<400> SEQ ID NO. 100 ggtgccttac aaccgtaacc tatg 24

<210> SEQ ID NO: 101 <211> Comprimento: 40 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer to b010.m7 fis31

<400> SEQ ID NO. 101 gcaaacttta tgtgatccct tcctcgctga acgagatgag 40

<210> SEQ ID NO: 102 <211> Comprimento: 40 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Primer to bl08.hl5 fis47 <400> SEQ ID NO. 102

gggacggcaa gtcacggcaa gaccagtcca accgaatgat 40

<210> SEQ ID NO: 103 <211> Comprimento: 40 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Primer to Cen3n.pk0001.gll <400> SEQ ID NO. 103

ccaaacttgc tgagattact gggcaatctg ttcgctcgca 40

<210> SEQ ID NO: 104 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüencia Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3101-3200f Biocode 103022 <400> SEQ ID NO. 104

ccaggtagtt tgaaacagta ttct 24

<210> SEQ ID NO: 105 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 105 ataaaggaaa agggcaaacc aaac

primer 23715-3101-3600f Biocode 103023

.24

<210> SEQ ID NO: 106 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 106 gatgcccaca ttatagtgat tagc

primer 23715-1401-1500f Biocode 103024

.24

<210> SEQ ID NO: 107 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-2901-3000f Biocode 103025 <400> SEQ ID NO. 107

ccacatatag ctgctgcata tgcc 24

<210> SEQ ID NO: 108 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3701-3800f Biocode 103026 <400> SEQ ID NO. 108

cggatctaac acaaacatga acag 24

<210> SEQ ID NO: 109 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-l-100f Biocode 103027 <400> SEQ ID NO. 109

cgatgaattt tctcgggtgt tctc 24

<210> SEQ ID NO: 110 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 110 cctgcagccc taataattca gaag

primer 23715-3101-3200f Biocode 103022

.24

<210> SEQ ID NO: 111 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 111 cacagtcgat gaatccagaa aagc

primer 23715-301-400f Biocode 103029

.24

<210> SEQ ID NO: 112 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-901-1000f Bioeode 103030 <400> SEQ ID NO. 112

gcgtgcaatc catcttgttc aatc 24

<210> SEQ ID NO: 113 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3201-3300f Biocode 103031 <400> SEQ ID NO. 113

caaccacacc acatcatcac aacc 24

<210> SEQ ID NO: 114 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3601-3700f Biocode 103032 <400> SEQ ID NO. 114

actggcaagt tagcaatcag aacg 24

<210> SEQ ID NO: 115 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-4901-5000f Biocode 103033 <400> SEQ ID NO. 115

catgaacgtg tcttcaacta gagg 24

<210> SEQ ID NO: 116 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 116 gacggcgttt aacaggctgg catt

primer 23715-4201-4300f Biocode 103034

.24

<210> SEQ ID NO: 117 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-201-300f Bioeode 103035 <400> SEQ ID NO. 117

ccaagctctt cagcaatatc acgg 24

<210> SEQ ID NO: 118 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-601-700f Biocode 103036 <400> SEQ ID NO. 118

atactttctc ggcaggagca aggt 24

<210> SEQ ID NO: 119 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1001-1100f Biocode 103037 <400> SEQ ID NO. 119

atccttggcg gcaagaaagc cate 24

<210> SEQ ID NO: 120 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1101-1200f Biocode 103038 <400> SEQ ID NO. 120

gcaagctacc tgctttctct ttgc 24

<210> SEQ ID NO: 121 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1601-1700f Biocode 103039 <400> SEQ ID NO. 121

gcttcttggc catgtagatg gact 24

<210> SEQ ID NO: 122 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1801-1900f Biocode 103040 <400> SEQ ID NO. 122

ttcacgccga tgaacttcac cttg 24

<210> SEQ ID NO: 123 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-5001-5087f Biocode 103041 <400> SEQ ID NO. 123

aagcttgcca acgactacgc acta 24

<210> SEQ ID NO: 124 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 124 ccctgatgct cttcgtccag atca

primer 23715-401-500f Biocode 103042

.24

<210> SEQ ID NO: 125 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-801-900f Biocode 103043 <400> SEQ ID NO. 125

agagcagccg attgtctgtt gtgc 24

<210> SEQ ID NO: 126 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1301-1400f Biocode 103044 <400> SEQ ID NO. 126

caggatcccg taactataac ggtc 24

<210> SEQ ID NO: 127 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-2801-2900f Biocode 103045 <400> SEQ ID NO. 127

cgacctgcag aagtaacacc aaac 24

<210> SEQ ID NO: 128 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3401-3500f Biocode 103046 <400> SEQ ID NO. 128

atctagaacg accgcccaac caga 24

<210> SEQ ID NO: 129 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 129 atttggggga gatctggttg tgtg

primer 23715-3801-3900f Biocode 103047

24

<210> SEQ ID NO: 130 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3901-4000f Biocode 103048 <400> SEQ ID NO. 130

gagggggtgt ctatttatta cggc 24

<210> SEQ ID NO: 131 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-4801-4900f Biocode 103049 <400> SEQ ID NO. 131

catgcaagct gatctgagct tggc 24

<210> SEQ ID NO: 132 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-2101-2200f Biocode 103050 <400> SEQ ID NO. 132

tccatgcgca ccttgaagcg catg 24

<210> SEQ ID NO: 133 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-501-600f Biocode 103051 <400> SEQ ID NO. 133

ttccatccga gtacgtgctc gctc 24

<210> SEQ ID NO: 134 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1201-1300f Biocode 103052 <400> SEQ ID NO. 134

atccactagt aacggccgcc agtg 24

<210> SEQ ID NO: 135 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-4001-4100f Biocode 103053 <400> SEQ ID NO. 135

gccacgcaat ttctggatgc cgac 24

<210> SEQ ID NO: 136 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-701-800f Biocode 103054 <400> SEQ ID NO. 136

cgatagccgc gctgcctcgt cttg 24

<210> SEQ ID NO: 137 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1901-2000f Biocode 103055 <400> SEQ ID NO. 137

cacttgaagc cctcggggaa ggac 24

<210> SEQ ID NO: 138 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1701-1800f Biocode 103056 <400> SEQ ID NO. 138

tccttcagct tcagggcctt gtgg 24

<210> SEQ ID NO: 139 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 139 caccttggag ccgtactgga actg

primer 23715-2001-2100f Biocode 103057

.24

<210> SEQ ID NO: 140 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 140 tgcggctcgg tgcggaagtt cacg

primer 23715-2601-2700f Biocode 103058

.24

<210> SEQ ID NO: 141 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-4101-4200f Biocode 103059 <400> SEQ ID NO. 141

acgcgacgct gctggttcgc tggt 24

<210> SEQ ID NO: 142 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3101-3200r Biocode 103060 <400> SEQ ID NO. 142

cgttctagat cggagtagaa tact 24

<210> SEQ ID NO: 143 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3501-3600r Biocode 103061 <400> SEQ ID NO. 143

tgtttcgttg catagggttt ggtt 24

<210> SEQ ID NO: 144 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1401-1500r Biocode 33332 <400> SEQ ID NO. 144

gcacacatag tgacatgcta atca 24

<210> SEQ ID NO: 145 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-2901-3000r Biocode 103062 <400> SEQ ID NO. 145

gatatacttg gatgatggca tatg 24

<210> SEQ ID NO: 146 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3701-3800r Biocode 103063 <400> SEQ ID NO. 146

cccggtagtt ctacttctgt tcat 24

<210> SEQ ID NO: 147 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe. primer 23715-l-100r Biocode 103064 <400> SEQ ID NO. 147 attcgagcca atatgcgaga acac 24

<210> SEQ ID NO: 148 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-101-200r Biocode 103065

<400> SEQ ID NO. 148 gccttcttga cgagttcttc tgaa 24

<210> SEQ ID NO: 149 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-301-400r Biocode 103066

<400> SEQ ID NO. 149 atggtggaaa atggccgctt ttct 24

<210> SEQ ID NO: 150 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-901-1000r Biocode 103067

<400> SEQ ID NO. 150 gaggatcgtt tcgcatgatt gaac 24

<210> SEQ ID NO: 151 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3201-3300r Biocode 103068

<400> SEQ ID NO. 151 tgctttttgt tcgcttggtt gtga 24

<210> SEQ ID NO: 152 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3601-3700r Biocode 103069 <400> SEQ ID NO. 152 acctgtacgt cagacacgtt ctga 24

<210> SEQ ID NO: 153 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-4901-5000r Biocode 103070 <400> SEQ ID NO. 153

aattaagtca ggcgcgcctc tagt 24

<210> SEQ ID NO: 154 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-4201-4300r Biocode 103071 <400> SEQ ID NO. 154

cttgtttcga gtagataatg ccag 24

<210> SEQ ID NO: 155 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-201-300r Biocode 103072 <400> SEQ ID NO. 155

acatagcgtt ggctacccgt gata 24

<210> SEQ ID NO: 156 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 156 gatctcctgt catctcacct tgct

primer 23715-601-700r Biocode 103073 .24

<210> SEQ ID NO: 157 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüênc ia Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1001-1100r Biocode 103074 <400> SEQ ID NO. 157

cctgcaaagt aaactggatg gctt 24

<210> SEQ ID NO: 158 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1101-1200r Biocode 103075 <400> SEQ ID NO. 158

aagggaaaac gcaagcgcaa agag 24

<210> SEQ ID NO: 159 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1601-1700r Biocode 103076 <400> SEQ ID NO. 159

tacctggtgg agttcaagtc catc 24

<210> SEQ ID NO: 160 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1801-1900r Biocode 103077 <400> SEQ ID NO. 160

acggctgctt catctacaag gtga 24

<210> SEQ ID NO: 161 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-5001-5087r Biocode 103078 <400> SEQ ID NO. 161

tgaagctctt gttggctagt gcgt 24

<210> SEQ ID NO: 162 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-401-500r Biocode 103079 <400> SEQ ID NO. 162 gtcttgtcga tcaggatgat ctgg 24

<210> SEQ ID NO: 163 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-801-900r Biocode 103080

<400> SEQ ID NO. 163 attcggctat gactgggcac aaca 24

<210> SEQ ID NO: 164 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1301-1400r Biocode 103081

<400> SEQ ID NO. 164 cgcttcgcta ccttaggacc gtta 24

<210> SEQ ID NO: 165 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-2801-2900r Biocode 103082

<400> SEQ ID NO. 164 cgatgctcac cctgttgttt ggtg 24

<210> SEQ ID NO: 166 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3401-3500r Biocode 88145

<400> SEQ ID NO. 166 ggttgtgatg atgtggtctg gttg 24

<210> SEQ ID NO: 167 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3801-3900r Biocode 103083 <400> SEQ ID NO. 167

gttcggagcg cacacacaca caac 24

<210> SEQ ID NO: 168 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-3901-4000r Biocode 103084 <400> SEQ ID NO. 168

tttcccttcc tcgcccgccg taat 24

<210> SEQ ID NO: 169 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe

<400> SEQ ID NO. 169 taaaacgacg gccagtgcca agct

primer 23715-4801-4900r Biocode 103085 24

<210> SEQ ID NO: 170 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-2101-2200r Biocode 103086 <400> SEQ ID NO. 170

acgtcatcac cgagttcatg cgct 24

<210> SEQ ID NO: 171 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-501-600r Biocode 103087 <400> SEQ ID NO. 171

agcgaaaeat cgcatcgagc gagc 24

<210> SEQ ID NO: 172 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1201-1300r Biocode 103088 <400> SEQ ID NO. 172 aagccgaatt ccagcacact ggcg 24

<210> SEQ ID NO: 173 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-4001-4100r Biocode 103089

<400> SEQ ID NO. 173 ttggacttgc tccgctgtcg gcat 24

<210> SEQ ID NO: 174 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-701-800r Biocode 103090

<400> SEQ ID NO. 174 tgccctgaat gaactgcaag acga 24

<210> SEQ ID NO: 175 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1901-2000r Biocode 103091

<400> SEQ ID NO. 175 ccgactacaa gaagctgtcc ttcc 24

<210> SEQ ID NO: 176 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-1701-1800r Biocode 103092

<400> SEQ ID NO. 176 tgctgaaggg cgagacccac aagg 24

<210> SEQ ID NO: 177 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-2001-2100r Biocode 103093 <400> SEQ ID NO. 177 ggacatcctg tccccccagt tcca 24

<210> SEQ ID NO: 178 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-2601-2700r Biocode 103094 <400> SEQ ID NO. 178

acatcgagac ctccaccgtg aact 24

<210> SEQ ID NO: 179 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: Overgo probe primer 23715-4101-4200r Biocode 103095 <400> SEQ ID NO. 179

agtctaacgg acaccaacca gcga 24

<210> SEQ ID NO: 180 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: PCR primer para bacm.pkl08.hl5.f seqüência única sequence

<400> SEQ ID NO. 180

gatcgtcgaa tgggaatcca tggg 24

<210> SEQ ID NO: 181 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: PCR primer para bacm.pkl08.hl5.r seqüência única sequence

<400> SEQ ID NO. 181

ccctgagtga accatttagg aagatcag 28

<210> SEQ ID NO: 182 <211> Comprimento: 24 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: PCR primer para bacm.pkl08.hl5.2 FIS47.f seqüência única

<400> SEQ ID NO. 182

tgcaacatcc aaagacccaa catg 24

<210> SEQ ID NO: 183 <211> Comprimento: 22 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: PCR primer para bacm.pkl08.hl5.2 FIS47.r seqüência única

<400> SEQ ID NO. 183

ttccaacatg gttggtggtc ag 22

<210> SEQ ID NO: 184 <211> Comprimento: 26 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:

<223> Outras Informações: PCR primer para bacm.pk010.m07. fis31.f seqüência única

<400> SEQ ID NO. 184

tgtcatgaca tcttgttgct accctg 26

<210> SEQ ID NO: 185 <211> Comprimento: 222 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características:

<223> Outras Informações: PCR primer para bacm.pk010.m07 fis31.r seqüência única

<400> SEQ ID NO. 185

aaacccggag tttctatgca gg 22

<211> Comprimento: 591

<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome: misc_features

<222> Localização (1)...(591)

<223> Outras Informações: η = a, t, c, ou g

<221> Nome: Origem <222> Localização (1)...(591)

<223> Outras Informações: bacm.pkl08.hl5 seqüência única

<400> SEQ

ttgctcgtaa

cttgaaattc

tttttcccaa

acaaacattc

tcaaaacatc

agtccacgac

cttgttaatg

accatggggt

ttaatagctc

ttagtcctat

ID NO. 186 cagatggttc aggttttctt gttgattttt ttcaaattgt cctgatcttc catcctactt tccatcagca ttgcaccttg agggatctcg taaaagnntn

angnnngatt tttgctacac tgtgattgtt ctgggaatgt ctaaatggtt ggcagcccct tagagtcttg agtgaaccac ataacatgct nnnnacagtg

gatcgtcgaa ctagttatat tttgaggcac catctaggtt cactcagggt acatctcttt ttagtgtcca ataacaagtt tggacaagtt cnacgncccc

tgggaatcca tttctgtttc cttttaaaag cccaaacgat tcgatccttc ctcccccctc cgtcgccagc gagggacatg ttagcnactg tattttacac

tgggcaccca 60 atacgggtct 120 aataaaatac 180 tagtttggat 240 aaaatcagct 300 tcgttcacac 3 60 caaaggattt 420 aaattgcaaa 480 ctgatgcatc 540 g 591

<210> SEQ ID NO: 187 <211> Comprimento: 2000 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Zea mays

<220> Características:

<221> Nome: Origem

<222> Localização (1)...(2000)

<223> Outras informações: bacm.pkl08.hl5-2.fis47 seqüência única <400> SEQ ID NO. 187

tgagaggctg atatgtcttc ttttttttct tattttttct aaaatcctga ttcctttcaa 60 tgtcagtttt gaattccaaa ttcaaattta atttgattct caagcttcaa ttttaatgca 120 acatccaaag acccaacatg aaatgcataa ttccatttta tttatcttat tttatctatt 180 aaacaaagag tttcttaata tgaaacttat atacacaaaa gacactattc taagaaaaca 240 attcctcata tatcatctta aatcttttgc tgaatattct ttaaacatta attctaaata 3 00 gttttatttg tacaagaatt tgtgattatt tcctacgaag agatggttcc taggcactat 3 60 aatgaatagt tttgctaatt aaacaattga aaatgtttct atgttctctg ttttaacctt 420 agtttagagt ttttaacttc aagtttgaac taccaaagtt tgaacctctt tttttatttt 480 ctttatactt ttaaaataca tttaaactca aatcttttgg agaaccttta taaatcccaa 540 aatagggttt tgaggtgtta taaacgagga gtctgtgcat gggacggcaa gtcacggtaa 600 gaccagtcca accgaatgat ggggcagctc ggtgtcgtct caattaatgc atctcttaag 660 ttgctgacca ccaaccatgt tggaacctga tcagttggta cccattgtct gtttacatgt 720 ggtagcttct aattggttcg cgtgatcttg aattttaaaa aattgaaata acatttttat 780 aaaattagaa tctagcttgt ggtaacattg ctcactccat tgttgaatat atcaaaatgg 840 agaaagcacg acgttaaaat gcttgcaaca tttatgtagg agtgttattt tatgtttttg 900 cgaggagtat aatcgtagtg tcactgttga caatctttgg cgacttttag ctaaaggaga 960 ggagagacaa tttcttgcta atgataggaa ttatagattg catatattga aagtgataga 1020 gctagagtgc ccgatctttc ggtgagtgga gataattccg atttggtgga agtagaccct 1080 cacgatccga ctacgacgag cgaacccgaa gcgccaatgc aatcgctgaa ccaactccca 1140 atggttaccg accttgctta tgcgagatcg gcctgatcac gaagatcgtt tcctgtgcgc 1200 aatcgaagaa cgaacaagaa aaagatgcga gcaatcttaa tatcactcga ggtggagttc 1260 tgaatcacag aggacaacac gtatttgtgt gtgttctggg gtagctaaag ctagatgtaa 1320 aacaaaactc aagttctaaa tgaaacagga ctctgactaa atagaggaga ggcgtgaaca 1380 gtaggtcgac gctacagtac cacgtttact gttcacgact tacctaggcg ccccatccgg 1440 gccttcctat tggaccatct tctaatcttc tgggccttcg ttctttaaca acatgatgta 1500 gttcaattct cttgcacgag cctgagtcac tggcccaagt ggaagggtgg cgcctggact 1560 agggaagatg gtgcctgggc tggagaaggt gctgctggtg tagatgtact catgttggtg 1620 ttgatgtcct cctcatcctc cccttcttga actgaagtcg tcctcgacgg caactcctca 1680 tcttctcccg catacggttt caaatctgca acattaaaat tagtggaaac accaaacttc 1740 gcaggtaggt caaggatata agcattagca ttaatcttgg ttagtatctt aaaaggacca 1800 gcaacacgag gcatcaattt agaacggcgc aaagtaggaa aacgatcctt tctcaaatgc 1860 aacccaacca tatcaccagg ttcaaaagta actaggtttc tgggctttac taccaataat 1920 ctgatattta gcattagcag caacaatgtt ttgttgagtt tgttctggag gttatcattt 1980 gttcacatgt gcacatcatc 2000 <210> SEQ ID NO: 188 <211> Comprimento: 1541 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Zea mays

<220> Características: <221> Nome: Origem <222> Localização (1)...(1541) <223> Outras Informações: bacm.pkOlO.m07-fis31 seqüência única

<400> SEQ ID NO. 188

atcgataccc ttaattggga gataactgtt atattaatag tgaaaaatcc atcctattat 60 aatttttgtt atatctttta catggccatc agtaatcaca gttaagagtt ggacaaaggc 120 actatggagc gtggcccttc taattgtgtt gctgaagttc ttattaaggt ttgccaattt 180 tttggtaggt gttccaaagc acagaaggct cttgagctaa gccaactttt aggagtcaac 240 atttcttcaa cacaggtact tctgaagtag tcatgagtca ttgcttatct gaagtaagga 300 gagaaagtta ttgcttttct tttctgatgc gtgaggttgt gcatgtacat tctatagagt 360 gtgcctttca agtactacat caataatttc ttatttcttc atagacctgt agcacctgaa 420 tgaaacctat ttttgaactc tgcatttttt gaagatgaca ttatgtatca atttagttct 480 gtattggttg ttgccaaaaa atttgtaaga tattgagata gataatatat gtgatatttt 540 tttatgtagt tgttttgcaa taacattttg atgaatattt ttgtatatta ttgtaacaca 600 taggcaccta actagtgtat atataggatg gaaacacaaa caccatcgac gtcgatgatc 660 tcttggatac cattatctag tgtaggtgta catgggtatt atgattatca tagtgtgttt 720 atggttgtca tgacatcttg ttgctaccct gacaggtaac ctaaaaatcc aaaacacaat 780 gcaagtgcag gaatgtatga ccaatgcaaa agctaaagta aagtgctttc acattcgttg 840 ccaatgaaag tttgaaaatg cttgaccaga ttttatcaac taataaatac tgtatataat 900 aggtctaaat ttgtgataac aaaacaagaa aaatagaaaa gtggggaaac aaaaaatagt 960 agaaagaggc gtggggagag gcgcgagaga ggtggttggt tgggggtgga ggaccgtcgg 1020 ccttccccgt ttcgtcttcc ggtcctcgtt ttatcccctc gcccttgcac tcctccgccg 1080 cacccctttc ctccttccgc cctccgccgc gcctggcttt ctcccttccc gagaggccac 1140 gctccatccc cgcccgcgct gcctcccctg gcgatcggcg gcgaccgcgg cccaacgaaa 1200 gcgtcgtggt cggccggtaa gagttccttg ctttcctcta cgcgttgctc ctgccgttac 1260 gcaaacttta tgtgatccct tcctcgctga acgagatgag aagaaaagtt gctgactttc 1320 gttcacacgt gcacctgcat agaaactccg ggttttggct tccgttggaa aattttgata 1380 aatgacttgc cacgcttcgt cttacttcaa attcgttcaa attaattact tgctatgctt 1440 catcttactt caaattcgtt cgattcttgc tgggttcctc tgattatatc tttttttgta 1500 tgatcaagcg taaagatacc gtcgacctcc cgctttttga a 1541

<210> SEQ ID NO: 189 <211> Comprimento: 355 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: TELO-266 consenso 355 bp repetida

<400> SEQ ID NO. 189

attttagtgt cgaaaccatg gtaaaatgaa atttgagtct cccaaccata tcaactttgc 60 tgacatagta gaattttagt gtccaaacca tagtacacat tttggtcccc ggaggccggt 120 aaggctattt ttggcctccc gtvacacatg ttttcatcgt caaacaacga tttcatgcct 180 cccgtccgcc acccatgatt tggccacwga gactgctaag gctrtttatg gcctcccgta 240 agctatagca camgttttca tggtcgagcg actattttta agtacgtgtt ccaccacccg 300 cgttttggtc cccagagcac cttaaagttg ttcttggcct cccacgagct gtagg 355

<210> SEQ ID NO: 190 <211> Comprimento: 430 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial <220> Características: <223> Outras Informações: TR430 subtelomeric repetido <400> SEQ ID NO. 190

gacatggtag aattttagtg tccaaaccaa agtacacgtt ttagtccccg gaggcccgta 60

aggctatttt ggcctcccgt gacacatgtt tttgtcgtcg aacagcgatt tcgtgcctcc 120

cgaccgccac ccatgatttg accatagaga ctggtaaggt tgttttggcc tcccgtgagc 180

tatagcacac gttttcatgg ccgagcgacc atttttatgt ccgtgttcct ccacacgtgt 240

ttttgtcccc ggagcacctt aaagcggttc ttggcctccc gcgagctata tcacacattt 300

ccgtggccaa acaaccaatt ttatgtatcc gacctgccac cttcgtttta gaccggggag 3 60

gccgttatgg caattttttt gccacccgtg agctatagca cacgatttta tggaaaccta 420 gaccctaaat 430

<210> SEQ ID NO: 191 <211> Comprimento: 10368 <212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Zea mays

<400> SEQ ID NO. 191 ggttccggtg gcaaaaactc gtgctttgta acgtgcgaca acgaaattgc gcgaaaccac ggattgggca tgtttgttgc tgatgtagct aattccgatt tggcggaaga tgacccttgc ccaatgcaat cgctgaacca actccctgtg tgatcacgaa gatcgtttcc tgtgcgcaat atctaatcta ttactcgagg gtggagttct tgttcggaag tagctaaggc taacgtaaaa ctcctgtata aatagagagg gggcgcagcc tatgggccgc aattgggctg gtcgtctatc tgtagttcaa ttctcttgca cgggcccgag gggctggaga aggtgctgct ggtgtagatg cctccccttc ttgaactgaa gtcgtcctcg gtttcaaatc tgcaacatta aaactagtgg tataagcatt atcattaatc ttggttagta atttagaacg gcgcaaagta ggaaaacgat caggttcaaa agtaactagt ttccggcctt cagcagcaat gttttgttga gtttgttcat gagcatctat gtgtggggcg tccgtagcat gaatgtaacc ataaacaatt tgaaaagggc tataagcaaa ctcaacatga ggtaagcaat cagccctaag catggtagac aaagttcgat ggtgacaagt ggtgctaaac agcaatttag aatgactcag aaacttggca tcacgatccg gaataatctc tctaaaaaac aattcagcaa gtatgaaatg agccattttg gagaatcgat tcttagttct aggcaatccc aaaacaaaat gaacaggcaa aggcatatac aaaccatggt tagtgcagcg tgcaacaagg cgctcaacat cagccaacac ctcatgtgtc ttgtagacgc cttcctgtaa caacaaaaga cgaaccgagc acaggaaccc atcctgtatg tgaaatttgc aagcatcttt aaaatcagca tcgtcaacat ttttaaaatc taactgtgac agcatggtat tgtccttccc gttcttgtgt ttaataatgt tagcatgacg acggttcaga tttgtttggg aatgaattat gaactcacga tgccaaagat acgcgtaaag ctccttatca taagtagaat taaaataagc aactggtttt ccttcttgta catcgcattc aagctcaaat actttattaa ttaacttatc tttcaaagtg ctgaacgctt

tgcacccgac acccgttttc ggaaagggtg 60 cccaaacatg agttttggac ctaaagtagt 120 gaggtgcccg atctttcggc gagtagagat 180 gatccgacta cgacgagcaa gcccgaggcg 240 gttaccgacc ttgctgatgc gagatcggcc 300 cgaagaacga acaagaacaa gatgcgagca 360 gaatacacga ggacagcgca gatttgcgcg 420 caaaactccc caaaaataaa ggaggcgcag 480 cctaggggcg gccaacccta ggtcgtccat 540 cttccgggcc ttcgttcttt aacaacatga 600 tcactggccc aggtggaagg ggtggcgcct 660 tgctcgtgtt ggtgttgatg tcctcatcat 720 acggcaactc ctcatcttct cccgcatacg 780 aaacaccaaa ctccgcaggc aggtcaagga 840 ccttaaaagg accagcagca cgaggcatca 900 cctttctcaa atgcaaccaa accatatcac 960 tactaccagt aatctgatat ttagcattag 1020 ggagattaat catttgttca acatgtgcaa 1080 caagcgaaaa caaagcaata ggcgccctag 1140 acatctttgt agaagaatgt gttgcatgat 1200 cctcccaacg tttcaaattt ttgtctaaaa 1260 taactacctc agtttgacca tcagtctgag 1320 ttcctaattt attccacaga gatctccaaa 1380 agactattgt attgggaata ccgtgcaaac 1440 cattgctagc atcatcagtc ttatgacaag 1500 caacaaccac aaaaatgcta tccctcccct 1560 ccatcgaaat atcaatccaa gggaaagtag 1620 tgttcaaccg tgacttagct ttctgacaag 1680 cagcgcgcat ccgaggccaa aagaagtggg 1740 caaagtgccc catgagaccg cctccatgtg 1800 tagctggaac acacagcttg ttagcgcgaa 1860 cccatggttt cccattaata caatggccga 1920 attgatcttt tacagtgtgc aaaccaaaga 1980 agcgacgaga caaagcatca gcaataacat 2040 aaggaaaaga ctcaatgaat tctacccatt 2100 tacgaatatg ttttaaagcc tcatgatcag 2160 agtgctgcca tgtatgtaaa gtgcgcacta 2220 atttcagact agcaccgctt aatttttcac 2280 ataaaacagc acctagccca ataccgctag 2340 aatcaggcaa ttgcaatagg ggagcttggg 2400 cctcctgcga atcactccaa gcaaatggca 2460 catctttctt tgtaagctca tgtagaggcg tgcggtagaa accggcaagt ccaagaaagc gccactcccg aatggcagca atcttgctgc cataaccaag aaacgagaca cgtcgtgtgc actgggcggc acgcaatgca tcaaaaacag atttgctgta aataaggata tcatcgaaat tcagaacttc attcatcact cgcataaaag taaccaacca ttcatataaa ccaaatttcg gtttcattct aatctggtgg taaccactac cactaagctc atctagcata tcatcaaggc tattattaat agcacgacag tctacacaca gtaacacagg aacagagcaa gggctaagag cctttacctg gcgctgaatc tccttcgtct ttggaagctg tgcaccggga atgaggtcga gacccggtgg taagtctttg ggaaagacat tagggggaat agccaaagat ggtgcatcat gtgcatagca tggcaaatga gcaccgtgta aaacaggagc cttcaactta atttcagaag cagttatagc agctcgggca agatcatctt taattatttt ctgaccctta aaaatgaaag tatcagtatc atattgccaa ggtcgaccaa catcacaatc aacaaaatca gaataagcac tgatttttat tttaccacca tcattaagcc gagtgggtaa cgacaacttt tcgaccagca tgtcgataat gatgcgaatt gaccgctcct gtcgctgatt cttctcgggc aaagcgacct tttcatacct atcagcgtcg cccgggttga tggcaagtag tgcatgttca atttcttcag cacgaatgag taaagtgcgc ttgtttggac agcgatgaca ctgaatatcc cgtgtacgac tcgtcttctc gcgtggagta gtggtggacg tggatgtcga gcttcgtcct gcaaaagggt cttcacgttc agctttgcaa gcatattcaa aatcaagtat atcttggatt tcgcggttta cgttgtcctc caatatccca caacgaatca caacagattg agaaccttgc tgaaaacgct acgaaggcac aaatcgatgt cgcatcgcag tagtgggatg ttttatttta aactcacgcc taatagcagc tttaacctga gaatgtgcag cctctaactc ccaatcaaga tatgcagcag taaatttaat cttagaaaat aagtcattag cacggcgatc tccatcgtcc cactcagtgt tcaacgcatc aaggcgtgct aggatggtgt ggtcaagctg gttgaaacgc tcggtcgtcg tcgtcctaat gtcatcagca agtccatcaa ccaccgtgtc atgtgctcct gccatagtta caaaaacagg ggtgtactgc tcacaaggcg ccgttcttac caagccacag tggtgaactg gatgagcgat tgcctggaga aacagaaacc gtaggctgca ctcaagtcaa ggattagcac gtgcaaaaca cgaaactata ttgctggcca atggcagtac cgtaaatatt gtactagcga tttttctttt ttgtatgatt tttttggtat agctacacga agtttcacct aaaacagagt tctctaaaaa gcgtgcgaga actttgaagg gacaattttg tcgaacccaa acagaccgaa aactagctcc tgtaaaaatt tcagattttt ttaaggaagg tacctcaaat tatgttttca ctccttcgtt gttttttgtt tctgtttttt aaacgatgtt gactcggttt gttttttttt gaaggagaaa atcaaggaaa acagccgttg

ctgcaatgga gctaaaatca cgaacaaatc 2 52 0 tccgaatttg tgtgaccgtc gtcggtgtag 2 580 tatccacctc aatgccctgt ggagtaacaa 2640 aaaagatgca tttttccatg ttagcgaata 2700 cacttaaatg ttccaaatgc tctttcttag 2760 aaacaaccac aaacaatcct atgaagggcc 2 82 0 tgctgggagc attagtcaat ccaaacggca 2 880 ttttgaaggc tgttttccat tcatcaccta 2940 gcaaatcaat cttagtgaaa ataatggcac 3000 gtggtatagg atagcgataa cgaatagtga 3060 tacgccatga cccatccttc ttgggaacaa 3120 actcacgaat gtatcctttg tcaagcaacg 3180 catccggatt tgtacggtat ggtgcgcggt 3240 tctggtgctc aatgccacga agcggtggga 3300 cagcgtactc ctgcaaaagg ttagcaacca 3360 caagtgaaat gaggacacta gagcatacaa 3420 gatcatcaaa atcagcacgt gtagcaagta 3480 gaacagagtg cgatggatca agttgtttag 3540 taacaatttg ttcaggtgtc attggatgta 3 600 aataatgatt cgaacgacca tgatgcaagc 3660 gtaacaaaga gcatgcttcc atgggaataa 3720 ccatggagaa aggaactcgc acggaacgcg 37 80 attgaatgtg atatgggttc ggatgcttac 3840 tggtactcgc caaattgttg caactgccgc 3900 gcacaacacc ctttgtatgg aacagagtgt 3960 gtgtactgag aacacgctgc acaacaagac 4020 catgtacctc cgccttagct gcatggtcag 4080 aatcactagc ggaagagtac tcaccatcgt 4140 agtcccgaat cacatggcca aatcctctac 4200 ctgtgggtgg ggcagtgctg gctggtttgg 42 60 tggatggcgc agggggaact ggtgctgagg 4320 tagaatattg cttcgagcgg cgtccctgca 4380 ataaagtagt catatcataa tattccttat 4440 aaccaccacg aaaacgtgcc atagcagcgt 4500 tacctttttg taactcctgg aaatagtcct 4560 gcattttatt aagcaaatca cgagcataat 4620 ctttcaactg atcccaagtg gttggaatgg 4680 accaaattaa agcaaaatca gtaaattcac 4740 caatatcatg gcatgaaaat ttttgttcaa 4800 gatcatattt gccattaaaa ggtggaattt 4860 ggggattacg aaccacacgg cgtgcacgac 492 0 caccgccgta gtcctgctcc atctttgtgg 4980 cgagtgtggt gcgagtcgcc gtttgagcaa 5040 aagtgaccgt tgaatcaagc cgttcatgca 5100 cttgtccctt tacttccagc aactgggcat 5160 gcgcaaacac caaaacacca aaaaaaacga 5220 ctcacactag tgctgttatc aaattcttat 5280 caaccaacag gtggaaccgg tgaaagattg 5340 tactcgttgt agaaatatgt ggagttctgg 5400 gaccaaacaa taatgcaaag ttgaattata 5460 caagtgcaaa ggacggatgg aactagcaga 5520 ggccactagt aggaatcaca agtgattttg 5580 ttttctcagc acaagaagca acaaaatagg 5640 tcaaatgtgg tctacagaaa atcagaaagt 57 00 attttttctt tattttcctg aatttttttt 5760 ggtcagtttg gccggcctca gaatggtgtc 5820 cggacacccg agcgaaaagt tatgcccggt 5880 aacgaccgga atgaaacaac cgtatccttt 5940 tttttacgta accgaaggag aaaaacaagg 6000 ctgttttttt ttctgttttt tttcgtaacc 6060 actcggtttg ttttttctgt ttttttttga 6120 cgtaaccgaa ggagaaaaac aaggaaacaa agagatggtg gcggcgctag ggtttgaatg tgacgcgaaa gcacacaaat tcaacaatgc agggtgctgg gataagatct aacctgaatt aaaacgctcg ataaactcac cgatcaacct gtgcccgatc tttcggcgag tagagataat ccgactacga cgagcaagcc cgaggcgcca accgaccttg ctgatgcgag atcggcctga agaacgaaca agaataagat gcgagcaatc tacacgaaga cagcgcagat tagcgcgtgt aactcaggaa ataaaggagg cgcagctcct gggcggccaa ccctaggtcg tccattatgg gggccttcgt tctttaacaa catgatgtag ggcccaggtg gaaggggtgg cgcctgggct gtgttggtgt tgatgtccgc atcaacatcg gaaaagggga cacgtaccga acgtgttacc atgtgatacg gatgtggatg tgtgcgagtg cttgccaaat tgttgcagct gccactatcg acgcccttgg tatggaatag agtgtgtcgc ctgagaacac gctgcacaac aagactctca acttcctcat tttctgcatg gttagtggca ctggctgaag agtactcacc attgtcacgt cgaatcatgt gcccaaaccc tctgcaacga gaagaagcgg cgcctttggc agggggcgcc gtgctaggcg taggaggtgc agggctggaa gcaaaagagt tagtatatgt ctttgatcgt gcatattcaa acaatgtggt tatatcaaaa tccctgttca aaccaccacg aaaacgcgcc caacgaagca tacccttttg caactcctgg tgaaaacgct gcattttgtt aagcaaatca cgcatggcag tttttaattg ggtccaagta tactcacgcc accaaattaa agcaaaatca ctattagcag gaatatcatg gcatgaaaat tatgcagcag gatcatattt accattaaaa aagtcattag ggggatgacg aaccacacga tgctcagtgt caccgccgta ttcctgctcc aggatggtgt cgagtgtggt gcgagtcgcc tcggtcgtcg aagtgatcgt tgaatcaagc agtccatcaa cttggcccct tacttcctgc gccatagtta gcgcaaacac caaaaggaga ctcacaaggc gctcacacta gtgctgttat gtggtgaact gcaaccaaca ggtggaaccg aaacagaaac ctgctcgtcg tagaaatatg aggattagca cgatcaaaca ataatgcaaa attgctggcc acaggtgcaa aggatggatg atattgtact agtgatgcca aaaaggcact tttttgtatg atttttttga tatttttctc cgaagtttca cctaaaacag atatcagatg aaagcgtgcg agaactttga cggatttttt ttgtcgaacc ccaaacagac cgtaggtgag ctcctgtaaa aatttcagat tttttggaca aaggtaccct caagttatgt tttcaaacga tcgttgtttt tttttgtttc tgtttttttt acgatgttgc ctcggttttt ttttttctgt gaaacggccg ttgactcggt ttgttttttc acaaggaaac aatgttgact cggtttgtgg aggatatgaa tggtggaaga acacaatgca aattcaacaa tgcagattat tgaaagaaag actaacctga atttttatgt ggttttgtgg accgatcaac ctggaaatct gataccaatt agtagagata attccgattt ggcggaagat

tgttgactcg gtttgtggtg tgatcaaacg 6180 gtggaagaac acaatgcaac cagcaacaaa 6240 agattattga aagaaagtgc gaggctcaaa 6300 tttatgtggt tttgtggact gtaggaaaaa 6360 agaaatctga taccaattga tgaagctgag 6420 tccgatttgg cggaagatga cccttgcgat 6480 atgcaatcgc tgaaccaact ccctgtggtt 6540 tcacgaagat cgtttcctgt gcgcaatcga 6600 taatctatta ctcgagggtg gagttctgaa 6660 tcgagagtag ctaaggctaa cgtaaaacaa 6720 gaataaatag agagggggcg cagcccctag 6780 gccgcaattg ggctggtcgt ctattcttcc 6840 ttcaattctc ttgcacgggc ccgagtcact 6900 ggagaaggtg ctgctggtgt agatgtgctc 6960 caatcaacat aatcagaata agaacccagc 7020 tttattttac caccatcatt aagccattga 7080 ggcaaggata atttctctac caacgctgta 7140 atgatgatgc gaatcgaccg ttcgtgcacg 7200 tgattttttt cggcctgggc aacctgtgtg 7260 tacctatcag cgtcgatggg atcaacgtgg 7320 atcatagcat gactagtttc ctcagaatca 7380 ataagcaagg tacgcttgtt tgggcagtcc 7440 tggcactgaa tatcccgtgt acgtcctgtg 7500 actggcttgg ccggccctgt gcgcgatgta 7 560 ggagttgagc tgtgtgttgg accccggcct 7620 cgtccctgca cttcacgttc agctttgcaa 7680 taatccttat aatcaagtat atcctgaatt 7740 atagcagcgt catctgactc aaccaaacca 7800 taatattcct caacagattg tgaaccttgt 7860 cgagcataat aggaaggaac aaatctgtgg 7920 atgacactgt taatgggaag tttttgttta 7980 gtaaattcac taatggcagc cttcacttgg 8040 ttctgttcta cctctaattc ccaatcaaga 8100 gatggaattt taaatttaat cttagaaaat 8160 cgtgcacgac cacggcgatc tccatcgtcc 8220 atctttgtgg tcaatgcatc aaggcgtgcc 8280 gtttgagcaa ggtcaagttg gttgaaacgc 8340 cgttcatgca tcgtcctaat gtcagcagca 8400 aactgggcat ccaccatgtc gtgtgctcct 8460 aaaaccaacg acaaaaacag gggtgtactg 8520 caagttctta tccgttctta ccaagccaca 8580 gtgaaagatt ggatgagcga ttgcttggag 8640 tggagttgtg ggtaggctgc actcaagtca 8700 gttgaattat agtgcaaaac acgaaactat 8760 gatggaaata gcagaatggc agtaacgtaa 8820 agtacaaatc acaggtgatt ttgtttttct 8880 agcacaagaa gcaacaagat aggagctaca 8940 tggtctacag aaaatcagga agttctctga 9000 tctttatttt cctgaatttt tttgacaatt 9060 tttggccggg ctcagaatgg tgtcaactag 9120 cccgagcgaa aagttatgcc cggtttaagg 9180 ccgggatgaa acaaccgtat cctttctcct 9240 ttgacgtaac cgaaggagaa aaacaaggaa 9300 tttttttcgt aaccgaagga gaaaaacaag 9360 tgtttttttt tacgtaaccg aaggagaaaa 9420 cgtgatcaaa ggggagatgg tggcggcgct 9480 accagcaaca aggaaacgcg aaagcacaca 9540 tgcgaggctc aaaagggtgc tgggataaga 9600 actgtaggaa aaaaaacgct cgataaactc 9660 gatgtagctg aggtgcccga tctttcggcg 9720 gacccttgcg atccgactac gacgagcaag 9780 cccgaggtgc caatgcaatc gctgaaccaa ctccctgtgg ttaccgacct tgctgatgcg 9840 agatcggcct gatcacgaag atcgtttcct gtgcgcaatc gaagaacgaa caagaacaag 9900 atgcgagcaa tctaatctat tactcgaggg tggagttctg aatacacgag gacagcgcag 9960 atttgcgcgt gttcggaagt agctaaggct aacgtaaaac aaaactccca aaaataaagg 10020 aggcgcagct cctgtataaa tagagagggg gcgcagcccc taggggcggc caaccctagg 10080 tcgtccatta tgggccgcaa ttgggctggt cgtctatcct tccgggcctt cgttctttaa 10140 caacatgatg tagttcaatt ctcttgcacg ggcccgagtc actggcccag gtggaagggg 10200 tggcgcctgg gctggagaag gtgctgctgg tgtagatgtg ctcgtgttgg tgttgatgtc 10260 ctcatcacat gtttggggtg gtttcgcgca atttcgttgt cgcacgtcac acattccgaa 10320 aacggttgtc ggggtgcata caaagcacga gtttttgaca ccggaacc 10368

<210> SEQ ID NO: 192 <211> Comprimento: 32 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Telo-31 overgo primerl Biocode 75319

<400> SEQ ID NO. 192 agggtttagg gtttagggtt tagggtttag gg 32

<210> SEQ ID NO: 193 <211> Comprimento: 32 <212> Tipo: DNA <213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características: <223> Outras Informações: Telo-31overgo primer2 Biocode 39612

<400> SEQ ID NO. 193 ccctaaaccc taaaccctaa accctaaacc c 31

App. Ref.: 2083-PCT

.50

Claims

1. Minicromossomo artificial de planta caracterizado por compreender um centrômero funcional contendo: (a) pelo menos dois arranjos de repetição em tandem de CentC em uma orientação invertida em que o primeiro arranjo compreende pelo menos cinqüenta cópias de CentC e o segundo arranjo compreende pelo menos cinqüenta cópias de CentC; e (b) pelo menos uma cópia de um elemento retrotransponível, em que o elemento retrotransponível está localizado entre o primeiro e o segundo arranjo.

2. Minicromossomo artificial de planta de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o elemento retrotransponível é selecionado do grupo que consiste em CentA, CRMl e CRM2.

3. Minicromossomo artificial de planta de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido minicromossomo compreende, adicionalmente, pelo menos um telômero funcional.

4. Minicromossomo artificial de planta de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o centrômero funcional se liga especificamente à proteína centromérica C (CENPC).

5. Planta de milho caracterizada por compreender o minicromossomo artificial de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3.

6. Planta de milho caracterizada por compreender o minicromossomo artificial de acordo com a reivindicação 4.

7. Minicromossomo artificial de planta caracterizado por compreender um centrômero funcional em que o centrômero se liga especificamente à proteína centromérica C (CENPC).

8. Planta de milho caracterizada por compreender o minicromossomo artificial de acordo com a reivindicação 7.

9. Polinucleotídeo isolado caracterizado por compreender: (a) pelo menos dois arranjos de repetições em tandem de CentC em uma orientação invertida em que o primeiro arranjo compreende pelo menos dez cópias de CentC e o segundo arranjo compreende pelo menos dez cópias de CentC; e (b) pelo menos uma cópia de um elemento retrotransponível, em que o elemento retrotransponível está localizado entre o primeiro e o segundo arranjo.

10. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação .9, caracterizado pelo fato de que o elemento retrotransponível é selecionado do grupo que consiste em CentA, CRMl e CRM2 .

11. Polinucleotídeo isolado caracterizado por compreender: (a) pelo menos um arranjo de repetições em tandem de CentC, o arranjo compreendendo pelo menos 10 cópias de CentC; e (b) pelo menos uma cópia de um elemento retrotransponível selecionada do grupo que consiste em CentA, CRMl e CRM2.

12. Polinucleotídeo isolado caraterizado por compreender: (a) pelo menos um arranjo de repetições em tandem de CentC, o arranjo compreendendo pelo menos 10 cópias de CentC; e (b) pelo menos uma cópia de cada de CentA, CRMl e CRM2.

13. Construção recombinante caracterizada por compreender o polinucleotídeo isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 12.

14. Construção recombinante de acordo com a reivindicação .13, caracterizada por compreender adicionalmente um fragmento de DNA compreendendo um arranjo de pelo menos 3 0 cópias de repetições teloméricas.

15. Planta transgênica de milho caracterizada por compreender a construção recombinante de acordo com a reivindicação 13.

16. Planta transgênica de milho caracterizada por compreender a construção recombinante de acordo com a reivindicação 14.

17. Método para produzir uma planta transgênica de milho compreendendo um minicromossomo artificial de planta tendo um centrômero funcional caracterizado por compreender: (a) contatar pelo menos uma célula vegetal de milho com uma mistura compreendendo a construção recombinante de acordo com a reivindicação 14; (b) identificar pelo menos uma célula vegetal de milho da etapa (a) compreendendo um minicromossomo artificial de planta tendo um centrômero funcional; e (c) regenerar uma planta de milho fértil a partir da célula vegetal de milho da etapa (b) em que a planta de milho citada compreende iam minicromossomo artificial de planta tendo um centrômero funcional.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a mistura compreende adicionalmente um polipeptideo que estimula crescimento de célula.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo é selecionado do grupo que consiste em um wuschel, um baby boom, um RepA ou um Lecl.