JP2015500648A - 所定の標的核酸配列を修飾するための組成物及び方法 - Google Patents
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Abstract
Description
遺伝子ターゲッティングの事象では、予め定義された内在性遺伝子又は別の予め定義された内在性核酸配列が、結果的に欠失、変異、挿入若しくは置換を生じる切断について標的とされ、又は遺伝子/標的とされた機能的修飾による化学修飾について標的とされる。標的とされないトランスジェニック生物の作出に勝る遺伝子ターゲッティングの利点の1つは、異種DNAを挿入することなく存在するゲノム配列を修飾する又は欠失させる可能性、又は代わりに、予め定義された遺伝子座において挿入若しくは置換によって異種の供与体DNAを配置する可能性である。こうして余分な配列なしで配列を操作できることは、それらが育種家、農夫、消費者及び規制当局によって望まれていないので有利であり、そのような配列を回避する多数の技法が提案されている一方でそれぞれ、それ自体の欠点に悩まされている。
(1)その内部で切断し、内在性ヌクレアーゼによって幾分、分解され、内在性のNHEJのDNA修復メカニズムによって再連結される二本鎖切断(DSB)を創ってDNAのインフレーム欠失及び/又はフレームシフト変異を創ることによってDNA配列を変異させること。植物におけるT−DNA又はトランスポゾンの挿入株とは対照的に、内在性遺伝子の欠失又は変異のこの方法は、異種DNAを残さず、植物は一部の定義によって非トランスジェニックと呼ばれ得る。NHEJでは、1以上のヌクレオチドが未だに特徴付けられていない内在性のメカニズムにてDSBに添加されてもよく、フレームシフト又は変異の同じ効果を本質的に達成する。
(2)内在性のNHEJのDNA修復メカニズムによって再連結される、それに隣接する2つの配列を切断することによって、又は欠失させる配列で若しくはその近傍で切断し、その後、標的に組換えられ、標的にて欠失させる配列に隣接する配列を含有する供与体DNAを供給することによる支援型HRによってDNA配列のストレッチを欠失させること。
(3)標的核酸を切断し、NHEJメカニズムによるギャップに直接連結される供与体DNAを供給することによって、又は好ましくは組み換えられ、支援型HRによるギャップに連結されるギャップの末端に相同性を有する供与体を供給することによって供与体DNAをDSBに挿入すること。
(4)それに隣接する双方の配列を切断し、NHEJによって標的隣接配列の中で挿入され、連結される、又は好ましくはHRによって組み換えられ、連結される供与体核酸を供給することによって、供与体の末端で標的核酸に類似する配列又はそれに隣接するものを付加することによって標的核酸配列を置き換えること。
(a)プログラム可能なキメラポリペプチドをコードする核酸配列を宿主細胞に送達する工程と
(キメラポリペプチドは、
(i)前記標的部位を修飾することが可能である機能性ドメイン、特定の核酸結合部位を欠いている機能性ドメインと
(ii)特異性付与核酸と相互作用することが可能である連結ドメイン(その際、連結ドメインは特定の核酸結合部位を欠いている)を含む)
(b)特異性付与核酸(SCNA)又はSCNAをコードする核酸を宿主細胞に送達する工程を含み、
その際、SCNAは
(i)標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性のヌクレオチド配列と
(ii)高い結合親和性でポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することが可能である認識領域を含み、
その際、SCNAを抱く細胞におけるポリペプチドの発現は、SCNAへの前記キメラポリペプチドの結合を可能にし、活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質複合体を形成し、それによって、宿主細胞内で所定の標的核酸配列に対してキメラポリペプチドを向け、前記活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質分子複合体による標的核酸配列の所定の標的部位の修飾を可能にする。
(a)(i)標的核酸配列における標的部位を修飾することが可能であり、特定の核酸結合部位を欠いている機能性ドメインと(ii)特異性付与核酸と相互作用することが可能であり、特定の標的核酸結合部位を欠くことが可能である連結領域を含むポリペプチドと、
(b)(i)標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性であるヌクレオチド配列と(ii)ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することが可能である認識領域を含む特異性付与核酸(SCNA)と
を含む宿主細胞が提供され、
それによって、宿主細胞内でのポリペプチドとSCNAの集合が、標的部位にて標的核酸を特異的に修飾することが可能である機能的なヌクレオタンパク質複合体を形成する。
定義
本明細書で使用されるとき、用語「約」は±10%を指す。
「投与すること」は、対象に医薬剤又は医薬組成物を提供することを指向し、医療専門家によって投与すること及び自己投与することを含むが、これらに限定されない。
「非経口投与」は、腸管を介さない投与を意味する。非経口投与には、皮下投与、静脈内投与、又は筋肉内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
「皮下投与」は皮膚直下の投与を意味する。
「静脈内投与」は静脈への投与を意味する。
「腫瘍内投与」は腫瘍の中への投与を意味する。
「化学塞栓」は、腫瘍への血液供給を外科的に又は機械的に遮断し、化学療法剤を直接腫瘍に投与する処置を意味する。
用語「アンチセンス」は本明細書で使用されるとき、特定のDNA又はRNAの配列に相補性であるヌクレオチド配列を指す。用語「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」に対して相補性である核酸の鎖を参照して使用される。アンチセンス分子は、相補鎖の合成を可能にするウイルスプロモータに逆方向で当該遺伝子を連結することによる合成を含む方法によって作出され得る。いったん細胞に導入されると、この転写された鎖は細胞によって作出された天然の鎖と合せて二本鎖を形成する。これらの二本鎖がさらなる転写又は翻訳のいずれかを阻止する。このようにして変異体の表現型が生成され得る。
「自律的に複製するベクター」は、ウイルス、改変ウイルス、特定の組換えベクター及びプラスミド、レプリコン及び細胞内寄生生物を含むが、これらに限定されない宿主の中で複製することが可能である天然の又は非天然の核酸配列を含むようにここでは定義される。
「細胞」は、単離された若しくはされない、培養された若しくはされない、又は分化した若しくはしない、たとえば、組織、臓器、カルス、生物又はその一部のような細胞のさらに高度なレベルの組織化も含む任意の種類の細胞、原核細胞又は真核細胞を含むようにここでは定義される。例となる細胞には、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、植物細胞、動物細胞、無脊椎細胞、線虫細胞、昆虫細胞、幹細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
「相補体」又は「相補性」は本明細書で使用されるとき、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の間でのワトソン/クリック(たとえば、A−T/U及びC−G)又はフーグスティーンの塩基対形成を意味する。完全な相補体又は完全な相補性は、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチド類似体の間での100%相補性の塩基対形成を意味し得る。部分的な相補性は、100%未満の相補性、たとえば、80%の相補性を意味し得る。
「送達ベクター」(単数)又は「送達ベクター」(複数)は、本発明で必要とされる剤/化学物質及び分子(タンパク質又は核酸)を細胞に接触させる又は細胞内若しくは細胞内区画に送達するのに本発明で使用することができる任意の送達ベクターを指向する。それには、伝達ベクター、リポソーム送達ベクター、プラスミド送達ベクター、ウイルス送達ベクター、細菌送達ベクター、薬剤送達ベクター、化学物質キャリア、高分子キャリア、リポプレックス、ポリプレックス、デンドリマー、微小バブル(超音波造影剤)、ナノ粒子、エマルジョン又は他の適当な移動ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。これらの送達ベクターは、分子、化学物質、高分子(遺伝子、核酸、タンパク質)、又はプラスミド及びT−DNAのような他のベクターの送達を可能にする。
「用量」は本明細書で使用されるとき、単回投与にて提供される医薬剤の特定の量を意味する。特定の実施形態では、用量は2以上のボーラス、錠剤又は注射て投与され得る。たとえば、特定の実施形態では、皮下投与が所望である場合、所望の用量は単回注射によって容易に収容されない容積を必要とする。そのような実施形態では、2回以上の注射を用いて所望の用量を達成してもよい。特定の実施形態では、用量は、2回以上の注射で投与して個体における注射部位の反応をできるだけ抑えてもよい。
「投与単位」は本明細書で使用されるとき、医薬剤が提供される形態を意味する。特定の実施形態では、投与単位は凍結乾燥したオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。特定の実施形態では、投与単位は再構成したオリゴヌクレオチドを含有するバイアルである。
「供与体核酸」は、DNA修復メカニズム、相同組換え(HR)、又は非相同末端結合(NHEJ)のいずれかによって標的配列に全体的に又は部分的に挿入される又は組換えられる、生物又は容器に供給される任意の核酸としてここでは定義される。
「持続時間」は本明細書で使用されるとき、活性又は事象が継続している間の時間を意味する。特定の実施形態では、治療の持続時間は、医薬剤又は医薬組成物の用量が投与される間の時間である。
「発現ベクター」は本明細書で使用されるとき、宿主細胞における内在性のタンパク質(単数)又はタンパク質(複数)を人工的にコードするように設計された任意の核酸を意味する。発現ベクターの例は、プラスミドDNA、T−DNA、ウイルスRNA、ssRNA又はdsRNA、レプリコン、自律的に複製するベクター、線形ssDNA、線形dsDNA、phiポリメラーゼ産物、RNA転写物、環状RNAを含み、本発明の一部の適用では、宿主細胞で移入されたゲノム及び細胞小器官のDNAを含む。
「断片」は、核酸又はポリペプチドの完全長ではない部分を指すように本明細書で使用される。従って、断片はそれぞれそれ自体、核酸又はポリペプチドである。
「遺伝子」は本明細書で使用されるとき、転写及び/又は翻訳の調節配列及び/又はコーディング領域及び/又は非翻訳領域(たとえば、イントロン、5’及び3’の非翻訳領域)を含む天然の(たとえば、ゲノムの)又は合成の遺伝子であり得る。遺伝子のコーディング領域は、アミノ酸又は、たとえば、tRNA、rRNA、触媒RNA、siRNA、miRNA、又はアンチセンスRNAのような機能的なRNAをコードするヌクレオチド配列であり得る。遺伝子は、任意でそれに連結された5’又は3’の非翻訳配列を含むコーディング領域(たとえば、エクソン及びmiRNA)に相当するmRNA又はcDNAでもあり得る。遺伝子はまた、コーディング領域のすべて又は一部及び/又はそれに連結された5’又は3’の非翻訳配列を含む試験管内で作出された増幅された核酸分子でもあり得る。
「遺伝子ターゲッティング」は、標的配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、変異及び置換を含む標的核酸配列への永続的な変化を誘導する遺伝的技法として本明細書で使用される。
「ゲノム修飾」は、遺伝子ターゲッティング又は遺伝子の機能的修飾の結果としての生物のゲノム又は染色体又は染色体外DNA又は細胞小器官DNAにて生成される修飾として本明細書で使用される。
本明細書で使用される「宿主細胞」は、ベクターを含有し得る天然に存在する細胞又は形質転換された細胞であり得る。宿主細胞は、培養された細胞、外植体、生体内の細胞等であり得る。宿主細胞は、たとえば、大腸菌のような原核細胞、又はたとえば、植物、酵母、昆虫、両生類の細胞、又はCHO及びHeLaのような哺乳類の細胞のような真核細胞であり得る。
一部の実施形態によれば、前記宿主細胞は生物、臓器、組織又はカルスにおける全体の又は部分的な、分化した又は未分化の細胞である。
「同一の」又は「同一性」は2以上の核酸又はポリペプチドの配列の文脈にて本明細書で使用されるとき、配列が特定された領域のわたって同一である特定された比率の残基を有することを意味する。比率は、2つの配列を最適に並べ、特定された領域にわたって2つの配列を比較し、双方の配列にて同一の残基が存在する位置の数を決定して一致した位置の数を得、特定された領域の位置の総数で一致した位置の数を割り、結果に100を乗じて配列同一性の比率を得ることによって算出され得る。2つの配列の長さが異なる、又は配列比較が1以上の互い違いの末端を生じ、比較の特定された領域が1本のみの配列を含む場合、1本配列の残基は算出の分母には含まれるが、分子には含まれない。DNAとRNAを比較する場合、チミジン(T)及びウラシル(U)は同等と見なされ得る。同一性は、手動で又はBLAST若しくはBLAST2.0のようなコンピュータ配列アルゴリズムを用いて実施され得る。
「阻害する」は本明細書で使用されるとき、防ぐ、抑制する、抑える、軽減する又は排除する、を意味する。
「試験管内で」は、全体の又は部分的な、分化した又は未分化の生きている生物、臓器、組織、カルス又は細胞の膜の外側での人工的な環境として本明細書では定義される。一部の実施形態では、用語、試験管内で、は生存能力のある細胞の内側ではない。
「生体内で」は、全体の又は部分的な、分化した又は未分化の生物、臓器、組織、カルス又は細胞の内側として本明細書では定義される。
キットは本明細書で使用されるとき、以下:アッセイ試薬、緩衝液、プローブ及び/又はプライマー、及び無菌の生理食塩水又は別の薬学上許容可能なエマルジョン及び懸濁液の基剤のすべて又は一部と一緒に本明細書で記載される組成物を含み得る。加えて、キットは、本明細書で記載される方法を実践するための指示を含有する指示書(たとえば、プロトコール)を含み得る。
「標識」は本明細書で使用されるとき、分光光度法、光化学、生化学、免疫化学、化学又は他の物理学の手段によって検出可能な組成物を意味する。たとえば、有用な標識には、32P、蛍光色素、電子密度の高い試薬、酵素(たとえば、ELISAで汎用されるような)、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン及び検出可能であり得る他の実体が挙げられる。
標識は任意の位置で核酸又はタンパク質に取り込まれ得る。
「ミスマッチ」は第2の核酸の相当する位置でヌクレオ塩基対形成をすることが可能ではない第1の核酸のヌクレオ塩基を意味する。
「修飾されたオリゴヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、天然に存在する末端、糖、ヌクレオ塩基及び/又はヌクレオシド間結合に対して1以上の修飾を有するオリゴヌクレオチドを意味する。
「調節」は本明細書で使用されるとき、機能及び/又は活性及び/又は構造の搖動を意味する。特定の実施形態では、調節は遺伝子発現の上昇を意味する。特定の実施形態では、調節は遺伝子発現の低下を意味する。
「変異体」は本明細書で使用されるとき、配列の機能性の少なくとも一部が失われている、たとえば、プロモータ又はエンハンサの領域における配列への変化が生物におけるコーディング配列の発現に少なくとも部分的に影響する配列を指す。本明細書で使用されるとき、用語「変異」は、たとえば、欠失、付加、置換又は再構成を生じ得る核酸配列における配列の変化を指す。変異はまた、配列が関与する1以上の工程に影響を及ぼし得る。たとえば、DNA配列における変化は、活性がある、部分的に活性がある又は不活性である変化したmRNAの合成を招き得る。
「核酸配列」又は「オリゴヌクレオチド」又は「ポリヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、一緒に共有結合した少なくとも2つのヌクレオチドを意味する。一本鎖の記載は相補鎖の配列も規定する。従って、核酸は記載された一本鎖の相補鎖も包含する。1つの核酸の多数の変異体が所与の核酸として同一目的に使用され得る。従って、核酸は実質的に同一の核酸及びその相補体も包含する。一本鎖はストリンジェントなハイブリッド形成条件下で標的配列とハイブリッド形成し得るプローブを提供する。従って、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成するプローブも包含する。
核酸は一本鎖であっても又は二本鎖であってもよく、二本鎖配列及び一本鎖配列の双方の部分を含有してもよい。核酸は、ゲノムの及びcDNA双方のDNA、RNA又はハイブリッドであってもよく、その際、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの組み合わせ、及びウラシル、アデニン、チミジン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は化学合成法又は組換え法によって入手され得る。少なくとも1つの異なる結合、たとえば、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又はO−メチルホスホロアミダイト結合及びペプチド核酸骨格及び結合を有し得る核酸類似体が含まれ得るが、核酸は一般にホスホジエステル結合を含有するであろう。他の類似体核酸には、参照によって組み入れられる米国特許第5,235,033号及び同第5,034,506号に記載されたものを含む陽性の骨格:非イオン性骨格及び非リボース骨格を持つものが含まれる。1以上の天然に存在しない又は修飾されたヌクレオチドを含有する核酸も核酸の定義の1つに含まれ得る。修飾されたヌクレオチド類似体は、たとえば、核酸分子の5’末端及び/又は3’末端に位置し得る。ヌクレオチド類似体の代表的な例は、糖又は骨格が修飾されたリボヌクレオチドから選択され得る。しかしながら、ヌクレオ塩基が修飾されたリボヌクレオチド、すなわち、天然に存在するヌクレオ塩基の代わりに天然に存在しないヌクレオ塩基、たとえば、5位で修飾されたウリジン又はシチジン、たとえば、5−(2−アミノ)プロピルウリジン、5−ブロモウリジン;8位で修飾されたアデノシン及びグアノシン、たとえば、8−ブロモグアノシン;デアザヌクレオチド、たとえば、7−デアザ−アデノシン;O−及びN−アルキル化ヌクレオチド、たとえば、N6−メチルアデノシンを含有するリボヌクレオチドも好適であることが留意されるべきである。2’−OH基は、H、OR、R、ハロ、SH、SR、NH2、NHR、NR2又はCNから選択される基によって置き換えられてもよく、その際、RはC1〜C6のアルキル、アルケニル及びアルキニルであり、ハロはF、Cl、Br又はIである。修飾されたヌクレオチドには、たとえば、ヒドロキシプロリノール結合を介してコレステロールと抱合されるヌクレオチドも含まれる。リボースリン酸骨格の修飾は、たとえば、生理的環境下でそのような分子の安定性及び半減期を高める、細胞膜を横切って拡散を高める、又はバイオチップ上のプローブとしてのような様々な理由で実施され得る。骨格の修飾は、たとえば、細胞の厳しいエンドサイトーシス環境における分解への耐性も高め得る。骨格の修飾は、たとえば、肝臓にて肝細胞による核酸のクリアランスも低減し得る。天然に存在する核酸と類似体の混合物が作製されてもよく、或いは、異なる核酸類似体の混合物及び天然に存在する核酸と類似体の混合物が作製されてもよい。
本明細書で使用される「操作可能に連結される」は、遺伝子の発現が、空間的に接続されるプロモータの制御下にあることを意味する。プロモータはその制御下の遺伝子の5’(上流)又は3’(下流)に位置し得る。プロモータと遺伝子の間の距離は、プロモータとプロモータが由来する遺伝子におけるそれが制御する遺伝子との間の距離にほぼ等しい。当該技術で知られるように、この距離における変動はプロモータ機能を喪失することなく調整され得る。
「プロモータ」は本明細書で使用されるとき、細胞において核酸の発現を付与する、活性化する又は高めることが可能である合成の又は天然に由来する分子を意味し得る。プロモータは、1以上の特定の転写調節配列を含んでその発現をさらに高める及び/又はその空間的発現及び/又は一時的な発現を変えてもよい。プロモータはまた、転写の開始部位から数千塩基対ほど離れて位置することができる遠位のエンハンサ又はリプレッサ要素も含み得る。プロモータはウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、及び動物を含む供給源に由来し得る。プロモータは、発現が生じる細胞、組織又は臓器に関して、発現が生じる発生段階に関して、又は生理的ストレス、病原体、金属イオン若しくは誘導剤のような外部刺激に応答して構成的に又は差次的に遺伝子成分の発現を調節し得る。プロモータの代表的な例には、バクテリオファージT7プロモータ、バクテリオファージT3プロモータ、SP6プロモータ、lacオペレータプロモータ、tacプロモータ、SV40後期プロモータ、SV40前記プロモータ、RSV−LTRプロモータ、CMV IEプロモータ、CaMV35Sプロモータ、NOSプロモータ、熱ショックプロモータ、ステロイド調節性プロモータ、金属調節性プロモータ、種子プロモータ、及び植物ユビキチンプロモータが挙げられる。
「組換え宿主細胞」は、組換えDNA法を用いて構築されたベクターで形質転換されている細胞を指す。
本明細書で使用される「選抜可能なマーカー」は、遺伝子構築物で形質移入される又は形質転換されるものの特定及び/又は選抜を円滑にするようにそれが発現される宿主細胞、組織、臓器、カルス又は生物における表現型を付与する遺伝子を意味する。選抜マーカーの代表例には、アンピシリン耐性遺伝子(AmpR)、テトラサイクリン耐性遺伝子(TcR)、細菌カナマイシン耐性遺伝子(KanR)、ゼオシン耐性遺伝子、抗生剤オーレオバシジンAに耐性を付与するAURI−C遺伝子、ホスフィノトリシン耐性遺伝子、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(nptII)、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β−グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする遺伝子及びルシフェラーゼ遺伝子が挙げられる。本発明の一部の実施形態では、選抜マーカーは、内在性遺伝子の修飾から、たとえば、この遺伝子の変異がフレームシフト変異を生じ、抗体によって陰性選択される場合、細胞の表面に発現され、提示されるケモカイン受容体の消滅から、又はたとえば、耐性を生じる、除草剤クロロスルフロン及びイマザキンも耐性を生じるタバコアセト乳酸シンターゼ遺伝子におけるW568L変異から作出することができる。
「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は本明細書で使用されるとき、たとえば、核酸の複合体混合物にて第1の核酸配列(たとえば、プローブ)が第2の核酸配列(たとえば、標的)とハイブリッド形成する条件を意味する。ストリンジェントな条件は配列に依存性であり、異なる状況で異なる。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度及びpHにて特定の配列の融点(Tm)よりも約5〜10℃低く選択され得る。Tmは、標的に相補性のプローブの50%が平衡で標的配列とハイブリッド形成する(Tmでは標的配列が過剰に存在するので、プローブの50%が平衡で占有される)温度(定義されたイオン強度、pH及び核酸濃度のもとでの)であり得る。ストリンジェントな条件は、pH7.0〜8.3にて塩濃度が約1.0M未満のナトリウムイオン、たとえば、約0.01〜1.0Mのナトリウムイオン濃度(又は他の塩)であり、温度が短いプローブ(たとえば、約10〜50ヌクレオチド)のためには少なくとも約30℃であり、長いプローブ(たとえば、50以上のヌクレオチド)のためには少なくとも約60℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような脱安定化剤の添加によっても達成され得る。選択的な又は特異的なハイブリッド形成については、陽性のシグナルはバックグランドのハイブリッド形成の少なくとも2〜10倍であり得る。例となるストリンジェントなハイブリッド形成条件には、以下:50%ホルムアミド、5×SSC及び1%SDSにて42℃でインキュベート;又は5×SSC、1%SDSにて65℃でインキュベート、0.2×SSC及び0.1%のSDSで65℃にて洗浄、が挙げられる。
「相補性」は本明細書で使用されるとき、第1の配列が、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100以上のヌクレオチドの領域にわたる第2の配列の相補体と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%同一である、又は2つの配列がストリンジェントなハイブリッド形成条件下でハイブリッド形成することを意味する。
「実質的に同一の」は本明細書で使用されるとき、第1及び第2の配列が8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100以上のヌクレオチド又はアミノ酸の領域にわたって、又は第1の配列が第2の配列の相補体に対して実質的に相補性であるならば、核酸に関して少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%同一であることを意味する。
「標的核酸」又は「標的ヌクレオチド」は本明細書で使用されるとき、コーディング配列又は非コーディング配列、遺伝子、エクソン又はイントロン、調節配列、遺伝子間配列、合成配列及び細胞内寄生生物配列を含むが、これらに限定されない作用させられる所望の所定の核酸配列である。一部の実施形態では、標的核酸は標的の細胞、組織、臓器又は生物の中に存在する。標的核酸は、本明細書で開示される方法及び組成物によってある程度修飾される、標的配列の中にて1以上のヌクレオチドを含む標的部位を含む。たとえば、標的部位は1ヌクレオチドを含み得る。たとえば、標的部位は1〜300のヌクレオチドを含み得る。たとえば、標的部位は1〜100のヌクレオチドを含み得る。たとえば、標的部位は1〜50のヌクレオチドを含み得る。たとえば、標的部位は1〜35のヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的核酸は同一であってもよく又は異なっていてもよい1を超える標的部位を含み得る。
「標的とされた遺伝子の機能的な修飾」又は「標的遺伝子の修飾」は、標的配列における1以上のヌクレオチドの欠失、挿入、変異、置換、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識、活性化、不活化、及び抑制を含むが、これらに限定されない標的核酸における永続的な又は一過性の変化を生じる遺伝的技法に向けられる。
「治療法」は本明細書で使用されるとき、疾患の治療方法を意味する。特定の実施形態では、治療法には、化学療法、外科的切除、移植、及び/又は化学塞栓が挙げられるが、これらに限定されない。
該用語は、本明細書で開示される組成物及び方法によって導入される、そのゲノムにおける1以上の遺伝子修飾を有する生物に向けられる。たとえば、修飾は、1以上のヌクレオチドの挿入、変異、置換、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識、活性化、不活化、及び/又は抑制から選択される。生物は任意の種類の生物であり、たとえば、ヒト、動物、植物等であり得る。
本明細書で使用される「一過性の発現」又は「一過性に発現する」は、全体の又は部分的な、分化した又は未分化の生物、臓器、組織、カルス又は細胞における提供された核酸からの転写又は翻訳を指してもよく、前記発現は、ゲノムの又は細胞小器官の核酸を含む生物、臓器、組織、カルス又は細胞の安定な核酸に提供された核酸が統合されていないために限定される。一過性の発現用のベクターは、提供された線形又は環状のssDNA、dsDNA又はRNA、プラスミド、自律的に複製するベクター、ウイルス、試験管内の転写物、合成核酸及びその修飾された誘導体を含む。従って、一過性の発現は、その限定によって非遺伝的である一方で、細胞系列で連続して発現され、染色体又は細胞小器官の外側での核酸の複製のために細胞から細胞への自律的に移され得る。
状態からの対象の保護を指す場合、本明細書で使用される「治療する」又は「治療すること」は、状態を防ぐこと、抑制すること、抑えること又は排除することを意味する。状態を防ぐことには、状態の発症に先立って対象に本明細書で記載される組成物を投与することが関与する。状態を抑制することには、状態の誘導後、しかし、その臨床的出現の前に対象に組成物を投与することが関与する。状態を抑えることには、状態の臨床的出現の後、状態が軽減されるように又は悪化を防ぐように対象に組成物を投与することが関与する。状態の排除には、状態の臨床的出現の後、対象がもはや状態で苦しまないように対象に組成物を投与することが関与する。
「変異体」は核酸を参照して本明細書で使用されるとき、(i)参照されたヌクレオチド配列の一部、(ii)参照されたヌクレオチド配列又はその一部の相補体、(iii)参照されたヌクレオチド配列又はその相補体と実質的に同一である核酸、又は(iv)参照された核酸、その相補体又はそれと実質的に同一の配列とストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する核酸を意味する。
「ベクター」は本明細書で使用されるとき、核酸の送達を目的として使用される核酸配列を意味する。ベクターは、遺伝的形質転換、タンパク質の発現、RNAの転写をもたらすように、又は相同組換え若しくは非相同末端結合のための供与体として直接使用されるように本発明では使用され得る。ベクターは、プラスミドDNA、T−DNA、ウイルスRNA、ssRNA又はdsRNA、レプリコン、自律的に複製するベクター、線形又は環状のssDNA、線形又は環状のdsDNA、分岐phiポリメラーゼ産物、核酸デンドリマー、RNA転写物、環状RNA、バクテリオファージ、細菌の人工染色体又は酵母の人工染色体であってもよく、及び本発明の一部の適用では、宿主細胞に形質移入されたゲノム及び細胞小器官のDNAであってもよい。ベクターは、複製しない、自己複製する染色体外のベクター又は宿主ゲノムに統合するベクターのいずれかであり得る。
本明細書で使用されるとき、「野生型」配列は、その配列の天然の又は正常な機能を実施する配列の対立遺伝子形態であるコーディング配列、非コーディング配列又は接点部分の配列を指す。野生型配列には、同族配列の複数の対立遺伝子形態が含まれ、たとえば、野生型配列の複数の対立遺伝子は、コーディング配列がコードするタンパク質配列に対するサイレント変化又は保存的変化をコードし得る。
遺伝性疾患
実施例
実施例1:分子複合体の成分を調整するためのバイオアッセイとしての生体内の系
タンパク質の配列及び特性
SCNAの特性及び配列
以下の標的部位配列が実施例1A〜1Cにて標的とされる。
実施例1A〜C:「第1の標的」配列
SCNA配列
修飾記号は:ホスホロチオエート結合=*;5’DIG=/5DigN/;3’DIG=/3DigN/)
1A〜C:「第1の標的」のために調べられ、対形成したSCNAの組み合わせ
センスSCNA
GFP_918_SR1:/5DigN/NNNNNNGTGTCCAAGGGCGAGGAGCTG*T;(核酸のみが本明細書では配列番号18として指定される)
GFP_896_SL1:T*TTACGAACGATAGCCATGGCCNNNNNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号19として指定される)
予測結果に従って24bpの標的ギャップとさらに短いSCNAリンカーを採用する第2のセンス対形成される組み合わせ
GFP_920_SR1:/5DigN/NNGTCCAAGGGCGAGGAGCTGTT*C(核酸のみが本明細書では配列番号20として指定される)
GFP_895_SL1:A*TTTACGAACGATAGCCATGGCNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号21として指定される)
アンチセンスSCNA
GFP_918_ASR1:C*AGCTCCTCGCCCTTGgagacNNNNNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号22として指定される)
GFP_896_ASL1:/5DIGN/NNNNNNGGCCATGGCTATCGTTCGTA*A(核酸のみが本明細書では配列番号23として指定される)
予測結果に従って24bpの標的ギャップとさらに短いSCNAリンカーを採用する第2のアンチセンス対形成される組み合わせ
GFP_920_ASR1:G*AACAGCTCCTCGCCCTTGGACNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号24として指定される)
GFP_895_ASL1:/5DigN/NNGCCATGGCTATCGTTCGTAAA*T(核酸のみが本明細書では配列番号25として指定される)
センスとアンチセンスの対の組み合わせ
GFP_918_SR1:/5DigN/NNNNNNGTGTCCAAGGGCGAGGAGCTG*T;(核酸のみが本明細書では配列番号18として指定される)
GFP_896_ASL1:/5DIGN/NNNNNNGGCCATGGCTATCGTTCGTA*A(核酸のみが本明細書では配列番号23として指定される)
予測結果に従って24bpの標的ギャップとさらに短いSCNAリンカーを採用する第2のアンチセンス対形成される組み合わせ
GFP_920_SR1:/5DigN/NNGTCCAAGGGCGAGGAGCTGTT*C(核酸のみが本明細書では配列番号20として指定される)
GFP_895_ASL1:/5DigN/NNGCCATGGCTATCGTTCGTAAA*T(核酸のみが本明細書では配列番号25として指定される)
GFP_918_ASR1:C*AGCTCCTCGCCCTTGgagacNNNNNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号22として指定される)
GFP_896_SL1:T*TTACGAACGATAGCCATGGCCNNNNNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号19として指定される)
予測結果に従って24bpの標的ギャップとさらに短いSCNAリンカーを採用する第2のアンチセンス対形成される組み合わせ
GFP_920_SL1:A*TTTACGAACGATAGCCATGGCNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号21として指定される)
GFP_895ASR1:G*AACAGCTCCTCGCCCTTGGACNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号24として指定される)
実施例1Cのための「第1の標的」は1A及び1Bの標識と一致する。
実施例1Cのための「第2の標的」:GACTCTAAGCTTGGGTCTAGA
実施例1CのためのSCNA
24bpの標的ギャップとさらに短いSCNAリンカーを利用する組み合わせ
センス
GFP_1658_SR:/5DIGN/NNTCCGCAAAAATCACCAGTCTC*T(核酸のみが本明細書では配列番号27として指定される)
GFP_1633_SL:G*CATGGACGAGCTGTACAAGTCNN/3DIGN/(核酸のみが本明細書では配列番号28として指定される)
アンチセンス
GFP_1658_ASR:A*GAGACTGGTGATTTTTGCGGANN/3DIGN/(核酸のみが本明細書では配列番号29として指定される)
GFP_1633_ASL:/5DIGN/NNGACTTGTACAGCTCGTCCATG*C(核酸のみが本明細書では配列番号30として指定される)
実施例1A〜Cの「第1の標的」SCNAで見られるように、これら4つの実施例1Cの「第2の標的」SCNAは上記のリストからの1つ「左」(L)及び1つ「右」(R)のSCNAを用いて対形成され得る。
送達
バイオアッセイの設定:シロイヌナズナのプロトプラストの調製はWuら(Wu et. al., 2009)に基づく。
植物材料:22℃にて1日16時間最適照明(150マイクロアインシュタイン・m−2・s−1)にて生長させたシロイヌナズナ。
葉:3〜5週齢の植物(W:約2cm、L:約5cm)
操作溶液
酵素溶液:1%セルロース、0.25%マセロザイム、0.4Mのマンニトール、10mMのCaCl2、20mMのKCl、0.1%BSA、20mMのMES、pH5.7、55℃にて10分間、加熱してプロテアーゼを不活化し、次いで濾過する。新鮮なうちに使用する。10ml/7〜10枚の剥がした葉(1〜5g)/皿
改変W5溶液:154mMのNaCl、125mMのCaCl2、5mMのKCl、5mMのグルコース、2mMのMES、pH5.7。25ml/プレートで2回洗浄+形質転換洗浄のために3mlで2回+1mlに再懸濁
改変MMg溶液:(再懸濁溶液)0.4Mのマンニトール、15mMのMgCl2、4mMのMES、pH5.7
改変TEAMP形質移入緩衝液(PEG溶液):40%PEG、MW4000、0.1MのCaCl2、0.2Mのマンニトール容積=1:1(MMgにおける200μlのプロトプラスト+DNAの容積)
BSA:1%BSA
操作プロトコール
(1)水槽を55℃で事前に加熱し、冷却スイングアウト遠心し、W5及びMMgを冷却し、先端を切る。
(2)新しいBSAをコーティングしたプレート(ウェル当たり1%BSA水溶液を1.25ml、使用までベンチでインキュベート)を準備する。
(3)10ml/処理の新しい酵素溶液を作る。
(4)7〜10枚の葉を摘み、湿らすべからず。10枚の葉で約4〜5回形質転換できるはずである。
(5)表皮の上に時間テープを貼り、下に磁気テープを貼る。手袋なしの方が簡単である。葉柄が時間テープにのみに貼り付けば簡単に剥がせる。
(6)10mlの新しい酵素溶液を0.22μmのフィルターで濾過して各ペトリ皿に入れる。
(7)磁気テープを剥がし、捨てる。時間テープをペトリ皿の側面に移す。
(8)プロトプラストが離れるまで(経験的にチェックする)照明の中で40rpmにて20〜60分間、平板振盪器で穏やかに振盪する。
(9)スイングアウトロータにて100×gで3分間、50mlの試験管を遠心する。
(10)25mlの冷却W5溶液で2回洗浄する。
(11)30分間氷で冷却し、この間に光学顕微鏡を用いて血球計算板にて数を数える。
(12)遠心し、2〜5×105細胞/ml(約1ml)にてMMg溶液に再浮遊する。
形質移入
(1)2ml試験管内にて形質移入用の新しいPEG溶液を作る。
(2)6穴プレートからBSAを捨て、乾かす。
(3)15mlの丸底(スナップ式のキャップ)試験管にてRTで、標的プラスミドDNA、タンパク質部分を発現するプラスミドDNA及びSCNAssDNAの総量30〜40μgまでの混合物と0.2mlのMMg溶液中の約5×104(2×104〜1×105)のプロトプラストを混合する。
(4)等量(0.2mlのプロトプラスト+midiprep容量)の新しいPEG溶液を加える。
(5)RTで5分間インキュベートする。
(6)3mlのW5溶液をゆっくり加えて洗浄し、1度に1ml加え、混合する。
(7)スイングアウトロータにて100×gで1分間遠心する。
(8)洗浄と遠心を繰り返す。
(9)1mlのW5溶液に再浮遊する。
(10)BASをコーティングしたプレートに注ぐ。
(11)22℃にて1日16時間最適照明(150マイクロアインシュタイン・m−2・s−1)にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
自動フローサイトメータ(FACS)を用いて形質移入の3日後、GFP/mCherry活性についてW5溶液に浮遊したプロトプラストをスクリーニングする。530/30のフィルターで検出される放射と共に488nmでの励起によってGFPは検出される。mCherryの励起と放射は561nmと610/20のフィルターである。閾値及び補正因子を設定して偽陽性を排除する。
実施例1A:誘導されたDSBによる点突然変異
シロイヌナズナのゲノム(プラスミドの代わりに)に予め安定的に導入された停止/GFP導入遺伝子を標的とする場合、GFPを発現するプロトプラストからゲノムを修飾した植物を再生することができる。
実施例1B:誘導されたゲノムDSBへの特異的統合
35SF:CTATCCTTCGCAAGACCCTTCC(配列番号31)
mCherryR:TTATCTTGTACAGCTCGTCCAT(配列番号32)によるPCRによって解析される。
同様に、細菌性の抗生剤耐性(複製開始点を含まないNPT−IIコーディングカセット)が線形dsDNAとしてプロトプラストに提供される。このDNAは、実施例1B及び1CのmCherryの代わりに挿入され、プロトプラストから全DNAを抽出し、大腸菌への挿入を伴う又は伴わないプラスミドを含むDNAで形質転換し、カナマイシンを含有する培地で増殖させることによってスクリーニングする。耐性の細菌はNPT−IIカセットを捕捉したプラスミドを有する。所定のGFP標的への挿入の特異性を評価するために、予想される挿入部位にまたがるプライマーによってGFP標的部位をPCR増幅する。特定の挿入物は、アガロースゲル上でPCR産物のサイズの有意なシフトを生じる。挿入の効率は、2つ組プレート実験にてカナマイシン耐性コロニーの数をアンピシリン耐性コロニーの数(アンピシリン耐性は標的プラスミドにコードされる)で割ることによって算出される。特異性は、プログラム可能な分子複合体(たとえば、GFPを標的とするSCNA)の成分を含めない又は置き換える実験を繰り返し、改変されない実験と比較することによって算出される。
実施例1C:NHEJ修復メカニズムを介した遺伝子置換
35SF: CTATCCTTCGCAAGACCCTTCC(配列番号31)
mCherryR: TTATCTTGTACAGCTCGTCCAT(配列番号32)
及び
35S−T−R−SEQ:CCCTATAAGAACCCTAATTCCC(配列番号33)
mCherryF: ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA(配列番号34)
による各細菌コロニーの2コロニーPCR反応の実施に供する。
シロイヌナズナのゲノム(プラスミドの代わりに)に予め安定的に導入されたGFP導入遺伝子を標的とする場合、大腸菌のそのような直接的な形質転換は行わない。代わりに、前記プライマーを用いて単一のプロトプラストからPCRによって直接、ゲノムDNAを増幅する。或いは、GFPを発現しない、mCherryを発現しているプロトプラストからゲノムが改変された植物を再生することができ、その一部を同様に解析することができる。
実施例2:単子葉植物穀類植物ゲノムにおける二本鎖切断の誘導、変異及び挿入
ノックアウトのためのトウモロコシにおけるターゲッティングIPK1
標的ヌクレオチド配列における標的部位
IPK1におけるエクソン2:TTCTCAAGTCATGAGCAACTC(配列番号35)
タンパク質の配列及び特性
SCNAの特性及び配列
IPK1標的部位に隣接するSCNAのヌクレオチド配列
IPK1−SR−1710:/5DIGN/NNNNNNCTGTGGGGCCATATCCCAGAA*C(核酸のみが本明細書では配列番号36として指定される)
IPK1−SL−1688:G*CGGGCACCGAGTTGTATTGTANNNNNN/3DIGN/(核酸のみが本明細書では配列番号37として指定される)
IPK1−ASR−1710:G*TTCTGGGATATGGCCCCACAGNNNNNN/3DIGN/(核酸のみが本明細書では配列番号38として指定される)
IPK1−ASL−1688:/5DIGN/NNNNNNTACAATACAACTCGGTGCCCG*C(核酸のみが本明細書では配列番号39として指定される)
IPK1−SR−1712:/5DigN/NNGTGGGGCCATATCCCAGAAC*T(核酸のみが本明細書では配列番号40として指定される)
IPK1−SL−1687:A*GCGGGCACCGAGTTGTATTGTNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号41として指定される)
IPK1−ASL−1687:/5DigN/NNACAATACAACTCGGTGCCCGC*T(核酸のみが本明細書では配列番号42として指定される)
IPK1−ASR−1712:A*GTTCTGGGATATGGCCCCACNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号43として指定される)
SCNAは修飾されたssDNAを含む。修飾記号は:ホスホロチオエート結合=*;5’DIG=/5DigN/;3’DIG=/3DigN/である。
実験2A:プロトプラストにおけるIPK1のノックアウト及びGFPの発現
本実施例2Aは、FACSによってGFPの活性について解析されるトウモロコシのプロトプラストで実施される。
操作プロトコール
プロトプラストの調製
Antonelli及びStadler,1989に基づく形質移入
(1)プロトプラストを調製し、8%マンニトールを伴った0.5mlのMurashige Skoogに基づく増殖培地(MS2D8M)に約2×106細胞にて再浮遊する。
(2)各実験について、新しいポリブレン(Aldrich)ストック溶液(リン酸緩衝生理食塩水、pH7.0にて10mg/ml)を調製する。これは、極度に吸湿性の化学物質であり、製造元の安全性の指示書が厳格に適用されなければならない。次いでストック溶液を希釈して0.1mlのMS2D8M中、30μgのポリブレンの最終濃度を得る。
(3)所望の濃度の形質転換DNA(プラスミドDNAと修飾されたssDNA SCNA)を0.4mlのMS2D8Mに懸濁する。
(4)再浮遊させたプロトプラストと0.1ml(30μg)のポリブレンを混合し、60mmのペトリ皿に移す。
(5)直ちに0.4mlのDNA懸濁液を加える(一滴ずつ)。プロトプラスト/ポリブレン/DNA混合物(総容量1.0ml)を旋回振盪器にて15分間、穏やかに回転し(25rpm)、次いで28℃にて6時間インキュベートする。
(6)6時間のインキュベートの後、4.0mlのMS2D8M中で上記混合物を希釈し、ペトリ皿を密閉し、一過性の遺伝子発現のアッセイ又は安定な形質転換体の選抜のための手順に従う。
検出
閾値及び補正因子を設定して偽陽性を排除する。FACSを用いてさらなる解析にために標的とされた細胞を分離する。
プロトプラストを、ゲノムDNAの抽出、及び以下のプライマー1F及び1Rを用いたPCRによるその増幅、及びPCR産物のBspHIによるその後の消化による解析に供する。野生型に多少類似するサイズのBspHIで切断できない産物は、所望のような標的への挿入の結果生じた不正確な再ライゲーション、さらに大きなサイズのPCR産物に加えて、正確なターゲッティング事象から生じる。
プライマー1F:GAGCTAGATAGCAGATGCAGAT(配列番号44)
プライマー1R:CTCCAGAAAATCCCTAGAAACA(配列番号45)
或いは、PCR産物を、SURVEYOR変異検出キット(米国、Transgenomics)における指示書に従ってCEL1酵素変異検出アッセイに供する。このアッセイを用いて、プログラムされた分子複合体による遺伝子ターゲッティングによってIPK1DNAの変異の有効性を評価する。
実験2B:IPKのノックアウト及びBarの挿入、カルスへの送達
本実施例は、DNA衝撃によって形質転換され、次いでビアラホス(Basta)選抜下で生長させるトウモロコシのカルスで実施する。
操作プロトコール
(2)Gordon−Kammら、1990によって使用された方法に基づくプラスミドDNAと修飾されたssDNA−SCNAのカルスへの衝撃移入。
(3)培地(B0178 Gold Biotechnology, 1328 Ashby Rd., St. Louis, MO 63132 U.S.A)におけるビアラホスの最終濃度2.5mg/Lと共に実施例2Aに記載されたようにカルスを増殖培地に移す。
(4)2週間ごとにカルスを新しい培地に移動させる。
(5)ビアラホスにて2ヵ月増殖させたカルスは除草剤に耐性であり、PCR解析又は再生に供することができる。
(6)再生された植物は双方ともBastaに耐性であり、フィチン酸塩のレベルは低い。
検出及び解析
さらに、実施例2Aで示したプライマー1F及び1Rを用いたPCR解析、その後の上記のようなBspHIによる産物の消化にカルスを供する。
実験2Bのための供与体の配列
実施例3:シロイヌナズナの生細胞における所定の染色体二本鎖切断(DSB)の誘導
実験3A
実験3B
タンパク質の配列及び特性
従って、本実施例で記載される分子複合体のタンパク質部分は配列番号49に示されるようなアミノ酸配列を有し、配列番号50に示されるようなヌクレオチド配列によってコードされる。
SCNAの特性及び配列
標的配列
SCNA配列の選択肢
センス(S)SCNA:
PDS−SL1−846:GCATCCTTCCGTAGTGCTCCTCNNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号52として指定される)
PDS−SR1−868:/56−FAM/NNNNNNTTGTAATTGCTGGTGCTGGTAT(核酸のみが本明細書では配列番号53として指定される)
アンチセンス(AS)SCNA:
PDS−ASL1−846:/56−FAM/NNNNNNGAGGAGCACTACGGAAGGATGC(核酸のみが本明細書では配列番号54として指定される)
PDS−ASR1−868:ATACCAGCACCAGCAATTACAANNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号217として指定される)
混合された鎖SCNA:
PDS−SL1−846:GCATCCTTCCGTAGTGCTCCTCNNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号52として指定される)
PDS−ASR1−868:ATACCAGCACCAGCAATTACAANNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号217として指定される)
PDS−SR1−868:/56−FAM/NNNNNNTTGTAATTGCTGGTGCTGGTAT(核酸のみが本明細書では配列番号53として指定される)
PDS−ASL1−846:/56−FAM/NNNNNNGAGGAGCACTACGGAAGGATGC(核酸のみが本明細書では配列番号54として指定される)
PDS−SL2−845:TGCATCCTTCCGTAGTGCTCCTNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号55として指定される)
PDS−SR2−870:/56−FAM/NNGTAATTGCTGGTGCTGGTATGT(核酸のみが本明細書では配列番号56として指定される)
PDS−ASL2−845:/56−FAM/NNAGGAGCACTACGGAAGGATGCA(核酸のみが本明細書では配列番号57として指定される)
PDS−ASR2−870:ACATACCAGCACCAGCAATTACNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号58として指定される)
PDS−SL2−845:TGCATCCTTCCGTAGTGCTCCTNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号55として指定される)
PDS−ASR2−870:ACATACCAGCACCAGCAATTACNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号58として指定される)
PDS−SR2−870:/56−FAM/NNGTAATTGCTGGTGCTGGTATGT(核酸のみが本明細書では配列番号56として指定される)
PDS−ASL2−845:/56−FAM/NNAGGAGCACTACGGAAGGATGCA(核酸のみが本明細書では配列番号57として指定される)
/56−FAMは、6−FAM(6−カルボキシ−フルオレセイン)から構成されるSCNAssDNAの5’修飾を記号で示す。/36−FAMは、6−FAM(6−カルボキシ−フルオレセイン)から構成されるSCNAssDNAの3’修飾を記号で示す。Nは任意のヌクレオチドを記号で示す。
供与体の配列は、配列番号59で示されるような配列を有するDONOR PD−MCHERRY−Sである(mCherryをコードするORFは配列番号59のヌクレオチド662〜1372である)。
送達
形質移入
(1)2ml試験管内にて形質移入用の新しいPEG溶液を作る。
(2)6穴プレートからBSAを捨て、乾かす。
(3)15mlの丸底(スナップ式のキャップ)試験管にてRTで、供与体プラスミドDNA(関連する場合)、タンパク質部分を発現するプラスミドDNA及びSCNAssDNAの総量30〜40μgまでの混合物と0.2mlのMMg溶液中の約5×104(2×104〜1×105)のプロトプラストを混合する。或いは、供与体DNAとタンパク質部分を発現するDNAを構築し、単一プラスミドに供給する。
(4)等量(0.2mlのプロトプラスト+midiprep容量)の新しいPEG溶液を加える。
(5)RTで5分間インキュベートする。
(6)3mlのW5溶液をゆっくり加えて洗浄し、1度に1ml加え、混合する。
(7)スイングアウトロータにて100×gで1分間遠心する。
(8)洗浄と遠心を繰り返す。
(9)1mlのW5溶液に再浮遊する。
(10)BASをコーティングしたプレートに注ぐ。
(11)22℃にて1日16時間最適照明(150マイクロアインシュタイン・m−2・s−1)にてプロトプラストを生長させ、必要に応じて培地を交換する。
解析
PCRはプライマー:
PCRプライマー2F:TGGTTGTGTTTGGGAATGTTTCT(配列番号60)
PCRプライマー2R:TATCCAAAAGATATCTTCCAGTAAAC(配列番号61)によって実施する。
実施例4:双子葉植物タバコにおける生体内のゲノムDNAターゲッティング及び遺伝子置換
タバコ植物体におけるプログラムされた分子複合体の発現及び集合はここでは2工程で実施する。タンパク質部分の送達は、植物体でのプログラム可能なタンパク質部分の送達及び発現のためのpTRV2(Vainstein et. al., 2011)から修飾されたベクターのようなタバコ茎壊疽ウイルス(TRV)に基づいたウイルスタンパク質発現ベクターでタバコ植物体を感染させることによって達成される。
従って、
変化しない元々の配列:GGTCAAGTGCCACGTAGGATG(配列番号64)
誘導された変異:GGTCAAGTGGCGCGCAGGATG(配列番号65)
タンパク質部分の成分の配列
(1)完全長Nタンパク質のN’末端又はその近傍のバクテリオファージPhi21のNタンパク質(配列番号63:N’−GTAKSRYKARRAELIAER−C’)。RNA結合タンパク質はN末端に位置する。
(2)FokIヌクレアーゼ(VKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF)(配列番号66)
(3)SV40-NLS(配列番号67:MPKKKRKV)
(4)ドメイン間の接続要素:種々のポリアミノ酸リンカーがプログラムされた分子複合体の最適な機能について調べられる。
(1)Phi21のNタンパク質がプログラム可能な分子構築物のタンパク質部分のN末端で集合し、核局在化シグナル、SV40NLSがC末端に位置し、ドメイン間リンカーがGGSGG(配列番号7)である第1の選択肢(配列番号68で示されるような)。このタンパク質集合は配列番号69で示されるような核酸配列によってコードされる。
SCNA配列の選択肢
センス(S)SCNA対
SuRB_P191_SR1586:
UUCACCUCUAACCGGGUGAGNGGUACUGAUGCUUUUCAGGAAA(配列番号70)
SuRB_P191_SL1557:
AUAGCGUCCCCAUUGUUGCUAUNUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号71)
アンチセンス(AS)SCNA対
SuRB_P191_ASR1586:
UUUCCUGAAAAGCAUCAGUACCNUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号72)
SuRB_P191_ASL1557:
UUCACCUCUAACCGGGUGAGNAUAGCAACAAUGGGGACGCUAU(配列番号73)
SCNA配列の選択肢
センス(S)SCNA対
SuRB_P191_SR1−588:UUCACCUCUAACCGGGUGAGUACUGAUGCUUUUCAGGAAACU(配列番号77)
SuRB_P191_SL1−556:GAUAGCGUCCCCAUUGUUGCUAUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号78)
アンチセンス(AS)SCNA対
SuRB_P191_ASR1−588:AGUUUCCUGAAAAGCAUCAGUAUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号79)
SuRB_P191_ASL1−556:UUCACCUCUAACCGGGUGAGUAGCAACAAUGGGGACGCUAUC(配列番号80)
センス及びアンチセンスの対の組み合わせ
SuRB_P191_SR1−588:UUCACCUCUAACCGGGUGAGUACUGAUGCUUUUCAGGAAACU(配列番号77)
SuRB_P191_ASL1−556:UUCACCUCUAACCGGGUGAGUAGCAACAAUGGGGACGCUAUC(配列番号80)
SuRB_P191_SL1−556:GAUAGCGUCCCCAUUGUUGCUAUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号78)
SuRB_P191_ASR1−588:AGUUUCCUGAAAAGCAUCAGUAUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号79)
予想結果に従って24bpの標的ギャップとさらに短い(単一N)SCNAリンカーを採用する対形成した「R」と「L」のSCNAの組み合わせの第2のセット:
センス(S):
SURB_P191_SR2−584:UUCACCUCUAACCGGGUGAGNUCGGUACUGAUGCUUUUCAGGA(配列番号81)
SURB_P191_SL2−560:GCGUCCCCAUUGUUGCUAUAACNUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号82)
アンチセンス(AS):SuRB_P191_ASR2−584:
UCCUGAAAAGCAUCAGUACCGANUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号83)
SuRB_P191_ASL2−560:UUCACCUCUAACCGGGUGAGNGUUAUAGCAACAAUGGGGACGC(配列番号84)
又は第2のセットからの「R」と「L」のSCNAの組み合わせ
UUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号62)は、バクテリオファージPhi21に由来する20量体のボックスBのRNAヘアピン結合断片であり、SCNAの連結ドメイン結合断片(図1Bにて「SCNAヌクレオチドモチーフ」として模式的に示す)として機能する。
ALS SURB CDS(変化していない)のコーディング配列は配列番号85に示される。
DONOR1 P191A:供与体はヌクレオチド配列を変えてプロリンからアラニン(P191A)の変異を創り、制限酵素解析を可能にしている。この供与体の配列は配列番号86で示される。変化した配列は配列番号86のヌクレオチド544〜591で示されるとおりである。
方法
(1)アグロバクテリウムの一晩培養物(SCNA転写物をコードし、供与体DNAを運ぶバイナリプラスミドで形質転換された)2mlを回収する。
(2)4mlの誘導培地(1L:10.5gのK2HPO4、4.5gのKH2PO4、1gの(NH4)2SO4、0.5gのクエン酸ナトリウム、1gのグルコース、4gのフルクトース、4gのグリセロール、0.12gのMgSO4、1.95gのMES、pH5.6)に再懸濁し、最終濃度100μMでアセトシリンゴンを加える。
(3)30℃で6時間、増殖させる。
(4)3000g、8分間の遠心で細菌を回収する。
(5)200μMのアセトシリンゴンを含有する浸潤培地(10mMのMgSO4、10mMのMES、pH5.6)にて最終OD600=0.4で再懸濁する。
(6)4〜12mmの葉ディスクを取り、細菌浸潤溶液(工程5)にて30分間インキュベートする。
(7)再生培地(1L:4.3gのMS、30gのスクロース、100mgのMyo−イノシトール、pH5.6、10gの寒天、最終濃度100μg/LのNAA及び3mg/LのBAにてNAA及びBAを添加)に葉ディスクを入れる。20〜25℃にて48時間、インキュベートする。
(8)抗生剤カルベニシリン(0.3mg)及び除草剤クロロスルフロン(420nM)を含有する新しい再生培地に葉ディスクを移す。21日ごとに新しい培地に移す。
(9)若芽を約10mmに切断し、発根のために1/2MS培地に移す(1L:KOH、10gの寒天を伴った2.15gのMS、10gのスクロース、0.5gのMES、pH=5.7)。
実施例5:プログラムされた分子複合体を用いたDNAの標的とされた化学修飾
DNMT3A
波長561nmの励起及び610/20のフィルターによって検出される放射でのFACS解析によって形質移入された細胞を検出する。
タンパク質部分の構築
本実験で使用されるSCNA配列
SL898:TCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTNNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号91として指定される)
SR951:/56−FAM/NNNNNNGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG(核酸のみが本明細書では配列番号92として指定される)
3’−及び5’−6FAM(6カルボキシ−フルオレセイン)連結−ドメイン−結合−部位はそれぞれ、36−FAM/及び/56−FAM/によって標識される。DNAのメチル化にはSCNA1つで十分であるが、タンパク質を二量体化させて特異性を高めるには正しく間隔を空けて1を超えるSCNAを使用することが可能である。
実験手順
シロイヌナズナのプロトプラストの調製はWu(Wu et al., 2009)に基づき、形質移入工程での差異を伴って実施例1に類似する。
形質移入
(2)6穴プレートからBSAを捨て、乾かす。
(3)15mlの丸底(スナップ式のキャップ)試験管にてRTで、タンパク質部分を発現するプラスミドDNA約20μgと0.2mlのMMg溶液中の約5×104(2×104〜1×105)のプロトプラストを混合する。
(4)等量(0.2mlのプロトプラスト+midiprep容量)の新しいPEG溶液を加える。
(5)RTで5分間インキュベートする。
(6)3mlのW5溶液をゆっくり加えて洗浄し、1度に1ml加え、混合する。
(7)スイングアウトロータにて100×gで1分間遠心する。
(8)洗浄と遠心を繰り返す。
(9)1mlのW5溶液に再浮遊する。
(10)BASをコーティングしたプレートに注ぐ。
(11)22℃にて1日16時間最適照明(150マイクロアインシュタイン・m−2・s−1)にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
(12)約16時間後、関連するSCNA(総量約20μg)を伴ったmCherry標的をコードするプラスミドで工程3のプラスミドを置き換えて工程1〜11を繰り返すことによってこれらの細胞の再形質移入を行う。
(13)抽出したプラスミドのmCherryの発現とメチル化の状態を48時間後解析する。
解析
(A)プールしたプロトプラストからの消化したDNAをPCR増幅によって解析する。メチル化感受性の制限酵素SmaI(CCCGGG)、SalI(GTCGAC)又はSacII(CCGCGG)を用いて消化を行う。SmaI、SalI及びSacIIの群をメチラーゼのためのCpG部位として使用する。CpGジヌクレオチドに下線を引いた。メチル化されたDNAはこれらの酵素によって切断されない。従って、これらの酵素の切断部位にまたがるMCS配列が増幅され、定量PCRによって測定された産物は、非メチル化を生じる完全な切断のためにほとんど増幅されない、分子複合体の成分を欠く試料又は故意に非特異的なSCNAを含有する試料に対するメチル化の効率の測定を示す。
(B)PCR増幅、クローニング及び配列決定に先立って、プールしたプロトプラストからのDNAを重亜硫酸塩によって変換し、多数の標的及び非標的の対照の配列のメチル化状態を解析する。メチル化DNAの検出に好適なDNAメチル化−ゴールドキット(米国、ZYMO)に記載されたように重亜硫酸塩配列決定を行い、さらなる解析に使用する。
実施例6:ヒトにおける標的とされたゲノム修飾:ヒト造血幹細胞におけるCC5遺伝子の欠失
以下の例では、この遺伝子のCCR5又は一部が、Δ32対立遺伝子を有さないHIV感染患者から抽出された造血幹細胞(HSC)から欠失される。
ATCAATTCTGGAAGAATTTCCA(配列番号96);
TCATTACACCTGCAGCTCTCAT(配列番号97)。
CCR5_D32_SR_3321:UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCUAUCAAUUCUGGAAGAAUUUCCA(配列番号98)
CCR5_D32_SL_3304:UCAUUACACCUGCAGCUCUCAUUUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU(配列番号99)
27bpのギャップと2「N」リンカーのヌクレオチドを採用するSCNA距離選択肢2:
CCR5_D32_SR_3319:
UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCUNNGUAUCAAUUCUGGAAGAAUUUC(配列番号100)
CCR5_D32_SL_3291:
CAAAAAGAAGGUCUUCAUUACACNNUUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU(配列番号101)
ATGSCNA:
SCNA間の標的とされる領域(ATGには下線を引く)
CAGGGTGGAACAAGATGGATTATCAAGTGTC(配列番号103)
31bpのギャップを利用し、SCNAの内部「N」リンカーを利用しないSCNA距離選択肢1
CCR5_SR_2779:UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCUAAGTCCAATCTATGACATCAAT(配列番号104);
CCR5_SL_2747:AAGATCACTTTTTATTTATGCAUUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU.(配列番号105)
CCR5_SR_2777:
UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCUNNUCAAGUCCAAUCUAUGACAUCA(配列番号106)
CCR5_SL_2749:
GAUCACUUUUUAUUUAUGCACANNUUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU(配列番号107)
停止SCNAs:
SCNA間の標的とされる領域(停止コドンに下線を引く)
ATATCTGTGGGCTTGTGACACGGACTCAAGT(配列番号108)
31bpのギャップを利用し、SCNAの内部「N」リンカーを利用しないSCNA距離選択肢1
CCR5_SR_3884:UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCUGGGCTGGTGACCCAGTCAGAGT(配列番号109);
CCR5_SL_3802:CCGATCCACTGGGGAGCAGGAAUUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU(配列番号110)
27bpの標的ギャップと2「N」リンカーのヌクレオチドを採用する、コンピュータの結果に基づくSCNA距離選択肢2:
CCR5_SR_3833:
UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCUNNUGGGCUGGUGACCCAGUCAGAG(配列番号111)
CCR5_SL_3805:
AUCCACUGGGGAGCAGGAAAUANNUUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU(配列番号112)
この実施例のためのタンパク質部分のアミノ酸配列
機能性ドメイン:FokIヌクレアーゼサブユニット(上記のような)に由来する
連結ドメイン:最小BIV TATペプチドSGPRPRGTRGKGRRIRR(配列番号93)ドメイン
細胞局在化ドメイン:SV40の核局在化シグナル(NLS)ドメイン(SV40NLS)
FokIヌクレアーゼサブユニット
VKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF(配列番号66);
SV40NLS:MPKKKRKV(配列番号67);
BIV TATペプチド:SGPRPRGTRGKGRRIRR(配列番号93).
ドメイン間接続要素:GSGGSGP(配列番号113)
実施例7:プログラム可能な核酸塩基対形成の標的とされる転写活性化因子
本実施例では、タンパク質部分は、UAS結合ドメインを除くGal4転写活性化因子及び抗フルオレセインscFvから構成される連結ドメインから構成されるタンパク質部分をフルオレセインで修飾したSCNAと一緒に用いてレポーター遺伝子の発現を活性化する。ここで使用される本実施例では、Gal4のDNA結合ドメインが取り除かれ、タンパク質部分の連結ドメインで置き換えられる。
標的プラスミドは以下の順(5’−>3’)で6UASプロモータ領域、その後のTATAボックスを含有し、本明細書では配列番号180:
GGACTGTAGAGGTTCCGGGTGACAGCCCTCCGACGGGTGACAGCCCTCCGACGGGTGACAGCCCTCCGAATTCTAGAGGATCCGGGTGACAGCCCTCCGACGGGTGACAGCCCTCCGACGGGTGACAGCCCTCCGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCTGTCGACCTCGATCGAGATCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAとして指定される。
スペーサーは、配列:AGGAAGTTCATTTCATTTGGRGAGGACACGCTGAACC(配列番号192)を有する。
選択肢1:配列番号193で示されるGFPコーディング配列
選択肢2:配列番号194で示されるβ−グルクロニダーゼ(GUS)コーディング配列
35Sターミネータの配列:
GTCCGCAAAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATTTTTCTCCAGAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTGAC(配列番号195)。
別々の実験にて2つの異なる配向のSCNAが供給されて2つのUAS配列結合SCNAのより効果的なものを選択する。
センス:CGGGTGACAGCCCTCCGANNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号196で示される)
アンチセンス:/5−6FAM/NNNNNNTCGGAGGGCTGTCACCCG(核酸のみが本明細書では配列番号197で示される)
標的プラスミドは以下の順でプラスミド骨格、その後にTATAボックスを含有する:
TCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCACCCATAATACCCATAATAGCTGTTTGCCAACCGGTTCTATATA(配列番号198)
スペーサー配列(配列番号199)
AGGAAGTTCATTTCATTTGGRGAGGACACGCTGAACC
選択肢1:配列番号200で示されるGFPのORF
選択肢2:配列番号201で示されるβ−グルクロニダーゼ(GUS)コーディング配列
35Sターミネータの配列(配列番号202)
2つの異なる配向のSCNAを使用する。
SCNA:選択肢(マイナス62)
GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGANNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号203で示される)
/5−6FAM/NNNNNNTCGTGACTGGGAAAACCCTGGC(核酸のみが本明細書では配列番号204で示される)
実施例8:細胞小器官DNAにおける遺伝子ターゲッティング
ペチュニアにおけるPCF
置換又は挿入の事象を含有する細胞の選抜は供与体DNAにコードされるクロラムフェニコール耐性オペロンによって達成することができる。
以下の例(8A〜8C)において、タンパク質部分は、
アミノ酸配列:SGPRPRGTRGKGRRIRR(配列番号93)を含むBIV TATペプチドに由来する連結ドメインと、
アミノ酸配列:VKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF(配列番号66)を含むFokIヌクレアーゼに由来する機能性ドメインと、
シロイヌナズナのリポ酸シンターゼに由来し、ミトコンドリアの局在化シグナル(MLS)であるアミノ酸配列:MHSRSALLYRFLRPASRCFSSSSを含む細胞局在化ドメインと、
ドメイン間接続要素:GSGGSGP(配列番号113)を含む。
(1)供与体DNAなしでCMS表現型を形成する(8A)。
(2)atp9を標的としてクロラムフェニコール耐性を持つ供与体DNAを用いてpcf様の変異を形成する(8B)。
(3)pcf(CMS)表現型を修復し、ATP9を再形成し、不稔を回復し、同時にクロラムフェニコール耐性を持つ供与体DNAを使用する(8C)。
「ATP9」:Petunia hybrida×Petunia axillaris subsp.parodiiのミトコンドリアATPシンターゼサブユニット9、Genbank、acc、Nr.Y00609.1 GI:297475。
「pcf」:Petunia axillaris subsp.parodiiにおける細胞質雄性不稔(CMS)、CMS関連の融合タンパク質(CMS-afp)、NADH脱水素酵素サブユニット3(nad3)及びリボソームタンパク質S12(rps12)遺伝子、完全なcds、ミトコンドリア性、GenBank、acc.Nr.M16770.1 GI:1256946。
実施例8:細胞小器官を単離しない細胞小器官DNAにおける指示されたDNA変異
SCNAは、標的部位にて単一のDSBを形成するように設計され、それは内在性のNHEJ修復経路によって修復されてコーディング配列の一部にてフレームシフトを創る。
ATP9標的部位:GCAAAACAATTATTTGGTTATGCCATTTTGG(配列番号118)
SCNAの距離選択肢1:31bpの標的ギャップ
SCNAに隣接するATP9標的部位:
ATP9_ASL_705:UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCUCAAUGAUGGAUUUCGCGCCACG(配列番号119)
ATP9_ASR_737:UUAGCUUCGGUUAGAGCAAAGCUUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU(配列番号120)
27bpの標的ギャップを採用するSCNAの距離選択肢2
ATP9_ASL_707:
UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCUGCCAAUGAUGGAUUUCGCGCCA(配列番号121)
ATP9_ASR_735:
AGCUUCGGUUAGAGCAAAGCCCUUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU(配列番号122)
解析については、形質移入の48時間後、植物からDNAを精製し、プライマーを用いたPCRによってATP9の配列を増幅する。
ATP9atgF:ATGTTAGAAGGTGCAAAATCAA(配列番号123)
ATP9p2R:CTAACGGACTTGGAATACGAAT(配列番号124)
次いで、PCR産物をCEL I 酵素変異検出アッセイ(SURVEYOR変異検出キット(米国、Transgenomics))に供する。このアッセイを用いて、プログラムされた分子複合体による遺伝子ターゲッティングによるミトコンドリアDNAの変異の有効性を評価する。
実施例8B:細胞小器官DNAにおける指示されたDNA挿入
方法:実施例8Aと同様に、標準の葉の浸潤法を用いて、プログラムされた分子複合体のタンパク質部分をコードするバイナリベクタープラスミドとRNA−SCNAに由来するT−DNAを抱くアグロバクテリウムをペチュニアの葉に植菌する。形質移入の後、プログラムされた分子複合体が細胞質で発現され、自己集合し、次いで、タンパク質部分の表面で提示されるMLSを介してミトコンドリア輸入装置によってミトコンドリアに局在する。約12〜72時間後、Hrsが浸潤した葉をミトコンドリアの調製に使用する。本実施例の供与体DNAを含むプラスミドベクター又は線形PCR産物を単離されたミトコンドリアにエレクトロポレーションによって送達する。次いでエレクトロポレーション行ったミトコンドリアを新鮮なペチュニアのプロトプラストに微量注入によって移植する。PCF様のミトコンドリアのみが細胞で生き残ることができるクロラムフェニコール選抜培地にて注入されたプロトプラストを再生させる。
8Bの供与体DNA(pcf様に変えられるatp9)は配列番号125で示される。
結果及び解析
実施例8C:細胞小器官DNAにおける指示されたDNA置換
方法A:本実施例の供与体DNAを含むプラスミドベクターと、実施例8Cで示すSCNAと実施例8Aのタンパク質部分を、エレクトロポレーションによって、本実施例では、図9で模式的に示すものに類似する設計での単一プラスミドにて、単離されたミトコンドリアに送達する。
8Cの配列
pcfにおける標的配列:AGACTTACATCACGATGTCTTTTTCTTCGTT(配列番号126)
標的部位に隣接するSCNA:
SCNA距離選択肢1:31bpの標的ギャップ
CMS_ASL_704:
UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCUGUUAUUUGUAUACCUAACACGG(配列番号127).
CMS_ASR_736:
AUACGAAAACCAAAAUCAGAAUUUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU(配列番号128).
SCNA距離選択肢2、27bpの標的ギャップを採用する、コンピュータの結果に基づく:
CMS_ASL_706
UUCAGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGagcuCUGUUAUUUGUAUACCUAACAC(配列番号129)
CMS_ASR_734
ACGAAAACCAAAAUCAGAAUAAuucagcuCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCU(配列番号130)
8Cの供与体の配列は配列番号131で示される。
実施例9:哺乳類細胞のゲノム修飾:FAS受容体が介在する死を防ぐこと
タンパク質の配列及び特性
従って、本実施例で記載される分子複合体のタンパク質部分は配列番号49で示されるアミノ酸配列を有する。
SCNAの特性及び配列
本実施例で使用されるようなGGSGG(配列番号7)ドメイン間リンカーを伴った抗フルオレセイン−scFv−6−FAM系についてのコンピュータ化3Dモデルから得られた空間測定の結果によって、SCNA間の予想される最適な距離が、SCNAにて2N’の存在下で約23〜26ヌクレオチドであることを示す。切断は、いずれかの側でSCNAとの最後のヌクレオチドのハイブリッド形成後から数え、二量体化構築物によるdsDNAの切断によって創られる4塩基の5’オーバーハングを考慮に入れて、11、12又は13番目のヌクレオチドの左及び右に約±2ヌクレオチドで生じると予想される。この基準は、標的とされる配列が、これについて、24ヌクレオチド:AAAAAAAAAAYYYYYYYYYXXXXXXYYYYYYYYYCCCCCCCCCCであるならば、Y+XがSCNA塩基対形成部位間でのヌクレオチドの数を表す場合、設計されたSCNAは領域AとCと塩基対形成し、DSBを生じる切断はX領域にある又は隣接することを示唆している。SCNAはセンス鎖又はアンチセンス鎖に相補性であることができるが、好ましくは、センス(転写されない)配列と塩基対形成するように選択される。タンパク質部分の位置が、「末端近傍」にあるプライマーの5’又は3’の修飾によって定義されるようにSCNAの「末端近傍」に位置するので、SCNAは双方とも同一鎖と塩基対形成することができる。
標的部位の配列
(A)
エクソン1は347で開始し、標的配列はGGGCATCTGGACCCTCCTACC(配列番号133)である。
SCNAs:
SCNA距離選択肢1、21bpの標的ギャップ
SL351:A*GGATTGCTCAACAACCATGCTNNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号134で示される)
SR373:/56−FAM/NNNNNNTCTGGTGAGCCCTCTCCTGCC*C(核酸のみが本明細書では配列番号135で示される)
SCNA距離選択肢2、24bpの標的ギャップ及びさらに短いSCNAの「N」リンカーを採用する、コンピュータの結果に基づく
SL349:G*GAGGATTGCTCAACAACCATGNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号136で示される)
SR374:/56−FAM/NNCTGGTGAGCCCTCTCCTGCCC*G(核酸のみが本明細書では配列番号137で示される)
エクソン2は12499で開始し、標的配列は:TACGTCTGTTGCTAGATTATC(配列番号138)である。
(B)
SCNA
SCNA距離選択肢1、21bpの標的ギャップ
SL12503:A*TGCTTTTATTTTACAGGTTCTNNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号139で示される)
SR12525:/56−FAM/NNNNNNGTCCAAAAGTGTTAATGCCCA*A(核酸のみが本明細書では配列番号140で示される)
SCNA距離選択肢2、24bpの標的ギャップ及びさらに短いSCNAの「N」リンカーを採用する、コンピュータの結果に基づく
SL12501:TCATGCTTTTATTTTACAGGTTNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号141で示される)
SR12526:/56−FAM/NNTCCAAAAGTGTTAATGCCCAA*G(核酸のみが本明細書では配列番号142で示される)
制限解析のためのエクソン2標的:CAGTTGAGACTCAGAACTTGG(配列番号143)
(C)
SCNA
SCNA距離選択肢1、21bpの標的ギャップ
SL12595:G*GAATTGAGGAAGACTGTTACTANNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号144で示される)
SR12617:/56−FAM/NNNNNNAAGGCCTGCATCATGATGGCCAATTCT*C(核酸のみが本明細書では配列番号145で示される)
SCNA距離選択肢2、24bpの標的ギャップ及びさらに短いSCNAの「N」リンカーを採用する、コンピュータの結果に基づく
SL12594:G*GAATTGAGGAAGACTGTTACTNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号146で示される)
SR12619:/56−FAM/NNGGCCTGCATCATGATGGCCAA*T(核酸のみが本明細書では配列番号147で示される)
実施例Cの解析のためのプライマー
FAS_E2F:CATGCTTTTATTTTACAG;(配列番号148)
FAS_E2R:CTGTGACTTTCACTGTAATC(配列番号149)
これらのプライマーによる標的にPCR増幅は(未修飾DNAで)227bpのPCR産物を形成し、DdeIによる消化によって127bpと100bpの断片を形成する。DdeI消化は正確なターゲッティングによって消滅する。
エクソン9標的:CAATTGTGAATTCACATAGAA(配列番号150)
(D)
SCNA
SL24524:G*GTGTCATATTATACAATATTTNNNNNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号151で示される)
SR24546:/56−FAM/NNNNNNAACATTAAATTATAATGTTTG*A(核酸のみが本明細書では配列番号152で示される)
SCNA距離選択肢2、24bpの標的ギャップ及びさらに短いSCNAの「N」リンカーを採用する、コンピュータの結果に基づく
SL24522:T*TGGTGTCATATTATACAATATNN/36−FAM/(核酸のみが本明細書では配列番号153で示される)
SR24547:/56−FAM/NNACATTAAATTATAATGTTTGA*C(核酸のみが本明細書では配列番号154で示される)
実施例Dの解析のためのプライマー:
FAS_E9F CTTTGTTTATAACTCTGAGAAG(核酸のみが本明細書では配列番号155で示される)
FAS_E9R TCAAAATGCTTTTGATGCCTGA(核酸のみが本明細書では配列番号156で示される)
これらのプライマーによる標的のPCR増幅は、EcoRIによって消化されて134bpと106bpの断片を形成する240bpのPCR産物を(未修飾のDNAで)形成する。EcoRIの消化は正確なターゲッティングによって消滅する。
/56−FAM及び/36−FAMは6−FAM(6−カルボキシ−フルオレセイン)から構成されるSCNAssDNAにおけるそれぞれ5’−修飾又は3’−修飾を記号で表す。Nは任意のヌクレオチド記号で表す。ホスホロチオエート結合は星印(*)によって示す。
アッセイ
実施例10:生体内でプラスミドDNAの配列を編集すること。抗生剤耐性修飾
細菌性の選抜可能なマーカー遺伝子を用いてプラスミドDNAを標的とする場合の遺伝子ターゲッティングの効率を測定する。
本実施例では、SCNAの核酸末端修飾は、オリゴヌクレオチドの5’又は3’位置に連結されたNHS−エステル結合したジゴキシゲニン(DIG)である。
分子複合体のタンパク質部分のアミノ酸配列(一文字コード)(ジゴキシゲニンscFvを伴ったNLS−FokIヌクレアーゼ配列は配列番号12で示される)。
SCNAの特性及び配列
検出アッセイ
(1)標的のアンピシリン耐性カセット(AmpR)
(2)構成的選抜カナマイシン(Km)耐性カセット(KanR)
(3)複製開始点(ori)
(4)試験生物、本実施例では植物に好適なプロモータを含むプログラム可能な分子複合体タンパク質部分をコードする配列カセット
(5)T1及びT2−標的配列1及び2。
解析
次いでプラスミドを以下のプライマーによるPCR及び結果の検証のための配列解析に供する:
A961F:TAGGGCGCTGGCAAGTGTAG(配列番号158)
A2161R:CATAACACCCCTTGTATTAC(配列番号159)
実験
実験10A−AMPRカセットにおける標的とされた変異
実験10B
実施例10C
AMP及びTetの双方に感受性のコロニーはNHEJを介した遺伝子の欠失を明らかにする。
Tet及びAMPの双方に耐性のコロニーは、AMP耐性カセットを欠失することなくTetR供与体を取り込んでいるプラスミドを含有し、標的とされた供与体の統合又は「挿入」を明らかにする。
送達
形質移入
(2)6穴プレートからBSAを捨て、乾かす。
(3)15mlの丸底(スナップ式のキャップ)試験管にて室温で、標的プラスミドDNA及びタンパク質部分を発現するDNAを含むプラスミド、SCNAssDNA及び線形dsDNA供与体の総量30〜40μgまでの混合物と0.2mlのMMg溶液中の約5×104(2×104〜1×105)のプロトプラストを混合する。
(4)等量(0.2mlのプロトプラスト+midiprep容量)の新しいPEG溶液を加える。
(5)RTで5分間インキュベートする。
(6)3mlのW5溶液をゆっくり加えて洗浄し、1度に1ml加え、混合する。
(7)スイングアウトロータにて100×gで1分間遠心する。
(8)洗浄と遠心を繰り返す。
(9)1mlのW5溶液に再浮遊する。
(10)BASをコーティングしたプレートに注ぐ。
(11)22℃にて1日16時間最適照明(150マイクロアインシュタイン・m−2・s−1)にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
次いでプロトプラストを検出アッセイで記載されたようなDNA抽出に供する。
標的とされるAmpRカセットは配列番号160で示される。
SCNAの対は、センス鎖(S)又はアンチセンス鎖(AS)に関わりなく選択された左(L)1つと右(R)1つである:SCNA対の組み合わせの選択は実験において調べられたパラメータである。
AMPRカセットにおける標的配列T1:TATGAGTATTCAACATTTCCG(配列番号161)(ATG開始コドンに下線を引く)
AMPターゲッティングSCNAのセット1
選択肢1−21pの標的ギャップを利用する
pTGD_130_SL:A*ATAATATTGAAAAAGGAAGAGNNNNNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号162で示される)
pTGD_152_SR:/5DigN/NNNNNNTGTCGCCCTTATTCCCTTTTT*T(核酸のみが本明細書では配列番号163で示される)
pTGD_130_ASL:/5DigN/NNNNNNCTCTTCCTTTTTCAATATTAT*T(核酸のみが本明細書では配列番号164で示される)
pTGD_152_ASR:A*AAAAAGGGAATAAGGGCGACANNNNNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号165で示される)
選択肢2−対形成の組み合わせ、予測結果に従って24bpの標的ギャップとさらに短いSCNAリンカーを採用する
AMP_129_SL:C*AATAATATTGAAAAAGGAAGANN/3DIGN/(核酸のみが本明細書では配列番号166で示される)
AMP_154_SR:/5DigN/NNTCGCCCTTATTCCCTTTTTTG*C(核酸のみが本明細書では配列番号167で示される)
AMP_129_ASL:/5DigN/NNTCTTCCTTTTTCAATATTATT*G(核酸のみが本明細書では配列番号168で示される)
AMP_154_ASR:G*CAAAAAAGGGAATAAGGGCGANN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号169で示される)
AMPRカセットにおける標的配列T2:AGCATTGGTAACTGTCAGACC(配列番号170)
AMPターゲッティングSCNAのセット2
21pの標的ギャップを利用する選択肢1
pTGD_981_SL:G*AGATAGGTGCCTCACTGATTANNNNNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号171で示される)
pTGD_1003_SR:/5DigN/NNNNNNAAGTTTACTCATATATACTTT*A(核酸のみが本明細書では配列番号172で示される)
pTGD_981_ASL:/5DigN/NNNNNNTAATCAGTGAGGCACCTATCT*C(核酸のみが本明細書では配列番号173で示される)
pTGD_1003_ASR:T*AAAGTATATATGAGTAAACTTNNNNNN/3DigN/(核酸のみが本明細書では配列番号174で示される)
選択肢2−対形成の組み合わせ、予測結果に従って24bpの標的ギャップとさらに短いSCNAリンカーを採用する
AMP_980_SL:T*GAGATAGGTGCCTCACTGATTNN/3DIGN/(核酸のみが本明細書では配列番号175で示される)
AMP_1005_SR:/5DigN/NNGTTTACTCATATATACTTTAG*A(核酸のみが本明細書では配列番号176で示される)
AMP_980_ASL:/5DigN/NNAATCAGTGAGGCACCTATCTC*A(核酸のみが本明細書では配列番号177で示される)
AMP_1005_ASR:T*CTAAAGTATATATGAGTAAACNN/3DigN/核酸のみが本明細書では配列番号178で示される)
供与体:
クローニングベクターpSoup、EU048870.1 GI:155733614からのテトラサイクリン耐性をコードする供与体の配列は配列番号179で示される
実施例11:接続された一対のSCNA配列と共に作用するプログラム可能な分子複合体の構築
図4Bにて模式的に説明される実施例11Bでは、修飾されたssDNA−SCNAは、本実施例では、末端ジゴキシゲニン(NHSエステル)(DTG)分子の添加による5’及び3’双方の末端で修飾された配列、及び「SCNA接続要素」、定義されない配列又は長さの標的とハイブリッド形成しないヌクレオチドのストレッチを含有する。
タンパク質の配列及び特性
実施例11A:Phi21NPに基づくプログラム可能な分子複合体のタンパク質部分
成分
バクテリオファージPhi21のNタンパク質(配列番号63:GTAKSRYKARRAELIAER)完全長のNタンパク質で見られるようなN末端にて又はその近傍で、RNA結合ペプチドはN末端に位置する。
VKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF(配列番号66)
ドメイン間接続要素:プログラムされた分子複合体の最適な機能について種々のポリアミノ酸リンカーを調べる。
分子複合体のタンパク質部分のアミノ酸配列:本実施例では、Phi21Nタンパク質(配列番号68で示されるようなアミノ酸配列)はプログラム可能な分子構築物のタンパク質部分のN’末端で集合し、核局在化シグナルSV40NLSはC’末端に位置し、ドメイン間リンカーはGGSGG(配列番号7)である。
実施例11B:分子複合体のタンパク質部分のアミノ酸配列(一文字コード)(ジゴキシゲニンscFvを伴ったNLS−FokIヌクレアーゼは配列番号12で示される)
SCNAの特性及び配列
実施例11A:(Phi21NPに基づく)
センスと接続されるSCNAs:
GFP−921SR−X(n)−892SLボックスBPhi
UUCACCUCUAACCGGGUGAGNUCCAAGGGCGAGGAGCUGUUCA(配列番号207)−X(n)−ACCAUUUACGAACGAUAGCCAUNUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号208として指定される).
アンチセンスと接続されるSCNAs:
GFP−921ASR−X(n)−892ASLボックスBPhi
UUCACCUCUAACCGGGUGAGNAUGGCUAUCGUUCGUAAAUGGU(配列番号209)−X(n)−UGAACAGCUCCUCGCCCUUGGANUUCACCUCUAACCGGGUGAG(配列番号210)
実施例11B
センスと接続されるSCNAs:
GFP−919SR−X(n)−894SL−DIG
/5DigN/NNTGTCCAAGGGCGAGGAGCTGTT(核酸のみが配列番号211として指定される)
−X(n)− CATTTACGAACGATAGCCATGGNN/3DigN/(核酸のみが配列番号212として指定される)
アンチセンスと接続されるSCNAs:
GFP−919ASR−X(n)−894ASL−DIG
/5DigN/NNCCATGGCTATCGTTCGTAAATG(核酸のみが配列番号213として指定される)−X(n)−AACAGCTCCTCGCCCTTGGACANN/3DigN/(核酸のみが配列番号214として指定される)
送達
形質移入
(2)6穴プレートからBSAを捨て、乾かす。
(3)15mlの丸底(スナップ式のキャップ)試験管にて室温で、標的プラスミドDNAとタンパク質部分を発現するDNAを含むプラスミド、及び二重SCNAを発現するプラスミド(実施例12Aについて)又はssDNAを含有する二重SCNA(実施例12Bについて)の混合物30〜40μgと0.2mlのMMg溶液中の約5×104(2×104〜1×105)のプロトプラストを混合する。
(4)等量(0.2mlのプロトプラスト+midiprep容量)の新しいPEG溶液を加える。
(5)RTで5分間インキュベートする。
(6)3mlのW5溶液をゆっくり加えて洗浄し、1度に1ml加え、混合する。
(7)スイングアウトロータにて100×gで1分間遠心する。
(8)洗浄と遠心を繰り返す。
(9)1mlのW5溶液に再浮遊する。
(10)BASをコーティングしたプレートに注ぐ。
(11)22℃にて1日16時間最適照明(150μE・m−2・s−1)にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
次いでプロトプラストを以下で記載されるようなFACS又はDNA抽出に供する。
結果:誘導されたDSBによる点突然変異
解析
実施例12:最適なSCNAの距離を決定するためのバイオアッセイ
挿入物におけるSCNA1結合の認識配列
ATCTCAAGTCTCTAGGACTGGT(配列番号182)
GFP配列におけるSCNA2結合の認識配列:
ATCTGTGAGCAAAGGCGAGGAG(配列番号183)
図16に概説されるような:
n=1についてのNcoI/MscI挿入物:
CCATGGGATCTCAAGTCTCTAGGACTGGTCTTCAAAATCTTTCTCACTAGTTTCTACGATCTTGGCCA(配列番号184)
n=2についてのNcoI/MscI挿入物:
CCATGGGATCTCAAGTCTCTAGGACTGGTCAAAATCTTTCTCACTAGTTTCTACGCTGGCCA(配列番号185)
n=3についてのNcoI/MscI挿入物:
CCATGGGATCTCAAGTCTCTAGGACTGGTAATCTTTCTCACTAGTTACGCTGGCCA(配列番号186)
n=4についてのNcoI/MscI挿入物:
CCATGGGATCTCAAGTCTCTAGGACTGGTAATCTTTCTTGATCAGTCTGGCCA(配列番号187)
n=5についてのNcoI/MscI挿入物:
CCATGGGATCTCAAGTCTCTAGGACTGGTAATCTTTCTTGATCAGCTGGCCA(配列番号188)
n=6についてのNcoI/MscI挿入物:
CCATGGGATCTCAAGTCTCTAGGACTGGTAATCTTTCTTGATCACTGGCCA(配列番号189)
n=7についてのNcoI/MscI挿入物:
CCATGGGATCTCAAGTCTCTAGGACTGGTCTTTCTCACTAGTTCTGGCCA(配列番号190)
n=8についてのNcoI/MscI挿入物:
CCATGGGATCTCAAGTCTCTAGGACTGGTCTTCACTAGTGGCCA(配列番号191)
バイオアッセイの設定:シロイヌナズナのプロトプラストの調製はWuら(2009)に基づき、形質移入工程における差異を伴って実施例1の調製に類似する。
形質移入
(2)6穴プレートからBSAを捨て、乾かす。
(3)15mlの丸底(スナップ式のキャップ)試験管にて室温で、供与体プラスミドDNA(関連する場合)、タンパク質部分を発現するプラスミドDNA、及びSCNAssDNAの総量30〜40μgまでの混合物と0.2mlのMMg溶液中の約5×104(2×104〜1×105)のプロトプラストを混合する。或いは、供与体DNAとタンパク質部分を発現するDNAを構築し、単一プラスミドに送達する。
(4)等量(0.2mlのプロトプラスト+midiprep容量)の新しいPEG溶液を加える。
(5)RTで5分間インキュベートする。
(6)3mlのW5溶液をゆっくり加えて洗浄し、1度に1ml加え、混合する。
(7)スイングアウトロータにて100×gで1分間遠心する。
(8)洗浄と遠心を繰り返す。
(9)1mlのW5溶液に再浮遊する。
(10)BASをコーティングしたプレートに注ぐ。
(11)22℃にて1日16時間最適照明(150マイクロアインシュタイン・m−2・s−1)にてプロトプラストを生長させる。必要に応じて培地を交換する。
解析
参考文献
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Claims (38)
- 標的細胞における標的核酸配列にて所定の標的部位を修飾するためのヌクレオタンパク質組成物であって、
(a)キメラポリペプチドドが(i)特定の核酸結合部位を欠き、標的部位を修飾することが可能である機能性ドメインと
(ii)特定の核酸結合部位を欠き、特異性付与核酸と相互作用することが可能である連結ドメインを含む、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、
(b)(i)標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性であるヌクレオチド配列と、
(ii)ポリペプチドの連結ドメインに特異的に連結することが可能である認識領域を含む特異性付与核酸(SCNA)とを含み、
それによって、標的細胞内でのポリペプチドとSCNAの集合が、標的部位で前記標的核酸を特異的に修飾することが可能である機能性のヌクレオタンパク質複合体を形成する組成物。 - 前記機能性ドメインが触媒ドメインを含む請求項1の組成物。
- 標的核酸の前記修飾が、変異、欠失、挿入、置換、結合、消化、二本鎖切断の創製、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識化、活性化及び不活化から選択される請求項1の組成物。
- 前記キメラポリペプチドがさらに細胞内局在化ドメインを含む請求項1の組成物。
- SCNAが、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、修飾されたDNA、修飾されたRNA、ロックド核酸(LNA)及びペプチド核酸(PNA)又はそれらの組み合わせから成る群から選択される核酸を含む請求項1の組成物。
- 前記標的核酸がDNAである請求項1の組成物。
- SCNAの認識領域が、5’末端修飾、3’末端修飾及び内部修飾から成る群から選択される化学修飾を含む請求項1の組成物。
- 前記化学修飾が、ヌクレオチドの修飾及び非ヌクレオチド部分の付加から成る群から選択される請求項7の組成物。
- 非ヌクレオチド部分が、ビオチン、フルオレセイン、アミドリンカー、オリゴペプチド、アミノアリル、色素分子、蛍光色素分子、ジゴキシゲニン、アクリダイト、アデニル化、アジド、NHS−エステル、コレステリル−TEG、アルキン、光切断性のビオチン、チオール、ジチオールから選択される請求項8の組成物。
- ヌクレオチド修飾が、リン酸塩、2−アミノプリン、トリマー−20、2,6−ジアミノプリン、5−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、逆位dT、ジデオキシヌクレオチド、5−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、5−ニトロインドール、2−O−メチルRNA塩基、イソ-dC、イソ−dG、フッ素修飾塩基及びホスホロチオエート結合から成る群から選択される請求項8の組成物。
- 前記修飾と前記連結ドメインの間の結合が、タンパク質/タンパク質、アグロバクテリウムVirD2/VirD2結合タンパク質、抗体/抗原、単鎖抗体/抗原の相互作用、抗フルオレセイン単鎖可変断片抗体(抗FAM-scFv)/フルオレセイン、抗DIG単鎖可変断片(scFv)免疫グロブリン(DIG−scFv)/ジゴキシゲニン、及びIgG/プロテインAから選択される結合対である請求項1の組成物。
- SCNAの前記認識領域が、キメラタンパク質の連結ドメインに特異的に結合することが可能であるヌクレオチドモチーフを含む請求項1の組成物。
- ヌクレオチドモチーフと連結ドメインの間の結合が、Eボックスドメインとの螺旋ループ螺旋の相互作用;VirE2との単鎖DNAの相互作用;dsDNAとのStickyC;核酸とのウイルスコーティングタンパク質;ウシ免疫不全ウイルス(BIV)トランス作用性の応答要素(TAR)配列のループ1とのBIVのTat主要結合ドメインの相互作用;N−利用(nut)部位におけるボックスBループヘアピンとのファージラムダPhi21タンパク質の相互作用;N−利用(nut)部位におけるボックスBループヘアピンとのファージラムダP22Nタンパク質の相互作用;及びHIVrev応答要素(RRE)の幹IIBとのHIVrevタンパク質の相互作用から選択される請求項12の組成物。
- 連結ドメインが、アグロバクテリウムのVirD2タンパク質、ピコナウイルスVPg、トポイソメラーゼ、PhiX174ファージAのタンパク質、PhiX A*のタンパク質、及びそれらの変異体から成る群から選択されるポリペプチドを含む請求項12の組成物。
- プログラム可能なヌクレオタンパク質の分子複合体によって標的核酸配列内で所定の標的部位を修飾する方法であって、
(a)(i)特定の核酸結合部位を欠き、標的部位を修飾することが可能である機能性ドメインと
(ii)特定の核酸結合部位を欠き、特異性付与核酸と相互作用することが可能である連結ドメインを含むプログラム可能なキメラポリペプチドをコードする核酸配列を宿主に送達する工程と、
(b)(i)標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性であるヌクレオチド配列と、
(ii)ポリペプチドの連結ドメインに高結合親和性で特異的に連結することが可能である認識領域を含む、特異性付与核酸(SCNA)分子又はSCNAをコードする核酸を前記宿主細胞に送達する工程を含み、
SCNAを抱く細胞におけるポリペプチドの発現が前記キメラポリペプチドのSCNAへの連結を可能にし、活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質複合体を形成し、それによって、宿主細胞内でキメラポリペプチドを所定の標的核酸配列に向け、前記活性のあるプログラムされたヌクレオタンパク質分子複合体による標的核酸配列の所定の標的部位の修飾を可能にする方法。 - 前記標的核酸がDNAである請求項15の方法。
- 前記標的DNAがゲノムDNAである請求項16の方法。
- 前記標的ゲノムDNAが真核細胞起源であるである請求項17の方法。
- 前記標的核酸配列が、ミトコンドリア、葉緑体、アミロプラスト及び有色体から成る群から選択される染色体外の核酸配列である請求項15の方法。
- 前記標的核酸配列が、ウイルス核酸配列、原核細胞核酸配列及び合成核酸配列から選択される請求項15の方法。
- 前記修飾が、変異、欠失、挿入、置換、結合、消化、二本鎖切断の創製、ニッキング、メチル化、アセチル化、ライゲーション、組換え、螺旋の巻き戻し、化学修飾、標識化、活性化及び不活化から選択される請求項15の方法。
- キメラタンパク質が核酸機能性修飾因子を有するタンパク質部分を含み、機能的な修飾が、転写の活性化、転写の不活化、RNAの転写スプライシング、選択的RNAスプライシング、クロマチンの再構成、細胞の寄生生物及びウイルスの不活化及び前記核酸配列の細胞での局在化又は区画化の変化から成る群から選択される請求項15の方法。
- SCNAが、一本鎖DNA、一本鎖RNA、二本鎖RNA、修飾されたDNA、修飾されたRNA、ロックド核酸(LNA)及びペプチド核酸(PNA)又はそれらの組み合わせから成る群から選択される核酸分子を含む請求項15の方法。
- SCNAと標的核酸の間の相互作用が、完全な二重螺旋塩基対形成、部分的な二重螺旋塩基対形成、完全な三重螺旋塩基対形成、部分的な三重螺旋塩基対形成、及び前記対形成によるDループ形態又は分岐形態から成る群から選択される塩基対形成を介する請求項15の方法。
- SCNAの認識領域が、5’末端修飾、3’末端修飾及び内部修飾から成る群から選択される修飾を含む請求項15の方法。
- 前記修飾が、ヌクレオチド修飾、ビオチン、フルオレセイン、アミドリンカー、オリゴペプチド、アミノアリル、色素分子、蛍光色素分子、ジゴキシゲニン、アクリダイト、アデニル化、アジド、NHS−エステル、コレステリル−TEG、アルキン、光切断性のビオチン、チオール、ジチオール、修飾された塩基、リン酸塩、2−アミノプリン、トリマー−20、2,6−ジアミノプリン、5−ブロモ−デオキシウリジン、デオキシウリジン、逆位dT、ジデオキシヌクレオチド、5−メチルデオキシシチジン、デオキシイノシン、5−ニトロインドール、2−O−メチルRNA塩基、イソ-dC、イソ−dG、フッ素修飾塩基及びホスホロチオエート結合から成る群から選択される請求項25の方法。
- 修飾と前記連結ドメインの間の会合が、タンパク質/タンパク質、アグロバクテリウムVirD2/VirD2結合タンパク質、抗体/抗原、単鎖抗体/抗原の相互作用、抗フルオレセイン単鎖可変断片抗体(抗FAM-scFv)/フルオレセイン、抗DIG単鎖可変断片(scFv)免疫グロブリン(DIG−scFv)/ジゴキシゲニン(DIG)、及びIgG/プロテインAから選択される結合対の相互作用である請求項25の方法。
- SCNAの認識領域が、キメラタンパク質の連結ドメインと相互作用することが可能であるヌクレオチドモチーフを含む請求項15の方法。
- ヌクレオチドモチーフと連結ドメインの間の相互作用が、Eボックスドメインとの螺旋ループ螺旋の相互作用;VirE2との単鎖DNAの相互作用;dsDNAとのStickyC;核酸とのウイルスコーティングタンパク質;ウシ免疫不全ウイルス(BIV)トランス作用性の応答要素(TAR)配列のループ1とのBIVのTat主要結合ドメインの相互作用;N−利用(nut)部位におけるボックスBループヘアピンとのファージラムダPhi21タンパク質の相互作用;N−利用(nut)部位におけるボックスBループヘアピンとのファージラムダP22Nタンパク質の相互作用;HIVrev応答要素(RRE)の幹IIBとのHIVrevタンパク質の相互作用、及びアグロバクテリウムVirD2/右境界配列から選択される請求項28の方法。
- 連結ドメインが、アグロバクテリウムのVirD2タンパク質、ピコナウイルスVPg、トポイソメラーゼ、PhiX174ファージAのタンパク質、PhiX A*のタンパク質、及びそれらの変異体から成る群から選択されるポリペプチドを含む請求項28の方法。
- タンパク質部分の連結ドメインと特異性付与核酸部分の認識領域との間の物理的会合が、標的細胞内でプログラムされた機能的複合体を形成する、請求項15の方法によって形成されるヌクレオタンパク質複合体。
- タンパク質部分の連結ドメインと特異性付与核酸部分の認識領域との間の物理的会合が、リガンド/受容体、リガンド/基質、水素結合、ファンデルワールス結合、イオン結合及び疎水性相互作用から成る群から選択される親和性相互作用である請求項31のヌクレオタンパク質複合体。
- 請求項15の方法によって創られる、所定の標的部位にて所定の遺伝的修飾を有する宿主細胞。
- 前記宿主細胞が、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、無脊椎動物細胞、線虫細胞、昆虫細胞及び幹細胞から成る群から選択される請求項33の宿主細胞。
- 請求項15の方法によって形成される所定の遺伝的修飾を有するトランスジェニック生物又はノックアウト生物。
- 生物における遺伝性疾患を治療する方法であって、生物の細胞にて請求項1のヌクレオタンパク質のプログラム可能な分子複合体を発現させることを含む方法。
- (a)(i)特定の核酸結合部位を欠き、標的部位を修飾することが可能である機能性ドメインと
(ii)特定の核酸結合部位を欠き、特異性付与核酸と相互作用することが可能である連結ドメインを含むポリペプチドと、
(b)(i)標的部位に隣接する標的核酸の領域に相補性であるヌクレオチド配列と、
(ii)ポリペプチドの連結ドメインに特異的に連結することが可能である認識領域を含む、特異性付与核酸(SCNA)とを含む宿主細胞であって、
宿主細胞内でのポリペプチドとSCNAの集合が標的部位にて標的核酸を特異的に修飾することが可能である機能的なヌクレオタンパク質複合体を形成する宿主細胞。 - 前記宿主細胞が、脊椎動物細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、無脊椎動物細胞、線虫細胞、昆虫細胞及び幹細胞から成る群から選択される請求項37の宿主細胞。
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