JPS6368083A - 普遍的な制限エンドヌクレア−ゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規な普遍的制限エンドヌクレアーゼおよびこ
の種のエンドヌクレアーゼの製法に関する。より詳細に
は、本発明はオリゴデオキシヌクレオチドアダプターと
既知の制限エンドヌクレアーゼを組み合わせることによ
り予め定められたＤＮＡ配列を実際に切断しうる制限エ
ンドヌクレアーゼに関する。

（従来の技術） 制限エンドヌクレアーゼは自然界で細菌中に存在する酵
素の１種である。それらが他の妨害性細菌成分から分離
精製されると、制限エンドヌクレアーゼを実験室にて使
用してＤＮＡ分子を正確なフラグメントに切断すること
ができる。この性質によりＤＮＡ分子は特異的に同定さ
れ、それらの構成サブユニットに正確に分画化される。

制限エンドヌクレアーゼは現代の遺伝子研究において欠
くことのできない物質であることが証明されている。そ
れらは生化学的−はさみ”であり、それらを利用して遺
伝子工学や遺伝子分析が行われている。

制限エンドヌクレアーゼは３つのグループに分類される
。クラス−■およびクラス−１１１の酵素は同一のタン
パク質成分中に修飾（メチル化）およびＡＴＰ要求性制
限（切断）作用を有する。両タイプの酵素は基質ＤＮＡ
中の非メチル化認識配列を認識するが、クラス−■酵素
は非特異的にＤＮＡを切断し、一方りラスー■酵素は特
定部位で、一般にはそれらの認識部位から一定の距剛ｔ
を置いて、ＤＮＡを切断する。

クラス−■制限／修飾系は別個の制限エンドヌクレアー
ゼと修飾メチラーゼから成っている。これらの酵素は一
般に４〜６個のヌクレオチドから成り且つ往々にして２
回回転対称軸を有するそれらの特定認識配列内またはそ
の近傍でＤＮＡを切断する。ＤＮＡを特定部位で切断す
るクラス−■制限エンドヌクレアーゼは５００種以上に
のぼる。

異なる認識部位の数は（メチル化を含めた修飾認識部位
を除外して）１００種以上ある。〔ロバ−ッ（Ｒｏｂｅ
ｒｔｓ）、Ｎｑｂｃｌ　、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１
３　：　ｒ１６５．１９８５；ケスラー（Ｋｔｒｓｓｌ
ｅｒ）ら、Ｇａｎｇ、３３：１〜１０２．１９８５を参
照されたい。〕現在までに知られている切断部位はすべ
て非常に価値あるものであるが、遺伝子および調節配列
の正確な遺伝子操作を可能にするためには、別の切断部
位がしばしば必要になる。目下のところ、有利な制限部
位が利用できない配列を利用可能にするために、適当な
リンカ−の挿入、突然変異誘発またはエキソヌクレアー
ゼ消化を含めた様々な方法でその配列を遺伝子操作する
ことが通常行われている。しかしながら、新しい切断部
位を作るこのような方法は研究中のヌクレオチド配列を
修飾し、その機能に影響を及ぼしかねない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明によれば、ＤＮＡを予め足められた特定部位で切
断しつる制限酵素の新規な遺伝子操作法が提供される。

１つの実施態様ではクラス■Ｓまたは“シフター（５ｈ
ｔｆｔｅｒ）”酵素が利用される。

クラス■Ｓ酵素は二本鎖（ｄ　ａ　）　Ｄ　Ｎ　Ａを認
識配列から正確な距離を置いて切断するクラス■エンド
ヌクレアーゼであると定義される。ある種のクラス■酵
素特にそれらの認識部位から一定の距離（約２０〜２５
ヌクレオチド）を置いて切断するクラス■酵素もまた本
発明を実施する際に使用できる。２種の認識部位の間に
切断部位を有するクラス■酵素（例えばＢｓｔＸｉ酵素
；　ＧｇｔＬｇ、４０　：１７３（１９８５）を参照）
も本発明の教示に従って使用し得る。

本発明は認識部位と切断部位との間の分離を利用して、
クラス■またはクラス■酵素と適切に構築されたオリゴ
デオキシヌクレオチドアダプターを組み合わせることに
より、上記酵素に予め定められた配列を実際に切断させ
るものである。アダプターは一定の認識部位ドメイン（
ヘアピン含有二重鎖（ｄ８）配列）と、切断しようとす
る標的一本鎖（８８）配列に相補的である不定可変の一
本鎖ドメインとから構築される。切断されるべき８８配
列は８８フアージＤＮＡ、ギャップを形成されたｄ８プ
ラスミド、アルカリ変性後すみゃかに中和されるスーパ
ーコイルｄ８プラスミドなどによって提供される。これ
らの３種の成分、すなわちクラス■Ｓ酵素、５ｓＤＮＡ
標的配列および相補性アダプターの組合せは標的ＤＮＡ
を予め定められた特定部位で切断する新規な制限エンド
ヌクレアーゼ複合体をもたらす。本発明の別の利点は、
オリゴデオキシヌクレオチドアダプターをプライマーと
して使用して、適当なりＮＡポリメラーゼにより標的５
ｓＤＮＡを正確に切断されたｄ８ＤＮＡに変換し得ると
いうことである。

従って、本発明によれば、制限エンドヌクレアーゼの酵
素特異性を合成構築物によって変えて、予め定められた
制限特異性をもつ新しいエンドヌクレアーゼの実際に無
限の種類へと導く方法が提供される。

（問題点を解決するための手段） 本発明は制限エンドヌクレアーゼの特異性を変更するた
めに使用しつる、一定の目的をもって構築されたオリゴ
デオキシヌクレオチドアダプターを提供する。アダプタ
ーはこれらの酵素にＤＮＡを前もって指定した標的部位
で切断するように指示する。言い換えれば、オリゴデオ
キシヌクレオチドアダプター（新規な合成“°補酵素”
にたとえられる）は制限エンドヌクレアーゼに新しい基
質特異性を与える。

本発明のオリゴデオキシヌクレオチドアダプターはある
種の制限エンドヌクレアーゼの認識部位と切断部位の間
に存在する関係をまねて、標的ＤＮＡ上の予め定められ
た部位でＤＮＡを切断する能力を有する修飾エンドヌク
レアーゼを提供するために使用される。本発明に従って
修飾される好適な制限酵素はクラス■Ｓ酵素であり、そ
の場合に切断部位は認識部位からかカリの距離（１３ヌ
クレオチド以下）、しかし正確な距離だけ移動する。１
１種のクラス■Ｓ制限酵素の認識部位と切断部位の移動
を表■に示す。本発明によれば、このようなりラス用Ｓ
酵素を合成オリゴデオキシヌクレオチドアダプター分子
を使って遺伝子工学的に処理することにより、その酵素
に予め定められたＤＮＡ配列を認識して切断するように
指示することかできる。先に述べたように、クラス■酵
素（好ましくはそれらの認識部位から約２０〜２５ヌク
レオチド離れた部位で切断するもの）およびその他のク
ラス■酵素（例えばＢ８ｔＸ■）もまた、本発明の教示
に従って類似のアダプターを使用することにより、普遍
的制限エンドヌクレアーゼとして機能するように修飾さ
れる。この種の酵素にはＥｃｏＰｌ、Ｅｃｏ　Ｐ　１５
、ＨｉｎｅＴＢよびＨｉｎｆＩＩＩが含まれる二ヶスラ
ーらの上記文献ｐ。

６７〜６８を参照されたい。

α、認識部位はパリンドローム構造でないので両方の方
向を示す。矢印は切断部位を表し、最初の酵素に対して
のみ示す。

ｂ、制限部位の５′または３′突出Ｓ８末端ぶよびそれ
らの長さを示す。

Ｃ，ケスラーらの上記文献（真数と記載番号を示す）を
参照。

ｄ、市販されている（例えばニコー−・イングランド・
バイオラプス：ケスラーらの上記文献参照）。

ｅ、　Ｍｌ　３　ｓｓ　ＤＮＡに対してヌクレオチド鎖
切断作用なし。

ｆ、この酵素の試験バッチはＭ　１３８ｓ　ＤＮＡに対
してヌクレオチド鎖切断作用を示した。しかし、この酵
素を精製すると切断作用は消失する。

ｇ、　　ｐｙ−ｒまたはＣ；Ｐｒｂ＝ＡまたはＧ０切断
位置についてはロバーツの上記文献参照。

ここで第１図を参照すると、そこにはＦｏｋ）エンドヌ
クレアーゼに応用された本発明の原理の概要が示されて
いる。普通のｄｓＤＮＡ分子上のＦ　ｏ　ｋ　Ｉ認識部
位：　ＧＧＡＴＧ、ＣＣＴＡＣおよびその位置からずれ
た切断部位の関係を第１α図に示す。上記配置をまねた
オリゴデオキシヌクレオチドアダプター（第１ｂ図参照
）は、Ｆｏｋ　Ｉ認識配列（下線部分）をもつヘアピン
ｄ８　ドメインぢよび相補標的ＤＮＡ鎖と対合後に切断
が生じる８８ドメインから成る。こうして、アダフリー
のｄ８ドメインはクラス■酵素の特異性を与える一定不
変部分であり、一方８Ｓ　ドメインはいろいろに変える
ことができ、相補標的ＤＮＡ鎖の所定の位置で切断が起
こるように本発明に従って構築しつる。

第１ｂ図に示したオリゴデオキシヌクンオチドはクラス
ＨＦｏｋＩ酵素とＭ１３ファージ由来の８８標的ＤＮＡ
のためのアダプターの例として役立つであろう。３４−
ｍｅｒのヘアピンｄ８　ドメインはＦｏｋＩのための５
’−ＧＧＡＴＧ認識部位を含み、その８８　ドメイン３
’−ＣＣＴＡＣは標的Ｍ１３ＤＮＡ甲のＴとＣの間で切
断が起こるように構築された。アダプターとＭ１３ＤＮ
Ａとの複合体（第１ｃ図参照）は、Ｆｏｋｌ認識部位と
ｄ８切断部位の両方を含むｄ８モジュール（第１α図参
照）によく似ている（表■および第１ｃ図参照）。アダ
プターの８８　ドメインの塩基配列に依存して、酵素は
標的ＤＮＡの所定位置で切断するであろう。

同時に、アタープターの３′末端（第１ｂ、０図参照）
は標的５ｓＤＮＡに相補的ｆｚＤＮＡ鎖の合成用プライ
マーとして役立ち、その相補ＤＮＡ鎖は４種類すべての
ｄＮＴＰを使用する１段階法で、あるいは３種類のｄＮ
ＴＰを使用する制限合成（Ｆｏｋ　Ｉ消化前にアダプタ
ーの３′末端を固定するためであるが、ＦｏｋＩのｄ８
認識部位を与えるほど伸長しない）とそれに続りＦｏｋ
Ｉ切断後の全相補鎖の合成から成る２段階法で合成され
る。

第１図は最適のアダプター構築を示すものではない。最
適化要件には（１１Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　認識部位の左
側８よび右側への最も有効なヘアピンの長さの決定；（
ｆｉ＋　　切断すべき５ｓＤＮＡに相補的でありかつ／
またプライマー機能を与える８８　ドメインの長さの変
更；　Ｈｉｌｌ　　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　および切断部
位に対するｓｓ　Ｍｌ３　ＤＮＡ分枝鎖（第１ｃ図参照
）の位置の修飾ｚ　（ｔＶ）　　５’　ｓｓ　ドメイン
をもつアダプターと３′８８ドメインをもつアタープタ
ーとの比較（第２図参照）；（ｖｌ　　アダプターの８
８　ドメインに２ける広義のヌクレオチド（イノシン酸
）またはりボヌクレオチドの使用可能性：および（ｖｌ
）ＵＶ光線照射時に共有結合した（しかし活性な）アダ
プター−酵素複合体を形成させるためのヘアピン先端へ
の反応性デオキシヌクレオチド（例えば５−ヨードデオ
キシウリジンヌクレオチド）の挿入：が含まれる。アダ
プター−酵素複合体のその他の形成方法も使用できるだ
ろう。アダプター構築の最適化はまた制限エンドヌクレ
アーゼのヌクレオチド鎖切断作用の機構をよりよく理解
するのに役立つ。

それぞれの所定切断部位のための特定アダプターを構築
することが必要であるが、いろいろに変えることのでき
る８８　ドメイン（５〜１５ヌクレオチド）のみを特別
に作らねばならない。その後、それは（１１ヘアピンと
８８　ドメインの隣接配列に相補的であるように構築さ
れた１組のオリゴデオキシヌクレオチドをスプライシン
グ支持体として使用して、一定不変のｄ８ヘアピンドメ
インのステム（ｓｔｅｍ）に連結されるか、または（１
１）初めに保護基をもつ一定のヘアピンドメイン供給物
を合成し、第２合成段階で可変の８８　ドメインを付加
することにより製造される。この種の２段階有機合成は
、ヌクレオチドカップリングが３′→５′の方向である
ので、５′８８ドメイン（第２α図参照）を含むアダプ
ターに対して可能である。

本発明に従って多くの配列のためのアダプター合成物が
作られねばならないが、一般によく見られる配列である
にもかかわらず現在酵素を利用できない多くの配列のた
めのアダプターが製造されるだろう。

第１図に示したＭ１３　　Ｊｌｌｌ　ＤＮＡによって例
示されるような８８標的ベクターＤＮＡを使用すること
の主な利点の１つは、それが大部分のクラス■Ｓ酵素の
ための認識部位を提供しないということである（クラス
■Ｓ酵素はむしろｔｌｓベクターの慣用切断剤である）
。いくつかの市販されているクラス■Ｓ酵素ＣＦｏｋ■
、Ｈｐｈ　Ｌ　Ｍｂｏ　Ｉ、Ｂｂｖ■：二二一・イング
ランド・バイオラプズ）は７１／１３ＤＮＡに対してヌ
クレオチド鎖切断作用をもたない。８８標的ＤＮＡは８
Ｂ　ＤＮＡファージベクターＣＨＩ　３、ｆｄ、ｆｌ）
！、たはファージの重感染の際にｄ８プラスミドをパッ
ケージングされたｍ５ＤＮＡに変換するファージの複製
起点（Ｏｒｉ）を有するｄ８プラスミドを含めて、多種
多様なりＮＡ源から得ることができるだろう。

他の基質は適切に作られた８ＢギヤツプをもつｄｓＤＮ
Ａであり得るが、この場合好ましくはｄ８切断部位が存
在しないか、あるいは（ｌｌ　　ｄｓＤＮＡのメチル化
または他の修飾、もしくは（１１）アダプターおよび可
能な共有結合による酵素の飽和により不活性化すべきで
ある。Ｆｏｋ■部位の特異的メチル化のために、Ｆｏｋ
）メチラーゼが利用されるにューイングランド・バイオ
ラプズ）。

４−ヌクレオチド接着末端を作るクラス■Ｓ酵素の場合
、各切断配列は唯−無二であるので、切断プラスミドの
再連結はもとの配置を回復するであろう。しかしながら
、８８ギヤツプ中の切断は未切断アダプターを除くなら
ば開いたままであるだろう。アダプター媒介ＦｏｋＩ切
断の目的が特定末端をもつ小さいフラグメントの作製で
あるならば、ｄｓＤＮＡ中の追加のＦｏｋｌ切断はまっ
たく重要でなく、むしろ有利でさえあるだろう。

（３）二本鎖ＤＮＡ ｄｓＤＮＡ基質の使用は、先に述べた諸問題に加えて、
アダプターの８８　ドメインをｄ８標的配列に連結する
ための特殊な方法を必要とする。これはスーパーコイル
プラスミドＤＮＡのアルカリ変性、その後の速やかな中
和によって得られる可逆的に変性された標的ＤＮＡを使
用するときに可能である。このような方法はプライマー
オリゴヌクレオチドとアニーリングすることが知られて
いる変性分子をもたらす〔チェ７（Ｃｈｅｎ）１６よび
シーバーブ（ＳｇｅｂｓｒＱ）、ＤＮＡ４　：　１６５
−１７０．１９８５を参照〕。単一アダブタ−の使用は
８８ニツクを生じさせ、一方相対するＤＮＡ鎖に相補的
であるわずかに重複したまたは隣接した８８　　ドメイ
ンをもつ２つのアダプターは移動された切断をもたらす
であろう。また、これは触媒（例えばＲｅｃＡ様タンパ
ク質）や温和な変性条件を使用するか、アダプターの８
８　ドメイン中にリボヌクレオチドを使用することによ
り達成されるかもしれない。また有利には、第１図また
は第２ｂ図に示すアダプターの場合に、そのアダプター
の３’−〇Ｈ末端をプライマーとして使用して上記のよ
うに相補鎖を合成することによりｄｓＤＮＡが得られる
。

本発明は綿密に考案された合成アダプター分子とクラス
■Ｓまたはクラス■制限エンドヌクレアーゼを組み合わ
せることによって、新規な切断特異性の構築を可能にす
る。本発明に従って無数の新しい酵素特異性（′新しい
制限酵素″）を考案することは、主にオリゴヌクレオチ
ド合成装置のｒ２ｎ） 合成能力によって制限される。

本発明は主としてクラス■Ｓ制限エンドヌクレアーゼに
向けられるが、本明細書中の教示に従って、一連の非特
異的塩基対によって分離された逆方向反復配列を認識す
る酵素のためのアダプターも構築することが可能である
。例えば、下記アダプター： はＢｓｔＸＩ酵素（ケスシーらの上記文献参照）を、ア
ダプターの中央のＮＮＮＮＮＮ　ｇａミドメイン相補的
な８８配列を捜し求めるエンドヌクレアーゼに変換する
だろう。多くの他の種類のアダプターも構築されるだろ
う。

次の実施例は、目下のところ実施するのが好適であるの
で、本発明の実施態様をさらに例示するために与えられ
る。これらの実施例は例示するためのものであって、本
発明は添付の特許請求の範囲に記載されるものを除いて
は何ら制限を受けるものでないと理解すべきである。

実施例Ｉ 実施例■では標的ＤＮＡ、標的配列、制限酵素を選択す
るために考案された方法、並びに切断過程を調べる方法
について説明する。

（ａ）　標的ＤＮＡの選択二本実施例のために、ファー
ジＭ１３誘導体が５ｓＤＮＡ源として選ばれた。その理
由は（１）その全ヌクレオチド配列が知られている〔フ
ォノ・ベーゼンベーク（ＶαｎＷｇｇｇｆＬｂｇｇ＆）
らの（、ｓｇ　１１：Ｉ２９〜１４８（１９８０）；ヤ
ニシーぺｏ　ｙ　（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｇｒｒｏｎ）らの
Ｇｅ％ｇ　３３：１０３〜１１９（１９８５）を参照〕
：（ｆｉｌ　　Ｍ　１３　ｍｐファージは便利なりロー
ニングベクターである：および（ｍｌ　　ｄ　８複製型
（ＲＦ）とｍ５ＤＮＡの両方を増殖させるのが簡単であ
る：ためである。Ｍ１３誘導体の甲でとりわけＭ１３ｍ
ｐ７ベクターが選ばれたが、それはその８８ＤＮＡが酵
素Ｅｃｏ　ＲＩ、　ＢａｍＨｉ　、　ｌ１ｉｎｄ　Ｉｌ
ｌ、ＡｃｃＩおよびｇａｌｌによって切断されるように
構築された小さいヘアピン構造を含むからである〔メッ
シング（Ｍｅｓｓｔ％ｇ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌ　。

１０１：２０〜７８（１９８３）を参照〕。これらの切
断は第３図に示すようなＦｏＪｃｌ−アダプター複合体
による８８切断の確認的マツピングのための参照箇所を
提供した。

第３図の実線は５ｓＤＮＡを表す。ヘアピン”α−の配
列は次の通りである。

■位置の２箇所の切断は第２図に示す通りである。■位
置の切断箇所はヌクレオチド６９３８の近くに位置する
ことがわかった。完全Ｍ１３ｍｐ７の長さは７２３８ヌ
クレオチドであり、フラグメントの２′ＪＦ３よその長
さはα、３２；ｂ、６７０；ｃ、１６４０；　ｄ、４８
９０；　ｂｌｃ、２３００；α十り＋ｄ、５６００ヌク
レオチドである。第３図は一定の比例に応じて描かれて
いない。

（ｂｌ　　標的配列の選択：ＤＥ：ｆ；ＣＦ；　　ＶＡ
Ｘ７８０’０でライスコンシン大学遺伝子コンピュータ
グループのコンピュータプログラム〔デバロー（Ｄｅｔ
Ｉｅｒｅｒｂｚ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｇｓ、１２　：　３８７−３７５（１９８４）を参照〕
を使って、次の基準を満足するＭｌ　３　ｍｐ７　　ｓ
ｓ　　Ｉ）ＮＡ中の１４−ヌクレオチド配列を見つけた
：すなわち（１）それは唯−無二である；Ｕ＋＋　　フ
ァージＤＮＡ中に１個、２個または３個の誤対合（ｍｊ
ａｍαｔ　ｃｈ）をもつ類似の塩基配列が存在しない：
曲）　ファージ中にＯ−２の誤対合をもつ相補的塩基配
列が存在しない；およびθＶ）所定の配列における切断
および参照ＥｃｏＲ７部位（第３図の切断■およびＥｃ
ｏＥＩを参照）での切断がゲルによる識別および測足の
しやすい２つのフラグメント（ＥｃｏＲＩにより切断さ
れた３２−ヌクレオチドのヘアピンフラグメントは無視
する）をもたらす。唯一の１４−ヌクレオチド配列ｓ’
　−ＴＧＣＴＡＣＣＣＴＣＧＴＴＣ−３’　　（ヌクレ
オチド１３３９〜１３５２）が選ばれ、この配列は３個
だけの点在する４−ヌクレオチド誤対合（ヌクレオチド
１７４９．２９０８８よび５５９９から出発）をもつＭ
１３ｍｐ７　　ｓｓ　ＤＮＡ　　中に見られる０−３ヌ
クレオチド誤射合を含まず、且つ（１）ＡＩ アダプターの対合を妨害しつる０−２ヌクレオチド−誤
射合−相補的塙基配列を含まない。唯一の３−ヌクレオ
チド誤対金相補的塩基配列はヌクレオチド５４４３から
出発する。

（ｃｌ　　制限酵素の選択：市販されているすべてのク
ラス■Ｓ酵素の試験により、それらのうちの４種（Ｆｏ
ｋ　Ｉ　、　Ｈｐｈ　Ｉ、ＭｂＯｍおよびＢｂｖＩ）は
８８７１／１３ｍｐ７に対してヌクレオチド鎖切断作用
を示さないことが判明した（第４図参照）。第４図は複
製型（ＲＦ）ｄ８（レーンｌ、３．５．７．９．１１．
１３）および８８　（レーン２．４．６．８．１０．１
２．１４　）　Ｍｌ　３ｍｐ　７　　ＤＮＡのＦｏｋｌ
（８ｕ：レーン１．２）、Ｈｐｈ　Ｉ　（８ｓ　；レー
ン３．４）、Ｈｐａ　Ｉ　（２ｗ　；レーン５．６　）
　、　Ｍｂ。

１１（２０ｕ；レーン７．８）、Ｍｎｌ　ｌ　（２ｕ　
；レーン９．１０）、５ｆａＮ　■（２％　；レーン１
１．１２）およびＢｂｖ　Ｉ　（２ｕ　；レーン１３．
１４）による切断を示す。酵素はすべてニュー・イング
ランド・バイオラプズから贈られたものであり、消化は
ｄｓＤＮＡの場合製造者によって示唆された条件下３７
℃で３時間、表示酵素単位数（％：上記かっこ内を参照
）／２０μを消化混合物／２μ２ＤＮＡを用いて実施し
た。ｓｓ　Ｍ１３ｍｐ　　７ＤＮＡの試料調製条件およ
び電気泳動は第６図に関して以下で説明するものと同じ
であった。ｄｓＤＮＡの消化についての試料調製条件は
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉ８）らの文献（１９８２）
に記載の方法に従った。ＤＮＡはエチジウムプロミドで
染色し、ＵＶ透過法を用いて写真を撮った。Ｆｏｋ　１
酵素に関しては以前の経験があり、壕だＦｏｋｉメチラ
ーゼが市販されていて予め存在する制限部位でのＦｏｋ
　■消化からｄｓＤＮＡを保護しつるので、第１相とし
てＦｏｋ　ｌが選ばれた。

第４図に示すように、クラス■Ｓ酵素１１ｇａＩおよび
Ｍｎ１ＩはＭ１３ｔｎｐ７　５ｓＤＮＡに対して複数の
切断を示すが、５ｆａＮ■は５ｓＤＮＡに対して若干の
非特異的切断作用を示すと思われる。７種の酵素はすべ
て予測されたｄ８切断を示し、Ｍｂｏｌを除いてはＤａ
ｍメチル化が２，３の切断を妨害する（ケスシーらの上
記文献を参照）。

（ｄ＋　　アダプターの構築：下記のＦｏｋＴ認識配列
ＧＡＴＧ ＣＴＡＣ は非対称であるので、第２図に示すように２種の異なる
オリゴデオキシヌクレオチドアダプター左”　（３２ヌ
クレオチド）および”右”（３４ヌクレオチド）が構築
された。それらはＭ　１３　ｍｐ７標的５ｓＤＮＡを２
つの異なる位置（８ヌクレオチド離れた位置）で切断す
ることが期待された（第２′Ｊ６よび３図参照）。この
アダプターは２つのドメイン：すなわち（ｉｌ　　Ｆｏ
ｋＩ認Ｒｄｓ部位を含む一足のｄｔｔ　　（ヘアピン）
ドメイン、および（１１）上記セクションｂに記載され
た標的配列に相補的である可変の８８　ドメインから成
る（第１図参照）。

左アダプターはその３′末端にヘアピンｄ８　ドメイン
をもち、２段階合成：すなわち（１）　　初めに保護さ
れた形の一足ｄ８　　ドメインを３′→５′有機合成に
より大量に製造する段階、および（１１）続いて所定の
標的配列に相補的な数種の予め構築された８８ドメイン
を付加する段階により製造される。右アダブターはその
５′末端にヘアピンｄ８　ドメインをもち、Ｍ　１３　
ｔｈｐ　７　　ＤＮＡの全相補鎖の合成のためにプライ
マーとしてその３′末端を利、用することができる。

（ｍｌ　　アダプターの高次構造：第５図に示すように
、アダプターはヘアピンモノマー（第２図参照）として
存在するか、あるいは数種の制限酵素ＣＨｇ１ＡＩ２３
よびＢｓｐ１２８６を含む）に感受性の２０塩基対パリ
ンドローム構造を中央にもつダイマー、例えば下記式の
右アダプターに対応するダイマー：を形成しつる。電気
泳動を非変性条件下で実施した場合（第５図、Ａ−レー
ン１ｓよびＢ−レーン１を参照）、ダイマーが観察され
た。アルカリ性の試料混合物を使用するか、または負荷
緩衝液中７０℃で処理すると、ダイマーのバンドは消失
した（第５Ｂ図、それぞれレーン３Ｅよびレーｍ参照）
。Ｆｏｋ（緩衝液中７０℃での３４−ｍａｒ変性は一部
がもとに戻った（第５Ａ図、レーン３を（２日） 参照）。モノマーおよびダイマーはともにアダプターと
して活性であるだろう。

（，４Ｆｏｋ１酵素に対するアダプターの感受性：Ｆｏ
ｋ（酵素はＭ１３標的配列とアダプターとのアニーリン
グによって形成された二本鎖のみを切断することが望ま
れるので、その酵素が相補ＤＮＡ鎖の不在下でアダプタ
ーの８８　ドメインを切断しないことを証明する必要が
あった。第５図はアダプターの高次構造（コンホメーシ
ョン）とＦｏｋｌ切断に対するその不感受性を示す。

第５Ａ図において、すべてのレーンはＦＯｋＴ緩衝液中
に懸濁し且つ７０℃で５分間加熱した（レーン３．４）
、あるいは熱処理しなかった（レーン１．２）３４−ヌ
クレオチドアダプター１１１を含有スる。レーン２８よ
び４のアダプターは第６図に関して説明するようにＦｏ
ｋｌで処理した。電気泳動はピーコック（ｐｅａｃｏｃ
ｋ）緩衝液（マニアチスらの文献（１９８２）を参照）
中２０％ＦＡゲル上にて２００Ｖで５時間実施した。各
ウェルにはアダプター溶液２０μｔおよびブロモフェノ
ールブルーを含む負荷緩衝液（マニアチスらの文献（１
９８２）を参照）５μｔを加えた。

第５Ｂ図において、すべてのレーンは負荷緩衝１（１０
％グリセロール、７％ショ糖、２．４％フイコール：ブ
ロモフェノールブルー不含）２０μｔ（レーン１および
２）、またけアルカリ性負荷緩衝液２０μｔ（レーン３
）のいずれかに懸濁した３２−ヌクレオチドアダプター
２μ７を含有する。

レーン２の試料は７０℃で５分間加熱した。試料２０μ
ｔはパネルＡのようにして電気泳動にかけた。

バンドをエチジウムプロミドで染色して第４図のように
写真を撮った。（、ｚ＋　　ダイマー、（ｂ）モノマー
、　＋６１　　ブロモフェノールブルー指示薬。アダプ
ター単独ではＦｏｋ）によって切断されないので、これ
は第５Ａ図（レーン２ｚよび４）に示すような場合にな
ることがわかった。上記のセクション（ｄ＋で述べたよ
うに、アダプター分子のダイマー形成が観察された。

［ｇｌ　　ｓ　ｓ　Ｍ　１３　ｍ　ｐ　７　ＤＮＡの切
断についての検定：ビーン（Ｂ１４１％）およびチャン
ポー（Ｃｈ　ａｍ、ｐｏｕ　ｒ、）、Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｒＬ　Ｅｎｔｙｔｎｏｌ＋　　１　０　１　　：　
　９０〜９８（１９８３）に記載されるように、アガロ
ースゲル（１，４％）電気泳動を用いて、８８環状ＤＮ
Ａの切断について調べた。単一切断は環状ＤＮＡを線状
ＤＮＡ（閉じた環状ＤＮＡよりも速やかに泳動する）に
変える（第６図：ＣＦからＬＦへの変換）。Ｍ　１３　
ｍ　ｐ　７　ＤＮＡ中の逆方向反復配列によって形成さ
れたヘアピンにＥｃｏＲ１部位が存在するので、Ｅｃｏ
ＲＩによる消化は対照として役立った（第３図参照）。

実施例■ 実施例■では酵素−アダプター複合体を使用することに
よる所定の位置での５ｓＤＮＡの切断について説明する
。

（ａ］　　左（３２−ｍｅｒ）′ｊ６よび右（３４−ｍ
ｅｒ）アダプターの存在下でのＦｏｋＩ制限酵素による
Ｍ１３情ｐ７８８環状ＤＮＡの消化：第６図はトリス−
ホウ酸（ピーコック）緩衝液中水平の１．４％アガロー
スゲル上にて１２０Ｖで３時間実施した（一般にはビー
ンおよびチャンポーの上記文献の方法に従う）線状Ｓよ
び環状のＭ　１３　ｍ　ｐ　７　　ｓ　５ＤＮＡの電気
泳動分離を示す。Ｍ１３ｍ１７　　ｓｇ環状ＤＮＡはマ
ニアチスらの文献（１９８２）に記載されるようにして
調製した。各レーンは（１）Ｆｏｋ７緩衝液（２０ｍＷ
　ＫＣＬ、　１０　ｍｕ　　）リス−ＨＣ１，ｐＨ７，
５，１０慨Ｍｕグｃｔ２、ｏ、５情ＭＤＴＴ）２０μを
中に懸濁した、（１１）消化または他の方法で処理した
、（ｔｉｌ＋　　０．３　Ｍ酢酸Ｎαの存在下に４倍容
量の９５％エタノールを用いて一７０°Ｃで１０分間沈
殿させ、微量遠心機で１０分間遠心した、（ｉｖ）　７
０％エタノールで洗浄して真壁下に乾燥し、アルカリ性
試料混合物（３０ｍｕ　ＮａＯＨ１２ｍＭ　Ｅｌ）ＴＡ
、　　７％フィコール、０．１％ＳＤＳｇよび０．０１
％ブロモフェノールブルー）２０μを中に懸濁した、上
記ＤＮＡ　　２μ２を含有する。

ＤＮＡのバンドはエチジウムプロミドで染色した。

レーン１（第６図）は未処理Ｍ１３情ｐ７ＤＮＡ〔９０
％以上の環状体（ＣＦ）は上のバンド、そして１０％未
満の線状体（ＬＦ）は下のバンド〕を含む。レーン２は
Ｆｏｋ■緩衝液（上記参照）中１２ｒｒＺつ） 単位のＦｏｋ　Ｉ／　２０μｔを用いて３７℃で２時間
処理した同じＤＮＡを含む。レーン３および４はそれぞ
れ１５倍モル過剰の３２−　ｍｅｒおよび３４−ｍｅｒ
アダプターとハイブリダイズした同じＤＮＡを含む。ハ
イブリダイゼーションはＦｏｋｌ緩衝液中７０℃で５分
、次に３７℃で１時間加熱することにより行った。レー
ン１〜４にはＤＮＡ切断が見られず、これらは陰性対照
を表す。レーン５および６はレーン３および４と同じ処
理を施した後にレーア２のようにＦｏｋＩで消化した。

ここではｊｌｆｌ　３　　ｍｓ　ＤＮＡの特異的切断が
見られる。レーン７はＦｏｋ　Ｉ緩衝液＋トリス−ＨＣ
Ｌ（ｐＨ７，５，１００ｍＷとする）中でのＥｃｏＲＩ
消化（１６舊／２０μｍ、　　１時間、２７°Ｃ）を表
し、これは陽性対照である。レーン８および９はレーン
５および６と同じ処理を施した後に、Ｆｏｋｌアダプタ
ー切断部位を位置づけさせるレーン７のようなＥｃ。

Ｒ７消化を１時間行う。α＋ｂ＋ｄ′ＢよびＣは第６図
のレーン５および６のバンド、ならびに第３図の対応す
るフラグメントを意味する。分子量マーカーについては
第７図を参照されたい。

Ｉａ”ｌ　　第６図（レーン１〜４）に示すように、Ｆ
ｏｋＴ単独あるいはアダプター単独のどちらも環状Ｍ１
３ｍｐ７　　ＤＮＡを切断しない。しかしながら、初め
に左または右アダプターのいずれかをＢｓＤＮＡにアニ
ーリングさせ、続いてＦｏｋｌを添加すると環状ＤＮＡ
は９０％以上の効率で線状化された。両方のアダプター
ともヌクレオチド鎖切断反応に関与するが、右（３４−
ヌクレオチド）アダプターの方が一層効率がよいと思わ
れる。

（６１ＦｏｋＩ−アダプターの組合せによる第２の切断
：第６図のレーン５．６−Ｊ６よび第７図のレーン２〜
６の綿密な調査は、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　７の全線状５ｓ
ＤＮＡを表す７２３８−ヌクレオチドバンドの他に２本
のバンドを示す。この２本の第２バンドの出現は反応条
件に依存すると思われる。

（ｃｌ　　Ｊ／　１３　ｑｎ　ｐ　７　ＤＮＡ　の切断
マツピ／グ：第１および第２切断の位置を決定するため
に、Ｍ１３ｆｎｐ７　５ｓＤＮＡをＦｏｋｊ−アダプタ
ー複合体と参照ＥｃｏＲ１酵素（第３図に示すようにＭ
１３ｍｐ７ヘアピン内を切断する）の両方で切断した。

レーン８および９（第６図）に示す結果は第３図に示す
Ｆｏｋ）切断位置と一致すると思われる。部位Ｉでの切
断は１４−ヌクレオチド標的配列（ヌクレオチド６９３
８〜６９５１　；第２図参照）内に位置し、そして部位
■での切断は次のヌクレオチド配列および点： によって示されるアダプターとＪ／１３　　ｓｓ　ＤＮ
Ａとの間の９−ヌクレオチドの完全な一致で起こると思
われる。

上向きの矢印は３４−ヌクレオチドアダプターによって
支配される５ｓＤＮＡの切断を示す。左３２−ヌクレオ
チドアダプターによって支配される切断は９−ヌクレオ
チド相同の右端で起こり（第２図参照）、低収率の第２
切断と一致する（第６図のレーン５および６を比較され
たい）。

（最後の数字は対応するヌクレオチドに相当する。）実
施例■では切断反応のいろいろな条件を例示する。

（ｃＬ）　　予め形成された酵素−アダプター複合体に
よる切断：実施例■に記載の方法では、Ｆｏｋ■添加前
にアダプターがＭ１３ｍｐ７　　ＤＮＡにアニーリング
された。ここではまず初めに酵編をアダプターで飽和し
、その後標的Ｍ１３ｍｐ７ｓｓＤＮＡと反応させた。

従って、アダプターが過剰に存在する場合は、遊離アダ
プター分子がＭ１３ｓｇ標的１）ＨＡと結合して酵素−
アダプター複合体による切断を妨げるだろう。一方、酵
素が過剰である場合は、遊離酵素が８８標的ＤＮＡを認
識しないのでこのような競合反応は起こらないだろう。

それ故に、酵素−アダプター複合体を予め形成するため
に、次第に増加する濃度のＦｏｋｌと一定量のアダプタ
ーが次のように使用された：第７Ａ図のレーンエは未処
理Ｍ１３環状８８ＤＮＡ対照（第６図のレーン１と同じ
）に相当する。レーン２〜４の場合は、可変量のＦｏｋ
■（それぞれ１２．２４および３６単位）と３４−　ｍ
ｅデ（第５図の３４−ｍａｒと同量ニアｏ℃で５分間変
性）を混合し、Ｆｏｋ）緩衝液２ｏｐｔ中３７℃で１０
分間インキュベートした。それぞれの酵素−アダプター
調製物にＭ　１３　ｍ　ｐ　７環状５ｓＤＮＡ２μ２を
加え、全容量３０μｔにて３７℃で１時間消化した。他
の手順は第６図のところで説明した通りであった。

（ｂ）　　緩衝液、ｘｃｔ　ＥよびＭ２＋十濃度の影響
：第７Ｂ図のレーン１および２は第６図のレーン１およ
び６に相当する。レーン３〜６はレーン２の実験の次の
変法に相当し：すなわちレーン３′Ｊ６よび４では、ハ
イブリダイゼーション３よび消化用のＦｏｋ■緩衝液を
それぞれ２倍と４倍に希釈した。

レーン５および６では、すべてのＫＣｌｊｉ　Ｆ　ｏ　
ｋ　■緩衝液から除いた。さらにレーン６ではＭ１＋十
濃度を４倍に減らした（Ｍｙｃｔ２を１０　ｍＭから２
．５ｍｕへ）。

（ｃｌ　　ＤＮＡ−アダプターのハイブリダイゼーショ
ン時間の影響：第７Ｃ図のレーン１および２はパネルＢ
のレーン１および２に相当する。レーン３〜５はレーン
２に相当するが、Ｍｌ　３　ｓ　ｓ　ＤＮＡ−アダプタ
ー（３４−ｍｓ＋ｒ）のノ〜イブリダイゼーション時間
をそれぞれ３０分、１５分および５分に短縮した。レー
ン６（８８鎖長の標準）はアルカリ性試料混合物中で変
性および電気泳動したプラスミドｐＲＨＰ２３３の５ｓ
ＤＮＡフラグメントを表す。フラグメントの鎖長は（上
から）それぞれ３６３６．３０９７．２４５９．２４４
３ヌクレオチドであり、その後１７００ｇよび１１５９
ヌクレオチドの２つの二重鎖（相補鎖）が続く。

パネルＡ、ＢおよびＣは異なる日に行った別々の実験を
表す。

第７Ａ図に示すように、この種の複合体はＭ１３ｓｓＤ
ＮＡを切断し、先に予測したように切断はＦｏｋＩ／ア
ダプターの比が増加するにつれて効率がよくなる（レー
ン２〜４参照）。また、予め形成された酵素−アダプタ
ー複合体の使用は、第２切断（第３図の切断■）の比率
にほとんど影響を及ぼさないと思われる。

実施例■および■で論じた反応はすべて２０　ｍＷＫＣ
ｌ、１０ｍＭ　　）リス−ＨＣ１，１０ｍＭ　ＭｇＣｌ
２および０．５　ｍｕ　Ｄ　Ｔ　Ｔから成る緩衝液中で
実施した。第２切断の比率が低下するかどうかを調べる
ために、より緊縮なアニーリング条件を徐々に低下する
塩濃度において捜し求めた（しかし、切断効率は実質的
に影響を受け々いようにする）。第７Ｂ図（レーン３お
よび４）に示すように、緩衝液の２倍または４倍希釈は
まだ反応を進行させるが、第１切断対第２切断の比はわ
ずかに増加するように思われる。ＫＣｌ分を全部排除し
ても選択的および効果的切断が生じる（レーン５参照）
。最も選択的な切断はＫＣｌの不在下で２．５　ｍＷ　
ＭｇＣｌ２を用いたときに得られた（レーン６参照）。

アダプターと標的Ｍｌ３想ｐ　７　　ｓ　ｓ　ＤＮＡは
、Ｆｏｋｌ酵素を加える前に、３７℃において１時間の
標的アニーリング時間でアニーリングさせた。

第７Ｃ図に示すように、アニーリング時間は消化パター
ンをほとんど変化させずに５分に短縮することができた
。

実施例■ 実施例■では酵素−アダプター複合体を用いることによ
る二本鎖ＤＮＡフラグメントの製造について説明する。

５′二本鎖ヘアピンドメインおよび３′８８ドメインか
ら成るアダブクーＤＮＡＣ第１図および第２ｂ図参照）
は、相補的ＤＮＡ鎖を合成するためのプライマーとして
使用した。このアダプターを５５Ｍ１３ｒｎｐ７鋳型と
アニーリングさせ、その際アダプターは部位■８よび■
（第３図参照）に結合した。Ｐｏ１ｌＫ（大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩのフレノウ断片）および４種類のｄＮＴ
　Ｐを加えて、ＤＮＡ合成をＦｏｋ■緩衝液中２０℃で
０．５〜２時間実施した。ＦｏｋＩ酵素は相補的ＤＮＡ
合成の開始後５分して、あるいは反応終了時に加えた。

両方の場合に２本の新しいＤＮＡフラグメントが製造さ
れ、そして部位Ｉ　（１３４１）　！６よび部位Ｉ１．
　（６９３８）で開始され且つ切断された（第３図およ
び第８図参照）。新しいフラグメントの鎖長は、それら
がまたヌクレオチド２２５および６３３５の通常のＦｏ
ｋ■部位で切断されるので、１１１６　ｂｐおよび６０
３　ｂｐであった（第８図参照）。二本鎖ＲＦ型Ｍ　１
３　ｒｎ　ｐ　７　ＤＮＡを消化すると、鎖長が３３３
５．２７７５．９１０および２１８　ｂｐである４つの
７ラグメントが生じた（第８図）。従って、１１１６　
ｈｐ　′Ｐ３よび６０３ｂｐフラグメントは新規であり
、アダプター　−Ｆｏｋ　Ｉ複合体の新しい酵素活性に
よってもたらされた。１１１６　ｂｐフラグメアンは部
位Ｉ（ヌクレオチド１３４１）のアダプターとＭ１３ｍ
ｐ７　　ｇｓＤＮＡとの間に完全な対合が存在するので
高収率で得られた。６０３ｂｐフラグメントの収率はア
ダプターの１４ヌクレオチドのうち９個だけが部位■で
対合するので低かった。しかし、たとえアダプターの３
′末端ヌクレオチドが対合していなくても、Ｐｏ１ｌＫ
は９ｂｐのみで対合したこのフリイマーを使用すること
ができた。得られた新規なりＮＡフラグメン）　（Ｆｏ
ｒ　ＩＫ反応のために平滑末端をもつ）はＭ　１３　ｍ
　ｐ　７ベクター内に平滑末端クローニングし、そして
それらの末端の塩基配列を決定した。一般に、その塩基
配列は新規末端の予測された配列と一致した。予め定め
られた末端をもつ二本鎖ＤＮＡフラグメントを製造する
この方法は簡単でしかも信頼できると思われる。フラグ
メントの第２末端はＦｏｋ１部位（第８図参照）にある
か、あるいは選択された別の制限酵素によって生成され
た他の末端であるだろう。

【図面の簡単な説明】

第１図はＭｌ３　　ｓｓ　ＤＮＡを予め定められた位置
で切断するようにＦｏｋＩクラスＨｓ酵累に指示するオ
リゴデオキシヌクレオチドアダプターの考案を示す模式
図である。 第２図はＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼと共に使用す
る２種類のオリゴデオキシヌクレオチドアダプターを示
す図である。 第３図はＭ１３ｍｐ７　５ｓＤＮＡの模式図である。 第４図はｄｓＪ３よびｓｓＭ１３ｍｐ７　　ＤＮＡのＦ
ｏｋ■、Ｈｐｈ　Ｉ　％ＨＰ　ａ　ｌ、Ｍｂｏｆ（、Ｍ
ｎ１）、５ｆａＮ　ＩおよびＢｂυ■による消化物のゲ
ル電気泳動写真である。 第５図はオリゴデオキシヌクレオチドアダプターの高次
構造とＦｏｋ■切断に対するその不感受性を示すゲル電
気泳動写真である。 第６図は第２図に示す３２−　ｍｅｒおよび３４−ｍｅ
ｒの存在下でのＭ　１３　ｍ　ｐ　７のＦｏｋｌ消化の
ゲル電気泳動写真である。 第７図は予め形成されたＦｏｋ）酵素−アダプター複合
体を使用するＭ　１３　ｍ　ｐ　７の消化の様子並びに
塩濃度君よびアダプターと標的ＤＮＡの間のアニーリン
グ条件の影響を示すゲル電気泳動写真である。 第８図はＭｌ　３ｔｎｐ　７　　ｄａ　ＤＮＡ　の模式
図である。 （外５名） 図面の浄書（内容に変更なし） へ７ｖ＞ｄｓ　Ｖ’ｓイア　　　　　　　５５１−”メ
インＦＩＧ　　＋ Ｃカ＝７ダ１７°ターＤ １３４９１５０左 ＦＩＧ、３ Ｆｏｋｌ　　Ｈｐｈｌ　Ｈｇａｌ　Ｍｂｏｌｌ　Ｍｎ１
ｌ　　５ｆａＮＩ　Ｂｂｖｌｌ　　２　　　：３　　４
　５　　６　　７　　８　９１０１１１２１：３１・Ｆ
ＩＧ、４ ＦＩＧ、５Ａ　　　　　ＦＩＧ、５Ｂ の　　　　・Ω 手続補正書（方式） １、事件の表示 昭和６２年特許願第２５５３８号 ２、発明の名称 普遍的な制限エンドヌクレアーゼ ３、補正をする者 事件との関係　　出願人 住所 氏名　　　ワクロウ・シルバスキー ４、代理人 ５、補正命令の日付　　昭和６２年４月２８日（発送日
）６、補正の対象 （別紙） （１）明細書第４３頁第１行〜第１２行の［および・・
・・・・・・・電気泳動写真で」を 「およびＪ３ｈｖ　ＩＫよる消化物のゲル電気泳動図で
ある。 第５図Ａおよび第５図Ｂはそれぞれ３４−　ｍｅｒおよ
び３２−ｍｅγのオリゴデオキシヌクレオチドアダプタ
ーの高次構造とＦｏｋ　Ｉ切断に対するその不感受性を
示すゲル電気泳動図である。 第６図は第２図に示す７，２−ｍａｒおよび６４−ｍｅ
ｒの存在下でのＭ１３ｍ、ｐ７のＦｏｋ　Ｉ消化のゲル
電気泳動図である。 第７図Ａは予め形成されたＦｏｋｌ酵素−アダプター複
合体を使用するＭｌろｍｐ７の消化の様子を示すゲル電
気泳動図であり、第７図Ｂは上記消化に対する塩濃度の
影響を示すゲル電気泳動図であり、第７図Ｃは上記消化
に対するアダプターと標的ＤＮＡの間のアニーリング条
件の影響を示すゲル電気泳動図で」と補正する。 以　　上

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）（α）オリゴデオキシヌクレオチドアダプター；
   および （ｂ）適切な制限酵素 から成る、予め定められた位置で標的ＤＮＡを切断する
   普遍的な制限エンドヌクレアーゼ。
2. （２）オリゴデオキシヌクレオチドアダプターおよび制
   限酵素は共有結合される、特許請求の範囲第１項記載の
   制限エンドヌクレアーゼ。
3. （３）オリゴデオキシヌクレオチドアダプターは制限酵
   素の認識部位と切断部位との間に存在する関係をまねた
   ものである、特許請求の範囲第１項記載の制限エンドヌ
   クレアーゼ。
4. （４）制限酵素はＢｂｖ I 、ＢｂｖII、Ｂｉｎ I 、Ｆ
   ｏｋ I 、ＨｇａＩ、Ｈｐｈ I 、ＭｂｏII、Ｍｎｌ I
   、ＳｆａＮ I 、ＴａｇIIまたはＴｔｈ１１１IIの群か
   ら選ばれるクラスII酵素である、特許請求の範囲第１項
   記載の制限エンドヌクレアーゼ。
5. （５）制限酵素はＦｏｋ I である特許請求の範囲第４
   項記載の制限エンドヌクレアーゼ。
6. （６）オリゴデオキシヌクレオチドアダプターは制限酵
   素の認識部位に一致する二本鎖ヌクレオチド配列および
   標的ＤＮＡの予め決められた部位に相補的である一本鎖
   ヌクレオチド配列を含む、特許請求の範囲第４項記載の
   制限エンドヌクレアーゼ。
7. （７）制限酵素はＥｃｏＰ１、ＥｃｏＰ１５、Ｈｉｎｅ
   I またはＨｉｎｆIIIの群から選ばれるクラスIII酵素
   である、特許請求の範囲第１項記載の制限エンドヌクレ
   アーゼ。
8. （８）オリゴデオキシヌクレオチドアダプターは制限酵
   素の認識部位に一致する二本鎖ヌクレオチド配列および
   標的ＤＮＡの予め決められた部位に相補的である一本鎖
   ヌクレオチド配列を含む、特許請求の範囲第７項記載の
   制限エンドヌクレアーゼ。
9. （９）標的ＤＮＡと修飾制限エンドヌクレアーゼを接触
   させることから成る、予め定められた位置での標的ＤＮ
   Ａの切断方法。
10. （１０）修飾制限エンドヌクレアーゼは（ａ）オリゴデ
    オキシヌクレオチドアダプター、および（ｂ）適切な制
    限酵素から成る、特許請求の範囲第９項記載の方法。
11. （１１）オリゴデオキシヌクレオチドアダプターおよび
    制限酵素は共有結合される、特許請求の範囲第１０項記
    載の方法。
12. （１２）オリゴデオキシヌクレオチドアダプターは制限
    酵素の認識部位に一致する二本鎖ヌクレオチド配列およ
    び標的ＤＮＡの予め決められた部位に相補的である一本
    鎖ヌクレオチド配列を含む、特許請求の範囲第１０項記
    載の方法。
13. （１３）修飾制限エンドヌクレアーゼと標的ＤＮＡとの
    接触は （ａ）オリゴデオキシヌクレオチドアダプターを標的Ｄ
    ＮＡの予め決められた部位に結合させ；そして （ｂ）その標的ＤＮＡ−アダプター複合体に適切な制限
    酵素を加える； ことから成る特許請求の範囲第１０項記載の方法。
14. （１４）標的ＤＮＡは一本鎖である特許請求の範囲第１
    ３項記載の方法。
15. （１５）適切な制限酵素の添加以前に、一本鎖標的ＤＮ
    Ａに沿つてオリゴデオキシヌクレオチドアダプターの３
    ′−ＯＨ末端を伸長させて、予め定められた切断部位を
    含む二本鎖ＤＮＡを形成させる工程をさらに含む、特許
    請求の範囲第１４項記載の方法。
16. （１６）オリゴデオキシヌクレオチドアダプターは制限
    酵素と複合体を形成し、接触工程がその酵素−アダプタ
    ー複合体を標的ＤＮＡと結合させることから成る、特許
    請求の範囲第１０項記載の方法。
17. （１７）標的ＤＮＡは一本鎖である特許請求の範囲第１
    ６項記載の方法。
18. （１８）一本鎖ＤＮＡに沿つてオリゴデオキシヌクレオ
    チドアダプターの３′−ＯＨ末端を伸長させて予め決め
    られた切断部位を含む二本鎖ＤＮＡを形成させ、次いで
    その二本鎖ＤＮＡを酵素−アダプター複合体の適切な制
    限酵素で切断する工程をさらに含む、特許請求の範囲第
    １７項記載の方法。