JPH03247282A - ポリメラーゼ・チェーン・リアクション用プライマーの作製法およびそれを用いるｄｎａの増幅法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は生体外ポリメラーゼ・チェーン・リアクション
（ＰＣＢ）に用いうる新しいプライマーの作製法および
そのプライマーを利用するＤＮＡの増幅法に関する。

〔従来の技術および 発明が解決しようとする課題〕

分子生物学の進歩の歴史に関して、いくつかの基本技術
の確立が大きく貢献している。例えば、クローニング技
術、塩基配列決定の技術、プロッティング法などがこれ
（こ当たる。近年報告され、応用が開始されたＰＣＲ法
（Ｒ，５ａｉｋｉ　ｅｔ　ａｌ　。

１９８５５ｃｉｅｎｃｅ　２３０：１３５０．に、Ｂ、
Ｍｕｌｌｉｓａｎｄ　Ｆ、　Ａ、　Ｆａｌｏｏｎａ　１
９８７　Ｍｅｔｈｏｃｉｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

１５５：３３５−３５０）も、一つの基本技術として定
着しつつある。本技術の特徴は、化学的に合成された１
組の単鎖ＤＮＡ（プライマー〕に夾まれだＤＮＡを選択
的に試験管内で増幅するところ（こある。また、本技術
は、鋳型ＤＮＡ、ＮＴＰ、プライマーおよび耐熱性ＤＮ
Ａポリメラーゼから構成される反応液を自動化されたブ
ロックヒーター（サーマルサイクラ−）内に保持し、Ｄ
ＮＡのアニーリング、ポリメラーゼによる新規ＤＮＡ鎖
の合成、デアニーリングのサイクルを繰り返させること
ｌこより、ごく微量の鋳型から目的とするＤＮＡ鎖を増
幅することを可能にした。本技術を応用することにより
、既知のＤＮＡ鎖の特異的な領域が簡便に得られるとと
もに染色体遺伝子内に於ける遺伝子の欠損、たとえば筋
ジストロフイー関連遺伝子の欠損等、を容易に検出でき
るようになっｔこ　（Ｊ、　　Ｓ、　　Ｃｈａｍｂｅｒ
ｌａｉｎ　　　　１　９８８　　　Ｎｕｃｌ、　　Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ、１６：１１１４１−１１７５６　）。し
かしながらこれら一連の技術は、塩基配列が全く未知な
遺伝子の解析への応用がきわめて限られたものであった
。

最近、以上の欠点を克服し染色体遺伝子の解析を行う方
法として逆方向のＰＣＲ法が報告された（　Ｔ、　Ｔｒ
ｉｇｌｉａ　ｅｔ　ａｌ　　１９８８　　Ｎｕｃｌ、　
Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、１６：８１８６）。これは、適当な
制限酵素で切断したクロモシームの遺伝子断片を、リガ
ーゼを用いてたくさんの小型環状ＤＮＡとしたのち、既
知の遺伝子（例えば特定のｃＤＮＡ）の両端に当たる部
分のＤＮＡを従来と逆向き（外向き）にＰＣＲ反応が進
むように合成して、反応に供するという方法である。こ
の方法によって、既知の遺伝子（例えば特定のｃＤＮＡ
）をコードする染色体遺伝子に隣接するＤＮＡの塩基配
列が増幅され、その機能、例えば、プロモーター、ター
ミネータ−などｃ　Ｄ　Ｎ　Ａとしてとらえられない遺
伝子の構造や機能の解析が不可能ではなくなった。しか
し本技術は、いくつかの欠点を有していた。第一にプラ
イマーの化学合成が不可欠である。第二にプライマーを
化学合成する上で、その設計にあたり、塩基配列が解明
されていなければならない。第三１？：　ｃ　Ｄ　Ｎ　
Ａコード領域に隣接した配列を決定しようとするとき、
介在配列やｃＤＮＡからは、予測できない塩基配列に関
しては、本性の応用は、不可能である。このように、最
新の応用技術をもってしても、遺伝子の解析に関するＰ
ＣＦＬ法の応用にあたって限界があった。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは鋭意研究を進めた結果、ＰＣＲに用いうる
全く新たなプライマーを作製することに成功した。それ
は手持ちのＤＮＡ鎖（例えばｃＤＮＡ）を特殊な酵素で
５′末端側から消化して適当な長さの断片を作製し、こ
れをプライマーとすることができるもので、ＤＮＡを化
学的に合成するものではない。つぎに、ｃＤＮＡをクロ
ーニングしたプラスミドをそのまま鋳型として、上記の
プライマーヲ利用して、ＰＣＲ法を実施した。その結果
、プラスミドが、そのまま、非常に高い効率で増幅され
ることが判った。この発見は、反応液中において、目的
とするｃＤＮＡをクローニングしたプラスミドだけを、
細菌の菌体内に導入する事なしに増幅、純化し、形質転
換の効率を飛躍的に高めることを、可能にするという新
たな技術の発明につながった。

つぎに、本プライマーを染色体遺伝子の増幅に応用した
。真核細胞の染色体由来のＤＮＡを制限酵素で切断した
後、リガーゼでセルフライゲートすることにより環状Ｄ
ＮＡを作製した。この環状ＤＮＡを鋳型にして、前述し
たプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。その結果
、驚くべき事に、手持ちＤＮＡ鎖の断片からなるプライ
マーに隣接した両側の染色体遺伝子で、切断に使用した
制限酵素の認識部位に夾まれだ部分だけが増幅され、そ
れ以外の遺伝子は、全く増幅されなかった。

このことにより、本発明がその特異性と簡便さにおいて
ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを用いた染色体上のコード遺伝子および
関連した制（財）遺伝子の解析にきわめて有効であるこ
とを明らかにして発明を確立するに至っｔこ。

本発明は、二重鎖ＤＮＡの断片にエキソヌクレアーゼを
作用させることを特徴とするポリメラーゼ・チェーン・
リアクション用プライマーの作製法、ポリメラーゼ・チ
ェーン・リアクションにより生体外でＤＮＡを増幅させ
る方法において、二重鎖ＤＮＡの断片にエキソヌクレア
ーゼを作用させて得られる断片をプライマーとして用い
ることを特徴とするＤＮＡの増幅方法、および二重鎖Ｄ
ＮＡ断片に５′末端から３′末端の方向にモノヌクレオ
チドを遊離する形式で二重鎖ＤＮＡの一方の鎖を消化す
るエキソヌクレアーゼを作用させて得られる断片をプラ
イマーとして、かつ染色体遺伝子を制限酵素により切断
し、生成す断片をセルフライゲーションして得られた環
状ＤＮＡを鋳型として、逆方向のポリメラーゼ・チェー
ン・リアクションを行うことを特徴とする染色体遺伝子
の増幅方法である。

本発明はＰＣＲ法、逆ＰＣＲ法を応用して未知の遺伝子
のクローニング、その解析を進める上できわめて有効な
手段を提供するものである。本発明に於て使用するプラ
イマーは、二重鎖ＤＮＡを酵素消化して得られる。今日
応用されているＰＣＲ法では、プライマーは化学的に合
成されなければならない。そのため、応用範囲は、塩基
配列が既知な断片に限られてきたうえ、高価なりＮＡ合
成装置やその試薬を使用しなければならなかったが、本
発明によって、その必要性はなくなった。

本発明によれば、例えば、ｃＤＮＡを逆転写酵素で合成
後、煩雑な塩基配列の決定を待つ事なく、そのｃＤＮＡ
そのものを出発材料としてプライマーを作製し、すぐに
関連した遺伝子の解析のためＰＣＲ法による遺伝子増幅
を実施できる。もちろん、ｃＤＮＡに限らず、あらゆる
ＤＮＡ断片が本法によるプライマーの作成の出発材料と
なり得る。

本法におけるプライマーはヌクレアーゼを使用して二重
鎖ＤＮＡの一方の鎖を大部分または完全に消化し除去す
ることによって得られる。そのヌクレアーゼとしては、
二重鎖Ｄ　Ｎ　Ａの断片を、いずれか一方向からのみ消
化するエキソヌクレアーゼを用いるのが好ましい。逆Ｐ
ＣＲ法に利用する場合、その消化の形式が５′末端から
進むヌクレアーゼが用いられる。この目的には、たとえ
ば、バクテリオファージλ由来エキソヌクレアーゼ（Ｊ
、Ｗ。

Ｌｉｔｔｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　１９６７　　Ｊ、Ｂ、Ｃ
，２４２；６７２−６７８）が適当である。プライマー
断片の長さは、１０塩基から４００塩基を越える長さま
で可能で、それぞれの場合に於て、サーマルサイクラ−
の温度、時間の条件を調整することが必要である。本法
により初めて可能になった１００塩基以上のプライマー
を使用する場合、従来より高温でアニーノングすること
ができる。このことにより短い合成りＮＡプライマーに
比較して、アニーリング温度の選択幅が広がり、はるか
に特異性の高いＰＣＲ反応が迅速にそして容易に実施で
きる。また、プライマー作製時のエキソヌクレアーゼ反
応を調節して、二重鎖ＤＮＡのオーバーラツプをのこし
た断片をプライマーとすることにより、鋳型環状ＤＮＡ
を増幅して得られるＤＮＡ鎖は、その鋳型のすべての塩
基配列を有する直鎖ＤＮＡとなる。

このことは、切断して得た染色体遺伝子などの中で、必
要なりＮＡ断片を、サブクローニングする事なく選択的
に増幅させることが可能であることを意味し、遺伝子解
析上、きわめて有用な方法論であることが明らかである
。

〔実施例１〕 λエキソヌクレアーゼ処理によってプライマーＤＮＡを
作製した。イネ種子貯蔵蛋白質である１０ｋＤａプロラ
ミンのｃＤＮＡをすでに報告した方法（Ｔ、　Ｍａｓｕ
ｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ　１９８９　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ
。

Ｂｉｏｌｏｇｙ　　１２：１２３−１３０）で得た。そ
のｃＤＮＡをクローン化したプラスミドＩ）ｌＲＰｌｏ
は、図１に示すような構造を持つ。本プラスミドを大腸
菌に導入したのち大量培養した。１１の培養液中の菌体
よりアルカリ溶菌法を用いて、プラスミドＤＮＡを回収
し、セシウムクロライド／エチジウムブロマイド中で超
遠心することにより精製し約１　ｍｇのｐｆｆＲＰ１０
プラスミドＤＮＡを得た。

そのうちの５０μｆを反応緩衝液（３５ｍＭＴｒｉｓ−
ａｃｅｔａｔｅ　、　ｐＨ７，９、１０ｍＭ　Ｍａｇｎ
ｅｓｉｕｍ−ａｃｅｔａｔｅ、　０．５　ｍＭ　ＤＴＴ
、　６６　ｍＭ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍａｃｅｔａｔｅ、
　０．０１％ＢＳＡ）中で制限酵素Ｈｉｎｃ■、Ｓｍａ
　Ｉ各５０単位を用いて、３７°Ｃ，２時間反応した。

反応物を３％アガロースゲル上で電気泳動し、４００お
よび２００　ｂｐの長さに相当するＤＮＡ断片のバンド
をゲルから抽出したうえエタノール沈澱して回収した。

得られたＤ　Ｎ　Ａ断片のうち、４００　ｂｐの断片２
ｐｇを６７ｍＭＧｌｙｃｉｎｅ　−ＫＯＨ，ｐＨ９，４
、２，５ｍＭ　ＭｇＣｌ２゜５０μｇ／ｍｆｆ　Ｂ　Ｓ
　Ａからなる緩衝液中で８単位のλエキソヌクレアーゼ
存在下、３７°ｃ１１５分間反応した。反応後、フェノ
ール／クロロホルム抽出したうえでエタノール沈澱によ
り１本鎖ＤＮＡとしてプライマーＤＮＡを得た。

〔実施例２〕 イネゲノムＤＮＡを制限酵素で切断したうえセルフライ
ゲートすることにより環状ＤＮＡとしこれを逆ＰＣＲ法
により増幅した。イネＤ　Ｎ　Ａは常法通り（Ｍｏ１ｅ
ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　、　２６９−２９４　。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　）調製した。

その１０１ｔｙを高塩濃度反応液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＣＡ’、　ｐＨ７，５゜１０　ｍＭ　Ｍｆ／Ｃ１２，
１ｍＭ　　ＤＴＴ、１００ｍＭ　ＮａＣｌり中で１２単
位の制限酵素ＥｃｏＲＩとともに３７°Ｃ１２時間反応
し、完全に切断した。反応液をフェノール／クロロホル
ム抽出したのちエタノール沈澱し、ＤＮＡ断片を回収し
た。このＤＮＡを宝ライゲーションキットを用いてセル
フライゲートし環状化したのちフェノール／クロロホル
ム抽出、エタノール沈澱し鋳型用環状ゲノムＤＮＡを得
た。

一方、Ｉ）ｌＲＰｌｏを制限酵素Ｒｓａｌ　　消化して
２８０　ｂｐの断片を調製し、この断片から実施例１記
載と同様にしてプライマーを作製した。上記の環状ゲノ
ムＤＮＡ２ｎｙを鋳型として反応溶液（１０ｍＭ　Ｔｒ
ｉｓ−Ｃ（１，ｐＨ８，３、１，５ｍＭＭｐＣ１２，０
，０１％（ｗ／ｖ　）　ｇｅｌａｔｉｎｅ　、　２００
　ｕＭｄＮＴＰｓ、　　０．５ＵＴ　Ａｍｐｌｉ　Ｔａ
ｑ　　ＤＮＡ　　ｐｏｌｙ−ｍｅｒａｓｅ　）に加え、
さらに、上記で作製したプライマーを２００　ｎｇ添加
して、反応を開始した。

反応は、熱変性（９４°Ｃ，１分）、アニーリング（６
０°Ｃ，２分）、ポリメラーゼ反応（７２°Ｃ１２分間
）の連続反応を１サイクルとして３５サイクル繰り返し
た。最後に１分間７２°Ｃの反応を延長した。以上の反
応は、シータス社サーマルサイクラ−を使用して、自動
的に行った。

反応液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈
澱の後、得られたＤＮＡを制限酵素Ｒｓａｌで消化しア
ガロース電気泳動に供した。その結果、プライマーの作
製にあたって出発材料として用いた２　８０１）ｐのｃ
ＤＮＡ断片に相当するバンドが認められた。また本ＤＮ
Ａを制限酵素Ｅｃｏ　Ｒ１で消化すると約４０００　ｂ
ｐの断片のみが検出された。また、このようにして増幅
されたＤＮＡは、プロラミンｃＤＮＡをプローブとした
サザンブロソトにおいて、プローブと反応した。これら
のことから、本実験の結果、イネ１０ｋＤａプロラミン
のｃＤＮＡに相当する部分とその上下流域でＥｃｏＲＩ
認識部位にはさまれたゲノムＤＮＡが特異的ｌこ増幅さ
れたことが確認された。

〔発明の効果〕

本発明によれば、二重鎖ＤＮＡを酵素で消化して得られ
るプライマーを用いてプラスミドＤＮＡ１ＣＤＮＡ、ク
ロモシームＤＮＡのようなりＮＡを、その塩基配列が不
明であっても、生体外で容易に増幅し、純化することが
できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例で用いたプラスミド１）ｎＲＰｌｏの制
限酵素地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　二重鎖ＤＮＡの断片にエキソヌクレアーゼを作用さ
   せることを特徴とするポリメラーゼ・チェーン・リアク
   ション用プライマーの作製法。 ２　エキソヌクレアーゼが５′末端から３′末端の方向
   にモノヌクレオチドを遊離する形式で二重鎖ＤＮＡの一
   方の鎖を消化するエキソヌクレアーゼである請求項１記
   載の作製法。 ３　エキソヌクレアーゼがバクテリオファージλに由来
   するエキソヌクレアーゼである請求項１または２記載の
   作製法。 ４　ポリメラーゼ・チェーン・リアクションにより生体
   外でＤＮＡを増幅させる方法において、二重鎖ＤＮＡの
   断片にエキソヌクレアーゼを作用させて得られる断片を
   プライマーとして用いることを特徴とするＤＮＡの増幅
   方法。 ５　エキソヌクレアーゼが５′末端から３′末端の方向
   にモノヌクレオチドを遊離する形式で二重鎖ＤＮＡの一
   方の鎖を消化するエキソヌクレアーゼである請求項４記
   載の方法。 ６　エキソヌクレアーゼがバクテリオファージλに由来
   するエキソヌクレアーゼである請求項４または５記載の
   方法。 ７　ポリメラーゼ・チェーン・リアクションが逆方向ポ
   リメラーゼ・チェーン・リアクションである請求項５ま
   たは６記載の方法。 ８　増幅させるＤＮＡが染色体遺伝子バンクにおけるコ
   ード遺伝子である請求項４、５または６記載の方法。 ９　二重鎖ＤＮＡ断片に５′末端から３′末端の方向に
   モノヌクレオチドを遊離する形式で二重鎖ＤＮＡの一方
   の鎖を消化するエキソヌクレアーゼを作用させて得られ
   る断片をプライマーとして、かつ染色体遺伝子を制限酵
   素により切断し、生成す断片をセルフライゲーションし
   て得られた環状ＤＮＡを鋳型として、逆方向のポリメラ
   ーゼ・チェーン・リアクションを行うことを特徴とする
   染色体遺伝子の増幅方法。 １０　エキソヌクレアーゼがバクテリオファージλ由来
   のエキソヌクレアーゼである請求項９記載の方法。