JP2002507128A

JP2002507128A - サイクリングプローブ反応における使用のための添加物

Info

Publication number: JP2002507128A
Application number: JP50600699A
Authority: JP
Inventors: ベッカウイ，ファウジ; ディー．モドラサン，ゾラ; エイ．ピシェ，イサベル; ディー．ダック，ピーター; ピー．クロニー，リン; シー．ケイ．ウォン，アルフレッド
Original assignee: アイディーバイオメディカルコーポレイション
Priority date: 1997-07-03
Filing date: 1998-07-03
Publication date: 2002-03-05
Also published as: EP1002129A2; AU8327198A; WO1999001569A3; CA2295206A1; US6136533A; WO1999001569A2

Abstract

(57)【要約】標的核酸分子を検出するための方法であって、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）切断されやすい連結を含む一本鎖核酸プローブ；（ｉｉｉ）二本鎖標的−プローブ複合体のプローブ部分を、該切断されやすい連結で切断し得る酵素；および（ｉｖ）リボソームタンパク質および/またはスペルミンを含む混合物を、該標的核酸および該プローブが互いにハイブリダイズし、そして二本鎖標的−プローブ複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で反応させ、続いて該プローブの切断、および切断されていない新たなプローブに対する標的のサイクリングを行い、その結果、該切断された核酸プローブの１以上の部分を該標的−プローブ複合体から放出させる工程；ならびに（ｂ）該核酸プローブの切断された部分が産生されているか否かを決定し、それにより該標的核酸の存在を検出する工程、を包含する、方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】サイクリングプローブ反応における使用のための添加物技術分野本発明は、一般に標的核酸配列を検出する方法、およびより詳細には、異種ＤＮＡによって生じるバックグラウンドを減少するサイクリングプローブ反応における添加物の使用に関する。発明の背景広範で種々の診断技術が現在、生物学的サンプル内の生物の検出（例えば、生化学試験、免疫学的試験および細胞学的試験を含む）について利用可能である。しかし、これらの技術の大部分は、時間の長さ、必要とされるサンプルの量、労働力、装置の使用の訓練、熟練レベルおよび検出の特異性または感度の欠如に関する欠点を有する。しばしば、目的の生物学的サンプルは、細胞数または検出される標的核酸の量に関して限定され得る。次いで、これは、使用する方法の感度に影響する。従って、生物の首尾よい検出について、少数の標的生物の感度の限定を克服するために、標的核酸の量を増加または増幅させることが必要であり得る。選択される核酸配列を増幅するために、最も広範にインビトロで使用される方法の一つは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号を参照のこと）である。手短には、増幅される標的配列のＤＮＡセグメントに隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、標的配列の指数関数的複製を開始させる。標的の熱変性後、プライマーのハイブリダイゼーションがそれらの反対側の鎖のそれらの相補的な配列に対して生じ、そして２つのプライマーの伸長に起因する複製が酵素学的に生じる。変性、プライマーアニーリング、および伸長の反復サイクルを実施し、１サイクル当たりでもとの鎖の各々に対する相補鎖の複製が生じる。次いで、産物の鎖の各々がプライマーにハイブリダイズされ得る。これは、続いて検出され得る標的核酸の指数関数的な増幅をもたらす。しかし、ＰＣＲに関連する多くの技術的問題が存在する。例えば、擬陽性の結果が、多数の供給源から生じる夾雑核酸に由来して生じ得る（ＫｗｏｋおよびＨｉｇｕｃｈｉ、Ｎａｔｕｒｅ３３９：２３７−２３８、１９８９；Ｋｉｔｃｈｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ３４４：２０１）。標的の以前の増幅からのＰＣＲ産物もまた、研究室において蓄積し得、これが異なるサンプル間の交叉夾雑を生じる。標的テンプレートに無関係の配列またはサンプル中に存在する他の異種核酸に対するプライマーのハイブリダイゼーションによって生じる非特異的な標的の同時増幅による問題もまた生じ得る。擬陰性の問題は、ＮｉｅｄｅｒｈａｕｓｅｒらＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌ．４：１１７−１２３、１９９４によって議論される。研究室の個人の技術的能力、研究室の性能および研究計画もまた、考慮に入れられなければならない。異種核酸夾雑にともなう問題（これは、阻害または交叉夾雑を生じ得るか、あるいは擬陽性を与える）は、他の増幅技術（例えば、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、ギャップリガーゼ連鎖反応（Ｇａｐ−ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびＱβレプリカーゼ（一般的には、ＣａｒｒｉｎｏおよびＬｅｅ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３：３−２０、１９９５；Ａｌｔｗｅｇｇ，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３：２１−３０を参照のこと））に影響を与える。多数のこれらの問題は、増幅系において標的が増幅されない場合に解決され得る。１つのこのような方法は、サイクリングプローブ技術（「ＣＰＴ」、例えば、米国特許第５，０１１，７６９号および同５，４０３，７１１号を参照のこと）であり、この方法において、標的配列に相補的な、切断されやすい連結オリゴヌクレオチドを含む特異的プローブが利用される。本発明は、サイクリングプローブ反応における使用のための新規の組成物および方法を開示する。これは、使用するに単純で、迅速で、かつ安価である。特に、他の核酸増幅技術とは異なり、本明細書において提供される方法は、定温で達成され得、１を超える酵素もプローブも必要とせず、そしてサンプル中に存在し得る異種ＤＮＡの存在下で実施され得る。さらに，本発明は他の関連する利点を提供する。発明の要旨手短に述べると、本発明は核酸反応を利用して標的核酸分子を検出するための組成物および方法を提供する。この核酸反応は、核酸標的に対する、１以上の核酸プローブまたは特に選択した核酸分のハイブリダイゼーションを含む。このような方法は、一般に、以下の工程を包含する：（ａ）（ｉ）１以上の選択された核酸分子（例えば、プローブ、プライマーまたは一連のプローブ）；（ｉｉ）検出される標的核酸分子を含み得るサンプル、および（ｉｉｉ）１以上の（Ｉ）リボソームタンパク質、（ＩＩ）スペルミンおよび／または（ＩＩＩ）界面活性剤またはキレート剤を、標的核酸分子とハイブリダイズする機会をこの選択される核酸分子に許容するに充分な条件下および時間で反応させる工程；ならびに（ｂ）ハイブリダイゼーションが生じるか否かを決定し、それにより標的核酸分子の存在を検出する工程を包含する。本発明の１つの局面において、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）切断されやすい連結を含む一本鎖核酸プローブ；（ｉｉｉ）二本鎖標的−プローブ複合体のプローブ部分を、この切断されやすい連結にて切断し得る酵素、および（ｉｖ）リボソームタンパク質および／またはスペルミン、および／または界面活性剤およびキレート剤を含む混合物を、この標的核酸およびこのプローブが互いにハイブリダイズし、そして二本鎖標的−プローブ複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で反応させ、続いてこのプローブの切断および切断されていない新たなプローブに対する標的のサイクリングを行い、その結果、この切断された核酸プローブの１以上の部分をこの標的−プローブ複合体から放出させる工程；ならびに（ｂ）この核酸プローブの切断された部分が産生されているか否かを決定し、それによりこの標的核酸の存在を検出する工程、を包含する、標的核酸分子を検出するための方法が提供される。種々の実施態様において、切断されたプローブが産生されているか否かの決定は、核酸プローブの切断された部分を直接検出すること、および／または切断されていないプローブの量の減少を検出することによって達成され得る。本発明の別の局面において、実質的に相補的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションを通じて標的核酸配列の存在を検出するための方法が提供され、ここで、プローブ：標的核酸配列比は、標的核酸配列のリサイクルを介して増幅され、この方法は以下の工程：（ａ）リボソームタンパク質および／またはスペルミンの存在下で核酸プローブに標的核酸配列をハイブリダイズさせて、プローブ：標的核酸配列二重鎖を提供する工程；（ｂ）プローブ：標的核酸配列二重鎖内のプローブのみを、選択的なプローブ切断を生じる酵素で切断して、二重鎖の解離を生じ、標的核酸配列をインタクトに放置する工程；（ｃ）（ａ）および（ｂ）の工程を反復することによる、標的核酸配列のリサイクル工程；ならびに（ｄ）切断されたプローブを検出し、それによりこの標的核酸配列の存在を決定する工程を包含する方法を提供する。本発明の種々の実施態様において、プローブは、構造［Ｎａ₁−Ｓ−ＮＡ₂］_n を含み、ここで、ＮＡ₁およびＮＡ₂は異なり、非相補的核酸配列（例えば、ＤＮＡ）であり、そしてＳは切断されやすい連結（例えば、「Ｒ」、ＲＮＡ配列）である。さらなる実施態様において、酵素はRNaseHであり、そして熱安定性（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来）または非熱安定性（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来）のいずれかであり得る。広範で種々のリボソームタンパク質が、本発明において利用され得る。これには、原核生物リボソームタンパク質および真核生物リボソームタンパク質が含まれる。好ましい実施態様において、リボソームタンパク質は、Ｓ１９またはＬ３４リボソームタンパク質である。本発明のなおさらなる実施態様において、反応混合物は、スペルミンおよび／または界面活性剤（例えば、ＤＴＡＢまたはＣＴＡＢ）、および／またはキレート剤（例えば、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、またはＭｇ⁺⁺、Ｍｎ⁺⁺またはＣａ⁺⁺のような二価のカチオン）、あるいは界面活性剤および／またはキレート剤を含み得る。さらなる改変において、本明細書において記載されるハイブリダイゼーション反応において利用されるプローブおよび標的核酸分子は、完全に相補的である必要はなく、そして実際、１，２、３以上のヌクレオチド核酸をわざと異ならせ得る（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１４１０６および米国特許第５，６６０，９８８号を参照のこと）。さらなる改変において、標的核酸配列分子は、ゲノム核酸の異種集団において存在する。本発明のこれらのおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。さらに、種々の参考文献が本明細書において示され、これらの文献は、特定の手順または組成物（例えば、プラスミドなど）をより詳細に記載し、それゆえ、それらの全体が参考として援用される。図面の簡単な説明図１は、サイクリングプローブ反応の１つの代表的な実施態様の模式図である。図２は、電気泳動による２０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離され、そしてクーマシーブルーによって染色された、異なるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ RNaseH酵素バッチに由来するタンパク質の図である。レーン１は、低分子量標準を含む；レーン２〜７は、それぞれ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ RNaseH酵素バッチのＡ１０−１、Ａ１１−１、Ａ１２−１、Ａ８−１、Ａ７−１およびＡ６−１を含む。図３は、２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、そしてクーマシーブルーで染色された、Ｅ．ｃｏｌｉにクローニングされ、そして発現された、精製され、そして部分精製されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ RNaseH酵素に由来するタンパク質、RNaseHの調製物からの補助タンパク質、ならびにＥ．ｃｏｌｉＬ３４リボソームタンパク質の図である。レーン１、精製されたＳ１９（「１３ｋＤａ」タンパク質）；レーン２、部分精製されたRNaseHバッチＡ２４−１；レーン３、比較的純粋なRNaseHバッチＡ２６−１；レーン４、精製されたＬ３４タンパク質、レーン５、Ｅ．ｃｏｌｉＬ３４タンパク質ならびにレーン６、低分子量標準。図４Ａおよび４Ｂは、異種ＤＮＡの存在下で、キメラプローブＡＲＫ２（配列番号１）を用いて、合成標的配列ＡＲＫ２−９５（配列番号３）を検出するための、ＣＰＴ反応における、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ）およびスペルミン（２ｍＭ、ＳＰ）の効果を試験する実験から得られた、正味のパーセントプローブ切断およびシグナル対ノイズ比を示す２つのヒストグラムを示す。ＥＧＴＡおよびスペルミンを、０〜８００ｎｇの範囲のｈｇＤＮＡを用いるＣＰＴ反応において独立しておよび一緒に試験した。図５は、サイクリングプローブ技術反応を用いる粗溶解物からのｍｅｃＡ遺伝子についての、２８５のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ（これは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓを含む）単離物のスクリーニングの頻度分布結果を示すヒストグラムである。³²Ｐ標識したキメラプローブは、ｍｅｃＡ９４５−２９（配列番号４）であり、そして反応混合物は、１．０ｍＭＥＧＴＡおよび２．０ｍＭスペルミンの組合せを含んでいた。単離物は、ＣＰＴ産物に基づいて、ｍｅｃＡ陽性またはｍｅｃＡ陰性に分離され得る。図６は、ヒトゲノムＤＮＡ（ｈｇＤＮＡ）のバックグラウンドで、RNaseHの、およびＡＲＫ２（配列番号１）プローブに対する結合を試験する、膜結合アッセイの結果を示す。ｈｇＤＮＡの非存在下では、RNaseHは、プローブに結合するが、ｈｇＤＮＡの存在下では、この相互作用は、破壊されたことが示された。コントロールのシトクロームＣ（ＣｙｔｏＣ）のＡＲＫ２プローブに対する結合は、ｈｇＤＮＡの非存在下でも存在下でもいずれでも観察されなかった。図７Ａおよび７Ｂは、一本鎖ＤＮＡアガロースカラムからの、RNaseHの溶出プロフィールからの結果を示すヒストグラムである。漸増濃度のスペルミンを用いて溶出したRNaseHの相対量（図７Ａ）を、ウェスタンブロット（図７Ｂ）から見積もった。カラムにロードしたRNaseHの２％がフロースルー画分において溶出された。図８Ａおよび８Ｂは、２ｍＭスペルミンで平衡化した一本鎖ＤＮＡアガロースカラムからのRNaseHの溶出プロフィールからの結果を示すヒストグラムである。漸増濃度のスペルミンで溶出して、RNaseHの相対量（図８Ａ）を、ウェスタンブロット（図８Ｂ）から見積もった。０ｍＭのスペルミンで示される画分は、カラムへのRNaseHのロードの間に得られたRNaseHのフロースルーを含む。発明の詳細な説明定義本発明を示す前に、本明細書において以降使用される特定の用語の定義をまず示すことは、本発明の理解に役立ち得る。「サンプルまたは生物学的材料」とは、標的核酸分子の存在または非存在を決定するために提供されるより大きな全体の代表的な部分をいう。サンプルは、生物学的（例えば、培養物または臨床的サンプル、粗細胞溶解物または粗微生物溶解物、血液、尿または糞便）、実験的に産生された、産業的（例えば、農業収穫物または酪農産物、ゴミ処理物、食品加工物、精製抽出物）または環境的なサンプルであり得る。「核酸分子」とは、重合体のヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、これは、天然起源または合成起源であり得る。核酸分子の代表的な例としては、ＤＮＡ（ｄｓ−ＤＮＡまたはｓｓ−ＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、もしくは核酸アナログ（例えば、天然に存在するヌクレオチドのα−エナンチオマー形態）から構成されるか、またはそれを含む核酸分子が挙げられる。さらに、ヌクレオチドは、それらの糖部分、またはピリミジン塩基もしくはプリン塩基部分において改変され得る。糖部分に対する改変の例としては、例えば、１つ以上のヒドロキシル基の別の基での改変または置換が挙げられる。塩基部分に対する改変としては、アルキルまたはアシル化のピリミジンおよびプリンが挙げられる。さらに、核酸単量体が、ホスホジエステル結合、またはこのような結合のアナログ（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミダイトなど）によって結合され得る。「単離された核酸分子」とは、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれない核酸分子をいう。単離された核酸分子としては、例えば、プローブおよび合成的または組換え的に生成された他の核酸分子が挙げられる。「切断されやすい結合」とは、分子自体または標的核酸配列の核酸配列を全く切断または破壊することなく、切断または破壊され得る核酸分子をいう。切断されやすい結合としては、２つの核酸配列を結合し、かつ結合される核酸配列を切断することなく選択的に切断され得る、任意の結合させる化学構造が挙げられる。切断されやすい結合は、単結合または複数単位配列であり得る。このような化学構造の例は、ＲＮＡ配列である。他の切断されやすい結合として適切な化学構造は、ＤＮＡ配列、アミノ酸配列、無塩基性ヌクレオチド配列、もしくは無塩基性ヌクレオチド、または任意の炭水化物ポリマー（すなわち、セルロースまたはデンプン）である。切断されやすい結合が核酸配列である場合、これは、（下記に記載される）ＮＡ₁およびＮＡ₂の核酸配列とは異なる。「切断されやすい結合を含むプローブ」とは、標的核酸分子に相補的であるかまたは実質的に相補的である公知の配列を考慮して構築される合成核酸分子をいう。特定の実施態様において、プローブは、構造「ＮＡ₁−−Ｓ−−ＮＡ₂」_nを含み、ここで、ＮＡ₁およびＮＡ₂は、異なる非相補的な核酸分子であり、そしてＳは、切断されやすい結合であり、そしてｎは、１〜１０の整数である。「リボヌクレアーゼＨ」（「RNase Ｈ」）とは、ＲＮＡ：ＤＮＡのハイブリッド二重鎖におけるＲＮＡ鎖を特異的に切断し得る酵素をいう（一般的には、ＣｒｏｕｃｈおよびＤｉｒｋｓｅｎｉｎＮｕｃｌｅａｓｅｓ，ＬｉｎｎおよびＲｏｂｅｒｔｓ編、２１１−２４１頁、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，１９８２を参照のこと）。「スペルミン」とは、４つの正電荷を有するポリアミンをいう。「リボソームタンパク質」とは、原核生物起源または真核生物起源のリボソームのタンパク質成分をいう。本発明は、ハイブリダイゼーション反応によって検出される目的の核酸分子を含むサンプル中の異種核酸分子によって生じるバックグラウンドを減少させる方法を提供する。例えば、本発明の１つの局面において、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）切断されやすい連結を含む一本鎖核酸プローブ；（ｉｉｉ）二本鎖標的−プローブ複合体のプローブ部分を、この切断されやすい連結で切断し得る酵素、および（ｉｖ）リボソームタンパク質および／またはスペルミン、および／または界面活性剤およびキレート剤を含む混合物を、この標的核酸およびこのプローブが互いにハイブリダイズし、そして二本鎖標的−プローブ複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で反応させ、続いてこのプローブの切断および切断されていない新たなプローブに対する標的のサイクリングを行い、その結果、この切断された核酸プローブの１以上の部分をこの標的−プローブ複合体から放出させる工程；ならびに（ｂ）この核酸プローブの切断された部分が産生されているか否かを決定し、それによりこの標的核酸の存在を検出する工程、を包含する、標的核酸分子を検出するための方法が提供される。この検出／ハイブリダイゼーション反応ならびに他の類似する検出／ハイブリダイゼーション反応を、以下により詳細に議論する。Ａ．標的核酸分子の選択および調製本発明の方法は、ウイルス、原核生物または真核生物から得られた、あるいは天然供給源から実験的に産生され、組換え技術により産生され、または化学合成された、標的核酸分子を検出するのに適切である。標的核酸分子の代表例は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト、サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットまたはマウスの細胞）、真菌細胞、細菌細胞、植物、ウイルスおよびバクテリオファージから得られた核酸分子を含む。標的核酸分子を選択する方法、ならびに標的核酸分子を生成する方法は、本明細書において提供される開示を参酌すれば当業者によって容易に達成され得る（一般的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第二版）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９を参照のこと）。一本鎖核酸分子は、標準的な技術を利用して標的細胞または生物から直接入手および／または調製され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ」、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、１９８９を参照のこと）か、または、例えば、ＰＣＲ，ＮＡＳＢＡ、ＲＮＡの逆転写、ＳＤＡ、分枝鎖ＤＮＡなどを含む広範で々の技術のいずれかを利用して調製され得る。Ｂ．プローブの選択および合成プローブの配列は、標的核酸に基づき、そしていくつかの基準に基づいて選択される。手短には、プローブは、標的配列とハイブリダイズし得るべきであり、そしてサンプル中に存在し得る任意の他の異種核酸配列とはハイブリダイズし得るべきではない。プローブ間またはプローブ内の対合（すなわち、安定なヘアピン、またはリボヌクレオチドを含む安定な二量体）は最小限であるべきかまたはないべきである。プローブの長さ、切断されやすくない連結および切断されやすい連結は、米国特許第４，８７６，１８７号；同第５，０１１，７６９号；および同５，４０３，７１１号に詳細に記載される。最後の基準は、標的または異種核酸に対するＣＰＴ反応におけるプローブの試験である。上記に記載されるように、本発明の１つの局面内で、標的核酸分子は、切断されやすい結合を有する、相補的な一本鎖核酸プローブと反応される。簡単に言うと、切断されやすい結合を有する広範な種々の核酸プローブは、本発明の文脈内で利用され得る。好ましくは、このプローブは、酵素（これは、切断されやすい結合でプローブ−標的複合体を特異的に切断し得る）による切断の際に、プローブ部分が検出可能に放出されるように設計される（米国特許第４，８７６，１８７号、同第５，０１１，７６９号および同第５，４０３，７１１号を参照のこと）。本発明の好ましいプローブ分子は、一般に［（ＮＡ₁）_x（−Ｓ−）_z（−ＮＡ₂）_y］_n構造を有する。ここでＮＡ₁およびＮＡ₂は、核酸または核酸アナログから構成される分子であり、−Ｓ−は切断されやすい結合であり、そしてｘ、ｙおよびｚは、１〜１００の整数であり、そしてｎは、１〜１０の整数である。本発明の特定の特に好ましい実施態様内で、ＮＡ₁およびＮＡ₂は、３〜４０ヌクレオチドの範囲であり得る。そしてＳが核酸から構成される場合、ＮＡ₁およびＮＡ₂は、２〜２０ヌクレオチドのサイズの範囲であり得る。さらに、本発明の文脈内で利用されるように、各々のｘ、ｙおよびｚは、ｎ回の各反復によって変動し得ることが理解されるべきである。本発明の種々の実施態様内で、一本鎖プローブが使用され、一本鎖標的配列と反応するかあるいはハイブリダイズするが、上記に記載される方法は、相補的プローブおよび標的配列とのペアが、二本鎖を形成するような状況のみに限定されないべきである。１つの実施態様内で、上記に記載されるようなＮＡ₁およびＮＡ₂は、ＤＮＡ分子であり、同じ配列を有してもよいし、有さなくともよい。あるいは、ＮＡ₁およびＮＡ₂は、ＲＮＡ分子（これは、同じ配列を有してもよいし、有さなくてもよい）またはＲＮＡおよびＤＮＡ分子の組合わせから構築され得る。利用されるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子は、天然に存在する供給源から誘導され得るか、あるいはこれらは、合成的に形成され得る。各々のＮＡ₁およびＮＡ₂は、約５塩基〜１０，０００塩基長であり得る。他の実施態様内で、ＮＡ₁またはＮＡ₂は、メチルホスホネート、カルバメート、アミデート、トリエステル、または「ペプチド核酸」（「ＰＮＡ」）のような、核酸アナログから構成され得る。例えば、ＰＮＡオリゴマーは、非常に高い特異性で相補的な標的オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）配列とハイブリダイズし得る。このような二本鎖は、対応するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖よりも安定である（Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ３６５：５５６ −５６８，１９９３）。さらにＰＮＡは、鎖置換によって二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡに結合し得（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１４９７−１５００，１９９１）、それゆえサンプル調製において、慣用的な二本鎖変性の必要性を省略し得る。低濃度の塩（５０ｍＭ／Ｌ以下のＮａ⁺）が、一般的にｄｓＤＮＡへのＰＮＡの結合のために好ましい。中程度の濃度の塩は、ｄｓＤＮＡへのＰＮＡの二本鎖置換を通して結合を阻止し得る。しかし、一旦結合したＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖は、高濃度の塩に対して安定である。さらに、これらの二重鎖はまた、オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオチド二重鎖と比べて熱的に安定である（ＰＮＡ／ＤＮＡの二重鎖は、対応するＤＮＡ／ＤＮＡと比較して、塩基対あたり約１℃ほど、より安定である）。標的オリゴヌクレオチドに対する高度な配列特異性、一旦形成した二重鎖の高塩濃度に対するより高い熱安定性および耐性の必要性に基づくと、ＰＮＡは、しばしば本明細書に記載される方法における使用のための理想的な分子である。特定の実施態様内で、２つの短いＰＮＡが、切断されやすい結合と共に連結され得、そして高度な配列特異的プローブとして使用され得る。本発明のプローブはまた、一方の末端または両末端（例えば、ＮＡ₁またはＮＡ₂）に付加される１つ以上の検出可能なマーカーを有し得る。マーカーは、検出され得る実質的に任意の分子または試薬（これらの代表的な例は、放射性同位体または放射標識された分子、蛍光分子、蛍光抗体、酵素または化学発光触媒を含む）であり得る。上記に記載されるように、核酸プローブは、切断されやすい結合（これは、分子自身の任意の核酸配列または標的核酸配列の、切断または破壊することなしに切断または破壊され得る）を有する。本発明の文脈内で使用される場合、切断されやすい結合は、任意の結合させる化学的構造（これは２つの核酸配列を結合し、そして結合される核酸配列の切断なく選択的に切断され得る）である。切断されやすい結合は、単一結合または複数単位配列であり得る。このような化学的構造の例は、ＲＮＡ分子であり得る。他の化学的構造（これは、切断されやすい結合として適切であり得る）は、ＤＮＡ分子、アミノ酸配列、無塩基性ヌクレオチド分子または任意の炭水化物ポリマー（例えば、セルロースまたはデンプン）である。切断されやすい結合が核酸分子である場合、これはＮＡ₁およびＮＡ₂の核酸配列とは異なるべきである。上記に記載される核酸プローブにおいて、ｎが１よりも大きい場合、単位ＮＡ₁ −Ｓ−ＮＡ₂は繰り返される。本明細書中に提供される開示によって当業者に容易に理解されるべきであるように、この単位は各繰り返し内に同一であり得るか、または定義されるパターンにおいてランダムに変化し得る。さらに、切断されやすい結合もまた、単位ごとに変動し得る。例えば、１つの切断されやすい結合は、アミノ酸配列であり得、そして別の切断されやすい結合は、ＲＮＡ分子であり得る。上記に記載されるように、本発明のプローブはまた、固体支持体へ直接的または、化学的リンカーを介してのいずれかで連結され得る。固体支持体の代表的な例は、シリカ材料、セルロース材料、ポリマーベース材料またはプラスチック材料を含む。本発明の特定の好ましい実施態様内で、核酸プローブは、構造：［ＮＡ₁−Ｓ −ＮＡ₂］_nを有する。ここで、ＮＡ₁およびＮＡ₂は核酸配列であり、Ｓは、切断されやすい核酸連結であり、そしてｎは１から１０の整数である。この実施態様内で、ＮＡ₁およびＮＡ₂は、種々の核酸配列（これは、互いに非相補的である）であり、そして−Ｓ−は、切断されやすい結合（これは、ＮＡ₁もしくはＮＡ₂、またはＮＡ₁もしくはＮＡ₂配列にハイブリダイズし得る標的核酸配列を切断または破壊することなく、切断されるかまたは破壊され得る）である。ここで切断されやすい結合が核酸配列であるならば、ＮＡ₁およびＮＡ₂の両方がＤＮＡ配列である場合、これはＲＮＡであり、またはＮＡ₁およびＮＡ₂の両方がＲＮＡ配列である場合、切断されやすい結合はＤＮＡである。本発明の特定の実施態様において、プローブは、蛍光標識または酵素標識（例えば、消光した蛍光対または蛍光標識および酵素標識）のような１以上の標識、あるいは標識およびビオチンのような結合分子（例えば、プローブ（切断された状態または切断されていない状態は、標識および結合分子の両方に共有結合または非共有結合され得る）を含み得る（例えば、米国特許第５，７３１，１４６号もまた参照のこと）。本発明の方法において有用である核酸分子は、固体支持体媒体（例えば、シリカゲルまたは制御された孔ガラス）上で、加水分解性結合または恒常性（非加水分解性の）結合のいずれかを使用して、構築され得る。公開された化学的方法がこの合成について使用され得る。オリゴヌクレオチド分子は、一般には、以下に記載されるように構築される：ＭａｔｔｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５，１９８１；ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ，ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２２：１８５９、１９８１、Ａｌｖａｒａｄｏ−Ｕｒｂｉｎａら、「ＡｕｔｏｍａｔｅｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＧｅｎｅＦｒａｇｍｅｎｔｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１４：２７０−２７４、１９８１；米国特許第４，８７６，１８７号、同５，０１１，７６９号、および５，４０３，７１１号もまた、参照のこと。オリゴヌクレオチドアナログおよび結合体合成について、一般には、Ａｇｒａｗａｌ（編）ＰｒｏｔｏｃｏｌｓＦｏｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓＡｎｄＡｎａｌｏｇｓ、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ第２０巻、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓＩｎｃ．、１９９３；Ｅｇｈｏｌｍら、Ｎａｔｕｒｅ３６５：５６６−５６８、１９９３；Ｄｕｅｈｏｌｍら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：５７６７−５７７３、１９９４；Ａｇｒａｗａｌ（編）、ＰｒｏｔｏｃｏｌｓＦｏｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅＣｏｎｊｕｇａｔｅ、ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＡｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ第２６巻、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓＩｎｃ．，１９９４．非同位体性プローブについては、一般に、Ｋｒｉｓｃｋａ、Ｎｏｎ−ＩｓｏｔｏｐｉｃＤＮＡＰｒｏｂｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．、ＮｅｗＹｏｒｋ、１９９２を参照のこと。簡単にいうと、オリゴヌクレオチド合成は、各サイクルが、１ヌクレオチドごとにオリゴヌクレオチドを伸長させるサイクルにおいて達成される。各サイクルは、４つの工程からなる：（１）固体支持体上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’末端を脱保護する工程、（２）固相に固定されたヌクレオチドへ次のヌクレオシドホスホルアミダイトをカップリングさせる工程、（３）固定されたヌクレオチドの数パーセントの５’−ＯＨ基（これは、添加されたホスホルアミダイトにカップリングしない）をキャッピングする工程、および（４）オリゴヌクレオチドの連結をホスホトリエステル連結に酸化させる工程。オリゴヌクレオチドを合成するための、およびオリゴヌクレオチドのビオチン化ならびに蛍光化のための代表的な方法が、実施例１に示される。Ｃ．リボヌクレアーゼＨリボヌクレアーゼＨ（RNaseH）は、原核生物から真核生物までに及ぶ生物に存在する（ＣｒｏｕｃｈおよびＤｉｒｋｓｅｎ、Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ、ＬｉｎｎおよびＲｏｂｅｒｓ編、２１１〜２４１頁、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹ，１９８２によって概説される）RNaseHは、市販で入手され得るかまたは公知の技術によって調製され得る。詳細には、RNaseHは、好熱性および非好熱性の生物から単離および精製され得る（例えば、Ｋａｎａｙａら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２７６−１２８１、１９８３；ＫａｎａｙａおよびＩｔａｙａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０１８４−１０１９２、１９９２を参照のこと）。本発明について有用なRNaseHは、好熱性細菌（例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から入手され得るか、あるいは、RNaseH遺伝子はＥ．ｃｏｌｉにおいて、ＫａｎａｙａおよびＩｔａｙａ、前出の方法によってクローニングおよび発現され得る。組換え技術もまた、非熱安定性生物からの熱安定性RNaseH 変異体について使用され得る（Ｉｓｈｉｋｉｗａら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．６：８５−９１、１９９３）。本発明において有用な非熱安定性のRNaseHは、Ｅ．ｃｏｌｉから、Ｋａｎａｙａら、前出の方法によって単離および精製され得る。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉ RNaseHもまた、市販されている。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ RNaseHは、６５℃においてより多い残留活性を有し（ＩｔａｙａおよびＫｏｎｄｏ，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：４４４３−４４４９、１９９１）、そしてＥ．ｃｏｌｉ酵素よりも３４℃高い熱ほどけ温度を有する（Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｊ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３０：５２９−５４２、１９９３）。RNaseHは、その触媒活性に二価のカチオンを必要とする（ＣｒｏｕｃｈおよびＤｉｒｋｓｅｎ、前出）。Ｄ．補足タンパク質およびリボソームタンパク質 RNaseHの組換え産生の間に生じるタンパク質の精製の際に、異種ＤＮＡを含むＣＰＴ反応における改変を生じた他のタンパク質がRNaseH調製物の一部として精製されることが首尾よく見い出された。主要なRNaseHピークの周囲で採取されたカラム画分においてわずかな改変を伴って産生されたいくつかのRNaseHのバッチの調製物は、単純系において使用される場合（すなわち、標的およびプローブのみが存在した場合）ＣＰＴ反応には有害な効果を与えなかった。しかし、これらの同じバッチは、異種ＤＮＡを含む複雑ＣＰＴ反応において使用された場合、活性において互いに一致して異なることが見い出された。これを、実施例３および図１に示す。同時精製されたタンパク質が存在しただけでなく、これらのタンパク質の相対量がＣＰＴ反応に影響を与えることもまた見い出された。これを、実施例４、図２および表２に示す。この知見の別の驚くべき局面は、高度に精製されたRNaseH（９５％を超える）は、異種ＤＮＡを含むサイクリング反応におけるほど良好には実行されなかった。ＣＰＴ反応が、精製されたRNaseHともにこれらの同時精製されたタンパク質の増加に伴って改善され得るので、これらのタンパク質を、補助タンパク質と称した。ＳＤＳゲル電気泳動によって、２つの主要な補助タンパク質が、それぞれ、約１０ｋｂおよび約１３ｋｂの推定分子量を有することが見い出され、そしてこれらを、それぞれ、「１０ｋＤａ」および「１３ｋＤａ」補助タンパク質と称した。補助タンパク質が精製され、そして部分精製されたRNaseHおよび精製されたRNaseHを用いたＣＰＴにおいて試験された。これらの補助タンパク質は、実施例６に示されるように精製されたRNaseH を用いた場合、ＣＰＴの改良に寄与することが証明された。アミノ酸配列決定によるタンパク質のさらなる特徴付けにおいて、これらのタンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉのＬ３４およびＳ１９リボソームタンパク質と類似するアミノ酸配列を有することが予想外に明らかになった。リボソームタンパク質は、原核生物および真核生物の生物の両方において見い出され、そしてポリペプチド鎖への遺伝メッセージの翻訳に関与する。Ｅ．ｃｏｌｉ７０Ｓリボソームは、３０Ｓおよび50Ｓとよばれる２つのサブユニットを有する。３０Ｓサブユニットは、２１の異なるタンパク質および１６ＳｒＲＮＡから構成され、そして５０Ｓサブユニットは、３２の異なるタンパク質および各々一本鎖の５Ｓおよび２３ＳｒＲＮＡから構成される。沈降平衡およびＳＤＳゲル電気泳動によって得られたリボソームタンパク質の分子量は、アミノ酸一次配列から化学的手段によって得られたものよりも一致してより高いことが観察された。前者の技術は、より大きなまたはあまり塩基性でないものよりもはるかに、小さなおよび非常に酸性のタンパク質に影響を与える。リボソームタンパク質は、水溶液において比較的不溶性であり、そして凝集する強い性向を有する（Ｇｉｒｉら、前出）。Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄら（Ｇｉｒｉら、前出において引用される）は、すべてのＥ．ｃｏｌｉリボソームタンパク質の一次構造を決定した。リボソームタンパク質の大部分は、比較的塩基性であり、そして高含量の塩基性アミノ酸を伴って、より高い等電点を有する（Ｋａｌｔｓｃｈｉｍｄｔ、Ｇｉｒｉら、前出において引用される）。Ｌ３４の分子量は５．４ｋＤａであり、そして４６のアミノ酸残基を有し、そしてＳ１９は、１０．３ｋＤａであり、そして９１残基を有する（Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ、Ｇｉｒｉら、前出において引用される、Ｗｉｔｔｍａｎｎ，Ｇｉｒｉら、前出において引用される）。以下により詳細に記載するように、精製されたおよび合成の両方のＬ３４リボソームタンパク質が、ＣＰＴ反応において試験された。驚きべきことに、合成Ｌ３４および真核生物酵母からのリボソームタンパク質の粗抽出物の両方が、精製されたRNaseHのみを利用した場合のＣＰＴ反応を改善した。Ｅ．ｃｏｌｉリボソームタンパク質の調製物は、当該分野で周知であり、一般的には、Ｇｉｒｉら、前出を参照のこと。酵母リボソームタンパク質は、一般的にＫａｔｓｃｈｉｍｄｔおよびＷｉｔｔｍａｎｎ，ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ３６：４０１−４１２，１９７０、Ｒａｕｅら、ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１９４：４５３− ４７７、１９９１の方法によって調製され得る。Ｅ．スペルミン上記のとおり、サイクリングプローブ反応を実行する場合、スペルミンまたはスペルミンおよびエチレンビス（オキシエチレンニトリロ）四酢酸（ＥＧＴＡの）組合せは、異種ＤＮＡの濃縮物を含むサンプルにおいて、バックグラウンドを減少させたが、シグナル対ノイズ比は維持したこともまた、予想外に発見されている。シグナル対ノイズ比において最も有意な改良は、スペルミンおよびＥＧＴＡの組合せを用いて生じた。対照的に、低濃度の異種ＤＮＡのみが存在した場合、スペルミンはバックグラウンドを減少させたが、シグナル対ノイズ比もまた減少させた。従って、ポリアミンであるスペルミンそれ自体でまたはキレート剤（ＥＧＴＡおよび、またＥＤＴＡ）との組合せでの利用は、ＣＰＴによる標的核酸の検出のために使用されるサンプル中の異種ＤＮＡによって引き起こされるバックグラウンドを減少させる。本発明は、合成および天然の核酸標的の両方の検出に適用される。さらに、スペルミンはまた，固体支持体を使用するＣＰＴ反応を改良することもまた見い出された。Ｆ．方法およびアッセイ条件上記のように、本発明は、ハイブリダイゼーション反応を利用する標的核酸分子の検出のための方法を提供する。例えば、本発明の1つの局面において、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）切断されやすい連結を含む一本鎖核酸プローブ；（ｉｉｉ）二本鎖標的−プローブ複合体のプローブ部分を、この切断されやすい連結で切断し得る酵素、および（ｉｖ）リボソームタンパク質および／またはスペルミン、および／または界面活性剤およびキレート剤を含む混合物を、この標的核酸およびこのプローブが互いにハイブリダイズし、そして二本鎖標的−プローブ複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で反応させ、続いてこのプローブの切断および切断されていない新たなプローブに対する標的のサイクリングを行い、その結果、この切断された核酸プローブの１以上の部分をこの標的−プローブ複合体から放出させる工程；ならびに（ｂ）この核酸プローブの切断された部分を検出し、それによりこの標的核酸の存在を決定する工程、を包含する、標的核酸分子を検出するための方法が提供される。適切なアッセイおよび方法の代表例は、米国特許第５，０１１，７６９号および同５，４０３，７１１号により詳細に記載される。このようなアッセイの他の改変は、米国特許第５，４０３，７１１号（米国特許第５，７４７，２５５号もまた参照のこと）に記載されるような「指数関数的」サイクリング反応を含む。本明細書において提供される組成物（例えば、プローブ、プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド、標的またはテンプレート、およびリボソームタンパク質および/またはスペルミンおよび/または界面活性剤およびキレート剤を含む反応混合物）は、広範で種々の他の／関連するハイブリダイゼーション方法（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号；同５，４８７，９７２号；同５，４２２，２５３号；同５，６９１，１４２号；同５，７１９，０２８号；同５，１３０，２３８号；同５，４０９，８１８号；同５，５５４，５１７号；同５，５８９，３３２号；同５，３９９，４９１号；同５，４８０，７８４号；同５，２１５，８９９号；同５，１６９，７６６号；同５，１９４，３７０号；同５，４７４，９１６号；同５，６８９，４００号；同５，６５６，４３０号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ８８／１０２１５；同ＷＯ９２／０８８００、同ＷＯ９６／０２６６８、同ＷＯ９７／１９１９３；同ＷＯ９７／０９４４４、同ＷＯ９６／２１１４４；同ＷＯ９２／２２６７１）において利用され得る。例えば、本発明の別の局面において、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）１つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチド分子；（ｉｉｉ）１つ以上の二本鎖標的−オリゴヌクレオチド複合体を形成するオリゴヌクレオチド分子の一方を、切断し得る酵素、および（ｉｖ）リボソームタンパク質および／またはスペルミン、および／またはキレート剤および界面活性剤を含む混合物を、この標的核酸およびこのオリゴヌクレオチド分子が互いにハイブリダイズし、そして二本鎖標的−オリゴヌクレオチド複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で反応させ、続いてこの標的−オリゴヌクレオチド複合体の一方を切断する工程；ならびに（ｂ）この核酸プローブの切断された部分が産生されているか否かを決定し、それによりこの標的核酸の存在を検出する工程、を包含する、標的核酸分子を検出するための方法が提供される。本発明の第二の局面において、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）１つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチド分子；（ｉｉｉ）１つ以上の二本鎖標的−オリゴヌクレオチド複合体を形成するオリゴヌクレオチド分子の一方を、切断し得る酵素、および（ｉｖ）リボソームタンパク質および／またはスペルミン、および／またはキレート剤および界面活性剤を含む混合物を、この標的核酸およびこのオリゴヌクレオチド分子が互いにハイブリダイズし、そして二本鎖標的 −オリゴヌクレオチド複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で反応させ、続いてこのオリゴヌクレオチド複合体の一方の切断および新たなオリゴヌクレオチド分子に対する標的のサイクリングを行い、その結果、この切断されたオリゴヌクレオチド分子の１以上の部分をこの標的−オリゴヌクレオチド複合体から放出させる工程；ならびに（ｂ）この核酸プローブの切断された部分が産生されているか否かを決定し、それによりこの標的核酸の存在を検出する工程、を包含する、標的核酸分子を検出するための方法が提供される。本発明の第三の局面において、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）１つ以上の一本鎖オリゴヌクレオチド分子；（ｉｉｉ）１つ以上の二本鎖標的−オリゴヌクレオチド複合体を形成するオリゴヌクレオチド分子の一方を、切断し得る酵素、および（ｉｖ）リボソームタンパク質および／またはスペルミン、および／またはキレート剤および界面活性剤を含む混合物を、この標的核酸およびこのオリゴヌクレオチド分子が互いにハイブリダイズし、そして二本鎖標的 −オリゴヌクレオチド複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で反応させ、続いてこのオリゴヌクレオチドの一方のプライマー伸長を行い、次いでこのオリゴヌクレオチド複合体の一方を酵素的に切断しそして新たなオリゴヌクレオチド分子に対する標的のサイクリングを行い、その結果、この切断されたオリゴヌクレオチド分子の１以上の部分をこの標的−オリゴヌクレオチド複合体から放出させる工程；ならびに（ｂ）この核酸プローブの切断された部分が産生されているか否かを決定し、それによりこの標的核酸の存在を検出する工程、を包含する、標的核酸分子を検出するための方法が提供される。他の関連する方法は、例えば、米国特許第５，４２２，２５３号、同５，６９１，１４２号、同５，１３０，２３８号、同５，５８９，３３２号、同５，３９９，９４１号、同５，２７０，１８４号を含む。より詳細には、異種核酸分子の存在下で、標的核酸を特異的な標的部位で切断するための方法が提供され、この方法は以下の一般的な工程：（ａ）標的核酸の標的部位を選択する工程；（ｂ）標的核酸の第一の領域の配列に相補的な配列を有するパイロット核酸を作製する工程；（ｃ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）パイロット核酸；（ｉｉｉ）二本鎖標的−パイロット複合体の標的分子部分を、切断し得る酵素、および（ｉｖ）リボソームタンパク質および／またはスペルミン、および／またはキレート剤および界面活性剤を含む混合物を反応させる工程；（ｄ）標的核酸およびパイロット核酸を含む切断構造を形成する工程であって、ここでこのパイロット核酸が標的核酸にアニールしない領域をなんら含まず、ここで、標的核酸の第一の領域がパイロット核酸とアニールして二重鎖を形成し、そして二重鎖と連続する標的核酸の第一の領域がパイロット核酸にアニールせず、それにより、二重鎖領域とアニールしない領域との間に接合部位を形成する工程；ならびに（ｅ）パイロット核酸とアニールする標的核酸の第一の領域内の特定の標的部位で切断構造を切断する切断剤に対して切断構造を曝露して、接合部位の２つのヌクレオチド内で、切断構造の配列とは独立した様式で、二重鎖を形成する工程であって、ここで切断剤がＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性、およびバクテリオファージＴ７の遺伝子６産物からなる群より選択される、工程、ならびに（ｆ）切断構造および切断剤をインキュベートして、切断を生じさせる工程を包含する。他の関連した局面において、異種核酸分子の存在下で特異的な標的ＤＮＡ分子の存在を検出するための方法が提供され、この方法は以下の一般的な工程：（ａ）以下を提供する工程：ｉ）第一の部分および第二の部分を有する標的核酸、ｉｉ）標的核酸の第一の部分に相補的な第一のオリゴヌクレオチド、およびｉｉｉ）５’および３’末端を有する第二のオリゴヌクレオチドおよび標的核酸の第二の部分に相補的な領域を有する第二のオリゴヌクレオチドであって、その相補的でない領域が一本鎖のアームを５’末端に提供する、第二のオリゴヌクレオチド、（ｉｖ）リボソームタンパク質、および／またはスペルミン、および／またはキレート剤、および界面活性剤；ならびにｂ）標的核酸、第一のオリゴヌクレオチド、第二のオリゴヌクレオチド、および（ｉｖ）リボソームタンパク質および／またはスペルミンを、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドの３’末端がアニールして標的ＤＮＡ配列に一本鎖アームを有する第一の切断構造を作製する条件下で、混合する工程；ｃ）第一の切断構造の切断が第二のオリゴヌクレオチド内に位置する部位で、標的核酸上の第一および第二のオリゴヌクレオチドのアニーリングに依存する様式で生じるような条件下で切断手段を提供し、それにより、切断構造の一本鎖アームを遊離させて第三のオリゴヌクレオチドを生成する工程；ｄ）一本鎖３’アーム、一本鎖５’アーム、およびリボソームタンパク質および／またはスペルミンを有する第一のヘアピン構造を、第三のオリゴヌクレオチドが第一のヘアピンの一本鎖３’アームにアニールし、それにより一本鎖５’アームを有する第二の切断構造を作製する条件下で、提供する、ｅ）第二の切断構造の切断が切断手段によって生じる条件を提供して、第二の切断構造の一本鎖５’アームを遊離し、その結果、第四のオリゴヌクレオチドおよび第一の切断されたヘアピン検出分子を含む反応産物を作製する工程；ｆ）一本鎖３’アーム、一本鎖５’アーム、およびリボソームタンパク質および／またはスペルミンを有する第二のヘアピン構造を、第四のオリゴヌクレオチドが第二のヘアピンの一本鎖３’アームにアニールような条件下で提供し、それにより、一本鎖５’アームを有する第三の切断構造が作製される工程；ｇ）第三の切断構造の切断が切断手段によって生じる条件を提供して、第三の切断構造の一本鎖５’アームを遊離し、その結果、第三のオリゴヌクレオチドと配列が同一である第五のオリゴヌクレオチドおよび第二のヘアピン切断された検出分子を生成することを含む反応産物を作製する工程；ならびにｈ）第一および第二の切断されたヘアピン検出分子の存在を検出する工程を包含する。他の局面において、比較的定温で、かつ試薬の連続的な添加なく、異種核酸分子の存在下で特異的な核酸配列の増幅のための方法が提供され、この方法は以下の工程：（Ａ）以下を含む試薬を含む単一反応媒体を提供する工程：（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｉｉ）プロモーターのアンチセンス配列を含む第二のオリゴヌクレオチドプライマー、（ｉｉｉ）そのプロモーターを認識するＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼ、（ｉｖ）ＲＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼ、（ｖ）ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼ、（ｖｉ）一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌクレアーゼ、（ｖｉｉ）リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸、（ｖｉｉｉ）ジメチルスルホキシド、および（ｉｘ）リボソームタンパク質、および／またはスペルミン、および／またはキレート剤および界面活性剤；および次いで（Ｂ）反応媒体において、特異的な核酸配列または特異的な核酸配列に相補的な配列を含むＲＮＡ第一テンプレートを含むＲＮＡを、サイクルが続くような条件下で提供する工程であって、ここで、（ｉ）第一のオリゴヌクレオチドプライマーはＲＮＡ第一テンプレートとハイブリダイズし、（ｉｉ）ＲＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ第一テンプレートを使用して、第一のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によってＤＮＡ第二テンプレートを合成し、それにより、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中間体を形成し、（ｉｉｉ）リボヌクレアーゼは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド中間体を含むＲＮＡを加水分解し、（ｉｖ）第二のオリゴヌクレアーゼプライマーは、ＤＮＡ第二テンプレートにハイブリダイズし、（ｖ）ＤＮＡ指向性ＤＮＡポリメラーゼは、第二のオリゴヌクレオチドプライマーをテンプレートとして使用してＤＮＡ第二テンプレートの伸長によりプロモーターを合成し；そして（ｖｉ）ＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターを認識し、そしてＤＮＡ第二テンプレートを転写し、それにより、ＲＮＡ第一テンプレートのコピーを提供する、工程；ならびにその後（Ｃ）特異的な核酸配列の所望の増幅を達成するに充分な時間の間の条件を維持する工程を包含する。他の局面において、溶液中で異種核酸分子の存在下で標的核酸分子を検出する方法が提供され、この方法は以下の工程：溶液中にリボソームタンパク質および／またはスペルミン、および／またはキレート剤および界面活性剤、ならびに２つの相補的なヌクレオチド分子がハイブリダイズする条件下でリボザイム分子、標識された共同標的核酸分子および標的核酸分子を提供する工程であって、ここで共同標的および標的分子が異なる配列を有し、そしてここでリボザイム分子が共同標的および標的核酸分子の部分に相補的な２つの領域を有し、そして第一の部分は、リボザイムのための切断部位を含有する標識された共同標的核酸分子に存在し、そして第二の部分は、標的核酸分子に存在し、そして相補性領域は、リボザイムと共同標的および標的核酸分子との間のハイブリダイゼーションを得るための相補的ヌクレオチドの最小限数を少なくとも含む、工程、リボザイム分子が標識された共同標的核酸分子および標的核酸分子と反応することを可能にする工程、そして標的核酸分子が溶液に存在する場合に、溶液に標的核酸分子が存在知る場合と比較して、遊離の標識の存在を検出する工程を包含する。さらに別の局面において、異種核酸分子の存在下で、標的核酸配列の複数コピーを合成するための方法が提供され、この方法は以下の一般的な工程：（ａ）ＲＮＡ標的配列を含む核酸を、標的配列の３’末端部分に対して、それとハイブリダイズするに充分に相補的であるハイブリダイズ配列を有する第一のプライマーを含み、そして必要に応じてＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター、リボソームタンパク質、および／またはスペルミン、および／またはキレート剤、および界面活性剤を含むハイブリダイズ配列に対して５’側の配列を有する第一のオリゴヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチド／標的配列ハイブリッドが形成され、そしてＤＮＡ合成が開始され得る条件下で、処理する工程、（ｂ）テンプレートとして標的を用いる伸長反応においてプライマーを伸長して、ＲＮＡ標的と相補的なＤＮＡプライマー伸長産物を得る工程、（ｃ）ＲＮＡ標的を選択的に分解する酵素を用いてＲＮＡ標的からＤＮＡプライマー伸長産物を分離する工程；（ｄ）ＤＮＡプライマー伸長産物を、プライマーまたはスプライステンプレートを含み、そして標的配列の３’末端部分に対して、それとハイブリダイズするに充分相補的なハイブリダイズ配列を有する第二のオリゴヌクレオチドを用いて、オリゴヌクレオチド／標的配列ハイブリッドが形成され、そしてＤＮＡ合成が開始され得る条件下であって、ただし第一のオリゴヌクレオチドがプロモーターを有さない場合、第二のオリゴヌクレオチドはＲＮＡポリメラーゼについてのプロモーターを含むハイブリダイズ配列の５’側に配列を有するスプライステンプレートであある、条件下で、処理する工程；（ｅ）第二のオリゴヌクレオチドまたは第一のプライマー伸長産物のいずれか、または両方の３’末端を、ＤＮＡ伸長反応において伸長して、ＲＮＡポリメラーゼについてのテンプレートを生成する工程；ならびに（ｆ）工程（ｅ）のテンプレートを用いて、プロモーター配列を認識するＲＮＡポリメラーゼを用いて標的配列の複数のＲＮＡコピーを作製する工程を包含する方法であって、ここで、この方法は、定温の条件下で実施され、そしてＲＮａｓｅＨ活性を有する逆転写酵素をこの方法において使用し、そしてＲＮａｓｅＨ活性を含む他の酵素を何らこの方法において使用しない。別の局面において、核酸フラグメントを増幅することを生成するための方法が提供され、この方法は、以下の一般的な工程：（ａ）第一のプライマーを、標的核酸配列の５’側に対して特異的にハイブリダイズさせる工程であって、この第一のプライマーは標的結合領域の５’の制限酵素認識配列を含む、工程、（ｂ）（ａ）と同時に、第一のプライマーの５’側に対して、第二のプライマーを、リボソームタンパク質、および／またはスペルミン、および／またはキレート剤および界面活性剤を含む条件下で、ハイブリダイズする工程、（ｃ）第一および第二のプライマーを伸長して，その結果、第一のプライマー伸長産物が、第二のプライマーの伸長によって標的核酸配列から置換される工程、（ｄ）第一のプライマー伸長産物を、相補鎖を合成することにより二本鎖とする工程、ならびに（ｅ）増幅反応において第一のプライマー伸長産物を増幅する工程であって、ここで、二本鎖核酸フラグメントの制限酵素認識部位が制限酵素によって切断される、工程を包含する。上記の任意のアッセイを含むさらに適切なアッセイ形式の代表的な例は、ディップスティック、磁気ビーズなどのような固体支持体上で実施される（一般に、米国特許第５，６３９，４２８号；同第５，６３５，３６２号；同第５，５７８，２７０号；同第５，５４７，８６１号；同第５，５１４，７８５号；同第５，４５７，０２７号；同第５，３９９，５００号；同第５，３６９，０３６号；同第５，２６０，０２５号；同第５，２０８，１４３号；同第５，２０４，０６１号；同第５，１８８，９３７号；同第５，１６６，０５４号；同第５，１３９，９３４号；同第５，１３５，８４７号；同第５，０９３，２３１号；同第５，０７３，３４０号；同第４，９６２，０２４号；同第４，９２０，０４６号；同第４，９０４，５８３号；同第４，８７４，７１０号；同第４，８６５，９９７号；同第４，８６１，７２８号；同第４，８５５，２４０号；および同第４，８４７，１９４号を参照のこと）。Ｇ．検出サイクリング（または、検出反応を実施した）後、切断された核酸プローブ（または、他の反応産物）の存在または非存在は、当該分野で周知の種々のリガンド、標識、またはタグを用いて直接または間接の形式で検出され得る。手短には、検出は、オリゴヌクレオチドの直接の標識のありまたはなしで、およびハイブリダイズしていない核酸分子を除去するための分離工程のありまたはなしで、実施され得る。標識されていない核酸プローブ（または、検出反応の他の産物）は、一本鎖分子が二重鎖を形成する場合に生じる物理的変化によって検出され得る。状態における変化は、ｄｓＤＮＡインターカレーター（色素）または抗体の使用によって検出され得る。インターカレーターの例は、エチジウムブロマイド、ＹＯ−ＰＲＯ−１およびＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Ｒｉｒｉｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４５：１５４−１６０、１９９７において引用される）を含む。あるいは、濃色および紫外線分光高度学的方法が用いられ得る。別の手段は、二重鎖が形成される場合の電気伝導性における変化を検出することによる。あるいは、核酸プローブは、サイクリング（または検出反応）の前に直接標識され得るか、またはタグ（例えば、アビジンまたはビオチン）の使用により、サイクリングの前に間接的に標識され、次いでサイクリングの後にタグに対して標識を付着され得る。標識は、例えば、放射性、酵素的、蛍光、化学発光、または生物発光であり得る（一般的には、ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ、前出、Ｗｅｔｍｕｒ、前出を参照のこと）。溶液または固定アッセイにおける使用のために、標識は、核酸プローブに直接または間接的に結合され得る。さらなる実施態様において、反応産物は、上記のような固体支持体を利用してか、および／またはさらなる処理（例えば、伸長反応の使用など）を介して検出され得る。以下の実施例は、例示の目的で提供され、制限するためではない。実施例実施例１核酸プローブの構築核酸分子を、自動化固相合成機（例えば、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＥｘｐｅｄｉｔｅＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ３９１ＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＰＣＲ−ＭＡＴＥＥＰ）またはＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．のＭｏｄｅｌ３９４ＤＮＡ／ＲＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ））において、標準的な化学薬品を利用して合成し得る。好ましくは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＥｘｐｅｄｉｔｅＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを使用し、そしてオリゴヌクレオチドを作製するために製造者が改変したプロトコルを実施する。オリゴヌクレオチドの合成のための試薬は、合成機製造業者（例えば、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．，ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）およびＢｉｏｇｅｎｅｘ）を含む、種々の供給源から市販されている。ＤＮＡおよびＲＮＡ合成のために、好ましいフルオレセインアミダイト、デオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドのホスホルアミダイト、２’−Ｏ−メチルおよび活性化剤、ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、酸化剤のような試薬、およびトリチル脱ブロッキング試薬は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である。Ｂｉｏｔｉｎ−ＴＥＧ−ホスホルアミダイトおよびＢｉｏｔｉｎ−ＴＥＧ− ＣＰＧは、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈから入手可能である。オリゴヌクレオチドの脱保護のために使用される水酸化アンモニウム（２８％）を、Ａｌｄｒｉｃｈから購入する。２’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基を除去するために使用する１Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ）を、Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、そして２４時間の分子ふるいを通して乾燥後に使用する。全ての緩衝液を、高圧滅菌水から調製し、そして０．２μｍフィルターを通して濾過する。以下の手順を、ビオチン化および／または蛍光化オリゴヌクレオチドを調製するために使用する。ビオチン−ＴＥＧ−ＣＰＧ（１μｍｏｌ）を合成カラム中へ充填する。次いで、ヌクレオシドホスホルアミダイトを連結して、オリゴヌクレオチドを作製するためのＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍの改変されたプロトコルを使用して、規定された核酸配列を作製する。フルオレセインアミダイトを最終濃度の０．１Ｍまでアセトニトリル中に溶解する。フルオレセインアミダイトを合成機にロードし、そしてオリゴヌクレオチドの５’末端に付加する。あるいは、チオリンカーを含むホスホルアミダイトを、改変されたプロトコルを使用して、キメラプローブの５’末端に付加する。以下に記載する脱保護工程の後、このプローブをＭｉｌｌｉｐｏｒｅＲ２樹脂（これは、オリゴヌクレオチドを含むトリチルを保持する）を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製する。遊離の反応性チオ基を生成するために、ＨＰＬＣ精製したプローブを室温にて９０分間硝酸銀を用いて処理し、続いてジチオスレイトール（ＤＴＴ）により硝酸銀を中和する。次いで、フルオレセインマレイミドを、プローブの遊離チオ基に付加し、次いで、以下に記載されるようにＨＰＬＣまたは電気泳動のいずれかによって精製する。オリゴヌクレオチド配列の合成後、オリゴヌクレオチドを結合した樹脂を、最初２５％のエタノールアンモニウム酸化物（４ｍｌ）で１時間室温にて、そして続いて密閉した試験管内で１６時間５５℃で、処理する。試験管を冷却し、上清を除去し、そしてアンモニアを除去するために、乾燥するまで濃縮する。残留物を１ｍｌの水に溶解し、そして０．２μｍのフィルターを通して濾過する。ＯＤ₂₆₀ を決定し、そしてＯＤ₂₆₀単位が約２であるアリコートをＢｉｏｃａｄのＨＰＬＣのＲ−２カラムへ注入し、キメラプローブのｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基について、クロマトグラムにおいてベースラインを得る。残存のプローブ溶液を１．５ｍｌ微小遠心管中で、遠心真空エバポレーター（Ｌａｂｃｏｎｃｏ）によって凍結乾燥する。得られたオリゴヌクレオチド残留物を、２４時間１．０ＭのＴＢＡＦで脱保護化する。脱シリル化（これはすでに生じている）の範囲を決定するために、ｐＨ６．５の５０ｍＭのトリエチルアンモニウムアセテート（ＴＥＡＡ）中、０から６０％の直線勾配を使用して、ＴＢＡＦ反応混合物のアリコートをＨＰＬＣ（Ｒ２カラム）へ注入する。部分的な脱シリル化のみが生じる場合、ＴＢＡＦ反応混合物を、保護基の完全な除去のためにさらに１２〜１６時間の間続ける。ＴＢＡＦ反応混合物を１００ｍＭのＮａＯＡｃ、ｐＨ５．５でクエンチングし、そして乾燥するまでエバポレートさせる。粗製のオリゴヌクレオチド産物をＰ−６カラム（２ｃｍ×１０ｃｍ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で脱塩し、この画分を濃縮して約１ｍｌにし、そしてこの濃縮物をＯＤ₂₆₀ で測定する。粗製オリゴヌクレオチドを、２０％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素を使用してポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により精製する。泳動ゲル緩衝液は１×ＴＢＥ（Ｔｒｉｓ−ホウ酸−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ｐＨ８．３）であり、そして電気泳動を５０ｍＡ電流で３．５〜４時間実行する。オリゴヌクレオチドバンドをＵＶ光で可視化し、切り出し、１５ｍｌプラスチックコニカルチューブ中に入れ、そして５ｍｌの５０ｍＭＮａＯＡｃ（ｐＨ５．５）中で約１２時間ゲルを破砕しそして浸たすことにより抽出した。次に、このチューブを３０００ＲＰＭで遠心分離し、パスツールピペットを用いて上清を注意深く除去する。このゲルを２ｍｌの抽出緩衝液でリンスして、残りの生成物をすべて取り出す。合わせた抽出物を約１ｍｌの容量まで濃縮し、そしてＰ−６カラム上で脱塩する。プローブを含む画分をプールし、そして約２ｍｌの最終容量にまで濃縮する。オリゴヌクレオチドの分析的純度を［γ³²Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼを用いてオリゴヌクレオチドの５’末端を標識すること、および次いでＰＡＧＥ上で標識オリゴヌクレオチドを泳動することによりチェックする。ＯＤ₂₆₀を、ＨｅｗｌｅｔｔＰａｃｋａｒｄ’ｓ８４５ＸＵＶ分光光度計を使用して測定する。オリゴヌクレオチド溶液を、０．２ μｍフィルターを通して濾過し、そして−２０℃で保存する。上記の手順を利用して、以下のオリゴマーを合成した（大文字はデオキシリボヌクレオチドを示すため、そして小文字はリボヌクレオチドを示すために利用した）。ＡＲＫ２プローブ配列（配列番号１）５’−ＧＴＣＧＴＣＡＧＡＣＣＣａａａａＣＣＣＣＧＡＧＡＧＧＧ−３’ ＡＲＫ２Ｔ標的配列（配列番号２）５’−ＣＣＣＴＣＴＣＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＡＣ −３’ ＡＲＫ２−９５標的配列（配列番号３）５’−ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＴＣＧＧＧＧＴＴＴＴＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡＣＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＴＴ−３’ ｍｅｃＡ９４５−２９プローブ配列（配列番号４）５’−ＡＡＴＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧａａａａＡＡＧＡＴＧＧＣＡＡＡＧ−３’ｍｅｃＡ９４５−Ｔ標的配列（配列番号５）５’−ＣＴＴＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＴ−３’ ｍｅｃＡ８３４−２５（配列番号６）５’−ＴＧＧＴＡＡＡＡＡＧＧＧＡＣＴＣＧＡＡＡＡＡＣＴＴ −３’ ｍｅｃＡＬ１０３９−２２（配列番号７）５’−ＧＧＴＧＧＡＴＡＧＣＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＣＣ−３’ 実施例２サイクリングプローブ反応サイクリングプローブ技術（ＣＰＴ）反応を、本質的に、ＷＯ９５／１４１０６およびＢｅｋｋａｏｕｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２０（２）：２４０−２４８，１９９６、６２０１に記載の条件の下で実施する。キメラのプローブを、放射性［³²Ｐ］−ＡＴＰ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９９０）用いて、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＲＴＧ；ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用して５’標識する。他に特定しない限り、標識したプローブを、取り込まれていない［³²Ｐ］−ＡＴＰから、Ｇ５０ＮＩＣＫカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーによって精製する。他に言及しない限り、最終のサイクリング反応混合物は、ＴｒｉｓまたはＴＥＳサイクリング緩衝液（Ｔｒｉｓ−またはＴＥＳ−ＣＢ）中の、特定された濃度のキメラプローブおよび合成または天然の核酸標的を含む。この緩衝液は、以下を含１または２０ｍＭＴＥＳ緩衝液、ｐＨ６．８。サンプル調製物、プローブ、標的、緩衝液成分、試験添加物の添加、異種ＤＮＡ、および他の成分の詳細は、以下の実施例に記載する。他に特定しなければ、ＣＰＴ反応物を、６５℃で３０分間インキュベートし、次いで尿素ローディング緩衝液（１０Ｍ尿素、１００ｍＭＥＤＴＡおよびそれぞれ０．０２５％のブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール）を氷上で添加することにより停止する。次いでこの反応混合物を、冷却しながら、５００ボルトで７Ｍ尿素−２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミド（１９：１）ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離した。このゲルを、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ^TMソフトウェアを利用するＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ^TM（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上で分析した。サイクルプローブの量を、インタクトなまたはプローブ切断に対応するバンドの面積の積分により見積もった。他に言及しなければ、ＣＰＴ反応において、パーセントプローブ切断はインプットプローブの総量に対するプローブ切断の総量である（方程式番号１）：パーセントプローブ切断＝（プローブ切断／総インプットプローブ）×１００ …（１）単純ＣＰＴ系において、Ｃ１バックグラウンドとは、ＲＮａｓｅＨも相同標的も存在しない反応緩衝液中のパーセントプローブ切断をいう。Ｃ２とは、相同標的を伴わないＲＮａｓｅＨの存在下でのパーセントプローブ切断をいう（方程式番号２）：Ｃ２＝（プローブ切断／総インプットプローブ）×１００…（２）複雑ＣＰＴ系について、Ｃ３とは、ＲＮａｓｅＨの非存在下で、サンプル（異種ＤＮＡまたはタンパク質のような外来の成分を含む生物学的サンプル）中のパーセントプローブ切断をいう。Ｃ４とは、ＲＮａｓｅＨの存在下であるが異種標的の非存在下での、生物学的サンプル中のパーセントプローブ切断をいう。（方程式番号３）：Ｃ４＝（プローブ切断／総インプットプローブ）×１００…（３）正味のパーセントプローブ切断は、相同標的に起因するプローブ切断のパーセントであり、そしてパーセント切断からバックグラウンドＣ２（単純系）またはＣ４（複雑系）を差し引くことにより計算される（それぞれ、方程式番号４または５）。正味のパーセント切断＝パーセント切断−Ｃ２…（４）正味のパーセント切断＝パーセント切断−Ｃ４…（５）ＣＰＴについてシグナル対ノイズの比（Ｓ：Ｎ）を、Ｃ２（単純系、方程式番号６）またはＣ４（複雑系、方程式番号７）に対する、相同標的の存在下でのパーセントプローブ切断の比と定義する。Ｓ：Ｎ＝パーセント切断／Ｃ２…（６）Ｓ：Ｎ＝パーセント切断／Ｃ４…（７）実施例３異種ＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応における熱安定性ＲＮａｓｅＨ調製物および改変体本実施例は、異種ＤＮＡを含むＣＰＴ反応物において観察される差異が、反応において使用されたＴｈｅｒｍｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＲＮａｓｅＨ酵素バッチによって生じ得ることを実証する。ネイティブなＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＲＮａｓｅＨを、ＩｔａｙａおよびＫｏｎｄｏ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：４４４３−４４４９、１９９１、ＫａｎａｙａおよびＩｔａｙａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０１８４−１０１９２、１９９２に記載され、そしてＢｅｋｋａｏｕｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２０：２４０−２４８、１９９６によって改変されるとおりに精製した。最初、最終のＲＮａｓｅＨバッチ調製物の各々を、ＳＤＳＰＡＧＥおよびタンパク質の銀染色によって分析した。これらのＲＮａｓｅＨバッチは、純粋であるようであり、従って等価であるとみなした。単純系を使用する（異種ＤＮＡなしの）最初の実験は、バッチ間でほとんど変動がないことを示し、それによりそれらの等価性が確認された。しかし、いくつかのバッチを異種ＤＮＡ（例えば、ｈｇＤＮＡ）を含んだＣＰＴ反応において試験した場合、ＣＰＴ反応の結果において説明が付かない大きな変動が存在した。従って、以下の実験を、ＲＮａｓｅＨバッチ間の変動を系統的な様式で試験するように設計した。この実験において、上記の方法によって産生された６つの別個のバッチの熱安定性ＲＮａｓｅＨを、ｈｇＤＮＡの存在下または非存在下でのＣＰＴ反応において比較した。以下のＲＮａｓｅＨバッチ調製物：Ａ６−１、Ａ７−１、Ａ８−１、Ａ１０− １、Ａ１１−１およびＡ１２−１を比較した。キメラプローブＡＲＫ２（配列番号１）を、実施例１に記載されるように合成および標識した。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからの同種標的およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｏｒｄｏｎｎａｅからの異種ＤＮＡを、Ｂｅｇｇｓら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３４：２９８５−２９８９、１９９６に記載されるように調製した。ＤＮＡの各タイプを、１×Ｔｒｉｓサイクリング緩衝液（ＣＢ、ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．１）に希釈した。ＣＰＴ反応および分析を実施例２に記載のように以下の例外を除いて実施した：４０μｌの最終反応容量におけるＴｒｉｓサイクリング緩衝液中、３０００ｃｐｍのＡＲＫ２プローブ（配列番号１）、２．５ｎｇのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡ（５×１０⁵ 細胞等価物のＤＮＡ）、特定のバッチ調製物からの４μｇＲＮａｓｅＨ、１ μｇのＥ．ｃｏｌｉの一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、２００ｎｇのｈｇＤＮＡありまたはなし。Ｃ４バックグラウンドを、非特異的ゲノムＭ．ｇｏｒｄｏｎｎａｅＤＮＡを用いて、実施例２に記載のように得、そしてこの値を試験値から減ずることによって、正味のパーセントプローブ切断を実施例２に記載のように得た。表１は、ｈｇＤＮＡの存在下または非存在下での異なるＲＮａｓｅＨ酵素バッチを用いるＣＰＴによってＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを検出した結果を示す。正味のパーセントプローブ切断は高く、そしてｈｇＤＮＡの添加なしで同じ濃度の各バッチからのＲＮａｓｅＨを用いるサンプルにおけるＣＰＴ反応において用いたＲＮａｓｅＨのバッチ間にわずかな変動が観察された。しかし、２００ｎｇのｈｇＤＮＡの存在下で、異なるＲＮａｓｅＨバッチを用いた正味のパーセントプローブ切断は、２つの驚くべき差異を示した。第一の差異は、正味のパーセントプローブ切断が減少したことであり、および第二の差異は、酵素バッチ間に、１３〜５０％におよぶ正味のパーセントプローブ切断における大きな変動が存在したことであった。これらの結果は、興味深い。なぜなら、ｈｇＤＮＡの存在が、正味のパーセントプローブ切断の減少を生じたのであれば、ｈｇＤＮＡが存在しなかった類似のサンプルと比較して比例した減少が存在するはずである。従って、これらの結果は、ｈｇＤＮＡ以外の供給源の変動が、ＣＰＴ反応において用いた酵素バッチが異なることのみであったことを示唆する。なぜなら、残りの成分および条件は、各反応において同じであったからである。表１．ｈｇＤＮＡ（２００ｎｇ）の存在下または非存在下で、ＣＰＴ反応においてＭ．ｇｏｒｄｏｎｎａｅおよびＳＳＢの存在下で、キメラプローブＡＲＫ２およびゲノムＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＤＮＡ標的を用いた、Ｃ４バックグラウンドおよび正味パーセントプローブ切断に対する異なるバッチの熱安定性ＲＮａｓｅＨの効果 ¹正味のパーセントプローブ切断を、実施例２に記載のようにＭ．ｇｏｒｄｏｎｎａｅＣ４バックグラウンドを総計パーセントプローブ切断から減ずることによって得た。² 正味のパーセントプローブ切断を、実施例２に記載のようにｈｇＤＮＡおよびＭ．ｇｏｒｄｏｎｎａｅＣ４バックグラウンドを総計パーセントプローブ切断から減ずることによって得た。実施例４ＣＰＴ反応において変動を生じる成分の同定以下の実施例は、ＣＰＴ反応における変動の、ＲＮａｓｅＨバッチ調製物における夾雑タンパク質成分の存在との驚くべき相関を示す。実施例３で用いたＲＮａｓｅＨ酵素バッチの各々を、２０％のＰｈａｓｔＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、電気泳動でそれらを分離することによってそれらの純度について公知の分子量タンパク質標準（６．２ｋＤａ〜１６．９ｋＤａ）と比較して分析した。電気泳動後、ゲル中のタンパク質を、クーマシーブルーで染色した。異なるＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＲＮａｓｅＨ酵素バッチからの図２のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。予想されるように、主要なＲＮａｓｅＨタンパク質バンドは、約１９ｋＤａに分離された。しかし、約９〜１４ｋＤａの範囲にもまた観察された、種々の量のさらなるより小さなタンパク質バンドが存在した。マイナーなバンドの２つは、分子量標準と比較して約１０ｋＤａおよび１３ｋＤａであった。酵素バッチの各々について、タンパク質成分および相対濃度を、実施例３のＣＰＴ反応において切断されたプローブの相対量と比較した。この実験および実施例３を合わせた結果を、以下の表２にまとめる。ＲＮａｓｅＨバッチ調製物の数を、調製物の相対純度に従って再度並べ、そして酵素バッチを、１（約９５％を超える純度について）から、６（約９０％の純度について）までにランク付けする。驚くべきことに、表２の結果は、酵素バッチのこれらのタンパク質の存在と、各ＣＰＴ反応において生成した正味のパーセントプローブ切断との間に予想外の相関が存在したことを示す。ＲＮａｓｅＨ酵素バッチに存在する、「１０ｋＤａ」および「１３ｋＤａ」タンパク質の相対量の増加とともに、正味のパーセントプローブ切断における相伴う増加が存在する。これらのタンパク質を、ＲＮａｓｅＨの補助（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ）タンパク質と称する。これらのＲＮａｓｅＨの間の差異は、以下の１以上に起因して、以前には見いだされなかった：最終ＲＮａｓｅＨバッチ調製物の各々を、銀染色（これは、これらの不純物を効率よくは染色しない）によって分析した；これらすべてのバッチを、単純ＣＰＴ系（すなわち、異種核酸の添加なし）において試験し、そして各バッチは、有意ではない小さな変動を有していた；ＲＮａｓｅＨ誘導のレベルはバッチ毎に変動し、そして最後に精製の間に採取した画分は、バッチ毎に、ＲＮａｓｅＨ誘導のレベルに依存して変動した。表２：異なるバッチの酵素の相対純度、「１０ｋＤａ」および「１３ｋＤａ」タンパク質の相対量、および２００ｎｇのｈｇＤＮＡの存在下または非存在下での正味のパーセントプローブ切断の比較 ¹各タンパク質の酵素バッチにおける存在および相対量を、プラスの印（＋）の数によって示す。タンパク質の非存在を、マイナスの印（−）によって示す。^2,3 正味のパーセントプローブ切断の結果は、表１、実施例３由来である。上記の実施例は、部分精製したＲＮａｓｅＨ調製物に存在する、「１０ｋＤａ」および「１３ｋＤａ」タンパク質のような補助タンパク質の存在および量が異種ＤＮＡを含んでいたサンプル中での正味のパーセントプローブ切断と相関していたことを示す。相対的に純粋なＲＮａｓｅＨ（すなわち、最小限の補助タンパク質または補助タンパク質なし）が、異種核酸の存在下でのＣＰＴ反応において活性を減少または最小限にしたこともまた予想外であった。従って、これらの補助タンパク質は、ＣＰＴ反応において有益な効果を有するようである。実施例５補助タンパク質の部分精製以下の実施例は、補助タンパク質の部分精製を示す。「１０ｋＤａ」補助タンパク質を、Ｂｅｋｋａｏｕｉら、前出の改変によって単離した。タンパク質の溶液を、第二の５ｍｌホスホセルロースに適用する工程の後、および尿素の非存在下で、タンパク質の溶出を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）における０．３〜１．０ＭＮａＣｌの勾配を用いて実施した。タンパク質の画分を、微量濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ１０、Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で濃縮し、そしてＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）に、酢酸緩衝液（２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．５、および１５０ｍＭＮａＣｌ）を用いて適用した。「１０ｋＤａ」タンパク質は、主要なＲＮａｓｅＨタンパク質ピークの後に溶出し、そしてこれを微量濃縮器で濃縮した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４，１９７６）によって決定した。上記の方法は、約９０％純度までの補助タンパク質の精製を可能にする。「１３ｋＤａ」タンパク質もまた、部分精製した（データ示さず）。これらのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、以前に記載の通りに分析し、そして推定分子量が、それぞれ、約１０ｋＤａおよび１３ｋＤａであることを確認した。実施例６部分精製した補助タンパク質を用いたＣＰＴ反応の改良以下の実施例は、精製したＲＮａｓｅＨを含む反応混合物に部分精製した「１０ｋＤａ」補助タンパク質を添加することが、異種ＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応を改良することを確認する。この実験において、相対的に純粋なＲＮａｓｅＨまたは部分精製したＲＮａｓｅＨ、およびｈｇＤＮＡを含むＣＰＴ反応混合物における部分精製された「１０ｋＤａ」タンパク質の濃度の増加の効果を試験した。キメラプローブＡＲＫ２（配列番号１）を、実施例１に記載のように合成し、そして実施例２に記載のように標識した。標的ゲノムＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを、Ｂｅｇｇｓら、前出の方法によって記載されるように調製した。部分精製したＲＮａｓｅＨＡ８− １および相対的に純粋なＲＮａｓｅＨＡ１２−１を、実施例３に記載のように生成し、そして純度について分析した。部分精製した「１０ｋＤａ」タンパク質を、実施例５に記載のように調製し、そして１００ｎｇ〜１０００ｎｇのタンパク質をＣＰＴ反応において試験した。ＣＰＴ反応および分析を、以下の例外を除いて本質的に実施例２に記載の通りに行った：４０μｇｌの最終反応容量中で、Ｔｒｉｓサイクリング緩衝液中の３０００ｃｐｍのＡＲＫ２プローブ、２．５ｎｇのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡ（５×１０⁵細胞等価物のＤＮＡ）、特定バッチの調製物由来の４μｇＲＮａｓｅＨ、１μｇのＥ．ｃｏｌｉＳＳＢ、２００ｎｇｈｇＤＮＡ。以下の表３は、部分精製したＲＮａｓｅＨおよび精製したＲＮａｓｅＨを用いたＣＰＴ反応における「１０ｋＤａ」タンパク質の濃度の増加の効果の結果を示す。正味のパーセントプローブ切断の最小限の増加が、ＳＳＢを、精製したＲＮａｓｅＨを含む反応物に対する添加物としてのみ使用した場合に、存在した。１００ｎｇ〜１０００ｎｇに及ぶ「１０ｋＤａ」タンパク質の添加は、約３０％のＣＰＴ産物の増加をもたらした。対照的に、「１０ｋＤａ」タンパク質を部分精製したＲＮａｓｅＨを含むサンプルに添加した場合には、パーセントプローブ切断の増加は存在しなかった。事実、試験した最高の濃度で、パーセントプローブ切断は、２５％減少した。これらの結果は、「１０ｋＤａ」タンパク質の添加が、精製したＲＮａｓｅＨをｈｇＤＮＡの存在下で用いる場合にＣＰＴ反応を改良することを示す。準精製したＲＮａｓｅＨは、すでに、「１０ｋＤａ」タンパク質および他の補助タンパク質（実施例３および４を参照のこと）を含んでおり、従って、「１０ｋＤａ」タンパク質の反応混合物へのさらなる添加は、反応には効果を与えないかもしれずまたは実際にはＣＰＴ反応を阻害するのかもしれない。従って、「１０ｋＤａ」タンパク質の、反応における効果は、濃度依存性であるようである。さらに、これはまた、試験したサンプルに存在する核酸の濃度にも依存し得る。表３．部分精製したかまたは精製したＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＲＮａｓｅＨを含むＣＰＴ反応混合物への部分精製した「１０ｋＤａ」タンパク質の添加、およびＡＲＫ２プローブを用いるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＤＮＡの検出についてのパーセントプローブ切断に対するその効果これまでに、異種ＤＮＡによるＣＰＴ反応の阻害は、反応物において使用した部分精製したＲＮａｓｅＨの濃度の増加によって改良され得ることが見いだされている（データ示さず）。上記の実験および実施例４からの結果は、ＣＰＴ反応の改良を担う（少なくとも部分的に）成分は、ＲＮａｓｅＨとともに同時精製された補助タンパク質であることを示唆している。上記の実施例は、部分精製したＲＮａｓｅＨに存在する補助タンパク質がｈｇＤＮＡの存在下でＣＰＴ反応を改良の原因でことを確認する。実施例７精製した熱安定性ＲＮａｓｅＨおよび部分精製した熱安定性ＲＮａｓｅＨの調製以下の実施例は、精製した熱安定性ＲＮａｓｅＨおよび部分精製した熱安定性ＲＮａｓｅＨを調製するために利用した制御方法を示す。部分精製した、および精製したＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＲＮａｓｅＨを生成するための方法は、Ｂｅｋｋａｏｕｉら、前出に、基づき、以下の改変を伴った。手順を、１ｌフラスコから６ｌ発酵器にまでスケールアップした。調製物の収量をさらに増加するために、合計３６ｌに由来するタンパク質を、１２ｌのロットにおいて処理およびプールし、その後Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−７５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によってゲル濾過した。ゲル濾過を、２０ｍＭＮａＡｃｐＨ５．５、１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液を用いて、１ｍｌ／分の流速で行った。１ｍｌの画分を、１２０分間の時間にわたって採取した。Ａ２４−１の調製物について、画分１４〜３２を採取およびプールした。ピークの肩における画分は補助タンパク質を含んでいた。Ａ２６−１の調製物について、タンパク質サンプルを、画分１９〜２７のみを採取およびプールしたことを除いて、本質的にＡ２４− １バッチのように処理した。これらのカラム画分はＲＮａｓｅＨを含んでいた。図３は、部分精製したＲＮａｓｅＨ、Ａ２４−１（レーン２）および精製したＲＮａｓｅＨ、Ａ２６−１（レーン３）のクーマシーブルー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。ゲルから理解し得るように、精製したＲＮａｓｅＨサンプルは、ＲＮａｓｅＨの主要な一つのバンドを、約１９ｋＤａの相対分子量を伴って、示した。部分精製したＲＮａｓｅＨサンプルは、主要なＲＮａｓｅＨ、ならびにさらに、「１３ｋＤａ」、「１０ｋＤａ」補助タンパク質の２つのマイナーなバンドおよび微量の他の補助タンパク質を示した。実施例８ＣＰＴ反応における異種ＤＮＡの効果以下の実施例は、サンプル中の漸増量の異種ＤＮＡがバックグラウンドを増加させ、そして標準的なＣＰＴ反応におけるパーセントプローブ切断を減少させることを示す。キメラプローブＡＲＫ２（配列番号１）および合成標的ＡＲＫ２−９５（配列番号３）を合成し、そしてプローブを実施例１および２に記載のように標識した。精製したＲＮａｓｅＨＡ２６−１および部分精製したＲＮａｓｅＨＡ２４ −１を、実施例７に記載のように調製した。ｈｇＤＮＡを、０〜８００ｎｇの最終濃度を用いて力価測定した。ＣＰＴ反応および分析を、以下を除いて本質的に実施例２に記載のように行った：３０μｌの最終反応容量中、０．６ｆｍｏｌ（２０００ｃｐｍ）のＡＲＫ２プローブ、１×１０^-5ｐｍｏｌの標的ＡＲＫ２−９５、８．０ｍＭＭｇＣｌ₂、１μｇの精製したＲＮａｓｅＨ（Ａ２６−１）または部分精製したＲＮａｓｅＨ（Ａ２４−１）、０．０２５％ＴｒｉｔｏｎＧＴＡ）、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．１。上記の実験の結果を表４にまとめる。手短には、ｈｇＤＮＡの非存在下、精製したＲＮａｓｅＨを含むサンプルは、部分精製したＲＮａｓｅＨを含むサンプルと比べて、より大きな正味のパーセントプローブ切断を有していた。しかし、４ｎｇのｈｇＤＮＡの精製したＲＮａｓｅＨを含むサンプルへの添加の際にＣ４バックグラウンドは増加した。ｈｇＤＮＡの４ｎｇを超える添加は、バックグラウンドおよびパーセントプローブ切断の両方を、標的の非検出のレベルまでへ減少させた。部分精製したＲＮａｓｅＨを含むサンプルは、１００〜２００ｎｇｈｇＤＮＡおよび２００ｎｇを超えるｈｇＤＮＡに寛容であり、バックグラウンドおよびパーセントプローブ切断の両方が、標的の検出が存在しない点にまで減少した。表４．精製した（Ａ２６−１）および部分精製した（Ａ２４−１）ＲＮａｓｅＨを用いた、ＡＲＫ２−９５（配列番号３）標的のＣＰＴ検出のために使用したサンプルにおけるｈｇＤＮＡの濃度の増加の効果 ¹部分精製したＲＮａｓｅＨ² 精製したＲＮａｓｅＨ上記の実施例は、異種ＤＮＡが、精製したＲＮａｓｅＨおよび部分精製したＲＮａｓｅＨの両方を含むサンプルについて、バックグラウンドを増加し、そしてまた正味のパーセントプローブ切断を減少させることを確認する。部分精製したＲＮａｓｅＨを用いて実施したＣＰＴ反応は、相対的に純粋なＲＮａｓｅＨと比較して、ｈｇＤＮＡのより多い濃度に寛容であり得る。実施例９リボソームタンパク質としての、補助タンパク質の精製および特徴付け以下の実施例は、補助タンパク質のさらなる精製およびアミノ酸配列特徴付けを示し、驚くべき結果として、これらの補助タンパク質はＥ．ｃｏｌｉリボソームタンパク質として同定される。「１０ｋＤａ」タンパク質を、実施例５に示すように部分精製し、そしてこのタンパク質のアミノ酸配列決定を以下のように行った。タンパク質を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｂｉｏ−ＲａｄＭｉｎｉ−ｃｅｌｌ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）上で、トリシン緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ、トリシン１００ｍＭ、ｐＨ８．３、０．１％ＳＤＳ）を用いて、分離した。次いで、タンパク質を、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ^SQメンブレンに対して、グリシン緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓＢａｓｅ、１９２ｍＭグリシンおよび２０％メタノール）を用いて電気ブロットを行った。メンブレンを、クーマシーブルーを用いて染色し、そして可視化されたタンパク質バンドを切り出した。サンプルのアミノ酸配列決定を、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７０Ａ気相配列決定機を用いて、オンラインＰＴＨ分析機および９００Ａシステムコントローラを用いて、行う。Ｇｅｎｅｂａｎｋ配列を用いた相同性検索を、Ｂｌａｓｔ／Ａｌｉｇｎプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０、１９９０）を用いて行った。上記の方法を用いて、「１０ｋＤａ」を配列決定し、そして部分アミノ酸配列を、以下の表５に示す。部分アミノ酸配列の、Ｇｅｎｅｂａｎｋタンパク質配列との整列は、「１０ｋＤａ」と、Ｅ．ｃｏｌｉからのＬ３４のリボソームタンパク質の最初の２１アミノ酸との９０％を超える相同性を示した。「１３ｋＤａ」タンパク質もまた精製し、そして特徴付け（データ示さず）をし、そして配列がＥ．ｃｏｌｉからのＳ１９リボソームタンパク質と一致することが見いだされた（表５）。表５．以下は、「１０ｋＤａ」および「１３ｋＤａ」タンパク質の部分アミノ酸配列、続いて相同性検索から得られた部分アミノ酸配列である。 ¹「１０ｋＤａ」タンパク質の最初の２１アミノ酸は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のリボソームタンパク質Ｌ３４のアミノ酸配列と一致した（Ｘは、同定されなかったアミノ酸を示す）。² 「１３ｋＤａ」タンパク質配列からの最初の１８アミノ酸は、Ｅ．ｃｏｌｉからのＳ１９リボソームタンパク質の配列と８３％相同であった。以下の実験を実施して、精製したＳ１９、精製したＬ３４、合成Ｌ３４の電気泳動プロフィールと、部分精製したＲＮａｓｅＨおよび精製したＲＮａｓｅＨとを、２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥＰｈａｓｔシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、比較した。電気泳動を、製造者が推奨する手順に従って実施し、そしてタンパク質をクーマシーブルーを用いて染色した。Ｌ３４を、Ｂ．Ｃｏｏｐｅｒｍａｎ博士（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）から得た。Ｌ３４もまた、Ｌ３４の公開されたアミノ酸配列に基づいて、ＰｒｏｔｅｉｎＳｅｒｖｉｃｅＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＢｒｉｔｉｓｈＣｏｌｏｍｂｉａ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）によって合成し、そして配列を、アミノ酸分析および質量スペクトルによって確認した。図３は、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＲＮａｓｅＨ酵素、精製したＳ１９、Ｌ３４および合成Ｌ３４のゲル電気泳動プロフィールの結果を示す。２つの補助タンパク質の推定分子量を、低分子量標準と比較して、約１０ｋＤａおよび１３ｋＤａであると決定した。Ｌ３４および「１０ｋＤａ」タンパク質は、同じプロフィールおよび約１０ｋＤａの推定分子量を有した。アミノ酸配列からのＥ．ｃｏｌｉＬ３４の推定分子量は、約５．４ｋＤａであることに留意すべきである。分子量における異常は、Ｌ３４がソフトウェアプログラムＤＮＡＳＩＳ（Ｈｉｔａｃｈｉ、ＳａｎＢｒｕｎｏ、ＣＡ）によって見積もられた高度に正の荷電および１３．５という等電荷電を有することに起因し得る。これはまた、単離された補助タンパク質Ｌ３４がＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてより低い移動度をもって移動し、そして実施例４に従えば約１０ｋＤａの推定分子量を有した理由を説明し得る。リボソームタンパク質の大部分は、比較的塩基性であり、そして高含量の塩基性アミノ酸を伴って、高い等電点を有する（Ｋａｌｔｓｃｈｉｍｄｔ、Ｇｉｒｉら、前出において引用される）。Ｌ３４の分子量は、４６アミノ酸残基を伴って５．４ｋＤａであり、そしてＳ１９は、９１残基を伴って１０．３ｋＤａである（Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄ。Ｇｉｒｉら、前出において引用される、Ｗｉｔｔｍａｎｎ、Ｇｉｒｉら、前出において引用される）。従って、部分精製された熱安定性ＲＮａｓｅＨ調製物から単離されたこれら２つのタンパク質は、Ｌ３４およびＳ１９Ｅ．ｃｏｌｉリボソームタンパク質であると結論づけた。上記の実施例は、ＲＮａｓｅＨ酵素の異なるバッチを用いるＣＰＴ反応における異種ＤＮＡを含むサンプルの正味のパーセントプローブ切断における差異の原因となる成分と同定された補助タンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉのリボソームタンパク質であるとことを示した。これらのタンパク質は、ＲＮａｓｅＨ精製プロセスの部分として、ＲＮａｓｅＨ調製物ととともに偶然に存在していた。熱安定性ＲＮａｓｅＨが、ＤＮＡと二重鎖形態である場合にＲＮＡを切断することは当該分野で公知であったが、これらのリボソームタンパク質が、精製されたＲＮａｓｅＨを異種ＤＮＡの存在下で使用した場合に、ＣＰＴ反応を改良するという事実は、予期されない発見であった。実施例１０ＣＰＴ反応において酵母リボソームタンパク質が異種ＤＮＡによって生じたバックグラウンドを減少する効果以下の実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉ以外の生物に由来するリボソームタンパク質が、精製したＲＮａｓｅＨを用いた異種ＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応を改良することを示す。この実験において、粗酵母６０Ｓリボソームタンパク質（ＹＲＰ）およびＬ３４タンパク質の効果を、相対的に純粋なＲＮａｓｅＨおよびｈｇＤＮＡを含むＣＰＴ反応において試験した。キメラプローブＡＲＫ２（配列番号１）および標的ＡＲＫ２Ｔ（配列番号２）を実施例１に記載のように合成し、部分精製したＲＮａｓｅＨ、Ａ２４−１および精製したＲＮａｓｅＨ、Ａ２６−１を、実施例８に記載のように調製し、粗酵母リボソームタンパク質を、ＲｏｓｓＮａｚａｒ博士（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＧｕｅｌｐｈ、Ｇｕｅｌｐｈ、ＯＮ）から得、そしてＫａｔｓｃｈｉｍｄｔおよびＷｉｔｔｍａｎｎ、ＡｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ３６：４０１−４１２、１９７０の方法によって調製し、精製したＬ３４を、実施例９に記載のように調製した。ＣＰＲ反応および分析を、以下の条件下で実施した：２０μｌの最終反応容量中で、０．６ｆｍｏｌのＡＲＫ２プローブ（配列番号１）、１０^-5ｐｍｏｌのＡＲＫ２Ｔ標的、２．０ｍＭＭｇＣｌ₂、２００ｎｇのｈｇＤＮＡ、１μｇの部分精製したかまたは精製したＲＮａｓｅＨ、０．００ｎｇの酵母リボソームタンパク質、および１００〜２００ｎｇの精製したＬ３４を、精製したＲＮａｓｅＨを含むＣＰＴ反応混合物において試験した。表６は、上記の実験の結果を示す。手短には、精製したＲＮａｓｅＨを含むサンプルにおいて任意の添加物の非存在下で、反応が、ｈｇＤＮＡの存在下で阻害された。２００ｎｇの酵母リボソームタンパク質の添加は、精製したＲＮａｓｅＨを用いた場合に、ｈｇＤＮＡによって生じた阻害を減少させた。Ｌ３４リボソームタンパク質もまた、ｈｇＤＮＡの存在下での正味のパーセントプローブ切断を改良した。正味のパーセントプローブ切断が、精製したＲＮａｓｅＨを含むサンプルにおけるＬ３４の濃度の増加とともに増加したこともまた観察された。２００ｎｇのＹＲＰおよび２００ｎｇのＬ３４リボソームタンパク質を含む精製したＲＮａｓｅＨにおける改良のレベルは、部分精製したＲＮａｓｅＨ（Ａ２４− １）に匹敵していた。リボソームタンパク質は、ＲＮａｓｅＨの非存在下ではキメラプローブの切断を触媒しない（データ示さず）。従って、このことは、これらのタンパク質がＣＰＴ反応の改良において未知の役割を有することを示す。表６．酵母リボソームタンパク質（ＹＲＰ）および精製したＬ３４リボソームタンパク質の効果。ｈｇＤＮＡの存在下および標的の非存在下で観察されたバックグラウンドを減じた。 ¹正味のパーセントプローブ切断（％）＝パーセントプローブ切断（％）−Ｃ４バックグラウンド（％）この実施例は、正味のパーセントプローブ切断が、異種ＤＮＡの存在下で精製したＲＮａｓｅＨを用いるＣＰＴ反応において、原核生物および真核生物の両方の生物由来のリボソームタンパク質の使用によって改良され得ることを示す。実施例１１異種ＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応におけるリボソームタンパク質Ｌ３４の効果以下の実施例は、異種ＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応を改良するためのＬ３４リボソームタンパク質の使用を示す。３つの実験を実施して、異種ＤＮＡの漸増濃度の存在下でそして精製した熱安定性ＲＮａｓｅＨを用いるＣＰＴ反応へのＬ３４の添加の効果を試験した。第一の実験は、添加したＬ３４を有さず、第二の実験は、精製したＬ３４を２００ｎｇ有し、そして第三の実験は、ＣＰＴ反応に対して添加した合成Ｌ３４を４００ｎｇ有した。合成Ｌ３４は、精製したＬ３４と類似の効果を有することがこれまでに示された（データ示さず）。キメラプローブＡＲＫ２（配列番号１）および標的ＡＲＫ２−９５（配列番号３）を合成し、そしてプローブを、実施例１に記載のように標識した。精製した熱安定性ＲＮａｓｅＨＡ２６−１を実施例８に記載のように調製し、精製および合成Ｌ３４を実施例９に記載のように調製した。ＣＰＴ反応および分析を、以下の例外を除いて本質的に実施例２に記載のように実施した：３０μｌの最終反応容量中で、０．６ｆｍｏｌのＡＲＫ２プローブ、１０^-5ｐｍｏｌのｄｓＡＲＫ２−Ｔ標的、１μｇの精製したＲＮａｓｅＨＡ２６−１、０〜８００ｎｇの５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．１。試験した添加物は：０ｎｇ、２００ｎｇの精製したＬ３４、および４００ｎｇの合成Ｌ３４であった。スパイクした標的ｄｓＡＲＫ２Ｔを有するｈｇＤＮＡを、９０℃で５分間で変性し、次いで氷上で冷却した。表７は、３つの実験からの結果の編集である。手短には、ＣＰＴ反応においてＬ３４の非存在下で、正味のパーセントプローブ切断は、ｈｇＤＮＡの濃度の増加とともに減少した。標的は、４０ｎｇ以上の濃度のｈｇＤＮＡでは検出されなかった。ＣＰＴ標的検出は、コントロール（Ｌ３４の添加なし）と比較して、２００ｎｇの精製したＬ３４の存在下で、ＣＰＴ反応における全ての異なる濃度のｈｇＤＮＡにて劇的に改良された。４００ｎｇのＬ３４の添加は、コントロールと比較して、正味のパーセントプローブ切断における改良を示した。しかし、４００ｎｇのＬ３４の存在下での正味のパーセントプローブ切断は、０〜２００ｎｇのｈｇＤＮＡを含むサンプルについてより低く、そして４００〜８００ｎｇのｈｇＤＮＡを含むサンプルについてより高かった。これらのサンプルにおけるＳＳＢの添加が存在しなかったので、ＣＰＴ反応の改良が、Ｌ３４リボソームタンパク質に起因し、そしてＳＳＢとは非依存性であると結論づけられ得る。表７．漸増濃度のｈｇＤＮＡの存在下、および精製したＴ．ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓＲＮａｓｅＨを用いたＣＰＴ反応へのＬ３４の添加の効果。 ¹プローブ切断（％）−Ｃ４バックグラウンド（％）上記の実施例は、Ｌ３４リボソームタンパク質が、低濃度および高濃度の両方のｈｇＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応を、使用したＬ３４の濃度に依存して改良することを示す。実施例１２明澄なＣＰＴ系における添加物の効果以下の実施例は、リボソームタンパク質およびスペルミンのような添加物が異種ＤＮＡの非存在下での種々のレベルの標的ＤＮＡを用いたＣＰＴ反応を改良することを示す。特に、この実験は、明澄な系における（すなわち、ｈｇＤＮＡの非存在下で）精製したＲＮａｓｅＨを用いた標的の漸減濃度の標的の検出についてＣＰＴ反応におけるＳ１９、Ｌ３４リボソームタンパク質の効果を試験するように設計した。キメラプローブｍｅｃＡ９４５−２９（配列番号４）および標的ｍｅｃＡ９４５−２９−Ｔ（配列番号５）を合成し、そしてプローブを実施例１に記載のように標識した。精製したＲＮａｓｅＨＡ２６−１を、実施例８に記載のように調製し、合成Ｌ３４を、実施例９に記載されるように合成し、そしてＳ１９リボソームタンパク質を、実施例９に記載のように精製した。ＣＰＴ反応および分析を、以下の例外を除いて本質的に実施例２に記載のように実施した：１０μｌの最終反応容量中で、０．３ｆｍｏｌのｍｅｃＡ９４５−２９プローブ、１０^-4〜１０^-6ｐｍｏｌのｍｅｃＡ９４５−Ｔ標的、４．０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｎｇの精１０ｍＭＰＢ、ｐＨ６．４。試験した添加物は：１０ｎｇのＬ３４、１０ｎｇのＳ１９、および０．２ｍＭのスペルミンであった。表８は、上記の実験の結果をまとめる。手短には、この結果は、リボソームタンパク質またはスペルミンのＣＰＴ反応への添加が、正味のパーセントプローブ切断を、添加物を有さないコントロールと比較して、すべての標的レベルで、そして特に１０^-5および１０^-4ｐｍｏｌの濃度で顕著に改良したことを示す。表８．合成標的を用いる正味のパーセントプローブ切断に対するスペルミン、Ｓ１９およびＬ３４の効果。標準偏差（ＳＤ）を括弧内に示す。上記実施例は、実験条件下で、リボソームタンパク質、Ｌ３４およびＳ１９ならびにスペルミンが明澄な系においてＣＰＴ反応を改良したことを示す。実施例１３異種ＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応におけるキレート剤の効果以下の実施例は、キレート剤ＥＧＴＡが、サイクリング反応緩衝液に組み込まれた場合に、パーセントプローブ切断を改良し、そして異種ＤＮＡの存在下でのＣ４バックグラウンドを減少させたことを示す。この実験において、ＥＧＴＡの効果を、ｈｇＤＮＡの存在下での、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡ標的の検出のためのＣＰＴ反応において試験した。ＣＰＴ反応および分析を、以下の例外を除いて実施例２に記載の通りに実施した：４０μｌの最終反応容量中で、１．５ｆｍｏｌ（３０００ｃｐｍ／４０ μｌ）のキメラＡＲＫ−２プローブ（配列番号１）、５×１０⁵細胞等価物のＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＤＮＡ、８００ｎｇのｈｇＤＮＡ、１．２５ｍＭＭｇＣｌ₂、４．０μｇの精製したＲＮａｓｅＨＡ１７−１。試験したＥＧＴＡの濃度範囲は、０．２〜７．５ｍＭに及んだ。Ｍ．ｇｏｒｄｏｎｎａｅＤＮＡを、非特異的なＤＮＡ標的コントロールとして使用した。表９は、上記の実験の結果をまとめる。シグナル対ノイズ比（Ｓ：Ｎ）が、ＥＧＴＡの濃度の増加につれて増加したことが観察された。これは、サンプルにおける漸増濃度のｈｇＤＮＡにおけるパーセントプローブ切断と比較して、バックグラウンド（Ｃ４）のより大きな減少に起因していた。ＣＰＴ反応の類似の改良が、ＥＤＴＡの使用によって観察された（データ示さず）。表９．ＲＮａｓｅＨＡ１７−１を用いるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＤＮＡの検出のためのＣＰＴ反応におけるｈｇＤＮＡを含むサンプル中でのＥＧＴＡの効果上記の実施例は、ＥＧＴＡが、サンプル中の異種ＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応を改良することを示す。実施例１４異種ＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応を改良するためのスペルミンおよびキレート剤の効果以下の実施例は、スペルミンおよびキレート剤の組み合わせが、ＣＰＴ反応における異種ＤＮＡに起因してバックグラウンドを減少することを示す。予備実験を、精製した熱安定性ＲＮａｓｅＨを用いてＣＰＴ反応において異種ＤＮＡの存在と関連するバックグラウンドを減少させるための種々のポリアミンおよびキレート剤の有用性を評価するために行った。スペルミン、スペルミジンおよびオルニチン（０．５〜１０．０ｍＭ）のようなポリアミン、ならびにキレート剤ＥＧＴＡ（０．５〜２．０ｍＭ）、およびＥＤＴＡ（５０μＭ〜１．０ｍＭ）を、８００ｎｇのｈｇＤＮＡを用いるＣＰＴ反応において試験した。合成標的およびキメラプローブは、それぞれ、ＡＲＫ２−９５（配列番号３）およびＡＲＫ２（配列番号１）であった。スペルミジンおよびオルニチンは、試験した濃度では、ＣＰＴ反応を改良しなかったことが観察された。スペルミンおよびＥＧＴＡまたはＥＤＴＡは、サンプル中のｈｇＤＮＡの存在下でのサイクリングを改良したことが示された。さらなる力価測定実験は、２ｍＭスペルミンおよび０．５ｍＭＥＧＴＡが、バックグラウンドの減少および正味のパーセントプローブ切断の両方に関してＣＰＴ反応の改良をもたらしたことを示した。続いての実験において、０．５ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭスペルミンまたは０．５ｍＭＥＧＴＡおよび２ｍＭスペルミンの組み合わせを、漸増濃度のｈｇＤＮＡを含むＣＰＴ反応において試験した。キメラプローブＡＲＫ２（配列番号１）および二本鎖標的ＡＲＫ２−９５（ｄｓＡＲＫ２−９５；配列番号３）を合成し、そしてプローブを実施例１に記載のように標識した。精製した熱安定性Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＲＮａｓｅＨ（バッチＡ２６−１）を実施例８に記載のように調製した。ＣＰＴ反応を、以下の例外を除いて本質的に実施例２に記載のように実施した：３０μｌの最終反応容量において、Ｔｒｉｓ−ＣＢ、ｐＨ８．１中で、０．６ｆｍｏｌＡＲＫ２プローブ、１０^-5ｐｍｏｌｄｓＡＲＫ２− ９５、１μｇの精製したＲＮａｓｅＨ、０〜８００ｎｇのｈｇＤＮＡ。プローブおよび酵素の添加の前に、スパイクしたｄｓＡＲＫ２Ｔ標的を伴うｈｇＤＮＡを、９０℃で５分間変性し、次いで氷上で冷却した。表１０は、上記の実験の結果をまとめ、そして漸増濃度のｈｇＤＮＡを伴うＣＰＴ反応における、ＥＧＴＡ、スペルミン、およびスペルミンおよびＥＧＴＡの組み合わせの、Ｃ４バックグラウンドおよびパーセントプローブ切断に対する効果を示す。図４は、表１０の結果に基づく正味のパーセントプローブ切断およびシグナル対ノイズ比を示す。添加物を含まないサンプルにおいて、ＣＰＴ反応による標的の検出は、４ｎｇのｈｇＤＮＡまでの存在下でのみ可能であった（図４）。０．５ｍＭＥＧＴＡの存在下で、Ｃ４バックグラウンドは、コントロールと比較して減少した（表１０）が、低いシグナル対ノイズ比に起因して、４ｎｇを超えるｈｇＤＮＡを含むサンプルにおける検出は不可能であった（図４）。これらのサンプルにおいて、パーセントプローブ切断と、Ｃ４バックグラウンドとの間にはほとんど差異は存在しなかった（図１０）。２ｍＭスペルミンの使用は、試験した４ｎｇ〜８００ｎｇのｈｇＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応において標的の検出を顕著に改善した（図４）。パーセントプローブ切断、およびより少ない程度でＣ４バックグラウンドは、スペルミンの存在下で増加し（表１０）、それにより、標的の検出を可能にするシグナル対ノイズ比をもたらした（図４）。スペルミンを用いた反応は、４０〜８００ｎｇのｈｇＤＮＡを含むサンプルにおいてＥＧＴＡと比較して約１．４〜２．７倍大きなＳ：Ｎを有した（図４）。高濃度のｈｇＤＮＡを含むサンプルにおけるＥＧＴＡおよびスペルミンの組み合わせは、ＣＰＴによる標的の検出において、予測されないかつ有意な改良をもたらした。スペルミンおよびＥＧＴＡの組み合わせ効果は、ｈｇＤＮＡの存在下で、低いバックグラウンド（６〜８％）をもたらした。組み合わせたＥＧＴＡおよびスペルミンの存在下でのバックグラウンドの値は、０．５ｍＭＥＧＴＡまたは２ｍＭスペルミンのいずれよりも低かった。添加物のこの組み合わせが、４０ｎｇのｈｇＤＮＡの存在下で、ｈｇＤＮＡを含まないサンプルに匹敵したほどの、最大の正味のパーセントプローブ切断またはシグナル対ノイズ比をもたらしたことは驚くべきことであった（図４）。ＥＧＴＡおよびスペルミンの存在下で生成されたパーセントプローブ切断の量は、漸増濃度のｈｇＤＮＡに伴って徐々に減少した（表１０）。しかし、バックグラウンドの減少は、比較的より大きく、従って、シグナル対ノイズ比は、８００ｎｇのｈｇＤＮＡまでを含むサンプルにおいて標的の検出を可能にした（図４）。これらの実験結果は、ｈｇＤＮＡの存在によってこれまで阻害されていた核酸標的の検出のためのＣＰＴ反応が、今や、予期されない、かつ驚くべき、ＥＧＴＡおよびスペルミンの反応における組み合わせによって克服され得ることを示す。これらの添加物は、８００ｎｇものｈｇＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応による標的の検出を可能にする。表１０．精製したＲＮａｓｅＨを用いた、漸増濃度のｈｇＤＮＡの存在下での、ＣＰＴ反応において生成されたＣ４バックグラウンドおよびパーセントプローブ切断に対する、ＥＧＴＡ（０．５ｍＭ）、スペルミン（２ｍＭ）およびＥＧＴＡ（０．５ｍＭ）およびスペルミン（２ｍＭ）の組み合わせの効果。 ¹ｈｇＤＮＡの存在下でのプローブの切断に起因するバックグラウンド² 総計プローブ切断³ 添加物なし⁴ ＳＰとはスペルミンをいう上記の実施例は、スペルミンおよびＥＧＴＡの組み合わせが、精製したＲＮａｓｅＨを用いたＣＰＴ反応の改良に非常に有効であり、そして異種ＤＮＡの高濃度または低濃度の両方の存在下で核酸標的分子の検出を可能にした。実施例１５異種ＤＮＡを含むＣＰＴ反応におけるＬ３４およびスペルミンの組み合わせの効果以下の実施例は、Ｌ３４およびスペルミンの組み合わせが、漸増濃度のｈｇＤＮＡにおける標的の検出のためのＣＰＴを改良し、そして漸減濃度の標的核酸を用いた感度を改良することを示す。第一の実験において、スペルミンおよびスペルミンとＬ３４との組み合わせを、１００〜４００ｎｇの範囲のｈｇＤＮＡを含むサンプルにおいて、ＡＲＫ２（配列番号１）、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡ標的および精製したＲＮａｓｅＨ（Ａ２６−１）を用いて試験した。キメラプローブＡＲＫ２（配列番号１）を実施例１に記載のように合成し、そして実施例２に記載のように標識した。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡ標的を、Ｂｅｇｇｓら、前出に記載のように調製した。精製したＲＮａｓｅＨＡ２６−１を、実施例８に記載のように調製した。ＣＰＴ反応および分析を、以下を除いて、本質的に実施例２に記載のように行った：２０μｌの最終反応容量において、０．６ｆｍｏｌのＡＲＫ２プローブ、１×１０^-5ｐｍｏｌのＡＲＫ２−９５（配列番号３）、８．０ｍＭＭｇＣｌ₂、１μｇの精製したＲＮａＥＧＴＡ、５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３。第二の実験において、アッセイの感度を、１×１０^-5ｐｍｏｌから２×１０^-7 ｐｍｏｌの範囲のＡＲＫ２−９５標的を用いて、４００ｎｇのｈｇＤＮＡの存在下で、および精製したＲＮａｓｅＨ（Ａ２６−１）を用いて実験した。ＣＰＴ反応および分析を、以下を除いて本質的に実施例２に記載のように実施した：３０ μｌの最終反応容量において、０．６ｆｍｏｌのＡＲＫ２プローブ、特定濃度のゲノムＤＮＡ、８．０ｍＭＭｇＣｌ₂、１μｇの精製したＲＮａｓｅＨ（Ａ５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３。第一の実験の結果を表１１にまとめる。手短には、結果は、スペルミンの添加が、ｈｇＤＮＡを含むサンプルにおけるＣＰＴ反応を改良する以前の観察を確認する。１００ｎｇ〜４００ｎｇについてのシグナル対ノイズ比は７．６〜６．３に及んだ。しかし、スペルミンをＬ３４と組み合わせて、そして類似の範囲のｈｇＤＮＡにおいて試験した場合に、シグナル対ノイズはより大きく、そして１１．３〜１５．７に及んだ。しかし、スペルミン単独と比較して、特定のプローブ切断は、添加物の組み合わせについてより低かった。Ｃ４バックグラウンドがこれらのサンプルにおいて約２倍減少したことに留意することも興味深かった。表１１．漸増濃度のｈｇＤＮＡを含むＣＰＴ反応において、サンプルにおけるスペルミン（２ｍＭ）およびスペルミン（２ｍＭ）とＬ３４（２００ｎｇ）との組み合わせの効果。４００ｎｇのｈｇＤＮＡの存在下でのＣＰＴ反応の感度を試験する第二の実験の結果を、表１２に示す。手短には、スペルミンおよびＬ３４の組み合わせは、ＣＰＴ検出の感度を、スペルミン自身よりもより大きな程度にまで増加させた。試験した標的の最低濃度である２×１０⁷ｐｍｏｌにおいて、シグナル対ノイズ比は約２であった。表１２．ｈｇＤＮＡの存在下および漸減濃度のＡＲＫ２−９５標的を含むＣＰＴ反応におけるサンプルにおけるスペルミン（２ｍＭ）およびスペルミン（２ｍＭ）とＬ３４（２００ｎｇ）との組み合わせの効果。上記の実施例は、スペルミンとリボソームタンパク質Ｌ３４との組み合わせがシグナル対ノイズ比を増加させ、そして異種ＤＮＡの存在下でのＣＰＴ検出の感度を改良することを示す。実施例１６ＣＰＴ反応を使用したｍｅｃＡ遺伝子の検出によるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓのメチシリン耐性状態の決定以下の実施例は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単離物の粗溶解物からのｍｅｃＡ遺伝子の検出についての、キメラプローブｍｅｃＡ９４５−２９（配列番号４）の有用性ならびにＣＰＴ反応におけるスペルミンおよびＥＧＴＡの有効性を実証する。この実験を、粗溶解物を使用したＭＲＳＡ単離物のｍｅｃＡ遺伝子の検出について、ＣＰＴ反応におけるスペルミンおよびＥＧＴＡの効果を試験するように設計した。試験した添加物の濃度は、１ｍＭＥＧＴＡ、２ｍＭスペルミンまたは１ｍＭＥＧＴＡと２ｍＭスペルミンとの組み合わせであった。この実験について、ＭＲＳＡ（ＡＴＣＣ３３５９２，アメリカンタイプカルチャーコレクション、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）およびＭＳＳＡ（ＡＴＴＣ１１６３２）単離物を、３７℃で一晩、５％ヒツジ血液（ＰＭＬＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＢＣ）でトリプティカーゼ（ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ）ダイズ寒天（ＴＳＡ）プレート上で増殖した。滅菌スワブを使用してＴＳＡプレートからこのコロニーを取り出し、次に２ｍｌの２０ｍＭＴＥＳ胞を再懸濁した。次にこの細胞懸濁液を、ＭｃＦａｒｌａｎｄ＃５標準細胞密度（約１．５ｘ１０⁹細胞／ｍｌ）に調整した。次に５０μｌの細胞懸濁液（約７．５ｘ１０⁷細胞）を微量遠心管に移した。この細胞の溶解を、アクロモペプチダーゼ（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（ＷａｋｏＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）を、１サンプルあたり１５０ユニット／ｍｌの最終濃度に添加して実施した。この懸濁液を混合し、そして３７℃で２０分間インキュベートした。このキメラプローブｍｅｃＡ９４５−２９を、実施例１に記載したとおりに合成し、そして以下の例外を除いて実施例２に記載したとおりに、標識した。ＲＴＧの単一のチューブを、１５μｌの水中に再懸濁する。１ｐｍｏｌのプローブを、５μ１のγ−³²ＰＡＴＰおよび３μｌのＲＴＧと合わせた。最終容量を、水で１０μｌに調整し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。取り込まれていないγ−³²Ｐをキナーゼ化されたプローブから、Ｇ５０Ｎｉｃｋカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いることによって分離する。回収したプローブを、ＳＳＣ緩衝液（１５ｍＭＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で０．１倍に調整し、そして−２０℃で保存する。熱安定性ＲＮａｓｅＨを実施例７に記載したとおりに生成した。ＣＰＴ反応および解析を、以下を除いて実施例２のとおりに実施した：ＣＰＴ反応を、以下：ＴＥＳサイクリング緩衝液、キメラ標識プローブ、ＲＮａｓｅＨを順番に添加することによって行って、サイクリングカクテルを得た。次いで、これを、試験される変性したサンプルに添加する。最終サイクリング反応混合物は、ＴＥＳサイクリング緩衝液（ＴＥＳ−ＣＢ）中に、１．８ｆｍｏｌｍｅｃＡ９４５−２９キメラプローブ、粗溶解物標的として５０μｌの核酸、３．３ μｇＲＮａｓｅＨを含み、これは、以下の最終濃度を含む：０．０５Ｔｒｉｔ８。５０μｌの粗溶解物サンプルを、９５℃５分間でヒーティングブロック中で熱変成させ、次に、５８℃の水浴に直接移した（反応温度は５６℃であった）。反応カクテル（５０μｌ）を直ちに添加し、そしてインキュベーションをさらに２０分間続けた。インキュベーションの終わりに、水浴中で４０ｍＭＰＢ（１００μｌ）を含む等量のローディング色素をこのサンプルに添加した。次にサンプルを９５℃のヒーティングブロックに５分間移した。サンプルを手短にスピンし、そして２０ μｌを電気泳動のためにアクリルアミドゲルにロードした。表１３はＭＲＳＡ溶解物からｍｅｃＡ遺伝子の検出のためのＣＰＴ反応中スペルミンおよびＥＧＴＡの効果の結果を要約する。簡単には、スペルミンおよびＥＧＴＡの非存在下では、高いＣ４バックグラウンドに起因して単離物ＭＲＳＡとＭＳＳＡとの間で区別がなかったことが観察される。ＥＧＴＡ単独の添加は、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方中のパーセントプローブ切断を減少したが、まだなおこの２者間の区別を可能にしなかった。ＣＰＴ反応物へのスペルミン単独の添加は、Ｃ４バックグラウンドを低下することによりＭＲＳＡの検出が可能になり、約５のシグナル対ノイズの比をもたらした。ＣＰＴ反応物へのＥＧＴＡおよびスペルミンの両方の添加は、標的の検出を劇的に改良した。表１に見られるように、Ｃ４バックグラウンドに主な減少があり、そしてｍｅｃＡＭＲＳＡは２０ので顕著なシグナル対ノイズの比で検出し得た。これらの結果は、ＭＲＳＡ単離物とＭＳＳＡ単離物との間で明らかな区別を得るために、サイクリング反応物へのスペルミンおよびＥＧＴＡ両方の添加の必要性を明らかに示す。表１３．ＭＲＳＡの粗溶解物からのｍｅｃＡ遺伝子の検出のためのＣＰＴ反応中のスペルミンおよびＥＧＴＡの効果上記実施例は、スペルミンまたはＥＧＴＡ自体の使用と比較して、ＣＰＴ反応による粗溶解物におけるｍｅｃＡ遺伝子の検出について、添加物スペルミンとＥＧＴＡとの組み合わせ使用がシグナル対ノイズ比の有意な改良をもたらしたことを示す。実施例１７ＣＰＴ反応を使用するｍｅｃＡ遺伝子の検出による、メチシリン耐性ブドウ球菌単離物の臨床スクリーニング以下の実施例は、ブドウ球菌臨床単離物の粗溶解物からｍｅｃＡ遺伝子を検出するためのＣＰＴ反応における、放射性同位体標識されたキメラプローブおよび付加物（スペルミンおよびＥＧＴＡ）の首尾よい使用を示す。この実験は、³²Ｐ標識キメラプローブｍｅｃＡ９４５−２９（配列番号４）の使用、ならびに２８５個のブドウ球菌単離物の粗溶解物からｍｅｃＡ遺伝子を検出するためのＣＰＴ反応におけるスペルミン（２．０ｍＭ）とＥＧＴＡ（１．０ｍＭ）との組み合わせを試験する。これらの単離物は、以下の供給源に由来した：ＷｉｓｈａｒｔＭｅｍｏｒｉａｌＨｏｓｐｉｔａｌ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）、ＣｌｅｖｅｌａｎｄＣｌｉｎｉｃＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）、ＶａｎｃｏｕｖｅｒＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）および２５個の参照株。全部で、２３８個のＳ．ａｕｒｅｕｓおよび４７個のＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ単離物であった。粗溶解物調製、プローブ合成、ＣＰＴ手順、および分析を、１μｌのプラスチックループ（ＰＭＬＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）を用いてＴＳＡ血液プレートから細胞を採取して、５０μｌの２０ｍＭＴＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）中の０．０５％Ｔｒｉｔｏｎい、そして実施例４に記載されるように、アクロモペプチラーゼ（ａｃｈｒｏｍｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ）（ＷａｋｏＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を添加して溶解した。ＤＮＡを、使用前に９５℃で５分間、熱変性させた。実験を、オペレーターブラインド研究として行なった。単離物もまた、４％ＮａＣｌを使用するＥ試験を使用して、従来のオキサシリンスクリーニング寒天（ＰＭＬＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、Ｋｉｒｂｙ−ＢａｕｅｒＤｉｓｃ拡散、最小阻害濃度（ＭＩＣ）によって試験し、Ｍｅｕｌｌｅｒ−ＨｉｎｔｏｎおよびＳ．ａｕｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて試験した。ＣＰＴ反応結果をオキサシリン寒天スクリーニングと比較した場合、４つの矛盾したサンプルが見つかった。これらの単離物は、寒天スクリーニング陽性であるが、ＣＰＴ陰性であることが観察された。ＰＣＲによる矛盾した解析（実施例７）の後、ｍｅｃＡ遺伝子がこれらの単離物において存在しないことが確認された。上記の実験結果は、単離物の数対パーセントプローブ切断の頻度分布ヒストグラムとして図２に示される。簡潔には、パーセントプローブ切断の頻度分布は、オペレーターブラインド研究を使用して、ｍｅｃＡ遺伝子の存在または非存在に基づいて、単離物を２つの異なる集団に分離した。この研究において使用される各々の感受性試験は、いくつかのブドウ球菌単離物を正確に同定し損なった。金の標準オキサシリン寒天スクリーニングは、４つのＳ．ａｕｒｅｕｓ単離物をＭＲＳＡと同定したが、ｍｅｃＡ遺伝子は存在しないことが示された。これらの４つの単離物の各々は、オキサシリンに対する境界型耐性（ＭＩＣの３〜１６μｇ／ｍｌ）を示し、そしてＭＩＣＥ試験およびオキサシリンディスク拡散によってさらに誤って同定された。これらの４つの単離物のうちの１つは、さらにＢＢＬＣｒｙｓｔａｌＩＤＭＲＳＡＳｙｓｔｅｍによって誤って同定された。ｍｅｃＡ遺伝子を欠如するさらなる３１個のＳ．ａｕｒｅｕｓ単離物は、オキサシリンＭＩＣの３〜１２μｇ／ｍｌでのＥ試験によってＭＲＳＡと称され、そしてこれらの単離物のうちの２つもまた、オキサシリンディスク拡散によって間違われた。これらの境界型オキサシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＢＯＲＳＡ）単離物の各々は、ディスク拡散によるｃｌａｖｕｌａｎｉｃａｃｉｄの存在において、オキサシリンに感受性であることがさらに示された。従来の感受性試験は、オキサシリン境界型感受性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単離物と低ＭＩＣを有する異種耐性ＭＲＳＡ単離物との間を確実に区別することは出来ない。表１４．感受性試験によって不正確に同定された単離物 ¹ＭＲＳＥとは、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓをいう。ＣＰＴアッセイは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ単離物およびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ単離物におけるｍｅｃＡ遺伝子を正確に検出し、そしてメチシリン感受性ブドウ球菌からメチシリン耐性ブドウ球菌の正確な同定を可能にした。上記の実施例は、スペルミンおよびＥＧＴＡの存在下で、ブドウ球菌臨床単離物の粗溶解物からｍｅｃＡ遺伝子について放射性同位体標識したｍｅｃＡ９４５ −２９プローブの感度および特異性を実証する。実施例１８ｍｅｃＡ遺伝子のＰＣＲ検出矛盾した分析についてのＰＣＲを以下の方法によって行なう。ＭＲＳＡのｍｅｃＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマー対ｍｅｃＡ８３４−２５およびｍｅｃＡＬ１０３９−２２（配列番号６および配列番号７）を、実施例１に記載されるように合成した。ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡＡＴＣＣ単離物の粗溶解物をコントロールとして使用し、そしてＴａｑポリメラーゼを使用するホットスタートの後、ＰＣＲを行なった。ホットスタートＰＣＲを、９５℃５分間の変性後、８０℃でのＴａｑポリメラーゼの添加によって５０μｌ容量において実施した。最終ＰＣＲ反応混合物は、以下を含んだ：５０μｌの最終反応容量中、２００μＭの各ｄＮＴＰ混合物（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＫＣｌ、２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ８．４、（１×ＰＣＲ緩衝液、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、０．５μＭの各プライマー対、１ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ− ＢＲＬ）および２ｎｇのブドウ球菌ＤＮＡ粗溶解物サンプル。サンプルを、サーマルサイクラー（ＰＴＣ１００，ＭＪＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｃ．）中で、９４℃で４０秒間、５３℃で４０秒間、および７２℃で９０秒間のサイクルを使用して、サイクルにかけた。増幅を５０サイクル行なった。増幅後、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミド含有の１．８％アガロースゲルを使用して、サンプルを電気泳動を用いて分析した。分子量マーカーもまた含まれた。２２７ｂｐのアンプリコンが検出された場合、サンプルを陽性とみなした。このアンプリコンはＡＴＣＣＭＲＳＡコントロールにおいて検出されたが、ＡＴＣＣＭＳＳＡコントロールまたはいかなる矛盾したＳ．ａｕｒｅｕｓ単離物においても検出されなかった。実施例１９サイクリングプローブ技術およびバックグラウンドにおける添加物としての界面活性剤の効果以下の実施例は、キレート剤、ポリアミンおよび界面活性剤の、ＣＰＴ反応におけるバックグラウンドおよびサイクリングに対する効果を試験する。以下のシリーズの実験（１９．１〜１９．４）を、実施例１４に記載されるＣＰＴ条件および分析を用い、そして各実験に注記される変化を伴って実施した。実施例１９．１この実験において、種々の組合せのＥＧＴＡ、スペルミンおよび界面活性剤ＤＴＡＢ（ドデシルトリメチル臭化アンモニウム（Ｓｉｇｍａ））を、ＡＲＫ２（配列番号１）プローブおよびその合成相補標的ＡＲＫ２−Ｔ（配列番号２）を用いるＣＰＴ反応において、ｈｇＤＮＡのバックグラウンドにおいて試験した。反応条件は、以下の通りであった：３０００ｃｐｍ（約１ｆｍｏｌ）³²Ｐ標識ＡＲＫ２プローブ、１０^-4ｐｍｏｌおよび１０^-5ｐｍｏｌの相補的合成標的ＡＲＫ２−Ｔ、１．２５ｍＭＭｇＣｌ₂、４μｇのＲＮａｓｅＨ（Ａ２４−１）、８００ｎｇのヒトゲノムＤＮＡおよび４０μｌの最終反応容量。コントロール反応は、０．５ｍＭＥＧＴＡのみを含み、そして試験条件は、（ｉ）０．５ｍＭ、１ｍＭ、および２．５ｍＭのＤＴＡＢを伴う０．５ｍＭＥＧＴＡ；（ｉｉ）０．５ｍＭ、２ｍＭ、および５ｍＭスペルミンを伴う０．５ｍＭＥＧＴＡ；（ｉｉｉ）５ｍＭ、６．２ｍＭ、および７．５ｍＭＤＴＡＢを伴う２ｍＭスペルミン。ＥＧＴＡおよびスペルミンの濃度を、実施例１４からの結果に基づいてコントロールとして０．５ｍＭおよび２ｍＭで固定した。表１５．ＡＲＫ２プローブ（配列番号１）およびその合成相補的標的ＡＲＫ２− Ｔ（配列番号２）を用いた、ｈｇＤＮＡバックグラウンドにおける、ＣＰＴ反応における添加物ＥＧＴＡ、スペルミンおよびＤＴＡＢの使用。８００ｎｇのｈｇＤＮＡを含み、そして上記の条件を使用するＣＰＴ反応において、２ｍＭスペルミンおよび０．５ｍＭＥＧＴＡの組み合わせは、最高の正味のパーセント切断を示した。他の２つの添加物の組み合わせは、０．５ｍＭＥＧＴＡを用いたコントロールと類似する値をもたらした。上記で試験した３つすべての組み合わせは、０．５ｍＭＥＧＴＡ自体の使用と比較して、Ｃ４バックグラウンドのより大きな減少をもたらした。２ｍＭスペルミンおよび５ｍＭＤＴＡＢの使用を用いたＣ４バックグラウンドは、２ｍＭスペルミンおよび０．５ｍＭＥＧＴＡの使用ほどは低くなかったが、０．５ｍＭＥＧＴＡおよび２．５ｍＭＤＴＡＢと匹敵していた。これらの結果は、スペルミンの存在下で、ＥＧＴＡの天下が、ＤＴＡＢの単価よりもＣ４の減少に対して比較的大きな効果を有することを示唆する。０．５ｍＭＥＧＴＡおよび２．５ｍＭＤＴＡＢの組み合わせは、ＤＴＡＢの添加に起因して、Ｃ４バックグラウンドの減少を生じた。これは、ＥＧＴＡの存在下で、Ｃ４がＥＧＴＡおよびＤＴＡＢの組み合わせよりも２倍大きかったという観察に基づいた。従って、ＤＴＡＢは、Ｃ４の減少に対して、ＥＧＴＡと類似の効果を有するようであった。ＥＧＴＡとＤＴＡＢとの間の効果の直接の比較を、次の実験において示す。上記の実験は、種々の組み合わせの添加物が、高濃度の異種ＤＮＡに起因して、ＣＰＴ反応におけるバックグラウンドを減少させるのに使用され得ることを示す。実施例１９．２ｈｇＤＮＡの高バックグラウンドを伴うＣＰＴ反応における添加物ＥＧＴＡおよびＤＴＡＢの効果。ＣＰＴ反応のプロトコルおよび分析は、以下の条件を試験したこと以外は実施例１９．２について記載するのと同様であった：０．５ｍＭＥＧＴＡおよび５ｍＭＤＴＡＢ。実験結果を表１６にまとめる。表１６．ＡＲＫ２プローブ（配列番号１）およびその合成相補的標的ＡＲＫ２− Ｔ（配列番号２）を用いた、ｈｇＤＮＡバックグラウンドにおける、ＣＰＴ反応における添加物ＥＧＴＡおよびＤＴＡＢの使用。これらの結果は、０．５ｍＭＥＧＴＡまたは５ｍＭＤＴＡＢのいずれかを用いて得られたＣ４値が類似していたことを示す。従って、これら２つの添加物は、Ｃ４に対して同様の効果を有するようである。正味のプローブ切断は、ＥＧＴＡを用いるよりもＤＴＡＢを用いる反応においてより大きかった。実施例１９．３ｈｇＤＮＡの高バックグラウンドを用いるＣＰＴ反応において合わせた添加物ＥＧＴＡおよびＤＴＡＢの効果。ＣＰＴ反応プロトコルおよび分析は、以下の条件を試験したこと以外は実施例１９．１について記載されるのと同様であった：コントロールは、０．５ｍＭＥＧＴＡであり、そして試験反応物は、２．５ｍＭＤＴＡＢまたは３．７ｍＭＤＴＡＢを伴う０．５ｍＭＥＧＴＡを含んだ。実験結果を、表１７にまとめる。表１７．ＡＲＫ２プローブ（配列番号１）およびその合成相補的標的ＡＲＫ２− Ｔ（配列番号２）を使用した、ｈｇＤＮＡのバックグラウンドにおける、ＣＰＴ反応における添加物ＥＧＴＡおよびＤＴＡＢの使用。上記のように、０．５ｍＭＥＧＴＡ存在下で得られたＣ４バックグラウンドは、０．５ｍＭＥＧＴＡ＋２．５ｍＭＤＴＡＢ（例１を参照のこと）を用いて得られたものよりも２倍高い。正味のパーセントプローブ切断は、ＥＧＴＡまたはＥＧＴＡ＋ＤＴＡＢを用いる場合と以前と非常に類似しており、この実験において、正味のパーセントプローブ切断は、ＥＧＴＡ＋ＤＴＡＢの存在下で、ＥＧＴＡを用いて得られたものよりわずかに良好であるようである（すなわち、１０^-6ｐｍｏｌでの正味のパーセントプローブ切断、１６％および４％を比較する）。０．５ｍＭＥＧＴＡおよびより高濃度のＤＴＡＢ（すなわち、３．７ｍＭ）の存在下で、Ｃ４バックグラウンドは、６％に減少し、これは、０．５ｍＭＥＧＴＡおよび２．５ｍＭＤＴＡＢを用いて得られたＣ４と比較してさらに５０％減少であった。０．５ｍＭＥＧＴＡおよび３．７ｍＭＤＴＡＢを用いて、正味のパーセントプローブ切断は、ＤＴＡＢのより低い濃度を用いて得られたものと類似したままである（すなわち、１０^-6ｐｍｏｌでの正味のパーセントプローブ切断、１６％および１１％を比較する）。界面活性剤ＤＴＡＢのキレート剤ＥＧＴＡへの添加は、Ｃ４バックグラウンドの減少をもたらしたが、正味のパーセントプローブ切断は変化しなかった。０．５ｍＭＥＧＴＡの存在下では、３．７ｍＭＤＴＡＢは、ＤＴＡＢのより低濃度（すなわち、２．５ｍＭ）より良好のようである。実施例１９．４高バックグラウンドのｈｇＤＮＡを伴うＣＰＴ反応における添加物ＤＴＡＢおよびスペルミンの組み合わせの効果を試験する。ＣＰＴ反応プロトコルおよび分析は、以下の条件を試験したこと以外は実施例１９．１について記載されるのと同様であった：コントロールは、０．５ｍＭＥＧＴＡであり、そして試験反応は、２ｍＭスペルミンまたは５ｍＭスペルミンを伴う５ｍＭスペルミンであった。実験結果を、表１８にまとめる。表１８．ＡＲＫ２プローブ（配列番号１）およびその合成相補的標的ＡＲＫ２− Ｔ（配列番号２）を使用した、ｈｇＤＮＡのバックグラウンドにおける、ＣＰＴ反応における添加物ＤＴＡＢおよびスペルミンの使用。上記の結果から、５ｍＭＤＴＡＢ砥用板コントロール条件は、類似のＣ４バックグラウンド、およびおそらく０．５ｍＭＥＧＴＡを用いて通常見られるものよりもわずかに良好な正味のパーセント切断をもたらした（例１、２および３を参照のこと）。５ｍＭＤＴＡＢを含む反応に対するスペルミンの添加は利点があった。なぜなら、正味のプローブ切断が同様のままであるが、Ｃ４バックグラウンドが減少したからである。上記の条件下で、ＤＴＡＢは、０．５ｍＭＥＧＴＡと類似して機能するようである。界面活性剤ＤＴＡＢへのポリアミンスペルミンの添加はＣ４を減少したが、正味のプローブ切断は同様のままであった。ＤＴＡＢに伴うスペルミンの濃度の増加は、ＣＰＴにおける正味のパーセント切断の改良をもたらした。実施例２０Ｃ４減少における添加物スペルミンの可能な機構以下の実施例は、ＣＰＴ反応における異種ＤＮＡに起因するバックグラウンドの減少に対するスペルミンの可能な機構を試験する。相同でないＤＮＡの存在が如何にＣＰＴ反応を阻害するかのより良い理解を得るために、２つのＣＰＴ成分キメラＡＲＫ２とＲＮａｓｅＨとの間の相互作用を試験した。メンブレン結合アッセイを使用して、ｈｇＤＮＡの存在下または非存在下のいずれかでのキメラプローブとＲＮａｓｅＨとの結合を定量的に評価した。メンブレン結合研究について使用したＲＮａｓｅＨの量、プローブおよびｈｇＤＮＡは、実施例１４におけるＣＰＴについて使用したものと類似していた。図６は、結合アッセイの結果を示す。ＲＮａｓｅＨとプローブとの結合がｈｇＤＮＡの非存在下で検出されたが、ｈｇＤＮＡの存在下では、ＲＮａｓｅＨ−プローブの相互作用が破壊されたことが観察された（図６）。シトクロームＣを、メンブレン結合アッセイについてのコントロールタンパク質として使用した。なぜなら、そのｐＩが、ＲＮａｓｅＨのｐＩと類似しているからである。シトクロームＣとＡＲＫ２プローブとの結合は、ｈｇＤＮＡの非存在下でも存在下のいずれでも観察されなかった。ＲＮａｓｅＨと相同でないＤＮＡとの間のこのような相互作用が存在する場合に、ｈｇＤＮＡがＲＮａｓｅＨ結合についてのプローブと競合し得るか否かを試験するために、ｓｓＤＮＡ−アガロースカラムを、ウェスタンブロット分析と組み合わせて利用した。手短には、酵素をｓｓＤＮＡ−アガロースカラムに通した後、半定量的な分析は、フロースルーに約２％のＲＮａｓｅＨの存在を示し、このことは、大部分のＲＮａｓｅＨがｓｓＤＮＡに結合したことを示す。約９８％の結合したＲＮａｓｅＨは、ウェスタンブロット分析によって検出されるように、ＤＮＡ−アガロースカラムから、漸増濃度のスペルミンによって溶出された（図７）。酵素の最終パーセントは、２ｍＭスペルミンで溶出され、同じスペルミン濃度がＣＰＴ反応について最適であることが決定された。ＲＮａｓｅＨの結合は、ＤＮＡに対して特異的であった。なぜなら、８０％の酵素が、ＤＮＡを何ら伴わないアガロースカラムを用いた場合にフロースルーに検出されたからである（データ示さず）。アガロースカラム内のスペルミンとｓｓＤＮＡとの結合が、ＲＮａｓｅＨの置換を担うか否かを決定するために、２ｍＭスペルミンで予備平衡化したｓｓＤＮＡ−アガロースカラムを使用した。酵素を通した後、半定量的分析は、５０％を超えるＲＮａｓｅＨがカラムと相互作用しなかったことを示した（図８）。大部分の結合したＲＮａｓｅＨは、２ｍＭスペルミンを用いてカラムから溶出したが、他方、相対的に有意ではない量のＲＮａｓｅＨが、５ｍＭスペルミンを用いた溶出の後に検出された。このデータは、ＲＮａｓｅＨおよびスペルミンの両方が、ｓｓＤＮＡの結合と競合すること、およびさらに、２ｍＭスペルミンが、ｓｓＤＮＡからのＲＮａｓｅＨを置換するに十分であることを示した。類似の原理、スペルミンによるＤＮＡからのＲＮａｓｅＨの置換は、相同でないＤＮＡの存在下でのＣＰＴの改良を説明し得る。例えば、ＣＰＴ反応において、ＲＮａｓｅＨのｈｇＤＮＡへの結合に起因して、より少ないＲＮａｓｅＨが、標的媒介したプローブ切断について利用可能であり、従って、より少ない量のパーセントプローブ切断が生成される。ＤＮＡアガロースカラムデータに基づいた、このような反応に対するスペルミンの添加は、ＲＮａｓｅＨとｈｇＤＮＡとの間の非特異的な相互作用を減少させ、従って、特異的プローブ切断またはＣＰＴ産物の量を増加させる。上記のことから、本発明の特定の実施態様を本明細書において例示の目的で記載してきたが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の請求の範囲によることを除いて制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号６０／０９０，２７４ (32)優先日平成10年６月22日(1998．6．22) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者モドラサン，ゾラディー. カナダ国ブイ６エイチ１ケイ７ブリティッシュコロンビア，バンクーバー, ナンバー 208，ウェスト 11ティーエイチアベニュー 1345 (72)発明者ピシェ，イサベルエイ. カナダ国ブイ５ジェイ５ジー１ブリティッシュコロンビア，バーナビー，ノースブルックコート 8855 (72)発明者ダック，ピーターディー. カナダ国ブイ６イー２ケイ３ブリティッシュコロンビア，バーナビー，ウッズワースアベニュー 5408 (72)発明者クロニー，リンピー. カナダ国ブイ５ワイ３ジェイ８ブリティッシュコロンビア，バンクーバー, エリザベスストリート 5438 (72)発明者ウォン，アルフレッドシー．ケイ. カナダ国ブイ３エヌ１エム５ブリティッシュコロンビア，バーナビー，17ティーエイチアベニュー 8051

Claims

【特許請求の範囲】１．標的核酸分子を検出するための方法であって、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）切断されやすい連結を含む一本鎖核酸プローブ；（ｉｉｉ）二本鎖標的−プローブ複合体のプローブ部分を、該切断されやすい連結で切断し得る酵素、および（ｉｖ）リボソームタンパク質を含む混合物を、該標的核酸および該プローブが互いにハイブリダイズし、そして二本鎖標的−プローブ複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で反応させ、続いて該プローブの切断、および切断されていない新たなプローブに対する標的のサイクリングを行い、その結果、該切断された核酸プローブの１以上の部分を該標的−プローブ複合体から放出させる工程；ならびに（ｂ）該核酸プローブの切断された部分が産生されているか否かを決定し、それにより該標的核酸の存在を検出する工程、を包含する、方法。２．標的核酸分子を検出するための方法であって、以下の工程：（ａ）（ｉ）標的核酸分子；（ｉｉ）切断されやすい連結を含む一本鎖核酸プローブ；（ｉｉｉ）二本鎖標的−プローブ複合体のプローブ部分を、該切断されやすい連結で切断し得る酵素、および（ｉｖ）スペルミンを含む混合物を、該標的核酸および該プローブが互いにハイブリダイズし、そして二本鎖標的−プローブ複合体を形成することを可能にするのに十分な条件下および時間で反応させ、続いて該プローブの切断、および切断されていない新たなプローブに対する標的のサイクリングを行い、その結果、該切断された核酸プローブの１以上の部分を該標的−プローブ複合体から放出させる工程；ならびに（ｂ）該核酸プローブの切断された部分が産生されているか否かを決定し、それにより該標的核酸の存在を検出する工程、を包含する、方法。３．前記決定する工程が、切断されていないプローブの量の減少を検出することを含む、請求項１に記載の方法。４．前記決定する工程が、前記核酸プローブの切断部分を直接決定することを含む、請求項１に記載の方法。５．前記プローブが構造［ＮＡ₁−Ｓ−ＮＡ₂］_nを含み、そして、ＮＡ₁およびＮＡ₂がＤＮＡからなる核酸配列である、請求項１または２に記載の方法。６．前記ＳがＲＮＡ配列である場合である、請求項５に記載の方法。７．前記酵素がＲＮａｓｅＨである、請求項１または２に記載の方法。８．前記ＲＮａｓｅＨが熱安定性ＲＮａｓｅＨである、請求項７に記載の方法。９．前記ＲＮａｓｅＨが非熱安定性ＲＮａｓｅＨである、請求項７に記載の方法。１０．前記リボソームタンパク質が原核生物リボソームタンパク質である、請求項１に記載の方法。１１．前記リボソームタンパク質が真核生物リボソームタンパク質である、請求項１に記載の方法。１２．前記リボソームタンパク質がＳ１９またはＬ３４リボソームタンパク質である、請求項８に記載の方法。１３．前記反応混合物が、さらにスペルミンを含む、請求項１に記載の方法。１４．前記反応混合物が、さらにキレート剤を含む、請求項２に記載の方法。１５．前記キレート剤がＥＧＴＡまたはＥＤＴＡである、請求項１２に記載の方法。１６．前記プローブが検出マーカーで直接または間接的に標識されている、請求項１または２に記載の方法。１７．前記反応混合物が、さらにマグネシウムイオンを含む、請求項２に記載の方法。１８．（ｉ）切断されやすい連結を含む一本鎖核酸プローブ、（ｉｉ）ＲＮａｓｅＨ、（ｉｉｉ）ポリアミン、および（ｉｖ）キレート剤を含む、組成物。