CN111808977B - 一种由snp所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种由SNP所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法及检测方法，该设计方法包括以下步骤：步骤一、获取抗性基因的核苷酸序列；步骤二、对核苷酸序列进行引物设计，生成候选引物；步骤三、根据候选引物的参数进行筛选，得到特异性引物对。本发明实施例的设计方法至少具有如下有益效果：通过对引物参数的设定并进行筛选，设计得到具有较高的特异性，设计得到的特异性引物对可以通过PCR扩增直接得到抗性基因的全长序列，大大简化操作步骤。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种由SNP所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法及检测方法。
背景技术
利福平为利福霉素类半合成广谱抗菌药，对金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌等多种病原微生物均有抗菌活性，主要应用于肺结核和其他结核病的治疗。近年来，由于结核病的发病率开始上升，利福平的滥用，造成环境中的利福平的含量逐年升高，这也导致环境中利福平耐药菌株的检出率显著升高。
利福平通过与细菌DNA依赖的RNA聚合酶亚基特异性结合，抑制RNA聚合酶的活性，干扰细菌DNA的转录起始，阻碍蛋白质合成从而发挥杀菌作用。RNA聚合酶由5个亚单位组成，其中的β亚单位由rpoB基因进行编码。rpoB基因突变是细菌的利福平类抗生素耐药的主要机制。rpoB基因的少数密码子发生突变后，其编码的氨基酸改变，使RNA聚合酶分子原有的利福平结合点的构象发生改变。利福平无法与RNA聚合酶分子结合，从而导致利福平耐药，这在多种细菌中都得到了证实。
虽然90%左右的利福平耐药菌株的突变发生在其利福平耐药决定区（RifampinResistance Determining Region，RRDR），包括cluster Ⅰ（507-533位氨基酸）、cluster Ⅱ（563-572位氨基酸）等，但仍有不少突变位点位于利福平耐药决定区以外。因此，获取细菌的rpoB基因全长序列，并对其相应的SNP位点分析就显地尤为重要。然而，rpoB基因全长在3kb以上，属于长片段基因序列。目前对于长片段基因序列的获取主要通过克隆载体测序的方式，但存在操作复杂、耗时长等问题。而常规的PCR反应对于3kb以上的DNA片段很难扩增，即便扩增成功但产量较低，难以进行进一步的检测分析。因而，有必要提供一种能够筛选利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种能够筛选由SNP所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法及检测方法。
第一方面，本发明的一个实施例提供了一种由SNP所引起利福平类抗生素耐药的抗性基因的特异性引物的设计方法，该设计方法包括以下步骤：
步骤一、获取抗性基因的核苷酸序列；
步骤二、对核苷酸序列进行引物设计，生成候选引物；
步骤三、根据候选引物的参数进行筛选，得到特异性引物对。
本发明实施例的设计方法至少具有如下有益效果：
通过对引物参数的设定并进行筛选，设计得到具有较高的特异性，设计得到的特异性引物对可以通过PCR扩增直接得到抗性基因的全长序列，大大简化操作步骤。
根据本发明的一些实施例的设计方法，候选引物的参数包括所述候选引物的长度、G+C含量、碱基分布随机性、引物互补性。引物的长度要求是指上游引物和下游引物的长度在25-35bp，其有效长度[Ln=2(G+C)+(A+T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度（74℃），从而降低产物的特异性。G+C含量的要求是指上游引物和下游引物的G+C含量应在40~60%。PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5~10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4 (G+C)+2(A+T)。碱基分布的随机性是指应避免出现4个以上的连续单一碱基，同时不应在其3′ 端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。引物互补性要求包括：①上游引物或下游引物不能含有自身互补序列，否则会形成发卡样二级结构；②上游引物和下游引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3′ 端的互补重叠；③上游引物或下游引物的3′ 末端序列不能结合到另一引物的任何位点上。另外，如果可能的话，每个引物的3′ 末端碱基最好是G或C，不能为A。然而，并不推荐使用3′ 端有NNCG或NNGC序列的引物，因为末端GC碱基高的自由能可以促进发卡结构的形成，还可能产生引物二聚体。因为位于5′ 端的限制性酶切位点的切割效率比较低，所以引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。上游引物和下游引物的Tm值相差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃。满足上述条件进行引物的设计筛选，得到的特异性引物对在扩增过程中可以更有效地扩增出抗性基因的全长序列。
根据本发明的一些实施例的设计方法，抗性基因为rpoB基因。大部分细菌的利福平类抗生素耐药的抗性基因的位点突变都发生在rpoB基因上，选择rpoB基因作为扩增标的可以获得利福平类抗生素耐药的大部分SNP位点。
第二方面，本发明的一个实施例提供了根据上述设计方法得到的特异性引物对，该特异性引物对的核苷酸序列如下所示：
rpoB-F：TTGGCAGGTCAAGTTGTCCAATAT（SEQ ID No.1）；
rpoB-R：TTAATCAGTAACTTCTTTTTGTGTTTC（SEQ ID No.2）。
本发明实施例的特异性引物对至少具有如下有益效果：
利用该特异性引物对可以完成rpoB基因的全长序列扩增，通过普通PCR扩增方法，优化反应体系和反应条件，就能够很好地得到长片段的全长序列，准确率高、速度快，技术手段简单。
第三方面，本发明的一个实施例提供了一种试剂盒，该试剂盒包括上述的特异性引物对。包括上述特异性引物对的试剂盒能够通过常规的PCR方法准确高效地完成对rpoB基因全长序列的扩增，方便后续对序列上SNP位点的分析。该试剂盒具体还包括DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液等成分。
第四方面，本发明的一个实施例提供了上述特异性引物对或试剂盒在细菌的rpoB基因的扩增或检测中的应用。利用上述特异性引物对或试剂盒能够准确高效地完成对样本细菌的rpoB基因的全长序列的扩增，根据扩增结果可以进一步进行相关的检测。
根据本发明的一些实施例的应用，细菌为金黄色葡萄球菌。
第五方面，本发明的一个实施例提供了上述特异性引物对或试剂盒在筛选利福平耐药菌中的应用。利用上述特异性引物对或试剂盒能够准确高效地扩增出菌株的rpoB基因，因而在将扩增产物进行序列比对后，可以准确得到菌株rpoB基因的SNP位点，根据这些SNP位点可以确认菌株的利福平耐药性，得到筛选结果。
第六方面，本发明的一个实施例提供了一种SNP位点的检测方法，该检测方法包括以下步骤：
获取待测样本的DNA；
利用上述的特异性引物对或试剂盒对DNA进行扩增；
回收扩增产物并测序，对测序结果进行序列比对，获得待测样本的SNP位点。
本检测方法所采用的特异性引物对能够简单方便地实现对DNA模板中rpoB基因全长序列的准确扩增，从而在比对后能够获得样本的SNP位点，判读结果直观准确、精确度高、灵敏度好、重复性高。
根据本发明的一些实施例的检测方法，序列比对的方法是将测序结果与预设的参考序列进行比对。
根据本发明的一些实施例的检测方法，待测样本包括金黄色葡萄球菌。
根据本发明的一些实施例的检测方法，预设的参考序列是指野生型金黄色葡萄球菌的rpoB基因的对应序列。
附图说明
图1是本发明的实施例2的不同样本的rpoB基因的PCR扩增的电泳结果。
图2是本发明的实施例3的不同样本的rpoB基因的1402~1475位的序列比对结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
1.引物设计
（1）抗性基因rpoB基因含有3552bp的开放读码框架，使用NCBI公布的金黄色葡萄球菌的rpoB的参考序列（GenBank NC_007795.1:522160-525711），编码1183个氨基酸。
（2）以上述参考序列利用DNAman软件进行引物设计，生成候选引物。
（3）由于需要扩增出rpoB基因的全长序列，就必须在参考序列的开头和结尾分别取，而且上游引物从参考序列首端开始，下游引物从参考序列末端结束，因此一些引物设计的软件就不能够自动生成特异性好的引物，需要去使用软件并结合一些长片段引物设计的原则去筛选引物。长片段引物的设计要必须注意下面的问题：
a. 引物长度：25-35bp。长片段的引物长度需要较长一点，以便提高退火温度，从而提高反应的特异性。但是也不要太长，应避免引物间3′端的互补，以防止或减少形成二级结构的可能性。
b. G+C含量：40~60%。PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5~10度。两个引物的解链温度应平衡，差别最好不要超过1℃。
c. 碱基分布的随机性：尽量避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3′端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G+C富集序列区错误引发。
d. 3′末端：3′末端碱基优选为G或C，不能为A。然而，并不推荐使用3′端有NNCG或NNGC序列的引物，因为末端GC碱基高的自由能可以促进发卡结构的形成，还可能产生引物二聚体。
e. 引物应当超出限制性内切酶识别位点3个核苷酸以上。
f. 引物之间：上下游引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基。不然会形成引物二聚体，尤应避免3′端的互补重叠。
g. 上下游引物的互补性：一个引物的3′ 末端序列不能结合到另一个引物的任何位点上。因为PCR中引物的浓度往往较高，即便引物之间的微弱互补也会导致引物之间形成杂交，随后是引物二聚体的形成和扩增。如果引物二聚体在PCR早期形成，其将与DNA聚合酶、引物、核苷酸竞争进而抑制靶DNA的扩增。
其它还包括对解链温度等的要求，如扩增产物的Tm值与引物的Tm值相差不能大于10℃。
通过上述方法设计筛选得到特异性引物对如下：
rpoB-F：TTGGCAGGTCAAGTTGTCCAATAT（SEQ ID No.1）；
rpoB-R：TTAATCAGTAACTTCTTTTTGTGTTTC（SEQ ID No.2）。
实施例2
特异性引物对扩增实验
（1）分别提取6株利福平最小抑菌浓度（MIC）值不同的金黄色葡萄球菌（记为利0~利5）、1份活性污泥样品和1株ATCC25922大肠杆菌的基因组DNA。
（2）以步骤1提取的各个基因组DNA为模板，用实施例1筛选得到的特异性引物对进行PCR扩增，得到对应的PCR产物；PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
其中，PCR反应体系为：
总反应体系为50μL
PCR的扩增程序为：94℃预变性5min；94℃、2min，97℃、1min，60℃、1min，35个循环；68℃、5min，68℃、10min。
（3）回收PCR产物，送至华大基因公司进行测序。
琼脂糖凝胶电泳结果参考图1。泳道1~6分别代表6株金黄色葡萄球菌，泳道7代表大肠杆菌，泳道8代表污泥样品。从图中可以看出，泳道1~6使用特异性引物扩增的结果很好，没有出现非特异性条带和引物二聚体，条带的大小也符合rpoB基因的全长大小。而在泳道7和8的非金黄色葡萄球菌样品中，没有条带出现，表明实施例1所提供的特异性引物对的特异性良好。
根据测序结果使用DNAman软件来进行序列比对，以此得到不同的SNP位点。比对结果见图2，图2是1402~1475位的比对结果。1~6分别表示利0~利5的对应序列，7表示GenBankNC_007795.1:522160-525711的参考序列，8表示根据比对结果得出的一致性序列（consensus sequences）。
从图2中可以看到，相对于参考序列：
第一个SNP发生在1412bp处（A-G，GAC-GGC，471天冬氨酸变成了甘氨酸），利1~利4这4株利福平耐药的菌株都出现了同样的突变；
第二个SNP发生在1451bp处（G-A，CGT-CAT，484精氨酸变成了组氨酸），只出现在利-2菌株中；
第三个SNP发生在1457bp处（C-T，TCA-TTA，486丝氨酸变成了亮氨酸），出现于利-3和利-4菌株中。
可以看到，利用实施例1设计得到的特异性引物对，可以高效地用于对rpoB基因的SNP位点的检测和后续研究。
实施例3
本实施例提供一种筛选利福平耐药菌株的方法，该方法包括以下步骤：
（1）获得待筛菌株的基因组DNA；
（2）利用实施例1中的特异性引物对、DNA聚合酶、核苷酸等对基因组DNA按照实施例2中的扩增程序扩展；
（3）扩增产物回收后测序，将其与野生型金黄色葡萄球菌的rpoB基因序列进行比对，获得待筛菌株的rpoB基因的SNP位点信息，根据其SNP位点信息筛选利福平耐药菌株。
本方案中采用的特异性引物对能够通过常规的PCR方式就可以将rpoB基因的全长序列准确扩增出来，因而可以有效地实现对菌株的筛选工作。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
Claims (3)
1.特异性引物对在扩增或检测金黄色葡萄球菌的rpoB基因的全长序列中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗目的，所述特异性引物对如下：
rpoB-F：TTGGCAGGTCAAGTTGTCCAATAT；
rpoB-R：TTAATCAGTAACTTCTTTTTGTGTTTC。
2.一种金黄色葡萄球菌的rpoB基因突变位点的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
获取待测样本的DNA，所述待测样本包括金黄色葡萄球菌；
利用权利要求1所述的特异性引物对对所述DNA进行扩增；
回收扩增产物并测序，对测序结果进行序列比对，获得待测样本的rpoB基因突变位点；
所述检测方法为非疾病诊断或治疗目的。
3.权利要求2所述的检测方法在筛选利福平耐药的金黄色葡萄球菌中的应用，所述应用为非疾病诊断或治疗目的。
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