CN111057783B

CN111057783B - 基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用

Info

Publication number: CN111057783B
Application number: CN202010189509.0A
Authority: CN
Inventors: 赵丽丽; 万康林; 李马超; 刘海灿
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2020-03-18
Filing date: 2020-03-18
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2040-03-18
Also published as: CN111057783A

Abstract

本发明涉及分子生物学及临床检测技术领域，具体涉及基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用。本发明以rpoB基因第1296位碱基突变作为分子标记鉴别结核分枝杆菌复合群菌株，针对该位点以及rpoB的516位点、526位点和531位点氨基酸突变设计了特异性引物探针组，开发了基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的方法。本发明的引物探针组检测灵敏度高、特异性强；该方法对设备的依赖性低，检测耗时短，可实现快速、准确的检测，结合侧向流动试纸条可实现可视化检测，对结核分枝杆菌复合群菌株的感染检测及结核分枝杆菌耐药性检测具有重要的应用价值。

Description

基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB 突变的引物探针组及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学及临床检测技术领域，具体涉及基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用。

背景技术

结核病主要是由结核分枝杆菌复合群菌株（Mycobacterium tuberculosisComplex，MTBC）所引起的一种严重危害人类健康的慢性传染病，其中由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染导致的病例占绝大多数。结核分枝杆菌复合群主要包括结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌等多种亲缘关系相近的菌株；其中，除田鼠分枝杆菌已明确对人无致病力外，大多数结核分枝杆菌复合群菌株对人可致病；且产生大致相同的临床表现。非结核分枝杆菌（Non Tuberculosismycobacteria，NTM）是指除结核杆菌复合群菌株及麻风分枝杆菌以外的所有分枝杆菌。NTM感染症状与结核病症状类似、易造成误诊、漏诊，增加了结核病诊断和治疗的难度。因此，迅速、准确的检测、鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌感染已经成为影响临床用药与治疗效果的重要因素。

rpoB基因是编码细菌RNA聚合酶β亚单位的基因，该基因的突变直接导致其所编码的β亚单位构象异常，菌体与利福平类抗结核药物的亲和力降低，进而导致治疗失败。而利福平是一种广谱抗生素，对结核分枝杆菌有较强抗菌作用，被世界卫生组织推荐为治疗结核病的最主要药物之一。利福平与依赖DNA的RNA多聚酶β亚单位结合，抑制细菌RNA的合成，从而阻断RNA转录与延伸过程，使DNA和蛋白的合成停止、抑制细菌繁殖。结核分枝杆菌对利福平的敏感性是评价结核分枝杆菌耐药特征的重要指标，对利福平耐药的菌株大多对另外一种重要的抗结核药物异烟肼不敏感，对利福平和异烟肼同时耐药的菌株被称为耐多药（Multi-Drug Resistant Tuberculosis，MDR-TB）菌株或广泛耐药（Extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）菌株。研究表明，超过95%的rpoB基因突变发生在81bp（编码507-533位点氨基酸）的核心区域—耐利福平决定区（Rifampicin ResistanceDetermining Region, RRDR）；该区域内发生的突变与结核分枝杆菌对利福平类药物的敏感性变化密切相关。

目前用于检测结核分枝杆菌对利福平敏感性的方法主要有表型检测法（如传统药敏试验法和BACTEC MGIT 960法）和分子药敏法。其中，传统的在含抗结核药物的固体培养基上检测药物敏感性的方法，虽然简单、经济、适用于基层，但是培养时间长，通常需1-2月时间；通过BACTEC MGIT 960快速培养系统检测利福平敏感性的方法，虽然比较快速，但目前仪器设备严重依赖进口、且无论是设备本身还是配套试剂采购成本较高、设备的依赖性强。而分子生物学的发展推动了各种快速、准确、成本低廉的检测技术得以广泛应用。

多酶恒温快速扩增技术（Multienzyme Isothermal Rapid Amplification，MIRA）是一种基于常温恒温核酸快速扩增的技术。具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等优点；反应组分可做冻干处理，操作简便，易于保存；无需购买价格高昂的专属设备；且可借助生物标记手段、与侧向流动检测技术相结合，在短时间内实现多重检测、以及短时间内检测结果的可视化读取。

目前，尚没有基于多酶恒温快速扩增技术的结核分枝杆菌复合群菌株鉴定及结核分枝杆菌对利福平耐药性的检测方法，因此，建立一种基于多酶恒温快速扩增技术、用于检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB基因突变的检测方法具有重要现实意义。

发明内容

在此为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组、试剂盒以及检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的方法。

为实现上述目的，本发明通过对结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌的基因组序列进行了充分的研究和分析，结合大量的实践验证发现，与非结核分枝杆菌相比，结核分枝杆菌复合群菌株在其rpoB基因的第1296位存在特异性的碱基突变，该碱基对应结核分枝杆菌复合群菌株RNA聚合酶β亚单位氨基酸序列的第513位点氨基酸的密码子（CAA:1294-1296位碱基）第3个碱基。仅当结核分枝杆菌复合群菌株RNA聚合酶β亚单位第513位点氨基酸的密码子第3个碱基（第1296位碱基）发生突变时，该密码子编码的氨基酸不发生突变，因此结核分枝杆菌复合群菌株的耐药性不受该碱基突变的影响。另一方面，本发明将多酶恒温快速扩增技术引入到结核分枝杆菌复合群检测中，开发了基于多酶恒温快速扩增技术的结核分枝杆菌复合群及结核分枝杆菌对利福平耐药性的检测方法，经人工设计和筛选，针对用于区分非结核分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群的rpoB基因突变位点以及导致结核分枝杆菌株对利福平敏感性变化的rpoB突变位点（对应编码第516位点（GAC：1303-1305位碱基）、526位点（CAC:1333-1335位碱基）和531位点（TCG:1348-1350位碱基）氨基酸的密码子突变）设计了特异的检测引物和探针。通过在该引物和探针的末端引物生物标记，可实现结合侧向流动试纸条的快速、可视化结果检测。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供rpoB突变位点在作为结核分枝杆菌复合群菌株的特异性分子标记中的应用；所述rpoB突变位点位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第1296位，结核分枝杆菌复合群菌株的该位点为A；非结核分枝杆菌的该位点为G。

本发明所述的第1296位碱基突变为相对于结核分枝杆菌的rpoB编码基因（SEQ IDNO.1）的位置，非结核分枝杆菌的该位点为G是指非结核分枝杆菌在与结核分枝杆菌进行rpoB基因序列比对时的对应位点。

第二方面，本发明提供rpoB突变位点或所述rpoB突变位点的检测试剂在鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌，或者制备用于检测结核分枝杆菌复合群菌株感染或检测结核病的试剂中的应用；所述rpoB突变位点位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第1296位，结核分枝杆菌复合群菌株的该位点为A；非结核分枝杆菌的该位点为G。

第三方面，本发明提供基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的特异性引物探针组，所述引物探针组包括上游引物和探针组，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述探针组包含选自核苷酸序列如SEQ ID NO.4~7所示的探针中的一个或多个。

SEQ ID NO.3：rpoB-A1：5’-TTCGATGAACCCGAACGGGTTGA CCCGC-3’；

SEQ ID NO.4：rpoB-183MF1：5’- AGTTCTTCGGCACCAGCCAG CTGAGCGAA-3’；

SEQ ID NO.5：rpoB-531MF7：5’- TGTCGGGGTTGACCCACAAG CGCCGACTTTC-3’；

SEQ ID NO.6：rpoB-526MF6：5’- CAACCCGCTGTCGGGGTTG ACTCA-3’；

SEQ ID NO.7：rpoB-516MD2：5’- GCACCAGCCAGCTGAGC CAATTCATCGA-3’。

上述引物中，SEQ ID NO.3所示引物为上游引物，可与各探针配对使用；SEQ IDNO.4所示探针用于区分结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌；SEQ ID NO.5、6、7所示探针分别用于检测rpoB编码蛋白的第531位点、第526位点和第516位点氨基酸突变（第531位点、第526位点和第516位点为相对于大肠杆菌的rpoB编码蛋白序列的位置，这些位点相对于结核分枝杆菌菌株的rpoB编码蛋白序列，即SEQ ID NO.2序列的第450位点、第445位点和第435位点），即rpoB基因（SEQ ID NO.1）的第1349位、第1333-1334位和第1303-1304位的碱基突变。

本发明所述上游引物可以4条探针中的任意一条或多条配合使用，组成引物探针组，实现所需的检测目的。例如：当同时鉴别结核分枝杆菌复合群菌株以及检测rpoB的531位点、526位点和516位点氨基酸突变时，所述引物探针组包括SEQ ID NO.3~7所示的引物和探针。

为方便检测结果的判断，本发明所述的上游引物和探针的末端采用生物标记。所述生物标记包括但不限于生物素标记、荧光素标记、地高辛标记等。所述荧光素标记包括但不限于FAM、HEX、ROX、TET、JOE、CY3、CY5、TAMRA、VIC。

优选地，所述上游引物和所述探针之间以及所述探针之间采用不同的生物标记。本领域技术人员可根据采用的生物标记检测方式的不同，设计引物和探针的不同标记方式。

作为本发明的一种实施方式，各引物、探针的标记方式如下：SEQ ID NO.3所示的引物（rpoB-A1）的5’末端采用荧光素FAM标记；SEQ ID NO.4所示的引物（rpoB-183MF1）的5’末端采用生物素BIO标记；SEQ ID NO.5所示的引物（rpoB-531MF7）的5’末端采用地高辛DIG标记；SEQ ID NO.6所示的引物（rpoB-526MF6）的5’末端采用生物素BIO标记；SEQ ID NO.7所示的引物（rpoB-516MD2）的5’末端采用地高辛DIG标记。

第四方面，本发明提供结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的检测试剂盒，其包含所述基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的特异性引物探针组。

可选地，所述试剂盒还包括选自dNTPs、重组酶、恒温聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶、聚乙二醇、Tris-HCl、醋酸镁和单链结合蛋白中的一种或多种。

第五方面，本发明提供基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的特异性引物探针组或包含所述引物探针组的检测试剂盒的如下任一种应用：

（1）在鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌，和/或，检测结核分枝杆菌菌株的耐药性中的应用；

（2）在制备用于检测结核分枝杆菌复合群菌株感染或检测结核病的试剂中的应用。

上述（1）中的应用，所述耐药性具体为对利福平或其衍生物的耐药性。

第六方面，本发明提供基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的方法，包括：利用所述引物探针组或所述检测试剂盒进行多酶恒温扩增。

优选地，所述多酶恒温扩增的反应体系中，所述上游引物与所述探针的摩尔比为（1.5~3）：1。

更优选地，所述多酶恒温扩增的反应体系包括：重组酶200-290ng/µl、恒温聚合酶80-160ng/µl、单链结合蛋白190-270ng/µl、辅助蛋白60-110ng/µl、核酸外切酶70-130ng/µl、dNTPs 0.2-1mM、聚乙二醇2-4%、Tris-HCl 20-40mM、醋酸镁280-300mM、上游引物（SEQ IDNO.3）0.4~0.6μM、探针（SEQ ID NO.4-7中的一个或多个）0.18~0.3μM、ddH₂O和待测样品。

作为本发明的优选方案，设置2个扩增体系，扩增体系1中添加上游引物（SEQ IDNO.3）以及探针（SEQ ID NO.4-5），扩增体系2中添加上游引物（SEQ ID NO.3）以及探针（SEQID NO.6-7）；扩增体系1中上游引物（SEQ ID NO.3）的终浓度为0.6μM、探针（SEQ ID NO.4）的终浓度为0.2μM，探针（SEQ ID NO.5）的终浓度为0.3μM；扩增体系2中上游引物（SEQ IDNO.3）的终浓度为0.4μM、探针（SEQ ID NO.6）的终浓度为0.22μM，探针（SEQ ID NO.7）的终浓度为0.18μM。

优选地，所述多酶恒温扩增的反应程序为：37~42℃反应20~25min。

本发明所述的基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的方法优选利用侧向流动试纸条检测多酶恒温扩增的产物，根据试纸条的质控线和检测线颜色变化结果判断待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌株以及待测菌株的rpoB基因突变情况。

作为本发明的一种优选方案，所述方法包括：

（1）将待测菌株的培养物于80~85℃加热25~35min，离心分离沉淀物，加水混匀后再次离心分离沉淀物，加水混匀后于95~105℃加热20~25min，离心分离上清作为模板；

（2）利用所述引物探针组、在2个扩增反应体系中进行多酶恒温扩增，扩增体系1的50μL反应体系包括：重组酶200~290ng/µl、恒温聚合酶80~160ng/µl、单链结合蛋白190~270ng/µl、辅助蛋白60~110ng/µl、核酸外切酶70~130ng/µl、dNTPs 0.2~1mM、聚乙二醇2~4%、Tris-HCl 20~40mM、醋酸镁280~300mM、10μM的SEQ ID NO.3所示上游引物3µl、10μM的SEQ ID NO.4所示探针1µl、10μM的SEQ ID NO.5所示探针1.5µl、步骤（1）制备的模板2~3µl、以ddH₂O补足至50µl；扩增体系2的50μL反应体系包括：重组酶200~290ng/µl、恒温聚合酶80~160ng/µl、单链结合蛋白190~270ng/µl、辅助蛋白60~110ng/µl、核酸外切酶70~130ng/µl、dNTPs 0.2~1mM、聚乙二醇2~4%、Tris-HCl 20~40mM、醋酸镁280~300mM、10μM的SEQ ID NO.3所示上游引物2µl、10μM的SEQ ID NO.6所示探针1.1µl、10μM的SEQ ID NO.7所示探针0.9µl、步骤（1）制备的模板2~3µl、以ddH₂O补足至50µl；所述多酶恒温扩增为在37~42℃反应20~25min；

（3）利用侧向流动试纸条对扩增产物进行检测：将扩增产物以侧向流动试纸条反应缓冲液稀释后，滴加到侧向流动试纸条的加样端，将试纸条插入侧向流动试纸条反应缓冲液中，反应4~5min后读取结果。根据侧向流动试纸条的质控线和各检测线的颜色判断待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌株及其rpoB是否存在对应于第531位点、516位点和526位点氨基酸突变的核苷酸突变。

本发明的有益效果在于：本发明发现结核分枝杆菌rpoB基因的第1296位的碱基类型可作为结核分枝杆菌复合群菌株的特异性分子标记，用于有效区分结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌。本发明开发了基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB基因突变的方法，分别针对上述区分结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌的rpoB基因位点以及导致结核分枝杆菌耐药性的rpoB基因突变位点设计了高效的多酶恒温扩增引物和探针，实现了结核分枝杆菌复合群菌株及其rpoB基因耐药性突变的快速、准确检测，对于结核分枝杆菌复合群菌株的区分鉴定、结核分枝杆菌复合群菌株的感染检测及其耐药性检测具有重要的应用价值，可广泛用于结核病的辅助诊断、流行病学监测等相关领域。

相比于现有技术的结核分枝杆菌复合群菌株及结核分枝杆菌耐药性的检测方法，本发明提供的基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB突变的方法，具有以下优点：

（1）具有较高的灵敏度和特异性；

（2）具有较高的准确性；

（3）扩增反应可在37-42℃下进行，对设备的依赖性低、甚至可利用常规微生物检测实验室的培养箱作为扩增设备，无需购置其他特殊设备，设备采购成本低廉，适用于基层机构或现场作业；

（4）可利用侧向流动试纸条对扩增产物实现可视化、即时化检测；

（5）检测过程耗时较短，可在短时间内完成大批量的样本检测；无需进行传统的DNA提取，将菌株样品经简单的加热处理即可作为检测模板；临床样本直接检测（样本核酸提取、核酸扩增、结果判读）可在2小时内完成、核酸样本检测（核酸扩增、结果判读）可在30分钟内完成、可视化结果判读可在10分钟内完成；

（6）检测所需试剂耗材的保存条件要求低，关键试剂以干粉状态可长期保存，运输、携带方便；

（7）检测试剂的成本较低，适合大规模商业化生产和推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌的rpoB序列比对结果。

图2为本发明实施例3中扩增反应1的各种检测结果示意图；从左至右依次为实施例3中的扩增反应1的（1）、（2）、（3）和（4）中的检测结果。

图3为本发明实施例3中扩增反应2的各种检测结果示意图；从左至右依次为实施例3中的扩增反应2的（1）、（2）、（3）、（4）和（5）中的检测结果。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，用于多酶恒温扩增的A buffer、B buffer成品均购自潍坊安普未来生物科技有限公司。

实施例1 适用于多酶恒温快速扩增技术的检测引物和探针的设计及合成

本发明通过对结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌的基因组序列进行了充分的研究和分析，结合大量的实践验证发现，与非结核分枝杆菌相比，结核分枝杆菌复合群菌株在其rpoB基因（Rv0667或相应核酸序列，序列如SEQ ID NO.1所示）的第1296位存在特异性的碱基突变，结核分枝杆菌复合群菌株的该位点为A；非结核分枝杆菌与该位点对应的位点为G。可利用该位点鉴别结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌。结核分枝杆菌复合群菌株的特异性位点及其上下游序列与非结核分枝杆菌的序列比对结果如图1所示。

分别针对该特异性位点以及与结核分枝杆菌菌株对利福平敏感性密切相关的rpoB编码蛋白的531位点（即SEQ ID NO.2所示序列的450位）、526位点（即SEQ ID NO.2所示序列的445位）和516位点（即SEQ ID NO.2所示序列的435位）氨基酸突变设计适用于多酶恒温扩增的引物和探针。

与普通PCR反应过程不同，多酶恒温扩增反应对所用引物/探针的要求较高。首先，为了保证扩增反应的高特异性，所用引物/探针的长度（24-31bp）均高于普通PCR反应所需的引物长度（18-20bp）。第二，为了保证扩增反应的高效性，即单次扩增同时发生多个反应，所用引物/探针需充分考虑引物/探针之间的非特异性配对与反应效率。第三，常规核酸扩增反应用于检测点突变时，检测的突变位点主要是引物/探针的3’端最后一个碱基；若该碱基为完整密码子第三位碱基时、根据密码子编码原则翻译后的氨基酸不发生突变（相应蛋白所具有的功能不发生改变）；而本发明在进行耐药性相关位点检测时主要检测相应氨基酸位点上密码子的第一、第二位核苷酸所发生的突变（核酸突变所带来的蛋白质功能改变）。因此，适用于普通PCR扩增反应的引物和探针的设计原则并不能完全适用于本发明所用的引物/探针。

本发明在设计引物/探针时，通过在引物/探针的3’上游的某个位置引入特异的突变碱基，通过引入的突变碱基与下游碱基之间自由能发生改变、进而影响该碱基及下游碱基与模板结合的稳定性，达到检测密码子第一、第二位碱基突变的目的。

综合上述考虑，基于多酶恒温扩增体系在反应过程中涉及的引物与模板之间、引物与引物之间、不同离子浓度之间的相互作用的复杂性，在引物/探针专业设计软件的辅助下，初步设计并筛选到多条候选的可用于本发明多酶恒温扩增体系的引物/探针。为实现高效、特异的多酶恒温扩增，本发明对经特异设计、筛选初步得到的候选引物/探针序列合成并进行生物标记后、进行了人工验证与优化，以下为本发明设计的候选引物、探针的部分罗列及效果说明。

1、516和526位点氨基酸突变检测的引物探针优化过程

上游引物的候选引物序列如下（5’-3’）：

A1：TTCGATGAACCCGAACGGGTTGACCCGC；

A2：GACAGCGAGCCGATCAGACCGATGTTGGG；

A3：CCGATCAGACCGATGTTGGGCCCCTCAGG；

A4：TCGCGGACCTCCAGCCCGGCACGCTCACG。

516位点氨基酸突变检测的候选探针序列如下（5’-3’）：

516MD1：GCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATAGA；

516MD2：GCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATCGA；

516MD3：GCACCAGCCAGCTGAGCCAATTCATTGA。

526位点氨基酸突变检测的候选探针序列如下（5’-3’）：

526MF1：CAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACTCA；

526MF2：CAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACGCA；

526MF3：CAGAACAACCCGCTGTCGGGGTTGACACA。

利用上述候选引物和探针的不同组合进行多酶恒温扩增，扩增体系如表1所示：

表1 用于候选引物探针筛选的多酶恒温扩增体系（1）

DNA模板为：516位点氨基酸未突变/突变菌株、526位点氨基酸未突变/突变菌株经热处理后的样品，热处理的具体方法如下：

（1）在1.5ml螺口离心管中加入800µl的ddH₂O，用接种环从罗氏固体培养基中刮取一环待测菌置于离心管中；

（2）将离心管置于80℃环境，加热30min灭活，12000rmp离心5min；

（3）将上清弃掉，向管中加入ddH₂O 1ml，混匀；

（4） 12000rmp离心5min，将上清弃掉、加入150µl ddH₂O，轻微震荡混匀；

（5）置于100℃环境，加热20min；

（6）12000rmp离心10min；

（7）吸取上清作为待测样品。

将上述扩增体系在39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：A1和516MD2引物性能最佳；526MF1引物性能虽优于526位点检测的其他两条引物，但仍呈现非特异扩增；在此基础上继续对526位点的扩增引物进行优化。

526位点氨基酸突变检测的部分候选探针序列如下（5’-3’）：

526MF5：AACAACCCGCTGTCGGGGTTGACTCA；

526MF6：CAACCCGCTGTCGGGGTTGACTCA。

将上述候选探针分别与上游引物A1和516MD2组合进行多酶恒温扩增，扩增体系如表2所示：

表2 用于候选引物探针筛选的多酶恒温扩增体系（2）

DNA模板为：526位点未突变/突变菌株热处理后样品。

将上述扩增体系于39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：526MF6引物最佳。

2、531位点氨基酸突变和1296位碱基突变检测的引物探针优化过程

上游引物的候选引物序列A(1-4) 的序列如上述1中所述。

531位点氨基酸突变检测的候选探针序列如下（5’-3’）：

531MF1：TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACGGCC；

531MF2：TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACCGCC；

531MF3：TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACAGCC；

531MF4：GGTTGACCCACAAGCGCCGACAGCC；

531MF5：TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTATC；

531MF6：TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGATTATC；

531MF7：TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTTTC；

531MF8：TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTGTC；

531MF9：TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACTCTC；

531MF10：TGTCGGGGTTGACCCACAAGCGCCGACCGTC。

1296位碱基突变检测的候选探针序列如下（5’-3’）：

183MF1：AGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCGAA；

183MF2：AGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCTAA；

183MF3：AGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGTCGA；

183MF4：AGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCAGA；

183MF5：AGTTCTTCGGCACCAGCCAGCTGAGCTGA。

利用上述候选引物和探针的不同组合进行多酶恒温扩增，扩增体系如表3所示：

表3 用于候选引物探针筛选的多酶恒温扩增体系（3）

DNA模板为：1296位碱基未突变/突变菌株、531位点氨基酸未突变/突变菌株热处理后样品。

将上述扩增体系在39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：A1、531MF7和183MF1引物性能最佳。

通过对引物、探针序列进行筛选和人工优化，最终获得能够实现高效的多酶恒温扩增的引物和探针序列：

SEQ ID NO.3：rpoB-A1：5’-TTCGATGAACCCGAACGGGTTGA CCCGC-3’；

SEQ ID NO.4：rpoB-183MF1：5’-AGTTCTTCGGCACCAGCCAG CTGAGCGAA-3’；

SEQ ID NO.5：rpoB-531MF7：5’-TGTCGGGGTTGACCCACAA GCGCCGACTTTC-3’；

SEQ ID NO.6：rpoB-526MF6：5’-CAACCCGCTGTCGGGGTTG ACTCA-3’；

SEQ ID NO.7：rpoB-516MD2：5’-GCACCAGCCAGCTGAGCC AATTCATCGA-3’。

上述引物中，SEQ ID NO.3所示引物为上游引物；SEQ ID NO.4所示探针用于检测1296位碱基突变，以区分结核分枝杆菌复合群菌株和非结核分枝杆菌；SEQ ID NO.5、6、7所示探针分别用于检测与结核分枝杆菌菌株对利福平敏感性密切相关的rpoB编码蛋白的第531位点（即SEQ ID NO.2所示序列的450位Ser）、第526位点（即SEQ ID NO.2所示序列的445位His）和第516位点（即SEQ ID NO.2所示序列的435位Asp）氨基酸突变。

为配合后续利用侧向流动试纸条检测扩增产物，对各引物、探针进行不同的生物标记，具体标记方式如下：SEQ ID NO.3所示的引物（rpoB-A1）的5’末端采用荧光素FAM标记；SEQ ID NO.4所示的引物（rpoB-183MF1）的5’末端采用生物素BIO标记；SEQ ID NO.5所示的引物（rpoB-531MF7）的5’末端采用地高辛DIG标记；SEQ ID NO.6所示的引物（rpoB-526MF6）的5’末端采用生物素BIO标记；SEQ ID NO.7所示的引物（rpoB-516MD2）的5’末端采用地高辛DIG标记。

实施例2 基于多酶恒温快速扩增技术的快速、可视化检测试剂盒

本实施例提供用于结核分枝杆菌复合群菌株检测及其rpoB突变检测的、基于多酶恒温快速扩增技术的快速、可视化的试剂盒，试剂盒包括如下组分：

（1）序列如SEQ ID NO.3-7所示的引物和探针；

（2）多酶恒温快速扩增反应缓冲液：、包含dNTPs、重组酶、恒温聚合酶、辅助蛋白、核酸外切酶、聚乙二醇、Tris-HCl、醋酸镁和单链结合蛋白；

（3）可同时检测3种标记（BIO、DIG、FAM）扩增产物的侧向流动试纸条及其反应缓冲液；

（4）ddH₂O。

实施例3 基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB基因突变的方法

1、待测样品的制备：

（3）将上清弃掉，向管中加入ddH₂O 1ml，混匀；

（5）置于100℃环境，加热20min；

（6）12000rmp离心10min；

（7）吸取上清作为待测样品；

以上待测样品的制备过程耗时约90min。

2、多酶恒温快速扩增反应

根据检测目的和识别位点的不同，将实施例1中的引物、探针应用于2个扩增反应，分别构建扩增体系，各扩增反应体系的具体组成如下：

扩增体系1（50µl）：ddH₂O、10.6µl；A buffer、29.4µl；rpoB-183MF1 (SEQ IDNO.4，10µM)、1µl；rpoB-531MF7（SEQ ID NO.5，10µM）、1.5µl；rpoB-A1（SEQ ID NO.3，10µM）、3µl；待测样品，2µl；B buffer、2.5µl。

扩增体系2（50µl）：ddH₂O、12.1µl；A buffer、29.4µl；rpoB-526MF6 （SEQ IDNO.6，10µM）、1.1µl；rpoB-516MD2 （SEQ ID NO.7，10µM）、0.9µl；rpoB-A1（SEQ ID NO.3，10µM）、2µl；待测样品，2µl；B buffer、2.5µl。

扩增体系1用于鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌以及检测rpoB基因编码531氨基酸位点的突变。扩增体系2用于检测rpoB基因编码516和526氨基酸位点的突变。

扩增体系的配制方法如下：在反应管中配制扩增反应体系，不添加B buffer；短暂离心混匀；打开反应管盖，在盖上加入2.5µl B buffer，盖上管盖；用手指轻弹反应管，混匀反应管中的扩增反应体系；短暂离心，将管中的反应液与管盖上B buffer充分混匀，启动反应。

将反应管置于39℃环境中反应10min（反应进行到第4min时，将反应管从39℃环境中取出，再次用手指轻弹混匀，短暂离心后置于39℃环境中继续反应）；反应10min后将反应管取出、进行可视化检测，如不立即进行检测，可置于4℃环境短时间保存。

以上多酶恒温快速扩增反应过程耗时约20min。

为提高多酶恒温扩增的检测效率，本发明对扩增体系进行了优化，以下为优化实验的部分罗列及效果说明。

（1）扩增体系1的优化过程

针对各引物和探针分别设置不同的添加量，具体如表4所示：

表4 扩增体系1的优化

DNA模板：1296位碱基未突变/突变菌株、531位点氨基酸未突变/突变菌株热处理后样品。

将上述各扩增体系于39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：当A1为3µl、531MF7为1.5µl、183MF1为1µl时扩增体系性能最佳。

（2）扩增体系2的优化过程

针对各引物和探针分别设置不同的添加量，具体如表5所示：

表5 扩增体系2的优化

DNA模板为：516位点氨基酸未突变/突变菌株、526位点氨基酸未突变/突变菌株热处理后样品。

将上述各扩增体系于39℃反应10min。反应结束后取反应液采用侧向流动试纸条进行检测，结果显示：当A1为2µl、516MD2为0.9µl、526MF6为1.1µl时扩增体系性能最佳。

3、基于侧向流动试纸条（可同时检测BIO、DIG和FAM 3种标记扩增产物）的扩增结果可视化检测

（1）在1.5ml离心管中加入49µl侧向流动试纸条反应缓冲液, 吸取1µl多酶恒温快速扩增反应产物于离心管中进行50倍稀释，混匀，得到扩增产物稀释液；

（2）吸取10µl扩增产物稀释液滴加到侧向流动试纸条上的加样端；

（3）另取一个1.5ml离心管，加入90µl侧向流动试纸条反应缓冲液；

（4）将已滴加扩增产物稀释液的侧向流动试纸条插入含有90µl侧向流动试纸条反应缓冲液的1.5ml离心管中，4min后读取结果；

以上可视化检测耗时约10min。

4、结果判读

侧向流动试纸条上从上至下依次分布3条检测带，依次为质控条带、DIG检测带、BIO检测带。当侧向流动试纸条上的某一检测带呈现红色或紫红色明显条带时，表示相应扩增反应呈阳性；当无红色或紫红色明显条带时，表示相应扩增反应呈阴性。

对于扩增反应1：（1）当质控条带、DIG检测带和BIO检测带均为阳性时，表示检测反应成功，待测样本为结核分枝杆菌复合群菌株且其相应的rpoB基因编码531氨基酸位点未发生突变；（2）当质控条带为阳性、DIG检测带与BIO检测带均为阴性时，表示检测反应成功，待测样本为分枝杆菌属中不属于结核分枝杆菌复合群的菌株或其他属菌株，且其相应的rpoB基因编码531氨基酸位点发生突变；（3）当质控条带为阳性、DIG检测带为阴性、BIO检测带均为阳性时，表示检测反应成功，待测样本为结核分枝杆菌复合群菌株且其相应的rpoB基因编码531氨基酸位点发生突变；（4）当质控条带、DIG检测带和BIO检测带均为阴性时，表示检测反应未成功。各种检测结果的示例如图2所示。

对于扩增反应2：（1）当质控条带、DIG检测带和BIO检测带均为阳性时，表示检测反应成功，且待测样本相应的rpoB基因编码516和526氨基酸位点均未发生突变；（2）当质控条带为阳性、DIG检测带为阳性、BIO检测带为阴性时，表示检测反应成功，且待测样本相应的rpoB基因编码516氨基酸位点未发生突变、rpoB基因编码526氨基酸位点发生突变；（3）当质控条带为阳性、DIG检测带为阴性、BIO检测带为阳性时，表示检测反应成功，且待测样本相应的rpoB基因编码516氨基酸位点发生突变、rpoB基因编码526氨基酸位点未发生突变；（4）当质控条带为阳性、DIG检测带和BIO检测带均为阴性时，表示检测反应成功，且待测样本相应的rpoB基因编码516和526氨基酸位点均发生突变；（5）当质控条带、DIG检测带和BIO检测带均为阴性时，表示检测反应均未成功。各种检测结果的示例如图3所示。

实施例4 基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB基因突变的方法的临床应用（1）

选取结核分枝杆菌复合群菌株、非结核分枝杆菌菌株、其他呼吸道病原菌的参考菌株共127株（表6、表7、表8和表9），利用实施例2的检测试剂盒和实施例3的检测方法对上述菌株进行结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌及其他常见呼吸道病原菌的鉴别。

表6 用于检测、鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的参考菌株（1）

表7 用于检测、鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的参考菌株（2）

表8 用于检测、鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的参考菌株（3）

表9 用于检测、鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌的参考菌株（4）

检测结果如表10所示，127株菌中所有结核分枝杆菌复合菌菌株的检测结果均为阳性，而非结核分枝杆菌和其他常见呼吸道病原菌的检测结果均为阴性。利用本发明提供的引物和探针以及检测方法鉴别结核分枝杆菌复合群与非结核分枝杆菌和其他常见呼吸道病原菌株的灵敏度与特异度均达到100%，灵敏度和特异度的计算公式如下：

灵敏度=真阳性数/（真阳性数+假阴性数）*100%；特异度=真阴性数/（真阴性数+假阳性数）*100%。

表10 结核分枝杆菌复合群菌株检测结果

实施例5 基于多酶恒温扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB基因突变的方法的临床应用（2）

收集74株已经确定为结核分枝杆菌的临床菌株，采用实施例2的试剂盒和实施例3的检测方法检测rpoB编码基因的1296位以及编码蛋白的516位点、526位点、531位点氨基酸发生突变的情况。

同时对各菌株的rpoB基因相应编码片段进行扩增、测序，所得序列与结核分枝杆菌参考菌株H37Rv（ATCC 27294）的rpoB基因（Rv0667）序列进行对比分析，确定各菌株rpoB编码基因的1296位以及编码蛋白的516位点、526位点、531位点氨基酸的突变信息，并与利用实施例2的检测试剂盒和实施例3的检测方法得到的检测结果对比。

测序引物序列如下：

rpoB-F:5’-TCGGTCGCTATAAGGTCAAC-3’ (SEQ ID NO.8)；

rpoB-R:5’-GCTCCAGGAAGGGAATCATC-3’ (SEQ ID NO.9)。

表11 本发明试剂盒检测rpoB基因编码516、526和531氨基酸位点突变结果

采用本发明实施例2的试剂盒和实施例3的检测方法检测rpoB编码基因的1296位以及编码蛋白的516位点、526位点、531位点氨基酸的突变发生情况得到的检测结果与测序结果完全符合，结果见表11。

以上结果表明，采用本发明的基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群菌株及rpoB基因突变的引物、探针及试剂盒，能够准确、快速的鉴别、检测结核分枝杆菌复合群菌株及其rpoB基因突变。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 基于多酶恒温快速扩增技术检测结核分枝杆菌复合群及rpoB突变的引物探针组及其应用

<130> KHP201110510.1YS

<160> 31

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3519

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttggcagatt cccgccagag caaaacagcc gctagtccta gtccgagtcg cccgcaaagt 60

tcctcgaata actccgtacc cggagcgcca aaccgggtct ccttcgctaa gctgcgcgaa 120

ccacttgagg ttccgggact ccttgacgtc cagaccgatt cgttcgagtg gctgatcggt 180

tcgccgcgct ggcgcgaatc cgccgccgag cggggtgatg tcaacccagt gggtggcctg 240

gaagaggtgc tctacgagct gtctccgatc gaggacttct ccgggtcgat gtcgttgtcg 300

ttctctgacc ctcgtttcga cgatgtcaag gcacccgtcg acgagtgcaa agacaaggac 360

atgacgtacg cggctccact gttcgtcacc gccgagttca tcaacaacaa caccggtgag 420

atcaagagtc agacggtgtt catgggtgac ttcccgatga tgaccgagaa gggcacgttc 480

atcatcaacg ggaccgagcg tgtggtggtc agccagctgg tgcggtcgcc cggggtgtac 540

ttcgacgaga ccattgacaa gtccaccgac aagacgctgc acagcgtcaa ggtgatcccg 600

agccgcggcg cgtggctcga gtttgacgtc gacaagcgcg acaccgtcgg cgtgcgcatc 660

gaccgcaaac gccggcaacc ggtcaccgtg ctgctcaagg cgctgggctg gaccagcgag 720

cagattgtcg agcggttcgg gttctccgag atcatgcgat cgacgctgga gaaggacaac 780

accgtcggca ccgacgaggc gctgttggac atctaccgca agctgcgtcc gggcgagccc 840

ccgaccaaag agtcagcgca gacgctgttg gaaaacttgt tcttcaagga gaagcgctac 900

gacctggccc gcgtcggtcg ctataaggtc aacaagaagc tcgggctgca tgtcggcgag 960

cccatcacgt cgtcgacgct gaccgaagaa gacgtcgtgg ccaccatcga atatctggtc 1020

cgcttgcacg agggtcagac cacgatgacc gttccgggcg gcgtcgaggt gccggtggaa 1080

accgacgaca tcgaccactt cggcaaccgc cgcctgcgta cggtcggcga gctgatccaa 1140

aaccagatcc gggtcggcat gtcgcggatg gagcgggtgg tccgggagcg gatgaccacc 1200

caggacgtgg aggcgatcac accgcagacg ttgatcaaca tccggccggt ggtcgccgcg 1260

atcaaggagt tcttcggcac cagccagctg agccaattca tggaccagaa caacccgctg 1320

tcggggttga cccacaagcg ccgactgtcg gcgctggggc ccggcggtct gtcacgtgag 1380

cgtgccgggc tggaggtccg cgacgtgcac ccgtcgcact acggccggat gtgcccgatc 1440

gaaacccctg aggggcccaa catcggtctg atcggctcgc tgtcggtgta cgcgcgggtc 1500

aacccgttcg ggttcatcga aacgccgtac cgcaaggtgg tcgacggcgt ggttagcgac 1560

gagatcgtgt acctgaccgc cgacgaggag gaccgccacg tggtggcaca ggccaattcg 1620

ccgatcgatg cggacggtcg cttcgtcgag ccgcgcgtgc tggtccgccg caaggcgggc 1680

gaggtggagt acgtgccctc gtctgaggtg gactacatgg acgtctcgcc ccgccagatg 1740

gtgtcggtgg ccaccgcgat gattcccttc ctggagcacg acgacgccaa ccgtgccctc 1800

atgggggcaa acatgcagcg ccaggcggtg ccgctggtcc gtagcgaggc cccgctggtg 1860

ggcaccggga tggagctgcg cgcggcgatc gacgccggcg acgtcgtcgt cgccgaagaa 1920

agcggcgtca tcgaggaggt gtcggccgac tacatcactg tgatgcacga caacggcacc 1980

cggcgtacct accggatgcg caagtttgcc cggtccaacc acggcacttg cgccaaccag 2040

tgccccatcg tggacgcggg cgaccgagtc gaggccggtc aggtgatcgc cgacggtccc 2100

tgtactgacg acggcgagat ggcgctgggc aagaacctgc tggtggccat catgccgtgg 2160

gagggccaca actacgagga cgcgatcatc ctgtccaacc gcctggtcga agaggacgtg 2220

ctcacctcga tccacatcga ggagcatgag atcgatgctc gcgacaccaa gctgggtgcg 2280

gaggagatca cccgcgacat cccgaacatc tccgacgagg tgctcgccga cctggatgag 2340

cggggcatcg tgcgcatcgg tgccgaggtt cgcgacgggg acatcctggt cggcaaggtc 2400

accccgaagg gtgagaccga gctgacgccg gaggagcggc tgctgcgtgc catcttcggt 2460

gagaaggccc gcgaggtgcg cgacacttcg ctgaaggtgc cgcacggcga atccggcaag 2520

gtgatcggca ttcgggtgtt ttcccgcgag gacgaggacg agttgccggc cggtgtcaac 2580

gagctggtgc gtgtgtatgt ggctcagaaa cgcaagatct ccgacggtga caagctggcc 2640

ggccggcacg gcaacaaggg cgtgatcggc aagatcctgc cggttgagga catgccgttc 2700

cttgccgacg gcaccccggt ggacattatt ttgaacaccc acggcgtgcc gcgacggatg 2760

aacatcggcc agattttgga gacccacctg ggttggtgtg cccacagcgg ctggaaggtc 2820

gacgccgcca agggggttcc ggactgggcc gccaggctgc ccgacgaact gctcgaggcg 2880

cagccgaacg ccattgtgtc gacgccggtg ttcgacggcg cccaggaggc cgagctgcag 2940

ggcctgttgt cgtgcacgct gcccaaccgc gacggtgacg tgctggtcga cgccgacggc 3000

aaggccatgc tcttcgacgg gcgcagcggc gagccgttcc cgtacccggt cacggttggc 3060

tacatgtaca tcatgaagct gcaccacctg gtggacgaca agatccacgc ccgctccacc 3120

gggccgtact cgatgatcac ccagcagccg ctgggcggta aggcgcagtt cggtggccag 3180

cggttcgggg agatggagtg ctgggccatg caggcctacg gtgctgccta caccctgcag 3240

gagctgttga ccatcaagtc cgatgacacc gtcggccgcg tcaaggtgta cgaggcgatc 3300

gtcaagggtg agaacatccc ggagccgggc atccccgagt cgttcaaggt gctgctcaaa 3360

gaactgcagt cgctgtgcct caacgtcgag gtgctatcga gtgacggtgc ggcgatcgaa 3420

ctgcgcgaag gtgaggacga ggacctggag cgggccgcgg ccaacctggg aatcaatctg 3480

tcccgcaacg aatccgcaag tgtcgaggat cttgcgtaa 3519

<210> 2

<211> 1172

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Leu Ala Asp Ser Arg Gln Ser Lys Thr Ala Ala Ser Pro Ser Pro Ser

1 5 10 15

Arg Pro Gln Ser Ser Ser Asn Asn Ser Val Pro Gly Ala Pro Asn Arg

20 25 30

Val Ser Phe Ala Lys Leu Arg Glu Pro Leu Glu Val Pro Gly Leu Leu

35 40 45

Asp Val Gln Thr Asp Ser Phe Glu Trp Leu Ile Gly Ser Pro Arg Trp

50 55 60

Arg Glu Ser Ala Ala Glu Arg Gly Asp Val Asn Pro Val Gly Gly Leu

65 70 75 80

Glu Glu Val Leu Tyr Glu Leu Ser Pro Ile Glu Asp Phe Ser Gly Ser

85 90 95

Met Ser Leu Ser Phe Ser Asp Pro Arg Phe Asp Asp Val Lys Ala Pro

100 105 110

Val Asp Glu Cys Lys Asp Lys Asp Met Thr Tyr Ala Ala Pro Leu Phe

115 120 125

Val Thr Ala Glu Phe Ile Asn Asn Asn Thr Gly Glu Ile Lys Ser Gln

130 135 140

Thr Val Phe Met Gly Asp Phe Pro Met Met Thr Glu Lys Gly Thr Phe

145 150 155 160

Ile Ile Asn Gly Thr Glu Arg Val Val Val Ser Gln Leu Val Arg Ser

165 170 175

Pro Gly Val Tyr Phe Asp Glu Thr Ile Asp Lys Ser Thr Asp Lys Thr

180 185 190

Leu His Ser Val Lys Val Ile Pro Ser Arg Gly Ala Trp Leu Glu Phe

195 200 205

Asp Val Asp Lys Arg Asp Thr Val Gly Val Arg Ile Asp Arg Lys Arg

210 215 220

Arg Gln Pro Val Thr Val Leu Leu Lys Ala Leu Gly Trp Thr Ser Glu

225 230 235 240

Gln Ile Val Glu Arg Phe Gly Phe Ser Glu Ile Met Arg Ser Thr Leu

245 250 255

Glu Lys Asp Asn Thr Val Gly Thr Asp Glu Ala Leu Leu Asp Ile Tyr

260 265 270

Arg Lys Leu Arg Pro Gly Glu Pro Pro Thr Lys Glu Ser Ala Gln Thr

275 280 285

Leu Leu Glu Asn Leu Phe Phe Lys Glu Lys Arg Tyr Asp Leu Ala Arg

290 295 300

Val Gly Arg Tyr Lys Val Asn Lys Lys Leu Gly Leu His Val Gly Glu

305 310 315 320

Pro Ile Thr Ser Ser Thr Leu Thr Glu Glu Asp Val Val Ala Thr Ile

325 330 335

Glu Tyr Leu Val Arg Leu His Glu Gly Gln Thr Thr Met Thr Val Pro

340 345 350

Gly Gly Val Glu Val Pro Val Glu Thr Asp Asp Ile Asp His Phe Gly

355 360 365

Asn Arg Arg Leu Arg Thr Val Gly Glu Leu Ile Gln Asn Gln Ile Arg

370 375 380

Val Gly Met Ser Arg Met Glu Arg Val Val Arg Glu Arg Met Thr Thr

385 390 395 400

Gln Asp Val Glu Ala Ile Thr Pro Gln Thr Leu Ile Asn Ile Arg Pro

405 410 415

Val Val Ala Ala Ile Lys Glu Phe Phe Gly Thr Ser Gln Leu Ser Gln

420 425 430

Phe Met Asp Gln Asn Asn Pro Leu Ser Gly Leu Thr His Lys Arg Arg

435 440 445

Leu Ser Ala Leu Gly Pro Gly Gly Leu Ser Arg Glu Arg Ala Gly Leu

450 455 460

Glu Val Arg Asp Val His Pro Ser His Tyr Gly Arg Met Cys Pro Ile

465 470 475 480

Glu Thr Pro Glu Gly Pro Asn Ile Gly Leu Ile Gly Ser Leu Ser Val

485 490 495

Tyr Ala Arg Val Asn Pro Phe Gly Phe Ile Glu Thr Pro Tyr Arg Lys

500 505 510

Val Val Asp Gly Val Val Ser Asp Glu Ile Val Tyr Leu Thr Ala Asp

515 520 525

Glu Glu Asp Arg His Val Val Ala Gln Ala Asn Ser Pro Ile Asp Ala

530 535 540

Asp Gly Arg Phe Val Glu Pro Arg Val Leu Val Arg Arg Lys Ala Gly

545 550 555 560

Glu Val Glu Tyr Val Pro Ser Ser Glu Val Asp Tyr Met Asp Val Ser

565 570 575

Pro Arg Gln Met Val Ser Val Ala Thr Ala Met Ile Pro Phe Leu Glu

580 585 590

His Asp Asp Ala Asn Arg Ala Leu Met Gly Ala Asn Met Gln Arg Gln

595 600 605

Ala Val Pro Leu Val Arg Ser Glu Ala Pro Leu Val Gly Thr Gly Met

610 615 620

Glu Leu Arg Ala Ala Ile Asp Ala Gly Asp Val Val Val Ala Glu Glu

625 630 635 640

Ser Gly Val Ile Glu Glu Val Ser Ala Asp Tyr Ile Thr Val Met His

645 650 655

Asp Asn Gly Thr Arg Arg Thr Tyr Arg Met Arg Lys Phe Ala Arg Ser

660 665 670

Asn His Gly Thr Cys Ala Asn Gln Cys Pro Ile Val Asp Ala Gly Asp

675 680 685

Arg Val Glu Ala Gly Gln Val Ile Ala Asp Gly Pro Cys Thr Asp Asp

690 695 700

Gly Glu Met Ala Leu Gly Lys Asn Leu Leu Val Ala Ile Met Pro Trp

705 710 715 720

Glu Gly His Asn Tyr Glu Asp Ala Ile Ile Leu Ser Asn Arg Leu Val

725 730 735

Glu Glu Asp Val Leu Thr Ser Ile His Ile Glu Glu His Glu Ile Asp

740 745 750

Ala Arg Asp Thr Lys Leu Gly Ala Glu Glu Ile Thr Arg Asp Ile Pro

755 760 765

Asn Ile Ser Asp Glu Val Leu Ala Asp Leu Asp Glu Arg Gly Ile Val

770 775 780

Arg Ile Gly Ala Glu Val Arg Asp Gly Asp Ile Leu Val Gly Lys Val

785 790 795 800

Thr Pro Lys Gly Glu Thr Glu Leu Thr Pro Glu Glu Arg Leu Leu Arg

805 810 815

Ala Ile Phe Gly Glu Lys Ala Arg Glu Val Arg Asp Thr Ser Leu Lys

820 825 830

Val Pro His Gly Glu Ser Gly Lys Val Ile Gly Ile Arg Val Phe Ser

835 840 845

Arg Glu Asp Glu Asp Glu Leu Pro Ala Gly Val Asn Glu Leu Val Arg

850 855 860

Val Tyr Val Ala Gln Lys Arg Lys Ile Ser Asp Gly Asp Lys Leu Ala

865 870 875 880

Gly Arg His Gly Asn Lys Gly Val Ile Gly Lys Ile Leu Pro Val Glu

885 890 895

Asp Met Pro Phe Leu Ala Asp Gly Thr Pro Val Asp Ile Ile Leu Asn

900 905 910

Thr His Gly Val Pro Arg Arg Met Asn Ile Gly Gln Ile Leu Glu Thr

915 920 925

His Leu Gly Trp Cys Ala His Ser Gly Trp Lys Val Asp Ala Ala Lys

930 935 940

Gly Val Pro Asp Trp Ala Ala Arg Leu Pro Asp Glu Leu Leu Glu Ala

945 950 955 960

Gln Pro Asn Ala Ile Val Ser Thr Pro Val Phe Asp Gly Ala Gln Glu

965 970 975

Ala Glu Leu Gln Gly Leu Leu Ser Cys Thr Leu Pro Asn Arg Asp Gly

980 985 990

Asp Val Leu Val Asp Ala Asp Gly Lys Ala Met Leu Phe Asp Gly Arg

995 1000 1005

Ser Gly Glu Pro Phe Pro Tyr Pro Val Thr Val Gly Tyr Met Tyr Ile

1010 1015 1020

Met Lys Leu His His Leu Val Asp Asp Lys Ile His Ala Arg Ser Thr

1025 1030 1035 1040

Gly Pro Tyr Ser Met Ile Thr Gln Gln Pro Leu Gly Gly Lys Ala Gln

1045 1050 1055

Phe Gly Gly Gln Arg Phe Gly Glu Met Glu Cys Trp Ala Met Gln Ala

1060 1065 1070

Tyr Gly Ala Ala Tyr Thr Leu Gln Glu Leu Leu Thr Ile Lys Ser Asp

1075 1080 1085

Asp Thr Val Gly Arg Val Lys Val Tyr Glu Ala Ile Val Lys Gly Glu

1090 1095 1100

Asn Ile Pro Glu Pro Gly Ile Pro Glu Ser Phe Lys Val Leu Leu Lys

1105 1110 1115 1120

Glu Leu Gln Ser Leu Cys Leu Asn Val Glu Val Leu Ser Ser Asp Gly

1125 1130 1135

Ala Ala Ile Glu Leu Arg Glu Gly Glu Asp Glu Asp Leu Glu Arg Ala

1140 1145 1150

Ala Ala Asn Leu Gly Ile Asn Leu Ser Arg Asn Glu Ser Ala Ser Val

1155 1160 1165

Glu Asp Leu Ala

1170

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttcgatgaac ccgaacgggt tgacccgc 28

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agttcttcgg caccagccag ctgagcgaa 29

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgtcggggtt gacccacaag cgccgacttt c 31

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caacccgctg tcggggttga ctca 24

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaccagcca gctgagccaa ttcatcga 28

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcggtcgcta taaggtcaac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctccaggaa gggaatcatc 20

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gacagcgagc cgatcagacc gatgttggg 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccgatcagac cgatgttggg cccctcagg 29

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcgcggacct ccagcccggc acgctcacg 29

<210> 13

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gcaccagcca gctgagccaa ttcataga 28

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcaccagcca gctgagccaa ttcattga 28

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cagaacaacc cgctgtcggg gttgactca 29

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagaacaacc cgctgtcggg gttgacgca 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagaacaacc cgctgtcggg gttgacaca 29

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aacaacccgc tgtcggggtt gactca 26

<210> 19

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgtcggggtt gacccacaag cgccgacggc c 31

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgtcggggtt gacccacaag cgccgaccgc c 31

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tgtcggggtt gacccacaag cgccgacagc c 31

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggttgaccca caagcgccga cagcc 25

<210> 23

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgtcggggtt gacccacaag cgccgactat c 31

<210> 24

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tgtcggggtt gacccacaag cgccgattat c 31

<210> 25

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tgtcggggtt gacccacaag cgccgactgt c 31

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgtcggggtt gacccacaag cgccgactct c 31

<210> 27

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tgtcggggtt gacccacaag cgccgaccgt c 31

<210> 28

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agttcttcgg caccagccag ctgagctaa 29

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

agttcttcgg caccagccag ctgagtcga 29

<210> 30

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agttcttcgg caccagccag ctgagcaga 29

<210> 31

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

agttcttcgg caccagccag ctgagctga 29

Claims

1.引物探针组在制备通过检测rpoB基因突变区分鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌的试剂中的应用；

所述rpoB基因突变位于如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第1296位，结核分枝杆菌复合群菌株的该位点为A，非结核分枝杆菌的该位点为G；

所述引物探针组包括上游引物和探针，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述区分鉴别结核分枝杆菌复合群菌株与非结核分枝杆菌采用多酶恒温扩增反应，所述多酶恒温扩增反应的反应体系中，所述上游引物与所述探针的摩尔比为（1.5~3）：1。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多酶恒温扩增反应的反应体系包括：重组酶200~290ng/µl、恒温聚合酶80~160ng/µl、单链结合蛋白190~270ng/µl、辅助蛋白60~110ng/µl、核酸外切酶70~130ng/µl、dNTPs 0.2~1mM、聚乙二醇2~4%、Tris-HCl 20~40mM、醋酸镁280~300mM、上游引物0.4~0.6μM、探针0.18~0.3μM、ddH₂O和待测样品；所述多酶恒温扩增反应的反应程序为：37~42℃反应20~25min。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用侧向流动试纸条检测多酶恒温扩增反应的产物，根据试纸条的质控线和检测线颜色变化结果判断待测菌株是否为结核分枝杆菌复合群菌株。