CN116814822B - 一种长双歧杆菌婴儿亚种cicc 6069菌株的鉴定方法和应用 - Google Patents
一种长双歧杆菌婴儿亚种cicc 6069菌株的鉴定方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物鉴定技术领域，尤其涉及一种长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的鉴定方法及其应用。本发明涉及如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069的菌株中的应用。本发明利用了长双歧杆菌的特有保守基因序列，提出了一种简单、快速鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的方法。本发明提供的引物对在长双歧杆菌婴儿亚种“亚种”水平上特异性良好且在“株”水平上可以精准快速鉴定CICC 6069菌株。
Description
技术领域
本发明涉及微生物鉴定技术领域，尤其涉及一种长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的鉴定方法和应用。
背景技术
长双歧杆菌婴儿亚种（Bifidobacterium longumsubsp.infantis），曾用名婴儿双歧杆菌，分离自婴儿肠道。细胞呈杆状、有时一端呈分叉状，严格厌氧，为革兰氏阳性菌。该菌株是人和动物肠道菌群的重要组成成员之一，能够以人乳寡糖（HMO）为唯一碳源，与其他细菌相比，其具有在肠道中定植和竞争优势，并且能够减少腔内病原体；该菌株还有益生功能，例如抗氧化、抑制炎症、调节胆固醇等，在食品、医药和饲料方面具有应用前景。2007年，长双歧杆菌（包括婴儿亚种）通过欧洲食品安全局（EFSA）评估并获得“安全资格认定”（QPS，Qualified Presumption of Safety）。国内，长双歧杆菌婴儿亚种被列入《中华人民共和国药典2020年版-微生态活菌制品》、《可用于食品的菌种名单》。长双歧杆菌婴儿亚种CICC6069（=ATCC 15697）被列入GB 4789.28-2013食品微生物学检验用培养和试剂的质量控制用标准菌株。
研究表明，长双歧杆菌婴儿亚种在代谢HMO、定植、调节肠道菌群和环境等益生功能在其菌株水平具有特异性。长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069（=JCM 1222 =ATCC 15697 =BCRC 14602 =BCRC 15416 =CCM 4990 =CCUG 18368 =CECT 4551 =CGMCC 1.2202 =CGMCC1.1853 =CIP 64.67 =DSM 20088 =KCTC 3249 =KCTC 3270 =LMG 8811 =NCFB 2205 =NCTC11817）为模式菌株，遗传性状稳定，其在新生儿肠道中具有持续的定植特性，以及独特的代谢HMO的能力，是一株极具开发潜力的优质益生菌菌株。因此，快速、精准的“株”水平鉴定方法是长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株研究开发和商业化应用的重要技术保障，对其工业化生产具有重要的意义。
大多数常用的微生物测序手段只能将微生物鉴定到种（species）水平，通常无法实现株水平精准鉴定。但长双歧杆菌婴儿亚种不同株之间具有潜在功能和特性差异。因此，需要针对性地开发每一株目标菌株的专属性鉴定方法，实现其“株”水平的快速且精准的鉴定。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种简单、快速鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的方法和应用。
本发明提出如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069的菌株中的应用。
可选的，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第400位的碱基为多态性位点。
本发明提出一种长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的鉴定方法，至少包括以下步骤：
S1、提取待测菌株的基因组DNA；
S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物覆盖SEQID NO:1所示的核苷酸序列上的多态性位点；
S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；
S4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069；
S5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ IDNO:1相同，待测菌株鉴定为长双歧杆菌CICC 6069；如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1不同，待测菌株鉴定为非长双歧杆菌CICC 6069。
可选的，至少包括以下步骤：
S1、提取待测菌株的基因组DNA；
S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物至少覆盖SEQ ID NO:1的第330位~第470位的碱基；目的扩增产物的长度至少为110 bp；
S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；
S4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069；
S5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第400位的碱基为A，待测菌株鉴定为长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069；如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第400位的碱基不为A，待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069。
可选的，引物的目的扩增产物至少覆盖SEQ ID NO:1的第336位~第445位的碱基。
可选的，如实际扩增产物的长度为110 bp，且如实际扩增产物在65号位点碱基为A，待测菌株鉴定为长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069。
可选的，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。
本发明还提出一种用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069的试剂盒，应用SEQID NO:1所示的核苷酸序列进行菌株鉴定，包括采用PCR技术和基因测序技术检测SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列上的多态性位点。
可选的，试剂盒内包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂内至少含有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的引物对。
本发明还提出一种用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
本发明提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本发明利用了长双歧杆菌的特有保守基因序列，提出了一种简单、快速鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的方法。
在优选的技术方案中，本发明的引物对在长双歧杆菌婴儿亚种“亚种”水平上特异性良好且在“株”水平上可以精准快速鉴定CICC 6069菌株。
附图说明
图1是保守基因6069GL001191与其36个NCBI库中100%相似度的序列构建的进化发育树；
图2是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物的特异性扩增验证电泳图；1 为CICC6069T、2为CICC 6199、3为CICC 10177R、4为CICC 6186T、5为CICC 6198T、6为CICC 10184R、7为CICC 6071T、8为CICC 6250T、9为CICC 6070T、10为CICC 6079T；11为空白对照；
图3是SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示引物的特异性扩增验证电泳图；1 为CICC6069T、2为CICC 6199、3为CICC 10177R、4为CICC 6186T、5为CICC 6198T、6为CICC 10184R、7为CICC 6071T、8为CICC 6250T、9为CICC 6070T、10为CICC 6079T；11为空白对照；
图4是SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示引物的特异性扩增验证电泳图；1 为CICC6069T、2为CICC 6199、3为CICC 10177R、4为CICC 6186T、5为CICC 6198T、6为CICC 10184R、7为CICC 6071T、8为CICC 6250T、9为CICC 6070T、10为CICC 6079T；11为空白对照；
图5是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的特异性扩增验证电泳图；1为CICC6069-1代，2为CICC 6069-3代，3为CICC 6069-5代，4为CICC 6069-8代，5为CICC 6069-10代，6为CICC 6199，7为CICC 6201，8为CICC 10175R，9为CICC 10177R，10为CICC 10172R，11为CICC 10173R，12为CICC 6186T、13为CICC 6205、14为CICC 6206、15为CICC 6207、16为CICC 6198T、17为CICC 6195、18为CICC 10184R、19为CICC 6071T、20为CICC 24210T、21为CICC 6250T、22为CICC 6070T、23为CICC 6079T、24为CICC 6224T、25为CICC 6038T、26为空白对照；
图6是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对在CICC 6069和44个长双歧杆菌基因组上扩增片段差异位点对比图。以CICC 6069（第一列，CICC 6069）作为模板，同一位点与模板相同则标记为“·”，不同则标记差异碱基。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明实施例的第一个方面提供了一条长双歧杆菌物种特有保守基因序列在鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株中的应用，该保守序列至少包括如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO:1的核苷酸序列为：
gaggcggaagctcagatgagcccttgcgagaaagcgatgacgttggcggactacgccacccatccggctgaaggcacgccgttattggagcagtatgccaccggtctggccgctcccctggcttggattgacgttgccgggtattgttcgggtcgttttgccgagggaacgttacgtgacgcgcagaccaagcaatggctgacttttctggccgataaattcgggcaggccgcgcctgaggtgacgccggcgcgtcttgatggcgtcacgtccgccaacgttgaccgatcggtattggatgcgatggccgtggccgaggatcgcgccggattcgctatcgaggtcttgaccgcacgaggacagaccgctggggctacgttggcgttgagcgatatgcataagaccgccgggcagcagctggtgtcgctggccaatggcaattttgatgattccggcgcacaatccagttcttccggccaaagcgacccccgccaaaaggtctatgccatcgaccagctactggccaaccccaccaccatcgccgacaaggcaagtggccaaaccgtaccgaccgccgccgccatcgaaatggactgcgcccgcgcgcagatcaaggccgtgaccgaatcgaaatcttccaccgagagcgatacgctgctcatcctcgccgcactggccgccaagcacgcctacaccgcgttccaacttggctacccagcgactgacgccgcattgttcgagtag
从中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）菌种资源库及NCBI GenBank数据库中搜集长双歧杆菌婴儿亚种全基因组数据，通过比对获得CICC 6069基因组上的一条保守编码蛋白的核酸序列及其特有SNP位点信息，序列功能注释详见表1所示。
表1：特有保守核酸序列注释结果
在NCBI数据库中检索（6069GL001191）核酸序列，使用megablast模块，预期阈值设为0.05，只检索出96条长双歧杆菌序列（表2），覆盖率均为100%，相似度均在97%以上，这表明6069GL001191是长双歧杆菌特有的保守基因，适用于长双歧杆菌“种”水平上的鉴定。选取相似度为100%的36条代表性序列进行聚类，详见图1。
表2-1：长双歧杆菌基因组序列
表2-2：长双歧杆菌基因组序列
经实验验证，利用该核苷酸序列以及其上特定的SNP位点，可以将长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株与其他菌株鉴别出来。
其中，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第400位的碱基为多态性位点。
本发明实施例的第二个方面提供了长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的鉴定方法，利用引物组特异性的在长双歧杆菌婴儿亚种中扩增得到目的片段；在此基础上，鉴别目标菌株是否为长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069必须满足：引物扩增片段的特异性SNP位点判别标准。具体包括以下步骤：
S1、提取待测菌株的基因组DNA；
S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物覆盖SEQID NO:1所示的核苷酸序列上的多态性位点；
S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；
S4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069；
S5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：
如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1相同，待测菌株鉴定为长双歧杆菌CICC 6069；
如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1不同，待测菌株鉴定为非长双歧杆菌CICC 6069。
作为本发明实施例的一种优选的技术方案，包括以下步骤：
S1、提取待测菌株的基因组DNA；
S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物至少覆盖SEQ ID NO:1的第330位~第470位的碱基；目的扩增产物的长度至少为110 bp；
S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；
S4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069；
S5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：
如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第400位的碱基为A，待测菌株鉴定为长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069；
如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第400位的碱基不为A，待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069。
作为本发明实施例的一种优选的技术方案，在S2中，当引物的目的扩增产物覆盖SEQ ID NO:1的第336位~第445位的碱基时，当所获得的实际扩增产物的长度为110 bp、且65号位点碱基为A时，则待测菌株鉴定为长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069。
本发明实施例通过引物筛选，获得了一对扩增效果最佳的引物对，利用该引物对扩增得到的PCR产物长度为110 bp，产物65号位点碱基为A（该SNP位点位于一段15 bp核酸序列GGTCTTGACCGCACG，下划线标出）。引物的核苷酸序列具体如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示，如表3所示：
表3：CICC 6069的特异性引物信息
本发明实施例基于基因序列开发的鉴别CICC 6069的特异性引物对，在长双歧杆菌“亚种”水平上具有特异性，可以获得110 bp的目标产物，利用其PCR扩增出目的条带的菌株可以被鉴定为长双歧杆婴儿亚种。通过实验证实，该引物对检测的准确性良好，对近缘菌株具有100%的区分。
利用NCBI引物工具Primer-BLAST在细菌（Bacteria<taxid:2>）基因组范围内验证SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的特异性，允许每条引物有不多于4个碱基的错配，扩增片段长度不超过2000 bp。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对在Refseq基因组数据库和NR非冗余的蛋白质序列数据库中都只在长双歧杆菌中存在结果，表明该引物组在长双歧杆菌“种”水平上具有特异性。说明该引物对在长双歧杆菌“种”水平上特异性良好且在“株”水平上可以精准快速鉴定CICC 6069菌株。
本发明实施例的第三个方面提供了一种于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的试剂盒，应用SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行菌株鉴定，包括采用PCR技术和基因测序技术检测SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的多态性位点。具体的，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第400位的碱基为多态性位点。
作为本发明实施例的一种改进，该试剂盒内包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂内至少含有如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的引物对。除引物外，还包括dNTPs、Buffer和DNA聚合酶等。引物的浓度可采用2 ~ 10 μmol/L，具体组成可采用：引物2μL×2，2×PCR Taqmix 25 μL，ddH2O 21 μL。
本发明实施例的第三个方面提供了一种用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
下面通过具体实施例进一步说明本发明实施例，以下实施例所采用的实验试剂均为市售，所采用的菌株均为现有菌株，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）。
实施例1
本实施例用于说明引物设计及特异性验证过程。
1）针对基因6069GL001191的核酸序列，使用Primer Premier 6设计包含SNP位点的引物，并通过Oligo 7对引物进行综合评估，最终筛选出3对特异性引物，具体如表4所示。在此基础上，进行了引物特异性验证的实验。
表4：CICC 6069的其他引物信息
PCR反应体系为50 μL总体积：DNA模板2 μL，引物（10 μmol/L）2 μL×2，2×PCRTaqmix 25 μL，ddH2O 21 μL；PCR扩增条件为95℃ 5 min；95℃ 30s，58℃ 30 s，72℃ 35s，35个循环；72℃ 10 min。将扩增产物进行凝胶电泳，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物的扩增结果如图2所示，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示引物的扩增结果如图3所示，SEQID NO:6和SEQ ID NO:7所示引物的扩增结果如图4所示。
如图2~图4所示的实验结果可知，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物特异性更好，后续对其进行特异性扩增验证实验。
2）引物特异性验证：
选取包含CICC 6069同株不同代的5株菌在内共25株菌作为实验验证菌株，如表5所示，提取基因组DNA后使用该对引物组进行PCR扩增验证。
表5：验证实验菌株信息
PCR反应体系为50 μL总体积：DNA模板2 μL，引物（10 μmol/L）2 μL×2，2×PCRTaqmix 25 μL，ddH2O 21 μL；PCR扩增条件为95℃ 5 min；95℃ 30s，58℃ 30 s，72℃ 35s，35个循环；72℃ 10 min。将扩增产物进行凝胶电泳，结果详见图5。
如图5所示，11株长双歧杆菌婴儿亚种在相应位置均有明亮的条带，14株非长双歧杆菌婴儿亚种无条带或有非特异性扩增条带，表明引物组在长双歧杆菌“亚种”水平上扩增效率良好。
实施例2：
本实施例用于说明特异性引物在长双歧杆菌婴儿亚种物种基因组中鉴别CICC6069菌株的过程。
为了检验长双歧杆菌婴儿亚种内CICC 6069“株”水平的鉴别标准是否普遍适用，搜集了NCBI RefSeq数据库中498个长双歧杆菌基因组作为参考基因组（如表6所示），从基因组层面进行补充验证。
表6-1：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
表6-2：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
表6-3：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
表6-4：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
表6-5：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
表6-6：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
表6-7：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
表6-8：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
表6-9：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
表6-10：NCBI数据库中长双歧杆菌基因组信息序号
以SEQ ID NO:1作为模板，使用软件Blast预测SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物在498个基因组上的PCR扩增片段，并使用软件cd-hit对模拟的扩增序列按照100%相似度聚类、去冗余，最终获得了23个同源组。每个同源组内各长双歧杆菌核酸序列完全相同，因此每组选取一条代表序列，与CICC 6069 PCR产物序列比对获取基因差异位点信息，分析结果如图6所示。
分析结果表明，长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069在SEQ ID NO:1的第400位的碱基与其余长双歧杆菌同源序列同一位点的碱基均不相同，可以作为其株水平鉴别的特有遗传标记，且该判别标准在长双歧杆菌物种上具有普适性。因此，扩增产物涵盖这个SNP位点的引物SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3能够明确地在株水平鉴定CICC 6069菌株。
即，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的SNP位点判别标准完全适用于长双歧杆菌所有亚种的基因组完成图，能够明确地在“株”水平鉴定CICC 6069。
实施例3：
本实施例用于说明多态性位点在不同代CICC 6069菌株株内的遗传稳定性。
1）样品信息及DNA模板提取
从CICC菌种资源库中获得菌株CICC 6069，使用强化羧基培养基在37℃厌氧环境下培养、传代；获得第1代（6069-1代）、第3代（6069-3代）、第5代（6069-5代）、第8代（6069-8代）、第10代（6069-10代）五批菌株，使用细菌基因组DNA提取试剂盒MightyPrep reagentfor DNA（Code no. 9182，TAKARA）提取菌株的基因组DNA。
2）特异性引物扩增目的片段
PCR反应体系为50 μL总体积：DNA模板2 μL，引物（10 μmol/L）2μL×2，2×PCRTaqmix 25μL，ddH2O 21μL；PCR扩增条件为95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 35s，35个循环；72℃ 10 min。将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段长度均符合理论设计长度（110 bp），结果如图5所示，其中，1为CICC 6069-1代，2为CICC 6069-3代，3为CICC6069-5代、4为CICC 6069-8代，5为CICC 6069-10代。
3）测序及鉴定结果
PCR扩增产物经过测序获得长度为110 bp的核酸序列进行比对分析。引物对6069-1、6069-2、6069-3、6069-4、6069-5五个样品扩增片段长度一致、核酸序列100%匹配，与CICC6069基因组上保守序列SEQID NO.1预测的PCR产物序列完全一致。这表明本发明提出的判别标准所依据的SNP位点在株内遗传稳定，可以作为CICC 6069菌株鉴定的有效参考。
实施例4：
本实施例用于说明特异性引物在长双歧杆菌婴儿亚种内不同菌株间快速、精准地鉴定菌株CICC 6069的验证过程。
1）特异性引物扩增目的片段
PCR扩增体系和扩增条件同实施例3，将PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段长度均符合理论设计长度（110 bp），结果详见图5。
2）测序及鉴定结果
如图5所示，与CICC 6069菌株相同，其它6株长双歧杆菌婴儿亚种的PCR产物测序也分别获得了110 bp的核酸序列。菌株CICC 6199、CICC 6201、CICC 10175R、CICC 10177R、CICC 10172R、CICC 10173R（编号6~编号11）的扩增片段完全一致。
上述菌株与CICC 6069序列差异位点见表7。
表7：CICC 6069与其它长双歧杆菌菌株扩增片段差异
如表7可知，其他菌株的扩增产物在产物65号位点碱基为“G”，不符合判别标准；只有CICC 6069符合判别标准。
实施例5：
本实施例用于说明引物在非长双歧杆菌婴儿亚种上的特异性验证过程。
1）样品信息及DNA模板提取
从CICC菌种资源库中获得7株长双歧杆菌其他亚种的菌株，CICC 6186T（长双歧杆菌长亚种）、CICC 6205（长双歧杆菌长亚种）、CICC 6206（长双歧杆菌长亚种）、CICC 6207（长双歧杆菌长亚种）、CICC 6198T（长双歧杆菌猪亚种）、CICC 6195（长双歧杆菌猪亚种）、CICC 10184R（长双歧杆菌猪瘟亚种）作为长双歧杆菌种内不同亚种特异性引物验证的实验菌株；5株双歧杆菌属其他种的菌株，CICC 6071T（两歧双歧杆菌）、CICC 24210T（动物双歧杆菌乳亚种）、CICC 6250T（动物双歧杆菌）、CICC 6060T（青春双歧杆菌）、CICC 6079T（短双歧杆菌）作为双歧杆菌属内不同种特异性引物验证的实验菌株；2株CICC 6224T（鼠李糖乳酪杆菌）、CICC 6038T（嗜热链球菌）作为其他科特异性引物验证的实验菌株。菌株培养条件及基因组DNA提取方法同实施例3。
2）特异性引物扩增目的片段
PCR扩增体系和扩增条件同实施例3。7株长双歧杆菌的PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳，有非特异性扩增条带。将其余7株非长双歧杆菌的PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，有非特异性扩增条带或无目标条带，结果也如图5所示。
3）鉴定结果
7株长双歧杆菌除了有目标扩增产物外，同时出现非特异性条带，不符合判别标准，可以与CICC 6069菌株有效区分。另外，7株非长双歧杆菌，包括5株双歧杆菌和1株鼠李糖乳酪杆菌、1株嗜热链球菌，出现非特异性扩增条带或无目的条带，不符合判别标准，可以与CICC 6069菌株有效区分。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (5)
1. 如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列作为检查靶点在用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069的菌株中的应用；
SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第400位的碱基为多态性位点。
2. 一种长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069菌株的鉴定方法，其特征在于，至少包括以下步骤：
S1、提取待测菌株的基因组DNA；
S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，所述引物的目的扩增产物为覆盖SEQ ID NO:1的第336位~第445位的碱基；目的扩增产物的长度为110 bp；
所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示；
S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；
S4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069；
S5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与SEQID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：
如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第400位的碱基为A，待测菌株鉴定为长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069；
如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第400位的碱基不为A，待测菌株鉴定为非长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069。
3.一种用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069的试剂盒，其特征在于，应用SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列进行菌株鉴定，包括采用PCR技术和基因测序技术检测SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的多态性位点，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第400位的碱基为多态性位点。
4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内包括核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂内至少含有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的引物对。
5. 一种用于鉴定长双歧杆菌婴儿亚种CICC 6069的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。
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