CN111534622A - 一种基于高通量测序的拟杆菌快速检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序的拟杆菌快速检测方法及应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过分子生物学方法获取一段具有高度分辨率的核心基因片段rpsD基因为筛选标记，可实现拟杆菌的高通量鉴定，无需分离纯化即可全面鉴定复杂样品中的拟杆菌的组成，分辨率高于16S rRNA基因片段。通过基于rpsD基因的特异性引物扩展的目的条带约为500bp，比传统鉴定方法节约50％以上的拟杆菌鉴定成本。将设计得到的引物与高通量测序结合，可以对粪便样品中拟杆菌的分布进行精确鉴定，并可以鉴定出现有报道的所有拟杆菌种，对拟杆菌种的鉴定准确率达100％。

Description

一种基于高通量测序的拟杆菌快速检测方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于高通量测序的拟杆菌快速检测方法及应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

拟杆菌是人类肠道菌群中数量最多的革兰氏阴性细菌。作为典型的下一代益生菌之一，它编码了许多补充人类基因组功能的基因。其中包括增强我们消化膳食纤维多糖的能力，缓解疾病，增强人体免疫力，甚至增强对癌症的抑制，表明拟杆菌属与宿主之间存在复杂的关系。值得注意的是，其中一些功能与人类肠道内不同种拟杆菌的生态分布以及丰度有关。因此，开发快速检测拟杆菌菌种的方法显得越发重要，甚至需要鉴定至种的水平，来评估其在人体肠道中的多样性和组成，以了解其与人体健康和疾病的关系。

近年来，随着分子生物学方法的发展，特别是基于16S rDNA基因的新一代测序技术的出现，使得大量的样品可以进行更深入的检测，并提出了多种检测方法。最初，国外的一篇论文提出了一种基于16S rRNA基因、16S-23S rRNAISR和23S rRNA基因可变区核苷酸序列的两步法多重PCR检测方法，该方法可实现对10个脆弱拟杆菌群的鉴定。之后，一些针对拟杆菌鉴定的技术被不断完善，比如一些学者设计了19个寡核苷酸引物可以在不同层次(结构域、顺序、簇和种类)来检测14种拟杆菌。尽管这些检测方法使样品在MiSeq仪器上的直接测序成为可能，但并没有充分发挥测序技术的潜力。前者由于其繁琐的步骤而受到限制，并且只能用于鉴定有限数量的10个脆弱类拟杆菌群种，数量远远小于与人类肠道相关的28个种。而后者的敏感性可能受到复杂环境样本中的非靶标DNA的干扰而影响测序质量。此外，基于16S rRNA的V3-V4区，提出了一种改进的双标引扩增和测序方法，用于评估临床样本微生物群落的组成。但V3-V4区域的检测只能在属水平上识别菌群，限制了拟杆菌属的研究进展。此外，根据调查，国内尚没有关于拟杆菌鉴定方法的专利报道。而国际上有关拟杆菌引物或者方法报道的专利只有少数几种。例如2006年，一种基于16S-23S基因间隔区DNA片段设计引物鉴定Bacteroides forsythus的的方法(公开号：JP2004057008A)。同年，一种利用该引物快速、简便地识别和分析细菌的方法能够识别7种不同的拟杆菌株(公开号：JP2006149400A)。但和现有的科研报道类似，这两种专利方法对于拟杆菌的识别还有很大的缺陷，它们仅能识别有限的几种拟杆菌。因此，目前还没有一种有效的技术可以实现所有拟杆菌在复杂样品中种水平的快速鉴定。

发明内容

基于此，本发明通过分子生物学方法获取拟杆菌种的核心基因序列。在此基础上，对这些核心基因进行比对，选取一段具有高度分辨率的核心基因片段rpsD基因为筛选标记，并结合Illumina MiSeq高通量测序检测技术的使用，首次开发了一种拟杆菌种的快速检测技术。为解决现有技术存在的上述缺陷，本发明选取rpsD基因(在过去的报道中rpsD作为区别于16s rRNA序列的一段基因，主要参与30S核糖体蛋白S4)，以该基因为基础设计引物，通过高通量测序技术在种水平进行拟杆菌的检测和鉴定。该方法可用于快速、灵敏和特异地检测复杂样品中不同种拟杆菌的组成。

本发明提供了一种鉴定拟杆菌种的方法，所述方法是以rpsD基因为标记物进行鉴定。

在本发明的一种实施方式中，所述方法以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物对标记物基因rpsD的序列进行扩增，能够成功扩增获得目的条带的即为拟杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述标记物基因片段的大小为450～550bp。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增是对含有微生物基因组的对象进行扩增。

在本发明的一种实施方式中，所述对象包括基因组DNA、菌悬液或单菌落。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增是以含待测样品的基因组DNA为模板进行扩增。

在本发明的一种实施方式中，所述扩增是以单菌落为模板进行扩增。

本发明提供了一种鉴定复杂样品中拟杆菌种水平组成及含量的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)构建拟杆菌rpsD基因标准文库；(2)以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，对复杂样品基因组中rpsD基因序列进行扩增；(3)将扩增结果回收、建库，并通过Miseq测序；(4)将测序结果与拟杆菌rpsD基因标准文库比对，鉴定、分析复杂样品中拟杆菌种水平的组成特征。

在本发明的一种实施方式中，所述拟杆菌rpsD基因标准文库含有Genbank数据库中可检索到的rpsD基因序列。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包含以下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)设计引物，正向引物如SEQ ID NO.1所示，反向引物如SEQ ID NO.2所示：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5’-AWCDAGAATHGCMCGTAA-3’

反向引物(SEQ ID NO.2)：5’-YRTCCCAYTCCAACCA-3’

(3)采用步骤(2)中所述的正向引物和反向引物，以步骤(1)中所提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后对PCR产物进行纯化；

(4)对步骤(3)中纯化后PCR产物进行定量，并等量混样，构建Miseq测序标准文库，然后进行高通量测序；

(5)根据步骤(4)中测序的结果，得到待测复杂样品或者混菌样品的rpsD基因序列信息，以此为基础对待测样品中不同种拟杆菌进行检测。

本发明提供了一种鉴定拟杆菌种的试剂盒，所述试剂盒应用于所述鉴定拟杆菌种的鉴定中。

在本发明的一种实施方式中，所述试剂盒中含有如SEQ ID NO.1所示的正向引物和如SEQ ID NO.2所示的反向引物。

本发明提供了一种筛选拟杆菌的方法，将待筛选的样品制成菌悬液，稀释、涂布于固体培养基上，培养至形成单菌落，再以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，对rpsD基因的序列进行扩增，扩增获得大小为485bp基因片段的菌株为拟杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述固体培养基包括MRS培养基可用于培养长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短乳杆菌(Lactobacillus breris)、短乳杆菌(Lactobacillus breris)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)；BHI培养基可用于培养粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)；TSB培养基(+0.1％半胱氨酸盐酸盐，pH＝7)用于培养乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)；BHI培养基(另外添加1％血晶质(1mg/ml)+0.1％维生素K1溶液(2mg/ml))用于培养所有的拟杆菌；厌氧培养基(胃粘膜素为唯一碳氮源)用于培养嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)，以上培养基均补充0.1％半胱氨酸盐酸盐，pH＝7。

本发明的有益效果：与现有的方法比较，它可以检测到复杂样品中所有拟杆菌种(尤其是人肠道相关的28种菌均可以得到鉴定)，并且对拟杆菌种的鉴定准确率达100％。本发明的方法可实现高通量鉴定，批量处理菌株信息，无需分离纯化即可全面鉴定复杂样品中的拟杆菌组成，并且可以鉴定至种水平，分辨率高于16S rRNA。因而，本发明的方法能够准确鉴定拟杆菌，对种的鉴定准确率达100％。因此，基于本方法对于拟杆菌进行检测，结果较常规鉴定方法更准确，可以将现有的拟杆菌完全区分开。

传统的16S rRNA条带为1500bp，要双向测序且需要拼接，而通过基于rpsD基因的特异性引物扩展目的条带485bp，经过单向鉴定即可完成拟杆菌鉴定；此外，16S rRNA在细菌基因组中是非单克隆拷贝基因(即在基因组中不止一条)，因此在扩增过程中同一条基因组可能会产生多个拷贝序列；而rpsD基因是单克隆拷贝基因(即在基因组中只有一条)，在扩增过程中同一条基因组只产生一条拷贝序列。所以，二代测序进行测序的时候，用rpsD基因作为引物针对复杂样品的鉴定可以节约50％以上的拟杆菌鉴定时间和鉴定成本，检测速度和效率更快。

附图说明

图1是以rpsD基因为基础的拟杆菌系统发育树的构建；分别利用NCBI和EMBL数据库下载拟杆菌不同菌株rpsD基因序列，通过MEGA软件利用neighbor-joining距离算法构建系统发育树。

图2是以rpsD基因为基础设计引物的准确度；通过将不同种拟杆菌以不同比例进行混合，然后以所设计引物为基础进行高通量测序，最后将测序得到的结果与预先混合的不同拟杆菌的比例进行对比得到准确度。

图3是所选14株拟杆菌和8株非拟杆菌PCR扩增产物电泳图；其中，M代表Marker，1-23分别为CK、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短乳杆菌(Lactobacillus breris)、短乳杆菌(Lactobacillus breris)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、Bacteroides dorei、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、Bacteroides faecis、Bacteroides salyersiae、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、Bacteroides kribbi、Bacteroides koreensis。

图4是实施例中人粪便和小鼠粪便样品中拟杆菌的组成结构图，其中，Hu1-22为人粪便样品，M1-22为小鼠粪便样品。

图5是实施例中待测人粪便样品基因组DNA的PCR扩增产物的电泳检测图；其中，部分人粪便和小鼠粪便样品基因组DNA的PCR扩增产物的电泳检测图。

图6是以16S rRNA基因的V3-V4区为基础的拟杆菌系统发育树。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。

实施例1：基于拟杆菌高分辨率核心基因构建拟杆菌特异性引物

1、通过在数据库NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)和EMBL

(European Molecular Biology Laboratory)上调研，有42个不同的拟杆菌种完成了基因组测序，有的只有一条基因组序列，有的近百条。我们下载拟杆菌不同物种的rpsD基因序列共100条(，每种拟杆菌最少一条序列，测序较多的则选择5条测序程度较高的)，通过MEGA软件构建系统发育树如图1所示，从图上我们能看出，该基因可以很好的将不同种拟杆菌进行区分。

2、构建rpsD基因数据库，从NCBI和EMBL等数据库下载已知拟杆菌的rpsD基因序列，利用所下载序列构建rpsD基因比对数据库。所构建rpsD基因序列数据库适用于目前已知的所有拟杆菌(表1)。

表1已知所有拟杆菌rpsD基因序列信息

3、对rpsD基因保守序列和特异序列进行充分分析后，选取特定序列(以rpsD全段基因为模板(全长606bp)，选择一段具有高度分辨率的片段)设计引物，并在这些引物对中挑选适合IlluminaMiseq测序平台读长的引物对，最终确定SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物为最终测序引物。

基于rpsD基因设计并合成拟杆菌特异性引物序列：

正向引物(SEQ ID NO.1)：5’-AWCDAGAATHGCMCGTAA-3’

反向引物(SEQ ID NO.2)：5’-YRTCCCAYTCCAACCA-3’

注：上述引物中的W表示碱基A和T，D表示碱基G、A和T，H表示碱基A、T和C、Y表示碱基C和T，R表示碱基A和G。

利用Primer-blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行模拟PCR，结果表明这对引物仅产生拟杆菌基因组的扩增子，这说明该引物具有较好的拟杆菌特异性，因此本发明所设计的引物确保了后续扩增的效率及鉴定的准确性。

实施例2：拟杆菌特异性引物在属水平上的验证

选取长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短乳杆菌(Lactobacillusbreris)、短乳杆菌(Lactobacillus breris)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、Bacteroides dorei、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、Bacteroidesfaecis、Bacteroides salyersiae、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、Bacteroides kribbi、Bacteroides koreensis，分别提取基因组，微生物基因组提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，北京，中国)中说明书，用序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物，以提取的基因组为模板进行PCR扩增，扩增条件如下：

①PCR扩增反应体系的组成为：基因组DNA模板1μL、2×taq mix 25μL(TaKaRa)、10uM的正向引物和反向引物各lμL，加ddH₂O至50μL。

②PCR扩增反应条件为：95℃预变性8min，然后以95℃变性40s、50℃退火40s、72℃延伸40s为一个循环，进行30个循环，最后72℃延伸8min。

PCR结果如图3所示，长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短乳杆菌(Lactobacillus breris)、短乳杆菌(Lactobacillus breris)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)无法扩增出目的条带，粪拟杆菌(Bacteroides caccae)、Bacteroides dorei、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、Bacteroides faecis、Bacteroides salyersiae、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、普通拟杆菌(Bacteroidesvulgatus)、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、Bacteroides kribbi、Bacteroides koreensis均扩增出大小为485bp的目的条带。

将PCR产物胶回收(胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司公司)、测序，采用美国Thermo Fisher科技公司Varioskan LUX多功能微孔板读数仪进行定量，并等量混样，用IlluminaTruSeq DNA LT Sample Preparation Kit试剂盒进行标准文库构建，并在Illumina Miseq测序平台进行上机测序，并与实施例1构建的基因文库进行比对，对待测样品中拟杆菌的属进行检测。

经验证，该比对结果与初始选定的菌株种属分类的信息一致。本发明的方法能够有效地将拟杆菌属的菌株与其它属的菌株区分，测序后的比对结果能够100％鉴定拟杆菌种。

实施例3：拟杆菌快速检测方法的构建及其在种水平上的验证

为了验证引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2在分析拟杆菌中的准确性，我们将普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)，Bacteroides salyersiae，Bacteroides dorei，Bacteroides faecis，单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)，粪拟杆菌(Bacteroidescaccae)，Bacteroides；xylanisolvens，诺迪拟杆菌(Bacteroides nordii)，Bacteroidesstercoris，脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，共10种拟杆菌(如表2)基因组按照浓度0.001-50ng/μL进行混合，用于模拟复杂样品中不同种拟杆菌的检测。基于新设计的拟杆菌鉴定引物并结合二代测序仪，然后按照实施例2所述方法步骤进行模拟样品测序，最后对测序所得rpsD基因序列信息与所构建数据库(实施例1中构建)进行比对。由于每一种菌株DNA在进行混合之前经过浓度检测，具体见表2，则每一株菌DNA含量确定，经过拟杆菌检测方法进行检测，理论上每一种菌株DNA浓度所能读取的数量应与其对应的混合样品中DNA浓度具有一定的相关性。此外，由于菌株DNA浓度测定，最终比对的结果应与对应浓度的菌株一致，因此这一步骤还可以检测本检测方法的准确性。

表2拟杆菌快速检测方法的构建及其在种水平上的验证

将依据高通量测序方法得到的拟杆菌不同物种的含量与模拟样品中预先混的拟杆菌含量比较得到如图2的结果，从图2我们可以看出，利用引物SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2测序到到的拟杆菌物种的含量与预先混入的拟杆菌物种含量具有很好的一致性(y＝1.0076x-0.1012,R²＝0.9974)，因此，该高通量测序方法在检测拟杆菌物种上具有较高的准确性。

因此本发明提供的基于高通量测序检测不同种拟杆菌的方法适用于对复杂样品的rpsD基因序列信息与所构建数据库中已知物种的rpsD基因序列比对，从而得出复杂样品中不同种的拟杆菌。

实施例4：拟杆菌快速检测方法在粪便样品中的应用

具体实施方式参见实施例2，区别在于，样品为人粪便，对粪便样品中微生物进行基因组DNA提取，提取时采用美国MPBiomedicals公司的DNA提取试剂盒进行，具体操作步骤以该试剂盒操作说明书为准。

对测序所得rpsD基因序列信息与所构建数据库(实施例1中构建)进行比对，检测结果如附图4所示，图4展示了部分人粪便样和小鼠品中拟杆菌的组成结构。普通拟杆菌和卵形拟杆菌是22份人粪便内的优势拟杆菌，Bacteroides acidifaciens是22份小鼠粪便内的优势拟杆菌。上述数据说明，所述方法可以快速、准确的检测人粪便以及小鼠粪便内的拟杆菌组成。

对照例1：16S rRNA V3-V4对于拟杆菌鉴定的准确性验证

采用16S rRNA作为标记物，构建脆弱拟杆菌、多形拟杆菌、普通拟杆菌、卵形拟杆菌、普通拟杆菌等42种已知的拟杆菌系统发育树(分别利用NCBI和EMBL数据库下载拟杆菌不同菌株16S rRNA基因序列，通过MEGA软件利用neighbor-joining距离算法构建系统发育树)。如图6所示，从图6可以看出，16Sr RNA基因的V3-V4区鉴定分类结果不够准确，无法区分某些种。例如单形拟杆菌(Bacteroides uniformisdnLKV2)、B.fluxus YIT12057，B.faecis MAJ27和多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron 7330)无法区分。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种鉴定拟杆菌的方法，其特征在于，以rpsD基因为标记物，以SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示序列为引物，扩增获得标记物基因片段的菌株为拟杆菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标记物的基因片段大小为400～600bp。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增是以含有微生物基因组的样品为模板，进行扩增。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述样品包括基因组DNA提取物、菌悬液或单菌落。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述扩增是以含待测混合物的基因组DNA为模板进行扩增。

6.一种鉴定复杂样品中拟杆菌种水平组成的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)构建拟杆菌rpsD基因标准文库；(2)以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，对复杂样品基因组中rpsD基因序列进行扩增；(3)将步骤(2)扩增结果回收、建库、测序；(4)将测序结果与步骤(1)构建的拟杆菌rpsD基因标准文库比对，鉴定、分析复杂样品中拟杆菌种水平的组成特征。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述拟杆菌rpsD基因标准文库含有Genbank数据库中可检索到的拟杆菌rpsD序列。

8.一种鉴定拟杆菌种的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒应用于鉴定拟杆菌种的鉴定中。

9.一种筛选拟杆菌的方法，其特征在于，将待筛选的样品制成菌悬液，将菌悬液稀释、涂布于固体培养基上培养至形成单菌落，对长出的单菌落进行摇瓶得到菌液，再以SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，利用菌液对rpsD基因的序列进行扩增，扩增获得大小为400～600bp基因片段的菌株为拟杆菌。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为MRS培养基、BHI培养基、TSB培养基或以胃粘膜素为唯一碳源的厌氧培养基。

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