CN112391484A - 一种定量检测长双歧杆菌菌株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种定量检测长双歧杆菌菌株的方法，属于微生物技术领域。本发明提供了一种操作简单(可避开大量电泳实验)、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，有别于传统电泳方法(在有限可得到的细菌菌株纯培养物的范围内，识别菌株特异性序列)，本发明的方法采用群体基因组学概念，获取公共数据库几百株测序长双歧杆菌基因组信息，采用生信方法，获得置信区间更宽的“菌株特异性”序列，且节省大量时间、工作量和成本。

Description

一种定量检测长双歧杆菌菌株的方法

技术领域

本发明涉及一种定量检测长双歧杆菌菌株的方法，属于微生物技术领域。

背景技术

肠道共生菌对人类健康发挥着至关重要的作用，它们中的大多数对宿主有益。双歧杆菌，被认为是宿主肠道的早期“定殖者”，被广泛证明对宿主具有健康促进作用(Frontiers in microbiology,2016,7:1204)。然而，这种益生作用背后的机制还未被阐明。许多双歧杆菌种在肠道中的丰度在不同膳食(Applied and environmentalmicrobiology,2015,81(7):2455-2465；mBio,2017,8(1):e02348-16)、不同年龄层(Cellhost&microbe,2015,17(5):690-703；BioMed Central,2014,13(S1):S4)、不同生理状态(Cell host&microbe,2014,15(3):382-392；Nature,2010,464(7285):59-65)的宿主个体间差异巨大。其中，长双歧杆菌是一个例外，它是人类肠道核心微生物组的成员(Nature,2013,493(7430):45-50)，是不同年龄阶段宿主肠道双歧杆菌属中丰度最具优势的物种(Frontiers in microbiology,2016,7:1204)，在宿主各个年龄阶段均广泛分布(Scientific reports,2018,8(1):85)，并且是少数可以在宿主肠道中稳定定殖长达数年的物种(Science,2013,341(6141))，这使得长双歧杆菌成为可代表宿主-微生物共进化的标志物种。

相比“过路菌”，具有肠道优良定殖能力的益生菌与免疫系统、宿主粘膜、上皮细胞以及土著菌群的联系更为紧密，可能发挥更优的益生功能。然而，受限于菌株水平上定量检测的技术壁垒，益生菌的肠道定殖机制一直未得到深入解析。考虑到肠道菌群中可能存在同摄入的益生菌菌株基因背景接近的种属，目前常用的平板计数和种水平PCR等定殖检测方法，均无法实现准确检测摄入益生菌定殖量的目的(Clinical Nutrition,2019,39(5),1315-1323)，因此，开发针对益生菌的菌株水平上的检测和定量方法，对于评价菌株的肠道定殖能力，继而进一步理解其益生功能性以及相关机制显得尤为必要。

目前，许多方法被用于检测益生菌在胃肠道中的存在和丰度。在研究初期，选择性培养基结合菌落鉴定方法(菌落形态学、生化方法、16S rDNA PCR,ITS-PCR，PFGE,单抗以及RAPD-PCR)被广泛使用(Applied and environmental microbiology,1999,65(11):4949-4956；Journal of Applied Microbiology,2001,90(1):43-52；Journal of pediatricgastroenterology and nutrition,2008,47(1):45-53；MSphere,2017,2(6):e00501-17；International journal of food microbiology,1995,25(2):199-203；Internationaljournal of food microbiology,1999,48(1):51-57)，但是，这些方法费时费力，并且，精度低。荧光和抗生素标记菌株或FISH方法等也具有缺陷，例如，肠道转导过程中带有荧光标记的质粒极易被菌株丢失，低的检测灵敏度以及安全因素也使得这些方法无法被广泛应用。基于16S rDNA可变区或16S-23S ITS序列的种水平PCR也被直接用于检测粪便中特定摄入益生菌的含量(BMC Research Notes,2013,6(1):252；Journal of appliedmicrobiology,2004,96(4):777-786)，然而，该方法不能排除宿主菌群背景中基因型相似的临近种属的干扰。

现阶段，随着细菌基因组的不断测序和积累，菌株特异性的序列开始被识别，根据这些序列对目标菌株进行检测和定量的观点开始被提出。实现菌株水平定量检测的关键是找到给定菌株的独特DNA序列。在菌株基因组大规模测序之前，专家学者根据特定的RAPD条带、来自SSH的特定DNA片段或者菌株的已知特性(LGG具有鞭毛结构，而LC705不具有)，针对一些益生菌[鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus GG),短双歧杆菌(Bifidobacterium breve Yakult),两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum BF-1),罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri DSM 17938),嗜酸乳杆菌(L.acidophilus LAB20),罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri DSM 16350)等]设计了一些菌株特异性引物用于菌株在肠道/粪便中的定殖量检测(Proceedings of the National Academy ofSciences,2009,106(40):17193-17198；Journal of applied microbiology,2011,110(1):209-217；Applied and environmental microbiology,2013,79(7):2182-2188；Antonie Van Leeuwenhoek,2010,97(2):189-200,Letters in applied microbiology,2013,57(4):330-335；PLoS One,2014,9(2):e90208)。然而，这些菌株特异性DNA片段的识别是基于有限数量的菌株，使得“菌株特异性”只在比较狭窄的置信区间中有效。另外，这些方法通常需要获取各种菌株纯培养物进行大量的电泳分析，费事费力。因此，亟需找到一种操作简单、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的特异性DNA片段以实现益生菌菌株的定量检测。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法以实现长双歧杆菌菌株的定量检测。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，所述方法为先获取全部或部分已测序的长双歧杆菌菌株的基因组，然后对获取得到的基因组进行基因存在缺失分析，得到长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因，在对得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因进行特异性验证，验证成功的基因即为可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为先获取全部或部分已测序的长双歧杆菌菌株的基因组，然后对获取得到的基因组进行基因存在缺失分析，得到长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因，再以获取的长双歧杆菌菌株的基因组构建数据库，采用BlastN比对，验证得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因在核苷酸水平上的特异性，随后基于NR/NT库，通过Blast检索，验证得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因在其它种属微生物背景下的特异性，验证成功的基因即为可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因存在缺失分析使用Roary软件、Pan-Seq软件、PGAT软件或PGAP软件完成。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌RG4-1、长双歧杆菌M1-20-R01-3以及长双歧杆菌FGSZY6M4。

在本发明的一种实施方式中，当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌RG4-1时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌M1-20-R01-3时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌FGSZY6M4时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物的方法，所述方法为先使用上述方法获取可用于筛选和/或鉴定某一长双歧杆菌菌株的特异性基因，然后根据获取得到的特异性基因设计可用于扩增此特异性基因的引物，此引物即为可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性引物。所设计引物只对与使用上述方法得到的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物相对应的长双歧杆菌菌株产生扩增，对其它非目标菌株无扩增，对不含目标菌株的样本无扩增。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌RG4-1、长双歧杆菌M1-20-R01-3以及长双歧杆菌FGSZY6M4。

在本发明的一种实施方式中，当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌RG4-1时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示；当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌M1-20-R01-3时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌FGSZY6M4时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供了可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的DNA片段，所述DNA片段为使用上述方法得到的可用于筛选和/或鉴定某一长双歧杆菌菌株的特异性基因和/或使用上述方法得到的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物。

在本发明的一种实施方式中，所述长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌RG4-1、长双歧杆菌M1-20-R01-3以及长双歧杆菌FGSZY6M4。

在本发明的一种实施方式中，当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌RG4-1时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌M1-20-R01-3时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌FGSZY6M4时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌RG4-1时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所示；当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌M1-20-R01-3时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；当长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌FGSZY6M4时，所述可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供了上述方法和上述DNA片段在筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株中的应用。

本发明还提供了一种鉴定长双歧杆菌菌株的方法，所述方法为使用上述方法得到的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物对待鉴定菌株进行PCR扩增，若能扩增出基因片段，则待鉴定菌株为与使用权利要求所述的方法得到的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物相对应的长双歧杆菌菌株。

本发明还提供了上述方法和上述DNA片段在对长双歧杆菌菌株进行绝对定量中的应用。

本发明还提供了一种对样本中长双歧杆菌菌株进行绝对定量的方法，所述方法为分离样本中某一长双歧杆菌菌株的单菌落；使用上述方法得到可用于筛选和/或鉴定该长双歧杆菌菌株的特异性引物；培养该长双歧杆菌菌株，得到该长双歧杆菌菌株的菌液；将该长双歧杆菌菌株的菌液梯度稀释后，使用上述方法得到的可用于筛选和/或鉴定该长双歧杆菌菌株的特异性引物，通过qPCR方法绘制以活菌数对数值为横坐标、以Cq值为纵坐标的该长双歧杆菌菌株的绝对定量标准曲线；使用上述方法得到可用于筛选和/或鉴定该长双歧杆菌菌株的特异性引物，通过qPCR方法获得样本的Cq值，将获得的Cq值代入该长双歧杆菌菌株的绝对定量标准曲线，即可获得样本中该长双歧杆菌菌株的含量。

有益效果：

(1)本发明提供了一种操作简单(可避开大量电泳实验)、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，有别于传统电泳方法(在有限可得到的细菌菌株纯培养物的范围内，识别菌株特异性序列)，本发明的方法采用群体基因组学概念，获取公共数据库几百株测序长双歧杆菌基因组信息，采用生信方法，获得置信区间更宽的“菌株特异性”序列，且节省大量时间、工作量和成本。

(2)本发明提供了一种操作简单(可避开大量电泳实验)、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，使用本发明的方法识别菌株特异性序列时，采用泛基因组分析软件Roary进行基因存在缺失分析，相比其它泛基因组分析软件，运行效率更高，并且，数据处理方式简单。

(3)本发明提供了一种操作简单(可避开大量电泳实验)、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，由于相比于其它物种，同物种的菌株间遗传信息相似性更高，而本发明的方法采用先于本物种(长双歧杆菌种)中进行菌株特异性序列查找，之后再于微生物基因信息全库(NR/NT库)中对相应序列的菌株特异性进行验证，因此，相比于直接纳入本物种和其它物种微生物同时进行分析，本发明的方法可大大减少分析的时间和工作量。

(4)本发明提供了一种操作简单(可避开大量电泳实验)、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，由于Roary软件是基于蛋白序列进行比对分析的可能存在假阳性结果，而本发明在获得菌株特异性的基因后，以纳入分析的百株长双歧杆菌基因组建库，采用基于核苷酸序列的Blast分析，对Roary输出的初步的菌株特异性序列进行验证，因此，本发明的方法可进一步保证菌株特异性序列的真实性。

(5)本发明提供了一种操作简单(可避开大量电泳实验)、可有效克服无法获取大规模细菌纯培养物难题且获得置信区间宽的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，利用本发明的方法针对菌株特异性序列设计引物，引物特异性较高，通过优化退火温度等PCR条件，可实现对非目标菌株以及不含目标菌株的粪便样品无扩增，可实现在复杂菌群背景下菌株特异性的定殖量检测。

生物材料保藏

一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum subsp.Longum)FGSZY6M4，分类学命名为Bifidobacterium longum subsp.Longum，已于2019年12月30日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60941，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

附图说明

图1：205株长双歧杆菌基于单核苷酸多态性位点(SNP)的进化树。

图2：长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4分别与数据集中其它菌株间的遗传距离。

图3：菌株特异性基因识别和特异性引物设计流程。

图4：205株长双歧杆菌的基因存在缺失分析结果。

图5：长双歧杆菌RG4-1特异性基因对NCBI的NR/NT库比对结果图。

图6：长双歧杆菌M1-20-R01-3特异性基因对NCBI的NR/NT库比对结果图。

图7：长双歧杆菌FGSZY6M4特异性基因对NCBI的NR/NT库比对结果图。

图8：长双歧杆菌RG4-1的引物特异性的电泳验证；图中，RG4-1-A胶图菌株顺序，从右向左：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)RG4-1、长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)FGSZY6M4、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)M1-20-R01-3、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)274、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FSHHK13M1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FSDLZ57M1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NaTon 49-4、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FJSWXJ11M1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)HUB 36-17、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)28-10、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ZCC7、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)DSM20213、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)DSM 20456、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)FQHXN5M4、假长双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudolongum)56M2、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB12、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)L2-32、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)DSM20555、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)DSM 20243、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)DSM 20011、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)DSM 20079、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DSM 20174、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM20016、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LMS2-1；RG4-1-B胶图菌株顺序，从右向左：大肠杆菌(Escherichia coli)CMCC44102、阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FJLHD50M21、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)ATCC 27768、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CCFM596、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)NCTC9343、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)FNMHLBE9-K-7、埃氏拟杆菌(Bacteroideseggerthii)FSDTA-HCK-B-9、解纤维拟杆菌(Bacteroides cellulosilyticus)FSDTA-ELI-BHI-5、诺迪拟杆菌(Bacteroides nordii)FNMHLBE13K2、粪便拟杆菌(Bacteroidesstercoris)FJSWX62K34、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)FJSWX62K43、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)FFJLY22K5、吉氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)FSDTA-HCM-XY-12、多雷拟杆菌(Bacteroides dorei)FJSWX61E4、其他拟杆菌(Bacteroidesfaecis)FTJS2E2、肠拟杆菌(Bacteroides intestinalis)FBJ60K5、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)FSDLZ51K1、细沟拟杆菌(Bacteroides finegoldii)FNMHLBE11E1、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)FBJ10-K-10、克拉鲁斯拟杆菌(Bacteroides clarus)F-FJ-LY-22-K-22、其他拟杆菌(Bacteroides salyersiae)FSDTA-ELI-BHI-9、木糖降解拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)FSDTAHCMXY17、粪副拟杆菌(Parabacteroides merdae)FSDTAELIBHI4以及丁酸梭菌(Clostridium butyricum)FJSCZD1G10。

图9：长双歧杆菌M1-20-R01-3的引物特异性的电泳验证；图中，M1-A胶图菌株顺序，从右向左：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)M1-20-R01-3、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)RG4-1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FGSZY6M4、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)274、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FSHHK13M1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FSDLZ57M1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NaTon 49-4、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FJSWXJ11M1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)HUB 36-17、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)28-10、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ZCC7、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)DSM 20213、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)DSM20456、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)FQHXN5M4、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)56M2、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB12、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)L2-32、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)DSM 20555、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)DSM 20243、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DSM 20011、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)DSM20079、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DSM 20174、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)DSM 20016、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LMS2-1；M1-B胶图菌株顺序，从右向左：大肠杆菌(Escherichia coli)CMCC44102、阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)FJLHD50M21、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)ATCC 27768、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CCFM596、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)NCTC9343、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)FNMHLBE9-K-7、埃氏拟杆菌(Bacteroideseggerthii)FSDTA-HCK-B-9、解纤维拟杆菌(Bacteroides cellulosilyticus)FSDTA-ELI-BHI-5、诺迪拟杆菌(Bacteroides nordii)FNMHLBE13K2、粪便拟杆菌(Bacteroidesstercoris)FJSWX62K34、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)FJSWX62K43、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)FFJLY22K5、吉氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)FSDTA-HCM-XY-12、多雷拟杆菌(Bacteroides dorei)FJSWX61E4、其他拟杆菌(Bacteroidesfaecis)FTJS2E2、肠拟杆菌(Bacteroides intestinalis)FBJ60K5、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)FSDLZ51K1、细沟拟杆菌(Bacteroides finegoldii)FNMHLBE11E1、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)FBJ10-K-10、克拉鲁斯拟杆菌(Bacteroides clarus)F-FJ-LY-22-K-22、其他拟杆菌(Bacteroides salyersiae)FSDTA-ELI-BHI-9、木糖降解拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)FSDTAHCMXY17、粪副拟杆菌(Parabacteroides merdae)FSDTAELIBHI4以及丁酸梭菌(Clostridium butyricum)FJSCZD1G10。

图10：长双歧杆菌FGSZY6M4的引物特异性的电泳验证；图中，GS-A胶图菌株顺序，从右向左：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FGSZY6M4、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)M1-20-R01-3、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)RG4-1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)274、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FSHHK13M1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FSDLZ57M1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NaTon 49-4、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)FJSWXJ11M1、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)HUB 36-17、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)28-10、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)ZCC7、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)DSM 20213、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)DSM20456、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)FQHXN5M4、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)56M2、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB12、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)L2-32、唾液乳杆菌(Lactobacillussalivarius)DSM 20555、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)DSM 20243、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DSM 20011、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)DSM20079、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DSM 20174、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)DSM 20016、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LMS2-1；GS-B胶图菌株顺序，从右向左：大肠杆菌(Escherichia coli)CMCC44102、阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)FJLHD50M21、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)ATCC 27768、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CCFM596、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)NCTC9343、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)FNMHLBE9-K-7、埃氏拟杆菌(Bacteroideseggerthii)FSDTA-HCK-B-9、解纤维拟杆菌(Bacteroides cellulosilyticus)FSDTA-ELI-BHI-5、诺迪拟杆菌(Bacteroides nordii)FNMHLBE13K2、粪便拟杆菌(Bacteroidesstercoris)FJSWX62K34、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)FJSWX62K43、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)FFJLY22K5、吉氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)FSDTA-HCM-XY-12、多雷拟杆菌(Bacteroides dorei)FJSWX61E4、其他拟杆菌(Bacteroidesfaecis)FTJS2E2、肠拟杆菌(Bacteroides intestinalis)FBJ60K5、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)FSDLZ51K1、细沟拟杆菌(Bacteroides finegoldii)FNMHLBE11E1、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)FBJ10-K-10、克拉鲁斯拟杆菌(Bacteroides clarus)F-FJ-LY-22-K-22、其他拟杆菌(Bacteroides salyersiae)FSDTA-ELI-BHI-9、木糖降解拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)FSDTAHCMXY17、粪副拟杆菌(Parabacteroides merdae)FSDTAELIBHI4以及丁酸梭菌(Clostridium butyricum)FJSCZD1G10。

图11：长双歧杆菌RG4-1 qPCR绝对定量标准曲线。

图12：长双歧杆菌M1-20-R01-3 qPCR绝对定量标准曲线。

图13：长双歧杆菌FGSZY6M4 qPCR绝对定量标准曲线。

图14：长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4分别灌胃小鼠7天后的定殖量。

具体实施方式

下述实施例中涉及的琼脂糖(产品编号：CAS#[9012-36-6])购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的100bp基因ladder(产品编号：CW0636S)购自江苏康为世纪生物科技有限公司；下述实施例中涉及的核酸染料(产品编号：CW2635S)购自江苏康为世纪生物科技有限公司；下述实施例中涉及的实验小鼠(BALB/c，5周龄，雄性)购自上海斯莱克实验动物中心；下述实施例中涉及的动物饲料(产品编号：LAD0011)购自南通特洛菲饲料科技有限公司；下述实施例中涉及的用于电泳验证的普通PCR相关2×Taq PlusMasterMix(Dye)(产品编号：CW2849L)购自江苏康为世纪生物科技有限公司，并使用PCR仪(Bio-Rad T100 Thermal Cycler)进行扩增；下述实施例中涉及的单菌基因组提取试剂盒(产品编号：DP302)购自天根生化科技(北京)有限公司；下述实施例中涉及的溶菌酶(产品编号：L6876-1G)购自美国sigma公司；下述实施例中涉及的粪便基因组提取试剂盒(产品编号：116570200)购自美国MPBiomedicals公司；下述实施例中涉及的iTaqTM UniversalSYBR Green Supermix购自美国BIO-RAD公司，并使用BIO-RAD CFX96 qPCR仪进行定量检测；下述实施例中涉及的葡萄糖、氯化钠、无水乙醇等无机或有机试剂购自上海国药集团化学试剂有限公司(沪试)；下述实施例中涉及的BHI培养基(产品编号：HB8478)购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂20g/L，pH为6.8。

MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂PO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄ 0.05g/L、吐温80 1mL/L，pH为6.8。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L、琼脂20g/L，pH为7.4。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠5g/L，pH为7.4。

强化梭菌固体培养基：胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉3g/L、无水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉1g/L、氯化钠5g/L、无水乙酸钠3g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、刃天青4mL(0.025％)、琼脂20g/L，pH 6.8。

强化梭菌液体培养基：胰蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉3g/L、无水葡萄糖5g/L、可溶性淀粉1g/L、氯化钠5g/L、无水乙酸钠3g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、刃天青4Ml(0.025％)，pH 6.8。

下述实施例中涉及的菌株和培养条件：

见表1。

表1下述实施例中涉及的菌株和培养条件

注：^a厌氧菌(双歧杆菌，阿克曼氏菌,柔嫩梭菌,拟杆菌菌株以及丁酸梭菌)于厌氧培养箱(80％N₂,10％H₂,10％CO₂)培养。

^b这些菌株取自江南大学食品生物技术菌种保藏中心(Culture Collection ofFood Microorganisms。

^c这些菌株购买自德国DSMZ保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen)。

^d这些菌株分离自商业益生菌产品。

^e这些菌株由BEI资源库(Biodefense and Emerging Infections ResearchResources Repository)提供。

^f这些菌株购自中国医学细菌菌种保藏管理中心(National Center for MedicalCulture Collections)。

^g这株菌购自美国ATCC保藏中心(American Type Culture Collection)。

实施例1：菌株基因组测序、公共数据库长双歧杆菌基因组获取以及系统发育关系重构

采用Illumina HiSeq 2000测序仪对3株分离自三个中国人粪便样品的长双歧杆菌(RG4-1、M1-20-R01-3和FGSZY6M4)进行全基因组测序。具体地，根据使用说明，构建一个平均插入片段350bp并且平均读长150bp的双端测序文库，保证每个样品产生至少3GB双端测序数据。去除接头和低质量reads后，我们采用SOAPdenovo v2.04对测序数据进行基因组组装(3株菌的基因组组装相关参数见表2)。从NCBI数据库的genome库中下载202株长双歧杆菌基因组(具体可见表3)，并纳入3株上述自测序长双歧杆菌基因组，构成最终数据集。

以长双歧杆菌NCC2705为参考基因组，使用MUMmer软件鉴定205株长双歧杆菌中的单核苷酸多态性(SNP)位点；选取所有的二态SNP，采用TreeBest软件构建(Neighbour-joining)邻接树(具体可见图1)。由系统发育树可见，3株分离自中国人肠道样本的自测序菌株相互聚拢，具有更近的亲缘关系，与大多分离自其它国家的公共数据集菌株相聚较远。但是，3株自测序长双歧菌株间仍具有一定遗传距离，提示它们是3株基因型相异的长双歧杆菌。另外，3株自测序菌株与数据集中其它204株菌的最小遗传距离分别为6000个SNP(RG4-1)、5257个SNP(M1-20-R01-3)以及8514个SNP(FGSZY6M4)(具体可见图2)，进一步说明3株自测序菌株的遗传背景差异。

上述针对长双歧杆菌的遗传背景的分析表明，长双歧杆菌菌株具有较高的种内遗传多样性，核心基因组上累积了数以千计(菌株两两间的SNP距离平均值为6691)的单碱基突变，要进行菌株特异性检测的3株自测序菌株具有一定的遗传背景差异，分属于不同的长双歧菌株。

表2测序基因组相关参数

表3公共数据库下载的202株长双歧杆菌的基因组信息

实施例2：长双歧杆菌种内菌株特异性基因的识别

考虑到物种内遗传信息较为接近，首先在长双歧杆菌物种内识别菌株特异性基因(分析流程图见图3)。由于公共数据库下载的菌株基因组常分属不同的bioproject，因此，它们的注释信息多存在不一致。首先基于Prokka软件采用默认参数对205株基因组进行重注释；接着采用Roary软件对重注释结果进行基于蛋白序列的基因存在缺失分析，分析设置最小BLASTP一致性为90％，定义菌株特异性基因(仅在1株菌中出现的基因)、核心基因(99％<＝菌株数<＝100％)、松散核心基因(95％<＝菌株数<99％)、壳基因(15％<＝菌株数<95％)以及云基因(0.5％<＝菌株数<15％)。该分析在205株菌株初步识别菌株特异性基因2398个，占据总基因数量的28.7％(具体可见图4)；其中，初步识别RG4-1菌株特异性基因32条(具体可见表4)，初步识别M1-20-R01-3菌株特异性基因14条(具体可见表5)，初步识别FGSZY6M4菌株特异性基因49条(具体可见表6)。

表4 Roary软件识别的长双歧杆菌RG4-1的菌株特异性基因

表5 Roary软件识别的长双歧杆菌M1-20-R01-3的菌株特异性基因

基因ID	非专一性基因名	注释信息	片段长度	片段ID
					group_6841		假定蛋白	194	M1-20-R01-3_00305
group_6842		假定蛋白	998	M1-20-R01-3_00310
					group_6843		假定蛋白	221	M1-20-R01-3_00311
group_6844		假定蛋白	233	M1-20-R01-3_00316
					group_6845		假定蛋白	257	M1-20-R01-3_00318
group_6846		假定蛋白	623	M1-20-R01-3_00319
					group_6847		假定蛋白	587	M1-20-R01-3_00320
group_6848		假定蛋白	1745	M1-20-R01-3_00324
					group_6849		假定蛋白	236	M1-20-R01-3_00325
group_6850		假定蛋白	581	M1-20-R01-3_00326
					group_6851		假定蛋白	191	M1-20-R01-3_00327
group_6852		YcfA状蛋白	224	M1-20-R01-3_00328
					group_6853		假定蛋白	413	M1-20-R01-3_00329
group_6854		假定蛋白	617	M1-20-R01-3_00562

表6 Roary软件识别的长双歧杆菌FGSZY6M4的菌株特异性基因

实施例3：基于NCBI中NR/NT库的菌株特异性序列的生信验证

实施例2中已经在长双歧杆菌物种内识别了菌株特异性基因，本实施例考察这些物种内特异性序列是否在全微生物基因背景下仍然具有特异性。首先以205株长双歧杆菌的基因组建库，采用基于核苷酸序列的Blast分析，将实施例2中得到的菌株特异性基因比对到长双歧基因组数据库，进一步确认这些基因在长双歧种内的“菌株特异性”。同时，把验证为真的菌株特异性序列，进行基于NCBI中NR/NT库的blast，选择没有比对结果的序列(具体可见图5～7)，最终选取RG4-1_01874(1331bp、SEQ ID NO.1)、M1-20-R01-3_00324(1745bp、SEQ ID NO.2)以及FGSZY6M4_01477(1691bp、SEQ ID NO.3)分别为对应长双歧杆菌的用于菌株特异性检测的特异性基因。

实施例4：菌株特异性定量引物设计及电泳验证

根据实施例3中确定的菌株特异性检测的特异性基因，采用Primer Premier5.0软件设计引物，并在NCBI网站的Primer-blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi？LINK_LOC＝BlastHome)对引物特异性进行评价，最终得到的引物如表7所示。接着，进行核酸凝胶电泳验证引物序列的菌株特异性，具体操作步骤如下：

(1)长双歧杆菌种内特异性验证

分别提取长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3、FGSZY6M4、274、FSHHK13M1、FSDLZ57M1、NaTon 49-4、FJSWXJ11M1、HUB 36-17、28-10以及ZCC7的基因组，微生物基因组提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒中说明书，用序列如SEQ ID NO.4至SEQ ID NO.9所示的引物，以提取的基因组为模板进行PCR扩增后进行电泳验证，扩增条件如下：

①PCR扩增反应体系的组成为：基因组DNA模板2μL、2×Taq Plus MasterMix 10μL(康维世纪)、10μM的正向引物和反向引物各2μL，加ddH₂O至20μL；

②PCR扩增反应条件为：95℃预变性2min，然后以95℃变性5s、65℃退火30s、72℃延伸30s为一个循环，进行40个循环，最后72℃延伸2min。

验证结果如图8～10所示，RG4-1的菌株特异性引物只对长双歧RG4-1产生特异性扩增，产物条带长度115bp；M1-20-R01-3的菌株特异性引物只对长双歧M1-20-R01-3产生特异性扩增，产物条带长度199bp；FGSZY6M4的菌株特异性引物只对长双歧FGSZY6M4产生特异性扩增，产物条带长度144bp；相应引物对其它长双歧杆菌菌株无扩增。

(2)双歧杆菌属内特异性验证

选取短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)DSM 20213、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)DSM 20456、假小链双歧杆菌(Bifidobacteriumpseudocatenulatum)FQHXN5M4、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)56M2、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)BB12以及青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)L2-32，按照步骤(1)中方法提取基因组，以提取的基因组为模板进行PCR扩增后进行电泳验证。

验证结果如图8～10所示，其它双歧杆菌种均未扩增出条带。

(3)基于其他肠道菌的引物特异性验证

选取唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)DSM 20555、格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)DSM 20243、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)DSM 20011、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)DSM 20079、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)DSM 20174、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)DSM 20016、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)LMS2-1、大肠杆菌(Escherichia coli)CMCC44102、阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FJLHD50M21、柔嫩梭菌(Faecalibacterium prausnitzii)ATCC 27768、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CCFM596、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)NCTC9343、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)FNMHLBE9-K-7、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)FSDTA-HCK-B-9、解纤维拟杆菌(Bacteroidescellulosilyticus)FSDTA-ELI-BHI-5、诺迪拟杆菌(Bacteroides nordii)FNMHLBE13K2、粪便拟杆菌(Bacteroides stercoris)FJSWX62K34、单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)FJSWX62K43、粪拟杆菌(Bacteroides caccae)FFJLY22K5、吉氏副拟杆菌(Parabacteroidesdistasonis)FSDTA-HCM-XY-12、多雷拟杆菌(Bacteroides dorei)FJSWX61E4、其他拟杆菌(Bacteroides faecis)FTJS2E2、肠拟杆菌(Bacteroides intestinalis)FBJ60K5、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)FSDLZ51K1、细沟拟杆菌(Bacteroides finegoldii)FNMHLBE11E1、卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)FBJ10-K-10、克拉鲁斯拟杆菌(Bacteroides clarus)F-FJ-LY-22-K-22、其他拟杆菌(Bacteroides salyersiae)FSDTA-ELI-BHI-9、木糖降解拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)FSDTAHCMXY17、粪副拟杆菌(Parabacteroides merdae)FSDTAELIBHI4以及丁酸梭菌(Clostridium butyricum)FJSCZD1G10，按照步骤(1)中方法提取基因组，以提取的基因组为模板进行PCR扩增后进行电泳验证。

验证结果如图8～10所示，3对长双歧菌株的特异性引物对测试的肠道菌未扩增出条带。

综上，针对3株长双歧杆菌设计的菌株特异性引物，仅对目的菌株产生扩增，对其它同种、同属以及其他属菌株无扩增，具有良好的菌株特异性。

表7 3株长双歧杆菌菌株的特异性检测引物基本信息

实施例5：引物专一性评价以及菌株定量标准曲线的绘制

分别蘸取长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的菌液在MRS固体培养基上划线，于37℃培养48h，得到单菌落；分别挑取长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的单菌落接种至MRS液体培养基中，于37℃培养18h至对数期，得到对数期菌液；分别将长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的对数期菌液离心，收集菌体。

为采用qPCR方法实现菌株的绝对定量，分别取长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的对数期菌液，用无接种的MRS液体培养基进行10倍梯度稀释，得到梯度稀释至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7的菌液，按照实施例4中的方法分别提取10^-0、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7各个梯度的菌液的菌株基因组。同时，对3株菌无稀释的菌液，在生理盐水中梯度稀释，进行平板倾注计数，记录无稀释菌液对应活菌数(各个梯度稀释菌液的活菌数以10倍除法类推计算)。最后，以上述各个梯度(10^-0～10^-7)提取的长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的菌液的基因组为模板进行qPCR扩增，扩增条件如下：

①qPCR扩增反应体系的组成为：基因组DNA模板2μL、2×supermix 10μL(BIO-RAD)、10μM的正向引物和反向引物各2μL，加ddH₂O至20μL；

②PCR扩增反应条件为：95℃预变性2min，然后以95℃变性5s、65℃退火30s为一个循环，进行40个循环，加溶解曲线分析(65～95℃，0.5℃为温度增量且2～5s/步)，最后95℃保持5min。

上述qPCR体系和条件是经过优化后，证明对无目的菌株的粪便样品无扩增信号，对目标菌株DNA具有最优扩增信号的最具选择性扩增的设置。

qPCR得到的3株菌的qPCR扩增活菌数对数lgCFU与Cq值的关系如图11～13所示，RG4-1的绝对定量标准曲线为Ct＝-3.4789lgCFU+38.217，线性R²＝0.9978；M1-20-R01-3的绝对定量标准曲线为Ct＝-3.5901lgCFU+35.128，线性R²＝0.9992；FGSZY6M4的绝对定量标准曲线为Ct＝-3.2936lgCFU+38.371，线性R²＝0.9948。

实施例6：3株长双歧在实验小鼠粪便中的定殖量

分别蘸取长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的菌液在MRS固体培养基上划线，于37℃培养48h，得到单菌落；分别挑取长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的单菌落接种至MRS液体培养基中，于37℃培养18h至对数期，得到菌液；分别将长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的菌液离心，收集菌体；分别将长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的菌体用生理盐水重悬至浓度为1×10¹⁰CFU/mL，得到重悬液。

选取5周龄Balb/c雄性小鼠15只，随机分成3组，每组5只，分别为：RG4-1组、M1-20-R01-3组和FGSZY6M4组。

实验共14天：第一周(7天)为小鼠适应期；第8天开始灌胃直至实验结束，RG4-1组、M1-20-R01-3组和FGSZY6M4组小鼠每天每只分别灌胃长双歧杆菌RG4-1、M1-20-R01-3以及FGSZY6M4的重悬液200μL，共灌胃7天。

收集各组小鼠灌胃开始前的粪便(基线期粪便)以及各组小鼠灌胃第7天的粪便。使用粪便基因组提取试剂盒提取各粪便中的基因组，并且，使用实施例5的方法对提取得到的基因组进行qPCR扩增，得到各粪便的Cq值，将获得Cq值代入实施例5获得的绝对定量标准曲线，得到各粪便中3株长双歧杆菌的绝对含量(具体可见图14)。

由图14可知，3株长双歧杆菌在干预期内的定殖量均大于10⁸CFU/g粪便。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种定量检测长双歧杆菌菌株的方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1332

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgatgaata ggaaaggcac aaccatgaaa accatgaagt tcgcggccgc gggccttgcc 60

gcagccatgc tgctgccact tggcgcatgt ggttccgctt cggacgccaa cacgctcacc 120

atctgggtgg agaaagtgtt cagcgagaag tcgaacgagg agatgaagca gcgtatcgaa 180

atcttctcca aggaaaccgg cataaaagtc aattacgagt tcatttccgc cacggactat 240

atgaccaagc tcaacgccac catcgaggcg gggcgcggca ttccggacat caccacgtcc 300

gccgtgtcca aggtagtgaa ctattaccct ggcaacccat acatggatat gaccgacatc 360

gtggagcgca tcaataagga ccggccgtat ctgaagtccg tgtacgaggg cagcaagatt 420

gacggcaagc tgtatttcgc gccattccgc agttcgtcga cgatgatgtt catccgcatg 480

gacaagctgt acgaggctgg gatctacgag gtgcccacta cctgggatga gctgttcgaa 540

gtagccgaga agatcagcga tccggcacag ggcttctatg gcctgggctg gggctgcggt 600

tccacggatg aggacggcga caacatcttc cgcaacatca tgtggaacca aggtggctac 660

atgttcgata aggacggcaa cgtcaccatc gacaacaagg tgagccgcaa gctgatgcag 720

cagtacaaga cgatgtacca gaacaaggtg ataccgccat cagccagcac ttgggattcc 780

ggcggcaaca acacctcgta cctcatgggc gaatccggca tcatcttcaa cgcgccgacc 840

ctgtactact ccatggcctc ggacccatca tatgagacgc tgctcggcaa taccgccgta 900

gtgaacctgc ccaagggcga ggacaacgat gtgaagatgt cgttcgtcac cggactgtcg 960

attatgaagg ccagcaagaa cgtcgacgcg gccaccaagc tcgtcgaata cctgctggac 1020

aaggactggt atgacggctt cctggaggag acggcccccg tgttcgcccc cgtgttccag 1080

gattccgagc aggtggacac gtggcagaag gacgtcaacg ccgaagtgct caactacgtc 1140

aagacgtcgg agggctacta cggatacccc gcacggtcta ccgccgatcg tgccgtggca 1200

gccaagaaca tgttcaccta cccagaagcg aagatgctca accagattgt cacggtgaat 1260

accagcatcg atgacgcgct aaaagacaac atccgcaaga ttgacgagct taagtcgctg 1320

ttcgctgagt ag 1332

<210> 2

<211> 1746

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgttcattg aattcctcag catcatcagc cgaaagtcag atgaggagtt acgtcggata 60

accttccaca agggcacaaa cctcgtcgtc gattccgagg attcggaacg ccataatcac 120

gtgggcaaga cgacgttcct cagactcatc gacgtgctgc ttggatcgga caagcgcaaa 180

agcatctaca ccgatgccga gaacggggcg gtgaataagg cactggaaca atttatcgca 240

acagaacgta tctccatcga aggcaggctt tccagtgatc tacccagcgg gaagacgtcg 300

agaacgatgt tcctccgggt cgatctcttc cggcgcggag ctcggtacat cgatggtgag 360

aaagtgaata tctctgaata tcatcgtcgg ctcaaggatt tcctgttcga tgacgagagg 420

aagaccccgt cattcaggca gctgattgac tttttcgttc ggatctcatt ggacggagac 480

gagaattcct ttctgagatg cataccccag ggcgaccgtg gaggaaacgg aacataccga 540

tccgcataca actatctctt tggcgtatcc gatcccgctt atgatgttcg gcttgcgaat 600

ctgaaaaaag agattcgcgg tatccagagc gcggagacga agtatcgcaa agtgcgctca 660

accgtcgatt cgttggaagg gctggaacaa aaaatctcct ccatggaaca cgaggaacag 720

gaactgcggg ccagaatcga tgacatcatg gacgcgaaga cgttcatgaa gaaccgtgat 780

gcgattttcc aagctcggga acaatacgat gaactgaccc atcagatatc cgacatcgat 840

ttcctaatca agagaaacac ggacatcctg aatgaggcgg tatcggaacg cgacaggaaa 900

cccgacactg accttgccat cgagttcttc gaagagatcc attccctgat tcccggtatc 960

gcgaaaaaat tcgaggaaat gctggaattc aacaacgagc ttatccaaaa caaaatcgac 1020

tatttcacgg gaatagtgga cgacctcgaa aacagcaaga aacaatatat ggaatcccga 1080

gaagaactta cgaaaggtga cgctccatac cttgccatcg tagagaatca gaaggtcgac 1140

gaatacaccg aacttatgca ggaacatcta cagatcctgc aggatcttgg cgctgaaaaa 1200

gaatcgttag acacgcttcg tgcgttcaag aacgaactgg aagaaaaaaa cgctgaagaa 1260

aaacagctgg aagaacgcat cgtaagaaac cagaactacc gggaaatctt cgaggaattc 1320

aaccaaaaat acttcactcc aatcgcggag agaatcagcg aagaaaaacc catactgatc 1380

tacgatccaa atccgcacaa cttcccggtc tcattaaacc atctcgacga tggcaccagc 1440

acaggaacaa gaaaatcact cattgccgca tacgatttgg cgtaccagca atatgcaaaa 1500

agccagggaa gaacgatacc ggaattcgtc gtacatgacg tcatcgaaaa tgtggaaggc 1560

aatcatctcg ttgccgcatt cgacgaagcc gaccactgcc aaagccaata catagtcgcc 1620

gtgctccagg aaaaactaaa ctcgtcggga atttcaggag aacggcagaa gaacatgacc 1680

atcctcaccc tttccatgcg agacagactg ttcgaagggg aaccaaacag caaagccaac 1740

acctaa 1746

<210> 3

<211> 1692

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgatgatgc gagattctga tcgcccttgg cttagacgag acaccatctt cgcctcggca 60

cccgggggag tgcttatctc caatgcgacg acgggttgtg aaatcgccgg tgagtccgct 120

tatgagctct tcagccgtgt tttcccgctc tttaacggtc aagcgacggt aggcgagatc 180

aagggtgcgg tcgccgaacg caactggaaa ctgattgagg caatcgcggc tccgcttgaa 240

gagaagggtt tcctgcgatg gattcccgaa tccgactatg agcttctcga caacgagaaa 300

cgggaaaagt acgcggacca gatcgccttc ctagcacaat tcaccgatgc tccgcacgag 360

gcatttctgg cgttcaatca ggcgcagatt ttagtagttg gcagcgacga ggtcgccgac 420

tcgttgcagg ccaacctgat cgataacggt gcggaattgg tgacgtccgc cgagtcgttc 480

gccgtcgatc agttcgaaga gctcgcgccc gaccttacgg tgttgggtcc cacggcgctt 540

agcgggatcg accacctccg caaggcagga gtccccttcc taggggtgtg cccggcagga 600

gactacttgt gggcgctacc agttgggtgg accgaaggca gtgcgagctg gcattcagca 660

gacagctctc tgcggcgggg ctccatgggc aaagagtggg ccgaggctat tgagcaggct 720

caggccgggc agccccagtg gacctcggca acgtcctcgc aggcagtcca gcgccttttt 780

ggtgcactct tggcctacga ggtattcaag ggtatcacgg gcgccatcac accagagacc 840

agcgaaaaga ttctcgcgtt caacgcgttg acgggcgcca catcgacaca tccgatgact 900

ccgatctact cagaggtgtc gcgcgaagtg cacgctcaac tagccggggc acatccggaa 960

gacgccggta gcgagacccc ggcgagcatc cacgtctcac atgcggatga gtacgacgac 1020

gtgtgggcgc ctttggtgga taggttcact atgcccgcgt tcgacttcga tgatctcgat 1080

atcgatcagg tgcccgtcaa ggtctcgttg gtggaaacgg caacaggcaa ggttttcgcg 1140

gcgagcccgt ggaccacggc cgatgcccgg attgaagcgc tcgcacgcgc ctatgggcag 1200

tcgcttagct ggcactgcac gtgggcgtca gacgcgccgc gcgtggtcgg catcggcact 1260

acccgagccg acgcgattcg gcgcggcgtc gaagcaacag ttcgcaggga aatgctttcc 1320

ggatcggggc tgacggagcc cgtgcagagc gtcctcggcg gtcggctagg cacattcgtc 1380

tccgacgtcg ctgaaggatc actggagttt ttcgcccacg atccattagc cggccaacac 1440

gtggcgatcg cgtgctgcga tgagtacagg gcggtgggcg ctggaagcag ccaggaagag 1500

gcgcaggcgc gcgcggcgat cgaaattctc gggcggcgcc aggtgggcct cgtcgatacg 1560

ggtgatgccc aacccatcgg cggagaggta gtactctcaa ccgcccgcat cgggcagtgg 1620

cacgtggcgg ttgtcgctcc ggctggctct cgggcgtgcg ttgacgattc agctctcgag 1680

gctgtgcgat ga 1692

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accatctggg tggagaaagt g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tggcggaaat gaactcgtaa t 21

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatggcacca gcacagg 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggagcacggc gactatg 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcccgaatcc gactatga 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tcgctgccaa ctactaaaa 19

Claims (10)

1.一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，其特征在于，所述方法为先获取全部或部分已测序的长双歧杆菌菌株的基因组，然后对获取得到的基因组进行基因存在缺失分析，得到长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因，在对得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因进行特异性验证，验证成功的基因即为可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因。

2.如权利要求1所述的一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，其特征在于，所述方法为先获取全部或部分已测序的长双歧杆菌菌株的基因组，然后对获取得到的基因组进行基因存在缺失分析，得到长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因，再以获取的长双歧杆菌菌株的基因组构建数据库，采用BlastN比对，验证得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因在核苷酸水平上的特异性，随后基于NR/NT库，通过Blast检索，验证得到的长双歧杆菌种内仅在某一株菌中出现的基因在其它种属微生物背景下的特异性，验证成功的基因即为可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性基因。

3.如权利要求1或2所述的一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，其特征在于，所述基因存在缺失分析使用Roary软件、Pan-Seq软件、PGAT软件或PGAP软件完成。

4.如权利要求1-3任一项所述的一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性基因的方法，其特征在于，所述长双歧杆菌菌株为长双歧杆菌RG4-1、长双歧杆菌M1-20-R01-3以及长双歧杆菌FGSZY6M4。

5.一种获得可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物的方法，其特征在于，所述方法为先使用权利要求1-4任一项所述的方法获取可用于筛选和/或鉴定某一长双歧杆菌菌株的特异性基因，然后根据获取得到的特异性基因设计可用于扩增此特异性基因的引物，此引物即为可用于筛选和/或鉴定这一长双歧杆菌菌株的特异性引物。

6.可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段为使用权利要求1-4任一项所述的方法得到的可用于筛选和/或鉴定某一长双歧杆菌菌株的特异性基因和/或使用权利要求5所述的方法得到的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物。

7.权利要求1-4任一项所述的方法或权利要求5所述的方法或权利要求6所述的DNA片段在筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株中的应用。

8.一种鉴定长双歧杆菌菌株的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求5所述的方法得到的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物对待鉴定菌株进行PCR扩增，若能扩增出基因片段，则待鉴定菌株为与使用权利要求所述的方法得到的可用于筛选和/或鉴定长双歧杆菌菌株的特异性引物相对应的长双歧杆菌菌株。

9.权利要求1-4任一项所述的方法或权利要求5所述的方法或权利要求6所述的DNA片段在对长双歧杆菌菌株进行绝对定量中的应用。

10.一种对样本中长双歧杆菌菌株进行绝对定量的方法，其特征在于，所述方法为分离样本中某一长双歧杆菌菌株的单菌落；使用权利要求5所述的方法得到可用于筛选和/或鉴定该长双歧杆菌菌株的特异性引物；培养该长双歧杆菌菌株，得到该长双歧杆菌菌株的菌液；将该长双歧杆菌菌株的菌液梯度稀释后，使用权利要求5所述的方法得到的可用于筛选和/或鉴定该长双歧杆菌菌株的特异性引物，通过qPCR方法绘制以活菌数对数值为横坐标、以Cq值为纵坐标的该长双歧杆菌菌株的绝对定量标准曲线；使用权利要求5所述的方法得到可用于筛选和/或鉴定该长双歧杆菌菌株的特异性引物，通过qPCR方法获得样本的Cq值，将获得的Cq值代入该长双歧杆菌菌株的绝对定量标准曲线，即可获得样本中该长双歧杆菌菌株的含量。

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