CN109971871A

CN109971871A - 一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法及其应用

Info

Publication number: CN109971871A
Application number: CN201910237954.7A
Authority: CN
Inventors: 陆文伟; 陈卫; 翟齐啸; 潘明罗; 谢妙琦; 崔树茂; 赵建新; 张灏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2019-07-05

Abstract

本发明公开了一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法及其应用，属于微生物技术领域。与传统的16S rRNA方法相比，本发明的方法基于乳杆菌groEL基因的特异性引物，因此，本发明的方法可以将菌株鉴定至乳杆菌种和亚种水平，分辨率和准确性更高，其中，准确性可高达100％；利用本发明的方法，配合16S rRNAV3‑V4区物种多样性分析方法，可以准确的测定出复杂样品中乳杆菌各个种及亚种的数量占复杂样品中总乳杆菌数量的百分比以及复杂样品中乳杆菌各个种及亚种的数量占复杂样品中总细菌数量的百分比，准确性高达100％。

Description

一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法及其应用，属于微生物技术领域。

背景技术

乳杆菌作为存在于人和其它一些动物肠道内的重要益生菌，不仅能抑制肠道中致病菌的生长进而调节和改善肠道菌群，还具有改善乳糖不耐症、降低血清胆固醇、促进免疫和抗氧化等重要益生作用。此外，也有大量国内外微生态学研究表明，乳杆菌具有抑菌、防癌、补充营养等多种功效。因此，乳杆菌在食品、医药等领域均具有很重要的应用，备受工业界和学术界专家学者的关注。

随着乳杆菌在各领域的应用越来越广泛和深入，其新菌株的研究和开发也越发重要，而菌种鉴定是开发新菌株过程中的不可缺少的一环，有时，甚至需要菌种鉴定结果精确至种及亚种的水平。但是，由于细菌传统的鉴定方法主要是依据其形态学及生理生化等特性进行的，而乳杆菌形态多变、兼性厌氧且对营养的要求较为复杂，采用糖发酵等方法往往无法将性状相近的乳杆菌菌种区分至种的水平，因此，迄今为止，国际国内却尚无统一的可将乳杆菌菌株准确鉴定至种水平的方法。

幸运的是，随着近年来分子生物学的发展，采用分子生物学方法对乳杆菌进行属、种水平鉴定已有较大进展。目前，应用最广泛的是以16S rRNA基因为基础的高通量测序技术，此技术具有简便和快速的特点，为肠道中乳杆菌的检测提供了可能。

然而，16S rRNA基因在区分不同种乳杆菌方面还存在分辨率较低的局限性，因此，使用该方法还不能满足乳杆菌种及亚种水平的检测。这在一定程度上限制了对乳杆菌的进一步研究和开发，进而影响了乳杆菌的工业应用。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种分辨率更高的乳杆菌鉴定方法。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的特异性基因库，其特征在于，所述基因库包含一种或一种以上的乳杆菌groEL基因的核苷酸序列；

或者，所述数据库包含可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列；

或者，所述数据库同时包含一种或一种以上的乳杆菌groEL基因的核苷酸序列以及可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列。

在本发明的一种实施方式中，所述乳杆菌groEL基因片段的大小为400～600bp。

在本发明的一种实施方式中，所述乳杆菌groEL基因的核苷酸序列包含SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10。

在本发明的一种实施方式中，所述可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列包含序列SEQ ID NO:11以及SEQ ID NO:12。

本发明还提供了一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法，其特征在于，所述方法为使用上述一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的特异性基因库，先提取需筛选或鉴定样品的基因组DNA，然后将获得的基因组DNA用可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列进行扩增，再将扩增结果回收后测序，最后将测序结果与特异性基因库中的乳杆菌groEL基因的核苷酸序列进行比对，若需筛选或鉴定样品中有菌的测序结果与特异性基因库中某一乳杆菌的groEL基因的相似度为100％，即可判断此菌与所述某一乳杆菌属于同一个种或亚种。

本发明还提供了一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的试剂盒，所述试剂盒包含可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列。

本发明还提供了上述一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的特异性基因库或上述一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法或上述一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的试剂盒在筛选和/或鉴定乳杆菌方面的应用。

[有益效果]

(1)与传统的16S rRNA方法相比，本发明的方法基于乳杆菌groEL基因的特异性引物，因此，本发明的方法可以将菌株鉴定至乳杆菌种和亚种水平，分辨率和准确性更高，其中，准确性可高达100％；

(2)利用本发明的方法，配合16S rRNA V3-V4区物种多样性分析方法，可以准确的测定出复杂样品中乳杆菌各个种及亚种的数量占复杂样品中总乳杆菌数量的百分比以及复杂样品中乳杆菌各个种及亚种的数量占复杂样品中总细菌数量的百分比，准确性高达100％；

(3)利用本发明的方法可实现菌株的高通量鉴定，批量处理菌株信息，无需分离纯化即可全面鉴定复杂样品中乳杆菌的种及亚种的组成以及复杂样品中各个乳杆菌在种水平的含量，对复杂样品中乳杆菌的筛选具有指导意义。

附图说明

图1：以乳杆菌groEL基因为基础的乳杆菌系统发育树。

图2：实施例2中一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法的准确性。

图3：实施例3中人粪便样品基因组DNA进行PCR扩增后得到的扩增产物的电泳检测结果；其中，M代表Marker，C代表空白对照，H1～H6分别表示6个不同人的粪便样品。

图4：实施例3中人粪便样品中乳杆菌的种及亚种的组成的检测结果；其中，H1～H6分别表示6个不同人的粪便样品。

图5：实施例5中大鼠粪便样品基因组DNA进行PCR扩增后得到的扩增产物的电泳检测结果；其中，M代表Marker，C代表空白对照，R1～R6分别表示6个不同大鼠的粪便样品。

图6：实施例5中大鼠粪便样品中乳杆菌的种及亚种的组成的检测结果；其中，R1～R6分别表示6个不同大鼠的粪便样品。

图7：实施例7中小鼠粪便样品中乳杆菌的种及亚种的组成的检测结果；其中，r1～r6分别表示6个不同小鼠的粪便样品。

图8：实施例9中乳扇样品中乳杆菌的种及亚种的组成的检测结果；其中，m1～m6分别表示6个不同乳扇样品。

图9：实施例11中10株乳杆菌和3株非乳杆菌基因组DNA进行PCR扩增后得到的扩增产物的电泳检测结果；其中，M代表Marker，1-13分别为嗜热链球菌、大肠杆菌、卵形拟杆菌、保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌。

图10：以乳杆菌16S rRNA基因的V3-V4区为基础的乳杆菌系统发育树。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1：一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法的构建

具体步骤如下：

(1)从NCBI(National Center for Biotechnology Information)和EMBL(European Molecular Biology Laboratory)等基因数据库获取乳杆菌groEL基因的核苷酸序列(共118条)，通过MEGA软件构建系统发育树(如图1所示)，由图1可知，乳杆菌groEL基因可以很好的将不同种的乳杆菌进行区分，因此，该基因可用于不同种乳杆菌的鉴定和检测；

(2)从NCBI(National Center for Biotechnology Information)和EMBL(European Molecular Biology Laboratory)等基因数据库下载所有已知的乳杆菌groEL基因的核苷酸序列(共118条，包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)，利用所下载序列构建乳杆菌groEL基因比对数据库；

(3)对乳杆菌groEL基因的保守序列和特异序列进行充分分析后，选取特定序列设计引物，并在这些引物对中挑选适合Illumina Miseq测序平台读长的引物对，最终确定以核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的正向引物：GCYGGTGCWAACCCNGTTGG和核苷酸序列如SEQID NO.12所示的反向引物：AANGTNCCVCGVATCTTGTT作为最终的测序引物，其中，Y代表碱基C或T，W代表碱基A或T，V代表碱基A、C或G，N代表碱基A、C、G或T；

(4)利用NCBI数据库中的PRIMER-BLAST功能，针对NCBI数据库中所有细菌的基因序列，以所设计的测序引物为PCR引物，通过电脑模拟PCR的方法验证此测序引物是否适用于目前所有已知种属的乳杆菌，结果证明，利用该引物进行PCR扩增时乳杆菌所有物种都可以扩增出目的条带，而非乳杆菌在相应位置基本都无相应产物扩增，因此，此测序引物可确保后续扩增的效率及鉴定的准确性；

(5)结合(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库以及(3)得到的测序引物构建得到一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法，包含如下步骤：

步骤一：提取需筛选或鉴定样品的微生物基因组DNA(美国MP Biomedicals公司的DNA提取试剂盒进行)，以(3)得到的测序引物为PCR引物，将提取得到的微生物基因组DNA进行PCR扩增，收集扩增产物，采用胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，得到大小在400～600bp左右的基因片段(若没有得到大小在400～600bp左右的基因片段，则可确定需筛选或鉴定样品中无乳杆菌)；

步骤二：参照Illumina Miseq测序平台的操作说明，采用美国Thermo Fisher科技公司的Varioskan LUX多功能微孔板读数仪对纯化后的基因片段进行定量，并等量混样，用Illumina TruSeq DNALT Sample Preparation Kit试剂盒进行标准文库构建，并在IlluminaMiseq测序平台上对步骤一得到的大小在400～600bp左右的基因片段进行高通量上机测序，将测序结果与(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库进行比对，若需筛选或鉴定样品中有菌的测序结果与(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库中的某一乳杆菌的groEL基因的相似度为100％，即可判断此菌与所述某一乳杆菌属于同一个种或亚种，根据比对结果，即可确定需筛选或鉴定样品中是否含有乳杆菌、需筛选或鉴定样品中含有的乳杆菌的种类以及需筛选或鉴定样品中含有的某种乳杆菌占总乳杆菌数量的百分比；

其中，步骤一的PCR扩增的反应体系组成为：微生物基因组DNA模板2μL、Ex taqmix 25μL、20μM的正向引物和反向引物分别1μL，加ddH₂O至50μL；该PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，然后以95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸60s为一个循环，进行35个循环，最后72℃延伸7min。

实施例2：一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法的验证

为验证实施例1得到的一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法的准确性，本实施例设计了如下实验：

将保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌共10种乳杆菌按照0.01：0.05：0.1：0.5：1：2：5：10：20：50的活菌比进行混合，得到需筛选或鉴定样品；按照实施例1得到的一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法对(1)得到的需筛选或鉴定样品进行检测，检测结果如图2。

由图2可知，利用实施例1得到的一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法得到的乳杆菌物种的含量与预先混入的乳杆菌物种含量具有很好的一致性，因此，实施例1的方法在检测乳杆菌的种上具有较高的准确性，并且，实施例1的方法适用于对复杂样品的groEL基因序列信息与所构建数据库中已知物种的groEL基因序列比对，从而得出复杂样品中不同种或亚种的乳杆菌。

实施例3：人粪便样品中不同种乳杆菌的检测

具体步骤如下：

步骤一：取6份人粪便样品，提取人粪便样品中的微生物基因组DNA(美国MPBiomedicals公司的DNA提取试剂盒进行)，以核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的测序引物为PCR引物，将提取得到的微生物基因组DNA进行PCR扩增，收集扩增产物，采用QIAquick胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，得到大小在400～600bp左右的基因片段(基因片段的电泳结果见图3，此电泳以购自Thermo Fisher公司的10Kbp DNA ladder为Marker)；

步骤二：参照Illumina Miseq测序平台的操作说明，采用美国Thermo Fisher科技公司的Varioskan LUX多功能微孔板读数仪对纯化后的基因片段进行定量，并等量混样，用Illumina TruSeq DNALT Sample Preparation Kit试剂盒进行标准文库构建，并在IlluminaMiseq测序平台上对步骤一得到的大小在400～600bp左右的基因片段进行高通量上机测序，将测序结果与实施例1中步骤(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库进行比对，若人粪便样品中有菌的测序结果与实施例1中步骤(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库中的某一乳杆菌的groEL基因的相似度为100％，即可判断此菌与所述某一乳杆菌属于同一个种或亚种，根据比对结果，即可确定人粪便样品中是否含有乳杆菌、人粪便样品中含有的乳杆菌的种类以及人粪便样品中含有的某种乳杆菌占总乳杆菌数量的百分比(人粪便样品中乳杆菌种及亚种的组成结构见图4)；

其中，步骤一的PCR扩增的反应体系组成为：微生物基因组DNA模板2μL、Ex taqmix 25μL、20μM的正向引物和反向引物分别lμL，加ddH₂O至50μL；该PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，然后以95℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸60s为一个循环，进行35个循环，最后72℃延伸7min。

由图3可知，6份人粪便样品用乳杆菌groEL基因进行PCR扩增后，在500bp处有目的条带；由图4可知，在种水平上，人粪便样品中乳杆菌种类丰富，其中，相对丰度最高的是粘膜乳杆菌。

实施例4：人粪便样品中不同种乳杆菌的检测

具体步骤如下：

实施例4与实施例3的区别在于：PCR引物为乳杆菌16S rRNA V3-V4区通用引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.13：CCTAYGGGRBGCASCAG、SEQ ID NO.14：GGACTACNNGGGTATCTAAT所示，其中，R代表碱基A或G，Y代表碱基C或T，S代表碱基C或G，B代表碱基C、G或T，N代表碱基A、C、G或T)，扩增人粪便样品中所有微生物的V3-V4区，根据测序得到的V3-V4区数据与NCBI数据库进行比对，得到乳杆菌属占总细菌含量的百分比，具体结果如表1所示；将实施例3得到的人粪便样品中每种乳杆菌占乳杆菌总量的百分比乘以本实施例得到的人粪便样品中乳杆菌属的含量，得到每个乳杆菌种在人体粪便中的百分含量比，具体结果如表2所示。

由表1可知，人粪便样品中乳杆菌属占总细菌数的百分比较低，而且个体之间存在差异；由表2可知，人粪便样品中乳杆菌属占总细菌数的百分比普遍较低，其中，粘膜乳杆菌相对丰度最高。

表1人粪便样品中乳杆菌属占总细菌百分含量

样品	乳杆菌属占细菌百分含量	样品	乳杆菌属占细菌百分含量
				H1	0.33％	H4	7.29％
H2	2.63％	H5	0.03％
				H3	0.71％	H6	2.38％

表2人粪便样品中不同种乳杆菌占总细菌百分含量

H1

H2

H3

H4

H5

H6

Lactobacillus mucosae

0.21％

1.67％

0.46％

6.30％

0.02％

1.47％

Lactobacillus gasseri

0.03％

0.23％

0.01％

0.19％

0.01％

0.29％

Lactobacillus salivarius

0.02％

0.21％

0.01％

0.36％

0.01％

0.24％

Lactobacillus oris

0.02％

0.16％

0.13％

0.16％

0.00％

0.06％

Lactobacillus rhamnosus

0.01％

0.10％

0.03％

0.01％

0.00％

0.05％

Lactobacillus amylovorus

0.01％

0.08％

0.01％

0.02％

0.00％

0.08％

Lactobacillus plantarum

0.01％

0.04％

0.02％

0.00％

0.07％

Lactobacillus vaginalis

0.01％

0.06％

0.01％

0.03％

0.00％

0.08％

Lactobacillus casei

0.01％

0.02％

0.01％

0.00％

0.03％

Lactobacillus crispatus

0.004％

0.038％

0.010％

0.130％

0.000％

0.009％

Lactobacillus pontis

0.001％

0.008％

0.003％

0.000％

0.005％

Lactobacillus fermentum

0.001％

0.004％

0.003％

0.001％

0.000％

0.003％

实施例5：大鼠粪便样品中不同种乳杆菌的检测

具体步骤如下：

步骤一：取6份大鼠粪便样品，提取大鼠粪便样品中的微生物基因组DNA(美国MPBiomedicals公司的DNA提取试剂盒进行)，以核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的测序引物为PCR引物，将提取得到的微生物基因组DNA进行PCR扩增，收集扩增产物，采用QIAquick胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，得到大小在400～600bp左右的基因片段(基因片段的电泳结果见图5，此电泳以购自Thermo Fisher公司的10Kbp DNA ladder为Marker)；

步骤二：参照Illumina Miseq测序平台的操作说明，采用美国Thermo Fisher科技公司的Varioskan LUX多功能微孔板读数仪对纯化后的基因片段进行定量，并等量混样，用Illumina TruSeq DNALT Sample Preparation Kit试剂盒进行标准文库构建，并在IlluminaMiseq测序平台上对步骤一得到的大小在400～600bp左右的基因片段进行高通量上机测序，将测序结果与实施例1中步骤(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库进行比对，若大鼠粪便样品中有菌的测序结果与实施例1中步骤(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库中的某一乳杆菌的groEL基因的相似度为100％，即可判断此菌与所述某一乳杆菌属于同一个种或亚种，根据比对结果，即可确定大鼠粪便样品中是否含有乳杆菌、大鼠粪便样品中含有的乳杆菌的种类以及大鼠粪便样品中含有的某种乳杆菌占总乳杆菌数量的百分比(大鼠粪便样品中乳杆菌种及亚种的组成结构见图6)；

由图5可知，6份大鼠粪便样品用乳杆groEL基因进行PCR扩增后，在500bp处有目的条带；由图6可知，在种水平上，大鼠粪便样品中相对丰度最高的是约氏乳杆菌和肠乳杆菌。

实施例6：大鼠粪便样品中不同种乳杆菌的检测

具体步骤如下：

实施例6与实施例5的区别在于：PCR引物为乳杆菌16S rRNA V3-V4区通用引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示)，扩增大鼠粪便样品中所有微生物的V3-V4区，根据测序得到的V3-V4区数据与NCBI数据库进行比对，得到乳杆菌属占总细菌含量的百分比，具体结果如表3所示；将实施例5得到的大鼠粪便样品中每种乳杆菌占乳杆菌总量的百分比乘以本实施例得到的大鼠粪便样品中乳杆菌属的含量，得到每个乳杆菌种在大鼠粪便中的百分含量比，具体结果如表4所示。

由表3可知，大鼠粪便样品中乳杆菌属占总细菌百分含量较高，但个体之间存在差异；由表4可知，大鼠粪便样品中乳杆菌属占总细菌数的百分比普遍较高，其中，约氏乳杆菌和肠乳杆菌相对丰度最高。

表3大鼠粪便样品中乳杆菌属占总细菌百分含量

样品	乳杆菌属占细菌百分含量	样品	乳杆菌属占细菌百分含量
				R1	15.71％	R4	8.61％
R2	9.12％	R5	10.31％
				R3	8.91％	R6	15.51％

表4大鼠粪便样品中不同种乳杆菌占总细菌百分含量(％)

R1

R2

R3

R4

R5

R6

Lactobacillus johnsonii

2.29％

6.59％

4.27％

2.94％

7.18％

0.57％

Lactobacillus intestinalis

1.55％

1.53％

2.42％

2.68％

0.76％

12.07％

Lactobacillus reuteri

1.29％

0.27％

0.88％

2.53％

0.32％

0.94％

Lactobacillus fermentum

4.40％

0.00％

Lactobacillus oris

0.01％

0.21％

0.00％

0.16％

0.04％

Lactobacillus sp.L6

0.01％

0.04％

0.01％

0.30％

0.02％

Lactobacillus animalis

0.10％

0.02％

0.01％

0.07％

0.25％

Lactobacillus plantarum

0.05％

0.00％

0.30％

0.00％

Lactobacillus murinus

0.13％

0.01％

0.04％

实施例7：小鼠粪便样品中不同种乳杆菌的检测

具体步骤如下：

步骤一：取6份小鼠粪便样品，提取小鼠粪便样品中的微生物基因组DNA(美国MPBiomedicals公司的DNA提取试剂盒进行)，以核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的测序引物为PCR引物，将提取得到的微生物基因组DNA进行PCR扩增，收集扩增产物，采用QIAquick胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，得到大小在400～600bp左右的基因片段；

步骤二：参照Illumina Miseq测序平台的操作说明，采用美国Thermo Fisher科技公司的Varioskan LUX多功能微孔板读数仪对纯化后的基因片段进行定量，并等量混样，用Illumina TruSeq DNALT Sample Preparation Kit试剂盒进行标准文库构建，并在IlluminaMiseq测序平台上对步骤一得到的大小在400～600bp左右的基因片段进行高通量上机测序，将测序结果与实施例1中步骤(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库进行比对，若小鼠粪便样品中有菌的测序结果与实施例1中步骤(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库中的某一乳杆菌的groEL基因的相似度为100％，即可判断此菌与所述某一乳杆菌属于同一个种或亚种，根据比对结果，即可确定小鼠粪便样品中是否含有乳杆菌、小鼠粪便样品中含有的乳杆菌的种类以及小鼠粪便样品中含有的某种乳杆菌占总乳杆菌数量的百分比(小鼠粪便样品中乳杆菌种及亚种的组成结构见图7)；

由图7可知，在种水平上，小鼠粪便样品中相对丰度最高的是约氏乳杆菌和sp.L6乳杆菌。

实施例8：小鼠粪便样品中不同种乳杆菌的检测

具体步骤如下：

实施例8与实施例7的区别在于：PCR引物为乳杆菌16S rRNA V3-V4区通用引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示)，扩增小鼠粪便样品中所有微生物的V3-V4区，根据测序得到的V3-V4区数据与NCBI数据库进行比对，得到乳杆菌属占总细菌含量的百分比，具体结果如表5所示；将实施例7得到的小鼠粪便样品中每种乳杆菌占乳杆菌总量的百分比乘以本实施例得到的小鼠粪便样品中乳杆菌属的含量，得到每个乳杆菌种在小鼠粪便中的百分含量比，具体结果如表6所示。

由表5可知，小鼠粪便样品中乳杆菌属占总细菌百分含量较高，但个体之间存在差异；由表6可知，小鼠粪便样品中乳杆菌属占总细菌数的百分比普遍较高，其中，约氏乳杆菌和sp.L6乳杆菌相对丰度最高。

表5小鼠粪便样品中乳杆菌属占总细菌百分含量

样品	乳杆菌属占细菌百分含量	样品	乳杆菌属占细菌百分含量
				r1	7.81％	r4	9.01％
r2	17.51％	r5	13.11％
				r3	11.61％	r6	24.21％

表6小鼠粪便样品中不同种乳杆菌占总细菌百分含量(％)

实施例9：乳扇样品中不同种乳杆菌的检测

具体步骤如下：

步骤一：取6份乳扇样品，提取乳扇样品中的微生物基因组DNA(美国MPBiomedicals公司的DNA提取试剂盒进行)，以核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的测序引物为PCR引物，将提取得到的微生物基因组DNA进行PCR扩增，收集扩增产物，采用QIAquick胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，得到大小在400～600bp左右的基因片段；

步骤二：参照Illumina Miseq测序平台的操作说明，采用美国Thermo Fisher科技公司的Varioskan LUX多功能微孔板读数仪对纯化后的基因片段进行定量，并等量混样，用Illumina TruSeq DNALT Sample Preparation Kit试剂盒进行标准文库构建，并在IlluminaMiseq测序平台上对步骤一得到的大小在400～600bp左右的基因片段进行高通量上机测序，将测序结果与实施例1中步骤(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库进行比对，若乳扇样品中有菌的测序结果与实施例1中步骤(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库中的某一乳杆菌的groEL基因的相似度为100％，即可判断此菌与所述某一乳杆菌属于同一个种或亚种，根据比对结果，即可确定乳扇样品中是否含有乳杆菌、乳扇样品中含有的乳杆菌的种类以及乳扇样品中含有的某种乳杆菌占总乳杆菌数量的百分比(乳扇样品中乳杆菌种及亚种的组成结构见图8)；

由图8可知，在种水平上，乳扇样品中相对丰度最高的是淀粉乳杆菌和瑞士乳杆菌。

实施例10：乳扇样品中不同种乳杆菌的检测

具体步骤如下：

实施例10与实施例9的区别在于：PCR引物为乳杆菌16S rRNA V3-V4区通用引物(核苷酸序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示)，扩增乳扇样品中所有微生物的V3-V4区，根据测序得到的V3-V4区数据与NCBI数据库进行比对，得到乳杆菌属占总细菌含量的百分比，具体结果如表7所示；将实施例7得到的乳扇样品中每种乳杆菌占乳杆菌总量的百分比乘以本实施例得到的乳扇样品中乳杆菌属的含量，得到每个乳杆菌种在乳扇中的百分含量比，具体结果如表8所示。

由表7可知，乳扇样品中乳杆菌属占总细菌百分含量高，样品之间存在一定差异；由表8可知，乳扇样品中乳杆菌属占总细菌数的百分比普遍较高，其中，淀粉乳杆菌和瑞士乳杆菌的相对丰度最高。

表7乳扇样品中乳杆菌属占总细菌百分含量

样品	乳杆菌属占细菌百分含量	样品	乳杆菌属占细菌百分含量
				m1	97.42％	m4	65.53％
m2	64.53％	m5	76.77％
				m3	63.93％	m6	83.59％

表8乳扇样品中不同种乳杆菌占总细菌百分含量(％)

实施例11：不同菌株的检测

具体步骤如下：

步骤一：取嗜热链球菌、大肠杆菌、卵形拟杆菌、保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌，提取上述菌株的基因组DNA(美国MP Biomedicals公司的DNA提取试剂盒进行)，以核苷酸序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示的测序引物为PCR引物，将提取得到的微生物基因组DNA进行PCR扩增，收集扩增产物，采用QIAquick胶回收试剂盒对扩增产物进行纯化，得到大小在400～600bp左右的基因片段，基因片段的电泳结果见图9，此电泳以购自Thermo Fisher公司的10Kbp DNA ladder为Marker，其中，嗜热链球菌、大肠杆菌、卵形拟杆菌无法扩增出目的条带，保加利亚乳杆菌、发酵乳杆菌、干酪乳杆菌、格氏乳杆菌、卷曲乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌均扩增出大小约500bp的目的条带；

步骤二：参照Illumina Miseq测序平台的操作说明，采用美国Thermo Fisher科技公司的Varioskan LUX多功能微孔板读数仪对纯化后的基因片段进行定量，并等量混样，用Illumina TruSeq DNALT Sample Preparation Kit试剂盒进行标准文库构建，并在IlluminaMiseq测序平台上对步骤一得到的大小在400～600bp左右的基因片段进行高通量上机测序，将测序结果与实施例1中步骤(2)得到的乳杆菌groEL基因比对数据库进行比对，比对结果与初始选定的菌株种属分类的信息一致；

由本实施例可知，本实施例的方法能够有效地将乳杆菌属的菌株与其它属的菌株区分，测序后的比对结果能够100％鉴定乳杆菌的亚种。

对比例1：现有的筛选和/或鉴定乳杆菌的方法的验证

具体步骤如下：

(1)参照实施例1，分别利用NCBI和EMBL数据库下载乳杆菌不同菌株16S rRNA基因序列，通过MEGA软件利用neighbor-joining距离算法构建构建清酒乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、约氏乳杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌和鼠李糖乳杆菌等已知的乳杆菌系统发育树(如图10所示)。

由图10可以看出，16Sr RNA基因的V3-V4区鉴定分类结果不够准确，无法区分某些种和亚种，约氏乳杆菌、格氏乳杆菌无法有效区分，德氏乳杆菌保加利亚亚种和德氏乳杆菌乳亚种无法分开，分辨率较低。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法及其应用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcaaaag atattaaatt tgctgaagac gcacggagcg caatgcttgc cggtgttgat 60

aagttagctg acactgttaa gaccaccatg ggtccaaagg gtcggaacgt tgttttaggt 120

caaaagtacg gtaacccaaa cattactaac gatggtgtta cgattgccaa ggacattgaa 180

ttagaagacc catttgaaaa tatgggtgct aagttggttg ccgaagttgc ttccaagacc 240

aacgacattg ccggtgatgg gaccaccact gccactgttt tgacccaagc aattgttaac 300

gccggaatga agaacgttac ttctggtgct aacccggttg gcattcgtcg ggggattgaa 360

aaggccacgg cagttgctgt taaagcattg aagaagatgt cacacgacgt taagaccaag 420

agtgatatcg aacaaattgc ttctatttca gctgctaacc ctgaagttgg taagttgatt 480

gccgacgcta tggaaaaggt tggtcacgat ggtgttatca ccattgaaga ctcccgtggt 540

gttgacacga gcgttaacgt tgttgaagga atgagcttcg atcgtggtta catgtctcaa 600

tacatggtaa ccgacaatga caagatggaa gctgatctgg acaacccata catcctgatt 660

actgacaaga agatcagtaa cattcaagac atcttgccat tactgcaaag tgttgttcaa 720

caaggtcggg cactgttgat tattgccgat gacattactg gtgaagcact gccaaccctt 780

gtcttgaaca agattcgtgg taccttcaac gtatgtgccg ttaaggctcc tggttttggt 840

gaccggcgga aggctcaatt acaagatatt gccgtattga ccggtggtac tgttatctcc 900

gatgatttgg gcatgaacct gaaggatgtt acaattgatc aattaggaca agctaacaag 960

gttacggtta ctaaagacgc tactaccatt gttgatggtg ccggcgcaag ggaagccatt 1020

gctgaacggg ttgaccaaat caagcaagcc attgccaaga ccacttctga cttcgacaag 1080

gacaagctcc aagaacgttt ggcaaagctt tccggtggtg ttgccgttgt taaggtcggt 1140

gctgctactg aaaccgaact gaaggaaaag aagtaccgtg ttgaagacgc cctgaacgct 1200

acccgggctg ccgttgaaga aggattcgtt cctggtggtg gtacggcctt agtaaacgtc 1260

atttctgctc tggaaaagat caacgcaact ggggacgaat taactggtgt caagatcgta 1320

acttctgctt tggaagcacc tgttcgtcaa atcgctgaaa atgccggggt tgaaggttct 1380

gttattgtaa acgaactgaa gggccaagac gacggtattg gttacaacgc tgctgatggc 1440

aagttcgaag acatggttaa ggccggaatc gttgacccaa caatggttac ccgttctgcc 1500

ttgcaaaacg ccgcttctgt atccgcactc ctgctgacca cggaagccgt tgttgctgac 1560

aagccagaag caaacgacaa gccacaagca cctgcacaac caggcccagc tatgatgtaa 1620

<210> 2

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcaaaag atattaaatt tgatgaaaaa gcaagacgct cacttttaaa gggtgttgat 60

aagttagctg acactgttaa gactacatta ggacctaagg gtcgcaacgt tgttcttgaa 120

aagagctacg gtgcaccaga aattactaat gacggtgtaa ctattgcgaa ggcaattgaa 180

cttaaggacc acttcgaaaa catgggtgct aagcttgtta gcgaagttgc tcaaaagact 240

aacgatattg ctggtgacgg tactactact gctactgttt taactcaagc tatcgttaac 300

gaaggtatga agaacgtaac tgctggtgct aacccagttg gtattcgtcg cgggattgaa 360

aaggcaacta aggctgctgt tgatgaatta cacaagatta gccacaaggt ttctggtcgt 420

gatgaaattg cccaagtagc tagcgtatca agtgcttcag aagaagtagg taacttgatt 480

gctgacgcta tggaaaaggt tggtcacgat ggtgttatct caattgaaga atcaaagggt 540

gttaacactg aactttcagt agttgaaggg atgcaatttg accgtggtta cctttcacaa 600

tacatggtaa ctgacaacga caagatggaa gcagaccttg ataacccata catcttgatt 660

actgataaga agatttctaa cattcaagat atcttgccat tacttcaaga aatcgtacaa 720

caaggtaagt cattacttat cattgctgat gatgttgaag gtgaagcttt accaactctt 780

gttttgaaca agattcgtgg tactttcaac gttgttgctg ttaaggctcc tggctttggt 840

gaccgtcgta aggctcaatt acaagatatt gctgctttaa ctggtggtac tgtaattacc 900

gaagacttag gcttagaact taaggacact aagattgatc aattaggtca agctggtaag 960

gtaactgtaa ctaaggactc aactactatt gttgaaggtg ctggtactaa ggaagctatt 1020

gctgaaagag ttgactcaat tagaaaagaa attgaaaact caactagtga ctttgacaaa 1080

gaaaagttac aagaacgtct tgctaaactt gctggtggtg ttgccgtaat caaggttggt 1140

gctgctactg aaactgaatt gaaggaacgt aagtacagaa tcgaagatgc cttgaactca 1200

actcgtgccg cagttgaaga aggttacgtt gctggtggtg gtactgcctt agtagacgtt 1260

aagaaggcta tcactaagct tactagcgac aatgaagatg aacaaactgg tattaacatc 1320

gttttacgtg cacttagcgc accagttcgt caaatcgctg aaaatgctgg taaagatggc 1380

tcagttatct tagaccactt aatgagtgct gatccagaag ttggttacaa cgctgcaact 1440

gacaagtggg aaaacatggt taaggccgga attatcgacc caaccaaggt aactcgttca 1500

gctttgcaaa atgctgcatc aatcgctgca ttactcttaa ctactgaagc tgtagttgct 1560

gaaattccag aagaaaagcc agctgcacct gctaacccag ctgcaggtat gggcggcatg 1620

atgtaa 1626

<210> 3

<211> 1623

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggctaaag aattaaaatt ttctgaagac gcccggagca agatgcttgc cggtgttgat 60

aagttagctg atacggttaa gactaccctt ggacctaagg gacgtaacgt cgttttggaa 120

caaagctacg gcaacccaac catcacgaat gatggtgtca cgattgctaa gtccatcgaa 180

cttgaagatc acttcgaaaa catgggtgct aagttggttt ccgaagttgc ttccaagacc 240

aacgacatcg ctggtgatgg gacgaccact gccactgttt tgacgcaagc tatcgttaac 300

gaaggtatga agaacgtgac tgccggtgct aaccctgttg gtatccgtcg cgggatcgaa 360

aaggctacga aggccgccgt tgatgggtta cacaagatgt cccatgacgt taagaccaag 420

gacgatatcg cccaaatcgc ttcaatttca tctgctagcc aagacaccgg taagttgatt 480

gccgatgcta tggaaaaggt tggtaacgat ggggttatca cgattgaaga atctcgtggt 540

gttgatacca gcttagacgt tgttgaaggg atgcaattcg atcgtggcta catgtcacaa 600

tacatggtta ccgacaacga caagatggaa gctaacttgg acaaccctta catcttgatc 660

actgacaaga agattgctaa cattcaagac attttgccat tgctgcaatc cgttgttgaa 720

caaagccgtt cactcttgat cattgccgat gacatcactg gtgaagcctt acctaccttg 780

gttttgaaca agatgcgtgg gacctttaac gttgttgctg tcaaggctcc tggctttggt 840

gaccgtcgta aggctacctt gcaagatatc gccgttctga ctggtgggac tgtcatcacc 900

gatgacttag gtcttaactt gaaggacacg acgatcgatc aattgggtca agcacaaaag 960

gtcaacgtta ccaaggacaa caccacggtc gttgaaggtg ctggtgccaa ggatcaaatc 1020

gctgcccggg ttgctgaaat caagggccaa atcgaagaaa cgacttctga cttcgaccgt 1080

gacaagttga aggaacgtct ggctaagtta gccggcgggg ttgccgttgt tcgtgtcggt 1140

gccgcaactg aaactgaatt aaaggaacgt aaataccgca ttgaagatgc tttgaacgca 1200

acgcgtgccg ctgttgaaga gggcttcgtt gctggtggtg ggactgcttt gatcaacgtc 1260

atcaaggacg ttgccaaggt tgaagctgaa ggcgacgaat tgacgggtgt taacatcgtt 1320

ctccgtgctt tggaagaacc tgttcgtcaa atcgctgaaa acgccggtgt cgaaggctcc 1380

gttgttgttg aacacctgaa gggtgaaaag gaaggcattg gttacaacgc cgccgacaac 1440

aactacgaag acatggttaa ggccggtatc accgacccaa ccaaggttac ccgttctgct 1500

ctgcaaaacg ctgcatccgt ttccgctctg ttgttaacga ctgaagccgt tgtggctgac 1560

aagccagaag acaacccagc accagcagct cctgctaacc caggtatggg cggcatgatg 1620

taa 1623

<210> 4

<211> 1614

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atggctaagg aagttaaatt ctcagaagac gcaagacgtt caatgctaag aggtgttgat 60

aaacttgcaa acactgttaa gactacatta ggaccaaagg gtagaaacgt tgttgttgaa 120

caatcaacag gtacaccaaa cattactaat gatggtgtta caatcgctaa gtcaatcgaa 180

ctaccaaatc attttgaaaa catgggtgct aagttagtat cagaagttgc atcaaagact 240

gacgacattg ccggtgatgg tactactact gctactgtat taactcaagc aatcgtaaac 300

gaaggaatga agaacgttac tgccggtgcc aacccagttg gtgttcgtcg cggtatcgaa 360

aaggcaaccg aagtagccgt tgaaaagcta cacaagatgt caaacgaaat caagagcaag 420

aatgatattg ctcaaatcgc ttcaatttca gctgctaacc cagaagttgg tgaattaatc 480

gccgatgcta tggaaaaggt tggaaacgat ggtgttatca ctgttgaaga ttcacgtggt 540

gttaatacaa ctatggatgt tgtagaaggt atgcaatttg atcgtggtta catgtcacaa 600

tacatggtta ccgacaacga taagatgcaa gctgacttag acaacccata catcttagtt 660

actgacaaga agattaacaa cattcaagaa atcctaccag tactacaatc agttgttgaa 720

caaggtcgtt cacttctaat cattgccgat gatattggtg gtgaagcact accaacattg 780

gtattaaaca agatgcgtgg tactttcaac gttgttgctg ttaaggctcc tggttttggt 840

gaccgtcgta aggctcaact acaagatatt tcagttctta caggcgctac tttaatcact 900

gacgacctag gattaaacct aaaggatgta accattgatc aattaggtca agctaacaag 960

gttaacgtta ctaaggatga cactacaatt gttcaaggtg ccggtgacaa ggaccaactt 1020

gctgcacgtg ttgcagaaat caagaaccaa ctagaaacta ctacatcaga attcgacaaa 1080

gaaaagctac gtgaacgttt agctaagtta gccggtggtg ttgccgttat ccgtgttggt 1140

gcagctaccg aaactgaact aaaagaacgt aagtacagaa ttgaagatgc attgaactca 1200

actagagccg ctgttgaaga aggcttcgtt cctggtggtg gaactgcatt catcaacatc 1260

ctaaaggatt tagaagaaat tcctgctgaa ggtgacgaaa agactggtgt aaacatcgtt 1320

ttacgtgctc tagaagctcc agttagacaa atcgcccaca acgccggaat tgatggttca 1380

atcgttgttg aacatctaaa gggtaaagaa atgggtattg gtttcaatgc cgctactggt 1440

gaatacgaag acatggttaa ggctggagtt gttgacccaa ccaaggtatc aagatctgct 1500

cttcaaaacg ccgcatctgt ttcagcattg ctattaacta ctgaagctgt tgttgctaac 1560

ttaccagaag aaaagaaaga tccaatgaac ccttcaatgg gaccaatgat gtaa 1614

<210> 5

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggcaaaag aacttaaatt ttcagaagac gcacgttcaa aaatgttggc aggggttgac 60

caattagcca acacagtgaa aacaacatta ggaccaaaag gccggaacgt tgttttggaa 120

aaagcttacg gttcaccaga aattactaat gatggtgtga caatcgctaa agcaatcgaa 180

ttagaagatc attttgaaaa tatgggtgct aagttagttt ctgaagtggc ttcaaaaacg 240

aatgacatcg ctggtgatgg gacaactact gctactgttt tagctcaagc aattattcgt 300

gaagggatga agaacgtcac agccggcgct aacccagttg ggattcgtcg tgggattgaa 360

ttagcaacta aagaagctgt taagaagtta cacgaaattt cacacaaagt cgaaagtaaa 420

gatgccattg cccaagtggc tgctgtttca tcagctaacg aagaaactgg tcgtttaatt 480

gctgatgcaa tggaaaaagt tggcaacgat ggggtcatca cagttgaaga atcaaaaggg 540

attgatactg aattaagcgt tgttgaaggg atgcaattcg atcgtggtta cttgtcacaa 600

tacatggtaa cggataacga taagatggaa gctgacctag ataacccata tatcttaatt 660

acagataaaa agatttcaaa tattcaagat gttttaccac ttttacaatc aatcgtgcaa 720

gaaggtaaag ccttgttaat catcgctgat gatgttgatg gcgaagcatt accaacactt 780

gtcttgaaca agattcgtgg gacattcaac gtggttgctg taaaagcccc tggttttggt 840

gatcgtcgta aggaacaatt agaagatatc gccacattaa caggtgccac agtgattaca 900

agtgacctcg gtctagaatt gaaagaaaca actatcgatc aattagggac agctggtaag 960

gtaactgtta caaaagatga tacaacaatc gttgaaggtg ctggtagcaa agatgccatc 1020

gctgaacggg ttgaaaacat caagaaacaa attgctgaaa caacatcaga ctttgaccgt 1080

gaaaaattac aagaacgctt ggctaaatta gctggtggcg ttgcagtgat taaagtcggt 1140

gctgccacag aaacagaatt gaaagaacaa aaatatcgga ttgaagatgc tttgaacgca 1200

acgcgtgcag ctgttgaaga aggctacgtt gccggcggtg ggacagcatt aatcgatgtg 1260

atcgaaagtg ttgctgcgct taaagaagaa ggcgacgttc aaaccgggat taacattgtg 1320

cttcgtgcat tggaagaacc tgttcgtcaa atcgcaacca acgctggtct tgaaggctca 1380

gtaattgttg aaaaagttaa atcacaacca gttgaagtcg gctacaatgc agccaacggc 1440

aactgggaaa atatgattga agccggcatc ttagatccaa ctaaggtgac acgttcagca 1500

ttacaaaatg cagctagtgt ggctgcctta atgttaacaa ctgaagcagt ggttgctgac 1560

aaaccagaag acaacccagc accagcagca ggcatggacc catcagcaat gggcggtatg 1620

atgtaa 1626

<210> 6

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggctaagg atttaaagtt ttcagaagac gcccgcagcg caatgctagc tggtgttgat 60

aaattagcaa acactgttaa aacaacgctt ggacctaagg gtcgtaacgt tgtcttggaa 120

caaagctacg gttcaccaac cattacaaac gatggggtaa ccattgctaa ggccgttgaa 180

ctaagtgacc attttgaaaa tatgggtgct aagttagttg ctgaagttgc ttcaaagacg 240

aacgacatcg caggggatgg tacaacaacc gccactgtat taacacaatc tattgtcaac 300

gaaggtatga agaacgtcac agccggtgct aaccctgttg gtattcgtac tgggattgaa 360

aaagcaacgg ctgctgcagt tgatgcttta cacaagatga gccacgaagt taagacaaag 420

tccgatatcg ctcagattgc ttcaatttca gccgctgatc cagaagttgg taagttgatt 480

gctgacgcta tggaaaaggt tggtaacgat ggtgtcatca ccattgaaga atcaaaggga 540

atcgaaacga cttctgatgt tgttgaagga atgcaatttg accgtggtta catgagtcaa 600

tacatggtta ccgacaacga caaaatggaa gctgatttgg acaatcctta catcttaatc 660

actgacaaga agattgctaa catccaagat atcttgccat tactacaatc agttgttgaa 720

caaggccgtg ctttgttgat catcgctgac gacatcactg gtgaagcttt accaacgctt 780

gttttgaaca agatgcgggg aacctttaac gttgttgctg ttaaggcacc tggttttggt 840

gaccgtcgta aagcacaact tgaagatatc gctgctttaa ctggtgggac tgttgtgact 900

gatgaccttg gcttaaactt gaaggacaca actgttgaac agttaggtca agcaggtaag 960

gttaccatca ccaaagacaa cacaactatt gttgaaggtg caggagacaa ggcagttgtt 1020

gatgaacgcg ttgcgaacat caaggctgaa ttggacgcaa cgacttctga ctttgacaaa 1080

gaaaagttac aagaacgttt ggctaagtta tctggtggtg ttgcccggat caacgtcgga 1140

gccgctactg aaactgaatt aaaagaacgc cgttatcgga ttgaagatgc tttgaatgca 1200

acgcgtgccg ctgttgaaga aggcttcgta tctggtggtg gtactgcctt agtaaacgct 1260

gttgaagcag ttgctgcttt gaaagaagaa ggcgacgccc aaacagggat taacatcgtt 1320

ctacgtgctt tggaagaacc tgttcgtcag attgctgaaa acgctggtaa agaaggctca 1380

gtaatcgttg aaaagctcaa gtcacaaaaa ccaggtattg gttataacgc cgctgatgac 1440

acttgggttg atatggttga agctggaatc gtggatccaa ccaaggttac acgttcagca 1500

ttgcaaaacg ctgcttctgt ttcatcatta ttgttgacga ctgaagctgt tgttgctgaa 1560

gaacctaagc aagacaatgg tgctgacgct gctgcagccg cacaagctgc acaaatgggc 1620

ggcatgatgt ag 1632

<210> 7

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atggcaaaag aaattaaatt ttccgaagac gctcgcgcaa aattattagc cggtgttgat 60

aaattagcaa atacagttaa aactacttta ggacctaaag gccgcaatgt tattttagaa 120

caatcatttg gttcaccaac aagtacaaat gatggtgtga caattgctaa agcgattgaa 180

ttagaagatc attttgaaaa tatgggtgct aaattagtat ctgaagttgc tgctacaaca 240

aatgatgtag ctggtgacgg aacaacaaca gcgactgttt taacacaagc aatcgtgaac 300

gaaggtatga aaaatgttac agctggtgca aatccagttg ggattcgtcg tgggattgaa 360

attgctacac aaacagcagt tgatggctta catgaaatgg ctcatatggt tgaatcaaaa 420

agtgatattg cccaagttgc tgctatttct tctgctagca aagaagttgg tgaattaatc 480

gctgatgcta tggaaaaagt aggtaatgat ggtgttattt ccattgaaga atcaaaaagt 540

attgatacaa cattagacgt tgtggaaggt atgcaatttg atcgtggtta tttatcacaa 600

tatatggtaa ctgatagtga aaaaatggaa gctaacttag ataaaccata tattttagtg 660

acagataaga agatttcaaa tattcaagaa atgatgccaa tgttaaacga aattgtgcaa 720

caaggccgtt cattattaat tattgctgat gatgttgatg gtgaagcttt accaacatta 780

gtcttgaaca agatgcgcgg aacattcaat gtagttgcag ttaaggcacc aggctttggt 840

gatcgccgta aagcaatgtt acaagatatt gcaatcttaa caggtgctac agtaattaca 900

gaggatttag gtttacaatt gaagaataca acactaggtc aattaggtag tgctggtaaa 960

gttactgtta caaaagaaaa cacagtaatc gttgaaggtg ctggggataa acgtcgcatc 1020

gcagaacgtg ttgatcaatt gaaattacaa gttgctgaaa caacatctga ctttgatcgt 1080

gaaaaattac aagaacgttt agcaaagtta tcaggcggcg tggctgtcat taaagttggt 1140

gctgcaactg atacagaatt aaaagaacgt aaatatcgga ttgaagatgc cttaaatgct 1200

acacgtgcag ctgtagaaga aggttttgta ccaggtggtg ggacagcttt agttgatgta 1260

attgataaag ttgctgctat tgaagaaact ggtgatgtac aaacaggtgt taaaattgtt 1320

caacgtgcat tagaagaacc tgtacgtcaa attgcaatca atgcaggtcg tgaaggctct 1380

gtaattgttg aaaaattaaa agaaaaagat gcgggaattg gttataatgc ggctgatgat 1440

acatgggttg atatggttga agccggaatt atcgatccaa ctaaagtaac acgttccgct 1500

ttacaaaatg cagcgagtgt ttccgctatt ttattaacaa cagaagcagt tgttgctgat 1560

aaacctagcg aaatgccaga aatgccacca atgccaggtg gaatgggcgg catgatgtaa 1620

<210> 8

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggctaaag agattaaatt ttctgaaaat gctagaaatt caatgttaaa tggtgttgac 60

aaattagctg acactgtaaa aacaacgatg ggtcctaagg gacgtaacgt tgttctagaa 120

gaaaaagctg gagatccaac cattacaaat gatggtgtta caattgctaa atcaattgac 180

cttccagatc actttgaaaa catgggtgca aaattagtat ctgaagttgc ttcaaagact 240

aatgatgttg ctggtgatgg tactactact gctactgttc ttgctcaagc aattgtcaag 300

gaaggtatga agaacgttac cgccggtgca aacccagttg gtgttcgtca aggaattgaa 360

aaagctacta gaacagccgt tgacagtctt cacaagatga gccatcaagt aactagcaag 420

gacgatattg ctcaaatcgc ttcaatttca tctgccaatg aaaaagttgg taacttgatt 480

gccgacgcaa tggaaaaagt tggtaatgat ggtgttatta ccattgaaga atcacgtggt 540

gttgacacta gtctagacgt tgttgaagga atggaatttg atcgtggata catgtcacaa 600

tacatggtta ccgaccaaga aaaaatggaa gctaacttag ataatcccta cattctaatt 660

actgacaaga aaattaataa tatccaagac attttgccat tacttcaatc agtcgttcaa 720

caaggtcgtt cactattgat cattgctgat gacattggtg gtgaagcact tccaacctta 780

gttttgaaca aaatgcgtgg aacatttaac gtagttgctg ttaaagctcc tggctttggc 840

gaccgtcgta aggaacaatt acaagatatt gctactttga ctggtggtac tgtaattact 900

tctgatcttg gtttagatct aaaagacacc actattgatc aattaggtca agctaacaaa 960

gttaacgtta ctaaagacaa cactactatt gttgaaggta agggtagcaa agaagcaatc 1020

gacaaacgaa tcgatgaaat caaacaacaa attgatgcca ctgattctga ctttgaccgt 1080

gacaagttga aggaacgttt ggctaagttg gcaggtggag ttgctgttat caaagttggt 1140

gcagctactg aaaccgaact taaagaacgt aaatacagaa ttgaagatgc tctaaatgct 1200

acgagagctg ccgttgaaga aggatttgtt cctggcggtg gtactgcata tgtcaacatc 1260

ttaaaggaca ttgctaagat ccctgctgaa ggtgacgaag caactggaat caacatcgtt 1320

gttaaagcac ttgaagctcc tgtaagacag attgctgaaa atgctggtgt cgatggttca 1380

gttatcgttg atcacttgaa agatgaaaaa ccaggagttg gttacaacgc tttaactggt 1440

aagtacgaag acatgatcaa tgctggagtt gttgacccaa ctaaggtaag tcgttcagca 1500

cttcaaaacg ctgcatctgt ttcagctctt ctattgacta ctgaagccgt tgttgccgaa 1560

caaccaaaaa atgataatga tcaaccagcc gctccacaac aacctggaat gggtggaatg 1620

atgtaa 1626

<210> 9

<211> 1635

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggctaaag atttaaagtt ttctgaagat gcccgcagcg caatgcttgc cggtgttgat 60

aaattagcaa acacagttaa aacgaccctt ggacctaaag gtcgcaacgt tgttttggaa 120

caaagttatg gttcacctac catcactaac gatggtgtca caattgccaa agcggttgaa 180

ttgtcagacc actttgaaaa tatgggtgct aagctagttg ctgaagttgc ttccaagacc 240

aacgacatcg ctggtgatgg tacaacgact gctactgttt taacccaatc catcgttaac 300

gaagggatga agaacgttac cgctggtgct aaccctgttg gtatccggac tgggattgaa 360

aaagcaacgt ctgccgctgt cgatgctttg cacaagatga gccacgatgt taagactaag 420

tctgacattg cacaaattgc gtcaatttca gccgctgatc cagaagttgg taagttaatt 480

gctgacgcta tggaaaaggt tggtaacgat ggtgttatta ccattgaaga atccaaggga 540

attgaaacaa cttctgatgt cgttgaaggg atgcagtttg accgtggata catgagtcaa 600

tacatggtta ctgacaatga caagatggaa gctgacttgg acaaccctta tatcttgatt 660

acagataaga agattgccaa cattcaagac attttgccat tgttgcaatc tgttgttgaa 720

caaggccgtg cattacttat cattgctgat gatattactg gtgaagcttt accaacgctt 780

gttttgaaca agatgcgtgg gacattcaat gttgttgctg ttaaggcacc tggttttggt 840

gaccgtcgta aggcacaact tgaagatatt gctgctttga caggtggtac tgttatcact 900

gatgaccttg gtctgaacct gaaggacata actgttgatc agttgggtca agctggtaag 960

atcacgatca ctaaggacaa cacaaccatt gttgaaggtg ctggcgacaa ggctgctgtt 1020

gacgaacgtg ttgcaaacat caagtctgaa ttagaagcaa caacttctga cttcgacaag 1080

gaaaagttgc aagaacgttt ggctaagtta tcaggcggtg ttgcacggat taacgtcggt 1140

gctgctactg aaaccgaatt gaaagaacgc cgttaccgga ttgaagatgc cttgaacgca 1200

acgcgtgccg ctgttgaaga agggtttgta tctggtggtg gtactgcatt ggttaatgct 1260

atcggtgctg tggccgacct gaaagaagaa ggagacgtcc aaacgggtgt taacatcgtt 1320

cgtcgtgccc ttgaagaacc tgttcgtcaa atcgccgaaa acgcaggccg tgaaggttcc 1380

gttatcgttg aaaagttgaa gtcacaaaag ccaggtattg gttacaatgc tgcaactgac 1440

gaatgggttg acatggttga tgccggaatc gttgacccaa ccaaagttac ccgttctgct 1500

ttgcaaaacg ctgcctctgt ttcatcatta ttgttgacga ctgaagccgt tgttgctgaa 1560

gaaccaaagc aagataatgg tggtggcgat gctgctgccg ctgcacaagc tgctcaaatg 1620

ggcggtatga tgtag 1635

<210> 10

<211> 1626

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atggctaaag agattaaatt ttctgaaaat gctagaaatt caatgttaaa tggtgttgac 60

aaattagctg acactgtaaa aacaacgatg ggtcctaagg gacgtaacgt tgttctagaa 120

gaaaaagctg gagatccaac cattacaaat gatggtgtta caattgctaa atcaattgac 180

cttccagatc actttgaaaa catgggtgca aaattagtat ctgaagttgc ttcaaagact 240

aatgatgttg ctggtgatgg tactactact gctactgttc ttgctcaagc aattgtcaag 300

gaaggtatga agaacgttac cgccggtgca aacccagttg gtgttcgtca aggaattgaa 360

aaagctacta gaacagccgt tgacagtctt cacaagatga gccatcaagt aactagcaag 420

gacgatattg ctcaaatcgc ttcaatttca tctgccaatg aaaaagttgg taacttgatt 480

gccgacgcaa tggaaaaagt tggtaatgat ggtgttatta ccattgaaga atcacgtggt 540

gttgacacta gtctagacgt tgttgaagga atggaatttg atcgtggata catgtcacaa 600

tacatggtta ccgaccaaga aaaaatggaa gctaacttag ataatcccta cattctaatt 660

actgacaaga aaattaataa tatccaagac attttgccat tacttcaatc agtcgttcaa 720

caaggtcgtt cactattgat cattgctgat gacattggtg gtgaagcact tccaacctta 780

gttttgaaca aaatgcgtgg aacatttaac gtagttgctg ttaaagctcc tggctttggc 840

gaccgtcgta aggaacaatt acaagatatt gctactttga ctggtggtac tgtaattact 900

tctgatcttg gtttagatct aaaagacacc actattgatc aattaggtca agctaacaaa 960

gttaacgtta ctaaagacaa cactactatt gttgaaggta agggtagcaa agaagcaatc 1020

gacaaacgaa tcgatgaaat caaacaacaa attgatgcca ctgattctga ctttgaccgt 1080

gacaagttga aggaacgttt ggctaagttg gcaggtggag ttgctgttat caaagttggt 1140

gcagctactg aaaccgaact taaagaacgt aaatacagaa ttgaagatgc tctaaatgct 1200

acgagagctg ccgttgaaga aggatttgtt cctggcggtg gtactgcata tgtcaacatc 1260

ttaaaggacg ttgctaagat ccctgctgaa ggtgacgaag caactggaat caacatcgtt 1320

gttaaagcac ttgaagctcc tgtaagacag attgctgaaa atgctggtgt cgatggttca 1380

gttatcgttg atcacttgaa agatgaaaaa ccaggagttg gttacaacgc tttaactggt 1440

aagtacgaag acatgatcaa tgctggagtt gttgacccaa ctaaggtaag tcgttcagca 1500

cttcaaaacg ctgcatctgt ttcagctctt ctattgacta ctgaagccgt tgttgccgaa 1560

caaccaaaaa atgataatga tcaaccagcc gctccacaac aacctggaat gggtggaatg 1620

atgtaa 1626

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 11

gcyggtgcwa acccngttgg 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 12

aangtnccvc gvatcttgtt 20

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cctaygggrb gcascag 17

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 14

ggactacnng ggtatctaat 20

Claims

1.一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的特异性基因库，其特征在于，所述基因库包含一种或一种以上的乳杆菌groEL基因的核苷酸序列；

2.如权利要求1所述的一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的特异性基因库，其特征在于，所述乳杆菌groEL基因片段的大小为400～600bp。

3.如权利要求1或2所述的一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的特异性基因库，其特征在于，所述乳杆菌groEL基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10。

4.如权利要求1-3任一所述的一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的特异性基因库，其特征在于，所述可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列包含序列SEQ ID NO:11以及SEQ IDNO:12。

5.一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法，其特征在于，所述方法为使用权利要求1-4任一所述的一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的特异性基因库，先提取需筛选或鉴定样品的基因组DNA，然后将获得的基因组DNA用可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列进行扩增，再将扩增结果回收后测序，最后将测序结果与特异性基因库中的乳杆菌groEL基因的核苷酸序列进行比对，若需筛选或鉴定样品中有菌的测序结果与特异性基因库中某一乳杆菌的groEL基因的相似度为100％，即可判断此菌与所述某一乳杆菌属于同一个种或亚种。

6.如权利要求5所述的一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法，其特征在于，所述乳杆菌groEL基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:10。

7.如权利要求5或6所述的一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法，其特征在于，所述可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列包含序列SEQ ID NO:11以及SEQ ID NO:12。

8.一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列。

9.如权利要求8所述的一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的试剂盒，其特征在于，所述可用于扩增乳杆菌groEL基因的引物序列包含序列SEQ ID NO:11以及SEQ ID NO:12。

10.权利要求1-4任一所述的一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的特异性基因库或权利要求5-7任一所述的一种筛选和/或鉴定乳杆菌的方法或权利要求8或9所述的一种可用于筛选和/或鉴定乳杆菌的试剂盒在筛选和/或鉴定乳杆菌方面的应用。