CN115976235B

CN115976235B - 德氏乳杆菌cicc 6047菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用

Info

Publication number: CN115976235B
Application number: CN202210995386.9A
Authority: CN
Inventors: 姚粟; 宋智泉; 葛媛媛; 于学健; 刘蕊; 程坤; 郭立峥
Original assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Current assignee: China National Research Institute of Food and Fermentation Industries
Priority date: 2022-08-18
Filing date: 2022-08-18
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-08-18
Also published as: CN115976235A

Abstract

本发明涉及微生物鉴定技术领域，尤其涉及一种德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用。本发明提出如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在用于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047的菌株中的应用。本发明提出德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法，提取待测菌株的基因组DNA，针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，对基因组DNA进行扩增，比较实际扩增产物与目的扩增产物的长度，以及多态性位点碱基的情况判定德氏乳杆菌CICC 6047的菌株。本发明利用了德氏乳杆菌物种的特有保守基因序列，提出了一种简单、快速鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的方法。

Description

德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用

技术领域

本发明涉及微生物鉴定技术领域，尤其涉及一种德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法及其引物、试剂盒和应用。

背景技术

德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，是一种革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、不运动、无芽孢、兼性厌氧、同型乳酸发酵的乳酸菌。德氏乳杆菌保加利亚亚种是工业生产发酵乳制品最常用的发酵菌种之一，在发酵过程中可将葡萄糖或乳糖转化为乳酸，降解蛋白质为小分子的肽类和氨基酸，从而提高乳制品功能性及营养价值，改善乳制品质地和风味。目前，其已被收录到我国《可用于食品的菌种名单》及欧盟QPS名单，具有食品食用安全(GRAS)状态，在全球发酵乳制品工业中具有重要的商业价值。

研究表明，蛋白分解活性、乳糖代谢能力、后酸化特性等生物活性在菌株水平具有特异性，直接影响发酵乳制品的品质和特性。因此，筛选开发具有优良性能的发酵剂菌株在乳品工业中具有非常重要的经济价值。德氏乳杆菌保加利亚亚种CICC 6047(以下简称CICC6047)性状稳定，生物活性高，乳酸合成能力强且后酸化较弱，具有优秀的开发利用潜力。因此，快速且准确地鉴别CICC 6047菌株的方法和技术是其商业化生产的重要技术保障，对其开发利用具有重要的意义。

随着分子生物学的日益精进，细菌的分类鉴定从传统的表型特征水平分类进入到各种基因型水平分类，常用的手段有16S rRNA基因序列分析、管家基因多位点序列分析(MLST)、全基因组分析等。2006年，德氏乳杆菌保加利亚亚种模式株ATCC11842基因组完成测序工作；2016年，研究人员采用MLST技术对L.delbrueckii菌株进行了遗传多样性和种群结构分析，发现德氏乳杆菌保加利亚亚种分为六个明显的具有地域特征的谱系；NCBIGenBank数据库中已收录超过50株德氏乳杆菌保加利亚亚种的基因组数据。德氏乳杆菌保加利亚亚种不同菌株之间存在潜在的功能差异，而目前大多数常用的微生物测序手段只能将微生物鉴定到种(species)水平，因此需要针对性地设计每一株菌株的特异性引物，实现“株”水平的快速且精准的鉴定。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种简单、快速鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的方法及其引物、试剂盒和应用。

本发明提出如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在用于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047的菌株中的应用。

可选的，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第225位、第298位的碱基为多态性位点。

本发明提出一种德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法，至少包括以下步骤：

S1、提取待测菌株的基因组DNA；

S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物覆盖至少一个SEQ ID NO:1的多态性位点；

S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；

S4、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度不一致，则待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047；

S5、如实际扩增产物与目的扩增产物的长度一致，对实际扩增产物进行测序，并与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：

如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1相同，待测菌株鉴定为德氏乳杆菌CICC 6047；

如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1不同，待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047。

可选的，德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法至少包括以下步骤：

S1、提取待测菌株的基因组DNA；

S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，引物的目的扩增产物至少覆盖SEQ ID NO:1的第225位～第298位的碱基；目的扩增产物的长度为74bp～984bp；

S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；

如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第225位的碱基为T且第298位的碱基为A，待测菌株鉴定为德氏乳杆菌CICC 6047；

如实际扩增产物在SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的对应位置上第225位的碱基不为T或第298位的碱基不为A，待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC6047。

可选的，在S2中，目的扩增产物的长度为100bp～300bp。

可选的，在S2中，引物的目的扩增产物至少覆盖SEQ ID NO:1的第189位～第366位的碱基。

可选的，引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示。

本发明提出一种于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的试剂盒，应用SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行菌株鉴定，包括采用PCR技术和基因测序技术检测SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的多态性位点。

可选的，试剂盒内包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂内至少含有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的引物对。

本发明提出一种用于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的引物，其核苷酸序列如SEQID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明利用了德氏乳杆菌物种的特有保守基因序列，提出了一种简单、快速鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的方法。

在优选的技术方案中，本发明的引物对在德氏乳杆菌“种”水平上特异性良好且在“株”水平上可以精准快速鉴定CICC 6047菌株。

附图说明

图1是保守基因6047_14_37与33个NCBI库中近缘序列构建的进化发育树；

图2是5对引物对的特异性扩增验证电泳图；1为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3引物对，2为SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5引物对，3为SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7引物对，4为SEQID NO:8和SEQ ID NO:9引物对，5为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11引物对，6为空白；

图3是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的特异性扩增验证电泳图；1为CICC6047-1，2为CICC 6047-2，3为CICC 6047-3，4为CICC 10134R，5为CICC 10139R，6为CICC10150R，7为CICC 6097，8为CICC 6098，9为CICC 6100，10为CICC 6103，11为CICC 6077，12为CICC 6256，13为CICC 6286，14为CICC 10720，15为CICC 6081，16为CICC 24878，17为CICC 24208，18为CICC 6252，19为CICC 6117，20为CICC 6132，21为空白；

图4和图5是SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对在CICC 6047和28个德氏乳杆菌基因组上扩增片段差异位点对比图。以CICC 6047(第一列，CICC 6047)作为模板，同一位点与模板相同则标记为“·”，不同则标记差异碱基。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明实施例的第一个方面提供了一条德氏乳杆菌物种的特有保守基因序列在鉴定德氏乳杆菌CICC 6047的菌株中的应用，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

SEQ ID NO:1的核苷酸序列为：

gtggttttagtatattttcgaaaggagatctcgcttatcaaacaatatgatcttgccgtgattggcgctggaccagtcggcctcttcgcggcctacttcgcccacctgcatggcttaaagacggttatccttgaatccttgaacgagcctggcggacagccagaaatgctctaccccttcaagaagatcctggacatccctgtcttcaatgaaatcaccgcggctgacttaaccaagcgcctcttagccaacttaaccgaccaggacctggtcactggccacaaggtcagccagctgaagaaaactgacgaatttgtgatcgatggcgaataccaggtccgcagcattatcgtcgcaactggcaacggggcctttaaggccaaaaagttccccctcaaggcgaccccggaagctgaagaccacatccactactttttcaaaaatcctgacctctttgctggccagaagatcggcatctttggcggcggagacacggccttagactgggcccaggaactttcccaaatcgctgacgtcaccctcgttcaccggcgcaaccagttccggggcatggaaagcagcgtggaaaacttgaaggctgaccaaaaggtgaccttgaagaccccctacctgccaaagagcatgcaggtcgaaaagggccagctggaaatttccttgaaaatggttggcggagatgaagtcactcaagaaacttttgaccagatcctggtcgcctacggcttccgggccgacaaccgcttcgtcagcaagtggggggttgacctggaccagggcttgatcgccgttgaccggtccatgcagaccagcgtgcctggcatctatgccattggcgactcctgcggctacccgggccgggtgccagttatcgggattggttttggggaagcccagatcgcggtcaacgcgattatgcaggacctcttcccggaaaagagcctgaccatccactcaaccagtatctag

从中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)菌种资源库中及NCBI GenBank数据库搜集德氏乳杆菌保加利亚亚种全基因组数据，通过比对获得CICC 6047基因组上的一条保守编码蛋白的核酸序列及特有SNP位点信息，序列功能注释详见表1所示。在NCBI数据库中检索6047_14_37核酸序列，序列覆盖率大于50％的只有33条结果，将其与CICC 6047保守核酸序列共同构建进化发育树，详见图1。这33条结果均为德氏乳杆菌，且每条结果序列相似度大于97％。验证结果表明基因6047_14_37是德氏乳杆菌特有的保守基因，适于用于德氏乳杆菌“种”水平上的鉴定。

表1：特有保守核酸序列注释结果

经实验验证，利用该核苷酸序列以及其上特定的SNP位点，可以将德氏乳杆菌CICC6047菌株与其他菌株鉴别出来。

其中，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第225位、第298位的碱基为多态性位点。

本发明实施例的第二个方面提供了德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法，利用引物组可以特异性在德氏乳杆菌中扩增目的片段；在此基础上，鉴别目标菌株是否为CICC6047必须满足引物扩增片段的特异性SNP位点判别标准。具体包括以下步骤：

S1、提取待测菌株的基因组DNA；

S3、利用引物对待测菌株的基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；

如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1相同，判定待测菌株鉴定为德氏乳杆菌CICC 6047；

如实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1不同，判定待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047。

本发明实施例的鉴定方法，克服了现有方法中需要对16S rDNA序列同源性进行分析的弊端，充分利用了德氏乳杆菌物种的特有保守基因序列，建立了一种简单、快速的鉴定方法，无需复杂的仪器，适合大规模推广应用。为了进一步保证鉴定的准确性，优选目的扩增产物覆盖两个SEQ ID NO:1的多态性位点、且实际扩增产物中两个多态性位点的碱基均与SEQ ID NO:1相同，判定为德氏乳杆菌CICC 6047菌株。

作为本发明实施例进一步优选的技术方案，德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法，至少包括以下步骤：

S1、提取待测菌株的基因组DNA；

S3、利用引物对基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；

在上述优选的技术方案中，引物的目的扩增产物覆盖SEQ ID NO:1的第225位～第298位的碱基时，目的扩增产物的长度为74bp；即目的扩增产物覆盖第225位、298位两个多态性位点。为了保证测序的准确性，可将目的扩增产物的长度适当延长，例如，可将上游引物设计在SEQ ID NO:1的第225位碱基上游10～100个bp的位置，下游引物设计在SEQ IDNO:1第298位的碱基下游的10～100个bp的位置。当引物的目的扩增产物覆盖SEQ ID NO:1的全部碱基时，目的扩增产物的长度为984bp。

作为本发明实施例进一步优选的技术方案，在S2中，目的扩增产物的长度可以为100bp～300bp，更优选150bp～300bp；该长度范围内的目的扩增产物既可以对目的片段具有很好的覆盖，同时该长度的核苷酸片段的扩增和测序都比较快速、高效和准确。

作为本发明实施例进一步优选的技术方案，在S2中，引物的目的扩增产物至少覆盖SEQ ID NO:1的第189位～第366位的碱基。针对SEQ ID NO:1的第189位～第366位的碱基，本发明实施例通过引物筛选，获得了一对扩增效果最佳的引物对，核苷酸序列如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示。具体如表2所示：

表2：CICC 6047的特异性引物信息

利用该引物对扩增得到的PCR产物长度为178bp，产物37号位点碱基为T(该SNP位点位于一段15bp核酸序列CCGCGGCTGACTTAA，下划线标出)和产物110号位点碱基为A(该SNP位点位于一段15bp核酸序列CCAGCTGAAGAAAAC上，下划线标出)。

本发明实施例基于基因序列开发的鉴别CICC 6047的特异性引物，在德氏乳杆菌“种”水平上具有特异性，可以获得178bp的目标产物，利用其PCR扩增出目的条带的菌株可以被鉴定为德氏乳杆菌种。通过实验证实，该引物对检测的准确性良好，对近似菌株具有100％的区分。利用NCBI引物工具Primer-BLAST在细菌(Bacteria<taxid:2>)基因组范围内验证SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的特异性，允许每条引物有不多于8个碱基的错配，扩增片段长度不超过3000bp。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对在Refseq基因组数据库和NR非冗余的蛋白质序列数据库中都只在德氏乳杆菌中存在结果，表明该引物组在德氏乳杆菌“种”水平上具有特异性。说明该引物对在德氏乳杆菌“种”水平上特异性良好且在“株”水平上可以精准快速鉴定CICC 6047菌株。

本发明实施例的第三个方面提供了一种于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的试剂盒，应用SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行菌株鉴定，包括采用PCR技术和基因测序技术检测SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的多态性位点。具体的，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第225位、第298位的碱基为多态性位点。

作为本发明实施例的一种改进，试剂盒内包括核酸扩增试剂，核酸扩增试剂内至少含有如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列的引物对。除引物外，还包括dNTPs、Buffer和DNA聚合酶等。具体可为：引物(10μmol/L)2μL×2，2×PCR Taqmix 25μL，ddH₂O 21μL。

本发明实施例的第三个方面提供了一种用于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047菌株的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示。

下面通过具体实施例进一步说明本发明实施例，以下实施例所采用的实验试剂均为市售，所采用的菌株均为现有菌株，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。

实施例1

本实施例用于说明引物设计及特异性验证过程。

1)针对基因6047_14_37的核酸序列，使用Primer Premier 6设计包含SNP位点的引物，并通过Oligo 7对引物进行综合评估，最终筛选出5对特异性引物，如表2和表3所示。在此基础上，进行了引物扩增效率验证的实验。

表3：CICC 6047的其他引物信息

PCR反应体系为50μL总体积：DNA模板2μL，引物(10μmol/L)2μL×2，2×PCR Taqmix25μL，ddH₂O 21μL；PCR扩增条件为95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃35s，35个循环；72℃10min。将扩增产物进行凝胶电泳，结果详见图2。

如图2所示的实验结果可知，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对扩增效率最高，后续对其进行特异性扩增验证实验。

2)引物特异性验证：

选取包含CICC 6047同株不同代的3株菌在内共20株菌作为实验验证菌株，如表4所示，提取基因组DNA后使用对引物组进行PCR扩增验证。

表4验证实验菌株信息

PCR反应体系为50μL总体积：DNA模板2μL，引物(10μmol/L)2μL×2，2×PCR Taqmix25μL，ddH₂O 21μL；PCR扩增条件为95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃35s，35个循环；72℃10min。将扩增产物进行凝胶电泳，结果详见图3。

如图3所示，12株德氏乳杆菌菌株在相应位置均有明亮的条带，8株非德氏乳杆菌和阴性对照均无条带，表明引物组在德氏乳杆菌“种”水平上扩增效率良好。

实施例2：

本实施例用于说明特异性引物在德氏乳杆菌基因组中鉴别CICC 6047菌株的过程。

为了检验德氏乳杆菌种内CICC 6047“株”水平的鉴别标准是否普遍适用，从基因组层面利用NCBI数据库中德氏乳杆菌基因组完成图进行补充验证。NCBI数据库中细菌基因组完成图的标准是所有染色体都是无间隙且模糊碱基(Ns)少于10个，没有组装的片段，并且所有预期的染色体都存在。高质量的基因组数据可以保证在遗传信息比对过程中不遗漏或误判彼此之间的差异。因此，搜集了28个德氏乳杆菌基因组完成图作为参考基因组，覆盖了德氏乳杆菌所有亚种，基因组信息详见表5。

表5：NCBI数据库中德氏乳杆菌基因组完成图信息

利用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的引物对检索基因组上的PCR扩增片段，并且与CICC 6047PCR产物序列比对，详见图4和图5。

结果表明，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对的SNP位点判别标准完全适用与德氏乳杆菌所有亚种的基因组完成图，能够明确地在“株”水平鉴定CICC 6047。

实施例3：

本实施例用于说明两个多态性位点在不同代CICC 6047菌株株内的遗传稳定性。

1)样品信息及DNA模板提取

从CICC菌种资源库中获得菌株CICC 6047，使用MRS培养基在37℃厌氧环境下培养、传代；获得第1代(6047-1)、第3代(6047-2)和第5代(6047-3)三批菌株，使用细菌基因组DNA提取试剂盒(Cat.#DP302-02，TIANGEN，北京)提取菌株的基因组DNA。

2)特异性引物扩增目的片段

PCR反应体系为50μL总体积：DNA模板2μL，引物(10μmol/L)2μL×2，2×PCR Taqmix25μL，ddH₂O 21μL；PCR扩增条件为95℃5min；95℃30s，58℃30s，72℃35s，35个循环；72℃10min。将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段长度符合理论设计长度(178bp)，结果如见图3，其中，1为CICC 6047-1，2为CICC 6047-2，3为CICC 6047-3。

3)测序及鉴定结果

将PCR产物进行测序获得了178bp的核酸序列进行比对分析。引物对6047-1、6047-2、6047-3三个样品扩增片段长度一致、核酸序列100％匹配，与CICC 6047基因组上保守序列SEQID NO.1预测的PCR产物序列完全一致。这表明本发明提出的判别标准所依据的SNP位点在株内遗传稳定，可以作为CICC 6047菌株鉴定的有效参考。

实施例4：

本实施例用于说明特异性引物在在不同德氏乳杆菌保加利亚亚种株间快速、精准地鉴定菌株CICC 6047的验证过程。

1)样品信息及DNA模板提取

从CICC菌种资源库中获得菌株CICC 10134R、CICC 10139R、CICC10150R、CICC6097、CICC 6098、CICC 6100、CICC 6103作为株间特异性引物验证的实验菌株。以上菌株均分离自市售酸奶，已完成了高通量测序获得了其基因组数据。经过生信分析，它们均属于德氏乳杆菌保加利亚亚种，并且通过全基因组SNP分析可以明确它们是不同的菌株，SNP信息详见表6。菌株培养条件及基因组DNA提取方法同实施例3。

表6：实验菌株全基因组SNP距离矩阵

2)特异性引物扩增目的片段

PCR扩增体系和扩增条件同实施例3，将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，扩增片段长度符合理论设计长度(178bp)，结果详见图3。

3)测序及鉴定结果

与CICC 6047菌株相同，其它7株德氏乳杆菌保加利亚亚种的PCR产物测序也分别获得了178bp的核酸序列。CICC 10150R、CICC 6097、CICC 6098、CICC 6100、CICC 6103等5株菌扩增片段完全一致，在产物110号位点碱基为“G”，不符合判别标准；CICC 10134R扩增片段在产物110号位点碱基为“G”，不符合判别标准；CICC 10139R扩增片段序列在产物37号位点碱基为“C”，不符合判别标准；只有CICC 6047符合判别标准，其它菌株与CICC 6047序列差异位点见表7。

表7：CICC 6047与其它菌株引物扩增片段差异

实施例5：

本实施例用于说明引物在非德氏乳杆菌保加利亚亚种上的特异性验证过程。

1)样品信息及DNA模板提取

从CICC菌种资源库中获得菌株CICC 6077，CICC 6256，CICC 6286，CICC 10720，CICC 6081，CICC 24878，CICC 24208，CICC 6252，CICC 6117和CICC 6132。前2株分别是德氏乳杆菌乳亚种和德式乳杆菌雅各布森亚种，作为德氏乳杆菌种内特异性引物验证的实验菌株；后8株均非德式乳杆菌，作为不同种属间特异性引物验证的实验菌株。菌株培养条件及基因组DNA提取方法同实施例3。

2)特异性引物扩增目的片段

PCR扩增体系和扩增条件同实施例3。两株德式乳杆菌CICC 6077和CICC 6256在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物对上均能有效扩增，扩增片段长度符合理论设计长度(178bp)。将其余8株非德式乳杆菌的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，均没有目标条带，结果详见图3所示。

3)测序及鉴定结果

2株德氏乳杆菌的PCR产物测序分别获得了178bp的核酸序列。鉴定结果如表8所示。

表8：德式乳杆菌CICC 6077、CICC 6256与CICC 6047目标片段差异

如表8所示，扩增产物110号位点碱基为“G”，不符合判别标准，可以与CICC 6047菌株有效区分。另外8株非德式乳杆菌，包括6株乳杆菌属乳酸菌和2株非乳杆菌属乳酸菌，均未扩增出特异性片段。

引物设计过程中，已经利用Primer-BLAST验证了两对引物组在NCBI的Refseqrepresentative genomes数据库和NR数据库中在德氏乳杆菌“种”水平上具有特异性。实验验证结果与序列验证结果一致，引物组都可以在“种”水平上有效地鉴别德氏乳杆菌。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列在用于鉴定德氏乳杆菌CICC 6047的菌株中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列上的第225位、第298位的碱基为多态性位点。

3.一种德氏乳杆菌CICC 6047菌株的鉴定方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

S1、提取待测菌株的基因组DNA；

S2、针对SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列设计引物，所述引物的核苷酸序列如SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示；

S3、利用所述引物对所述基因组DNA进行扩增，获得实际扩增产物；

S4、如所述实际扩增产物与所述目的扩增产物的长度不一致，则所述待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047；

S5、如所述实际扩增产物与所述目的扩增产物的长度一致，对所述实际扩增产物进行测序，并与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列进行对比：

如所述实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1相同，所述待测菌株鉴定为德氏乳杆菌CICC 6047；

如所述实际扩增产物多态性位点的碱基与SEQ ID NO:1不同，所述待测菌株鉴定为非德氏乳杆菌CICC 6047。